JPH0353167A - 免疫活性物質で被覆された固相マトリツクスの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、免疫活性物質で被覆された固和マトリックス
の製法に関する． 従来の技術 診断の際に、不均質系免疫検定の原埋により行なう多く
の測定には、測定すべき物質又は測定すべき物質と標識
した物質とからの複合体と結合し得る物質が結合してい
る同和が使われる．その際に、この特異的結合性物質の
固和への結合は大きな問題である。支持材料の種類に和
応して、結合は吸着で又は共有結合で行なうことができ
る。一般に、共有結合は、相応する官能基を有する支持
材料及び同様に相応する官能基を有する免疫活性物質を
必要とする．この方法は工業的に非常に経費がかかうか
つしばしば免疫活性物質の活性に影響を与える。一般に
、活性維持には有利である吸着結合は、プラスチック表
面に対して不十分な付着しか達成されないという欠点を
有する。それ故、測定法を実施するのには必要である恒
温保持の範囲において及び温度一及び洗浄作用が原因と
なって血清成分又は界面活性剤による脱着及び排除が行
なわれる．しばしば適用される、純粋に吸着的ｉ１プラ
スチック表面への蛋白質の結合に伴なう大きな欠点は不
十分な付着であり、これは多〈の問題をひき起こす。壁
から分離した壁抗体が試験溶液中で分析物と反応し、分
析物がこれにより捕集されることになう、これは誤った
再現値をもたらす。吏に、強力な結合性の血清威分が壁
抗体を排除でき、これも同様に騙った再現値をもたらす
。反応時間を短縮するために行なわれる高い温度での試
験は、脱着が著しいために、シグナルが低下しかつ再現
性が温度に左右されるのでしばしば不可能である。進行
を妨害されないよりにしかつ非特異的に結合する血清或
分を除去するために行なわれる強力な洗浄工程は多かれ
少なかれ壁抗体を強く分離させ、これは再現性を損ない
かつ精度を低下させる。非特異的結合を回避するために
しばしば使われる界面活性剤も１た吸着結合を損い、そ
れ故著しい壁の分離がもたらされる。支持材料の吸着結
合特性がバッチに左右されて変動するために、異なる分
離率が得られ、これもオた精度を低下させかつ誤った再
現性をもたらす。これらの問題点すべてによって免疫測
定法の精度及び感度は損なわれる． 免疫活性物質の固相への結合を改良するために、米国特
許第４６８９３１　０号明細書には、支持材料か又は結
合すべきリガンドに、光活性化可能な基を有する化合物
を共有結合させることが提案された。一方が相応して誘
導されている支持材料とリガンドを接触させかつ照射す
ると、両者間の結合が行なわれる。しかしながらこの方
法は経費がかかシ、筐た満足すべき結果をもたらさない
． 発明が解決しよりとする課題 本発明ｏｎ題は、簡単に実施することができ、かつ支持
材料への免疫活性物質の非常に耐久性の結合をもたらす
方法を開示することであった。

課題を解決するための手段 との課Ｍは、支持材料を、 （ａ＞　　免疫活性物質、 （ｂ）　　光活性化可能な官能基少なくとも２個並びに
支持材料及び免疫活性物質と吸着的に相互作用する部分
少なくとも１個を含有する化合物 より成る混合物で吸収被覆し、かつ引続いて照射して架
橋させることを特徴とする、免疫活性物質で被覆した固
相マトリックスの製法にょｂ解決される。

本発明によシ、固相マトリックスを、長時間にわたって
かつ温度及び界面活性剤の作用下でも安定である免疫学
的に結合性の物質で被覆することができる。

被覆すべき支持材料を、免疫活性物質と光活性化可能な
基を有する化合物とを含有する負荷溶液と接触させる．
光活性化可能な基の活性化をもたらす波長の光を排除し
ながら十分に長い時間接触させた後で、疎水性部分に基
いて蛋白質、２官能性化合物及び支持材料の間の相互作
用により初めは吸着結合した表面層が生じる。

この最初の恒温保持の終結後に好適な波長と強さの光で
照射する。これにより、例えばカルペン及び／又はニト
レンのより慶高反応性の基が戒分（ｂ）に生成し、これ
らの基は蛋白質と、オた支持材料と迅速かつ非特異的反
応にかいて共有結合の形成下に反応する。このよりにし
て、初めは吸着的に前形戒された表面層を蛋白質一蛋白
質結合及び蛋白質一壁結合によシ共有的に固定する．こ
れらの手段の組合せよ少、被覆法の効率及び架橋の確率
が著しく改良される。更に、表画で蛋白質が吸着的に富
化されることにょシ免疫活性物質は最適に利用されかつ
高い負荷密度が達成される。

本発明によＤｇ造した固相マトリックスは不均質系免疫
検定の実施に使用する。このために固相には免疫活性物
質を固定化する．免疫活性物質とは、他の物質と特異的
に結合し得る化合物である．例としては抗体、結合蛋白
質、レクチン、ビオチン、アピジンないしはストレデタ
ビジン、ホルモン及び他の生物活性物質が挙げられる。

特に、免疫検定で使用するには、検出すべき物質又は検
出すべき物質とそれに結合した標識接合体とからの複合
体と結合性である免疫活性物質が該当する。それ故、抗
体及び結合蛋白質並びにストレプタビジンもしくはアピ
ゾン又はピオチン接合体を使用すると優れている．生物
活性分子、例えばＴ４＋’ｒ３ｔｔたポＩＪ　／％プテ
ン、デロラクチン、ＬＨ又はＴ８Ｈとしてのそのよりな
もの並びにこれらに対する抗体も同様に好適である． 支持材料としては常用の材料を使うことができる。光活
性化可能な基と共有結合の形戒下に反応するナベでの物
質、例えばポリサツカリド，ガラス，セラミック，セル
ロース及びプラスチックが好適である。光活性化可能な
化合物を使用することによシ、既に官能基を有するプラ
スチック並びに有利に不活性材料、例えばポリエチレン
を使用することができる，特に、例えばポリアミド、ポ
リアクリルアξド，ポリエステル，ポリエチレン．ｆ＋
）−１ロビレン，シリコーン，ポリカーポネートのより
なすべての種類のプラスチックで好適である。できるだ
け多くの反応成分を吸着結合する性質を有するプラスチ
ック，例えばポリビニルクロリド，ポリメチルメタクリ
レート（プレキシグラス）が好適である。本発明方法に
はポリステレン及びポリスチレンの共重合体（例えばア
クリルニトリルルーラン：　Ｌｕｒａｎ　）を使用する
と特に優れている。

ポリスチレンを使用する際に、支持材料を被覆する前に
ｒ照射によシ殺曹すると有利である。

支持材料は一般的に球、微量滴定板、試験管、プレート
、フォイル、織物／フリース、ミクロデル／ラテックス
の形で存在する。

結合は、光活性化可能な官能基少なくとも２個及び疎水
性部分を有し、かつ更に殊に水もしくは緩衝溶液中で十
分な溶解度を有する化合物を介して行ｉう。その際に、
疎水性部分は一方でこの戒分と支持材料との結合を、他
方で免疫活性物質との結合を惹起する．好適な波長と強
さの光を照射すると、生成する高反応性中間生成物（例
えばニトレン、カルベン、ラジカル）が重合体分子と、
１た蛋白質分子と反応する。

このよりにして、蛋白質とプラスチックの分子間架橋が
生成する。一定波長の光の作用により高反応性中間生成
物を形成する官能基は公知である．アジド、ジアゾー又
はケテン基がしばしば使われる．光活性化可能な基の選
択は、その活性化に必要な波長によっても決定される。

短波長照射は蛋白質を光酸化的に破壊することもあシか
つ特に長い波長の光の使用は不利であり、１た昼光に対
する非常に大きな感度が生じるので、光活性化可能な基
はその励起が範囲２５０〜５　０　０　ｒｉｒｎ　，％
に有利に３２０〜４　０　０　ｎｆｆｌで行なわれるよ
りに選択すべきである．本発明によシ使う成分（ｂ）　
Ｆｉ、同じか又は異なっていてよい光活性化可能な基２
個以上を有していてよい。

成分（ｂ）としてホモ２官能性化合物を使用すると優れ
ている。光活性化可能な基を結合する分子部分は少なく
とも部分的に疎水性である。その際に拭薬が固相表面及
び噴た固定すべき物質とできる限ｂ強い疎水的々和互作
用を呈するよりに疎水性部分が構成されていると優れて
いる。

そのためには疎水性部分が支持材料もしくは免疫活性物
質と同じよりに構威されていると優れている．例えば、
蛋白質をポリスチレンー又はルーラン試験管に固定する
際に疎水性部分が縮合一又は多核芳香族環系を含有して
いてよい。

戒分（ｂ）としては次の一般式の化合物を使用すると優
れている： Ｖ−Ｈｙ−Ｗ 〔式中Ｖ及びＷはそれぞれ党活性化可能な官能基を表わ
し、かつＨｙは疎水性基を表わす〕。

この際に、疎水性基としてはジフエニルー、ナ７チルー
又はアントラシル基を未置換形か又は置換形で使用する
と優れている。本発明の特に優れた実施形では、或分（
ｂ）として式：？式中Ｒ１及びＲ２は疎水性部分を表わ
し、かつＸｚ．Ｘ２及びｙ■，ｙ２はそれぞれ相互に独
立してＨ，Ｎｏ，又はハロゲンを表わしかつ２はスペー
サ基を表わす〕の化合物を使用する。スペーサ基は元素
Ｃ，！｛，Ｏ，Ｎ及び／又はＳよｂ戒シかつ原子１〜２
０個の連鎖長を有すると優れている．Ｚがジチオ基を表
わすと特に優れている。

免疫活性物質及び光活性化可能な基を含有する化合物は
、免疫活性物質の架橋及び結合を確実にするよりな比で
使用する。係数１〜１０６殊に３〜３　Ｘ　１　０’　
、特に１００〜１０００００モル過剰の光活性化可能な
化合物が好適であることか明らかになった． 被覆後、所望の架橋を惹起するために照射を行なった．
照射は、使用する光活性化可能な基に相応して、高反応
性中間体を生成するが、蛋白質の光酸化的破壊を惹起し
得ない波長で行なう．支持材料としては非常に頻繁に試
験管を使用するので、波長が充填した試験管内で照射を
実施し得る範囲であると更に優れている。この際に、賦
験管の光透過性は制限される。

照射時間は光活性化可能な基の反応性及び感光性により
決曾シ、かつ一般に１秒〜１時間である。照射時間３０
〜６０分間が特に優れている。

照射に際して公知の装置を適用することができる．その
際に、試験管の均一な照射が保障されるよりに注意すべ
きである。それというのも不均一性は変動する壁付着性
をもたらすからである． 本発明方法によｂ１免疫活性物質又は表面を前処理する
こともな〈、支持材料を免疫活性物質で被覆することが
できる．本方法は莫大な経費を使わずに通常の製造工程
に統合することができる．それというのも負荷溶液用に
１種の付加的な使用物質及び支持材料のオンライン照射
だけを必要とするからである。本方法は一般的に適用可
能であシ、かつ多くの種々の使用可能な支持材料に多種
多様の物質を固定するのに好適である．本方法は壁付着
性の明瞭な改良をもたらす． 機能試験の間のかつ温度及び界面活性剤の負荷下の壁威
分の分離率は著しく減少する。検量線、再現性及び精確
さは公知の被覆試験管に比べても変らない。

実施例 次に本発明を実施例につき詳説する。

例　　１ 本発明方法によシ管を種々の免疫活性物質で被覆した。

使用したすべての抗体、ポリハプテン及び結合蛋白質を
１２５１で放射性標識した。放射計によシ次の測定を行
った： 一　固相に結合した免疫活性物質の量（被覆溶液を充填
した管と被覆終結後に吸出して空にした管の有効率（　
Ｎｕｔｚｒａｔｅ　）の差）、機能、試験（異なる温度
で）の間並びに界面活性剤負荷下の壁成分の分離。この
ために、被覆管を機能賦験の実施前後にもしくは界面活
性剤含有緩衝液（４０ｍｍｏｘ／１リン酸ナトリウム、
ｐ｝１７．４）との恒温保持前後にｒ一カウンター中で
測定した。測定した有効率の差から分離率を計算した。

更に評価するために、機能試験の被覆管を使用した．試
験基準は検量線、精確さ、再現性及び管安定性であった
．対照としてはすべての測定で常法、即ち吸着被覆管法
が有効であった．ａ）吸着被覆 免疫活性物質（０．７〜１０μ９／一）を４０７Ｆｌ　
ｍｏｌ　／　ｌリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４（もしくは
Ｔ４試験に関しては緩衝液１１例４参照；　ＴＳＨ試験
に関してぱ緩伽液■、例６参照；ストレプタビジンに関
しては緩衝液Ｉ１例７参照）中室温で２４時間恒温保持
する。引続いて以下の例１ｂ）２に記載されているより
に後負荷しかつ乾燥する． ｂ）光被覆（光固定） 光被覆は吸着被覆と同様に行なうが、次のよりに変更し
た： １．　被覆溶液は１．５多エタノール及び１．１０−５
モル７１４．４’−ジチオービス−７エニルアシドの添
加物を含有した。免疫活性物質の濃度（０．７〜１６μ
１１／Ｍｌ）及びＭ衛液濃度は吸着被覆用の被覆溶液の
組戒に相応した。この変更した被覆溶液をポリスチレン
管、ｒ照射したポリスチレン管（ｒ管）又はルーラン管
中で２０〜２４時間２０℃暗所にかいて恒温保持した。

２　最初の恒温保持工程の終結後、なシ第一被覆溶液で
充填されている管を１時間ＵＶ下に波長３　６　６　ｎ
ｍで照射した．引続いて、後負荷し（０．９％塩化ナト
リウム及び２優サツカロースを含むＱ．３　％　Ｒ　Ｓ
　Ａ溶液、２０℃で３０分間）かつ管を乾燥した（２０
℃、相対湿度４０多で？４時間）． 例　　２ 例１で紀載したよりに試験管をｆｅＩラクチン試験用に
製造した。被覆を４　０ｍｍｏ１／１　＋）ンａｔ［ｌ
１１ｉ中Ｏ抗体４４／ｙｄ及び１１　０−５ｍｍｏｌ　
／　ｌ　４　ｅ　４’−ジチオーピスーフエニルアジド
（ＤＰＡ）で行なった。照射は３　６　６　ｎｍで６０
分間行なった。この試験管で得られた結果は棟準被覆試
験管に比較して第１図及び第２図並びに表１及び表２か
ら明らかである。

光固定した試験管を用いると著しく低下した分離率が界
面活性剤一及び温度負荷下でも、比較可能な検量線、精
確さ及び再現性で認められることが明らかになった。機
能試験の実施に当シ、緩衝液（　４　Ｑ　ｍｍｏｌ　／
　ｌ’Ｊン酸二水素ナトリウム、ＰＩ｛７．４）１一中
のＰＯＤ標識した、プロラクチンに対するモノクａナー
ル抗体１０ＤｍＵを試料又は標準５０μｌと一緒に被覆
管中で６０分間２０℃及び３７℃で恒温保持した。水道
水で２回洗浄後、ＡＢＴ８■基質溶液（１．９ｍ■■■
１／１２，２’−７ジノージー〔３−エチルーペンゾチ
アソリンースルホン酸（６）〕−ジアンモニウム塩、１
００ｍｍｏｘ／Ａ’リン酸塩−クエン酸塩Ｉｌ債液、ｐ
Ｊ｛　４．４、３−２　ｍ　ｍｏｌ　／　ｌ過硼素酸ナ
トリウム）１１ＩＬｌを加えかつ３０分後に４０５ｎｍ
で吸光度を測定した。

表　　１ ｎ：測定回数 ８Ｄ８：ドデシル硫酸ナトリウム ＲＴ二室温 デルロニツク：　Ｐｌｕｒｏｎ１ｃ　Ｆ　（５　８　（
　ＢＡＳ　Ｆ’社）、エチレンー及びプロピレンオキシ
ドからのブロック重合体 ン トリ｝ｍ　Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　Ｉ　Ｑ　Ｑ　（　Ｒｏ
ｈｍ　＆＋　Ｈａａｓ社）、４一（１，１，３．３〜テ
トラメチルプチル）フェノールのエトキシレート １） ルーラン製 例　　３ 試験管をＬＨ試験用に被覆した．条件は例同じであった
。被覆は４０ｍｍｏｌ／Ａ”Ｊン酸塩緩衝液、ｐＨ７．
２中の１．５μＩ／ｄ抗体を用いて行なった。この試験
管による結果は表３並びに第３図から明らかである．温
度一及び界面活性剤安定性が比較可能な検量線、精確さ
及び再現性で優れていることが明らかである。結合した
抗体の量は標準被覆試験管と同じ範囲である。

機能試験を実施するに当シ、ＰＯＤ標識した、ＬＨに対
するモノクロナール抗体６　６　ｍＵを緩衝液（　４　
０　ｍ　ｍｏｌ　／ｌリン酸塩、ｐＨ７．４）Ｉｄ中で
試料又は標準１００μｌと一緒に２時間２０℃及び３０
℃で恒温保持した。水道水で３回洗浄後、ＡＢＴ一基質
溶液ｉ１１１７を添加しかつ３０分後２０℃で吸光度を
４　０　５　ｎｍで測定した。

例　　４ 試験管をＴ４試験用に被覆した。２つのバッチを形戒し
、その際に第１のバッチには１μｇ／ｄ抗体及び２．５
μｇ／Ｉｔ／ＲＳＡＩＪン酸塩緩衡液、ｐ｝Ｉ　７．４
を含有する被覆溶液を使い、かつ第２のバッチには２μ
ｇ／Ｒｌ抗体及び２．５μ，ｐ／ｊｌ１８ＲＡリン酸塩
緩衛液、ｐ｝１７．４を含有する被覆溶液を使用した。

その他の被覆条件は例１と同じであった。結果は表４，
５及び６並びに第４図から明らかである。機能試験及び
界面活性剤負荷で、非常に良好な管安定性及び低い分離
率の試験管が得られた。精確さは総体的に非常に良好で
ありかつ再現値は標準被覆管の範囲である。

／ 表 ４ １）吸光度値に関して ２）　ポリスｔレン製 機能試験を実施するために、緩衝液Ｉ（１２Ｑ７ＦＬｍ
ｏｌ／Ａ！バルビツール酸ナトリウム、１８．２ｍ　ｍ
ｏｌ　／　ｌリン酸塩、ｆ’１．０４％ＡＮＳ（８−ア
ニリノー１−ナフタリンスルホン酸）、ｐＨ８．５）１
１ＩＩｌ中のＴ４　−　Ｐ　Ｏ　Ｄ一接合体１５７７Ｌ
Ｕを試料又Ｆｉ標準２０μｌと一緒に管中２０℃で３０
分間恒温保持した。水道水で１回洗浄した後でＡＢＴＳ
■基質溶液１ｗＬｌを加えかつ３０分後（２０℃）に４
　０　５　ｎｍで吸光度を測定した。

表 ５ ３） ポリスチレン製 例　　５ Ｔ３−ポリハプテン試験用に試験管を被覆した．そのた
めに賦験管を、０．７５μｇ／Ｉｌｌポリハデテン（Ｐ
Ｈ’）／２μｇ／　ｔｘｌ　Ｒ　−　１ｇＧを４０ｒｒ
Ｌｍｏｌ　／　ｌリン酸塩緩衛液、ｐＨ　７．４中に含
有する溶液と共に恒温保持した。他の条件は例と同じで
あった．この試験管による結果は次の表７及び第５図か
ら明らかである。光固定によりこの場合にも標準被覆管
に比べて明らかに低い分離率が達成された。皮膜は強い
界面活性剤及び高い温度に対して安定である。

機能試験を実施するために、緩伽液ｎ　（　１２０ｍ　
ｍｏｌ　／　／バルビタール緩衝液、０．０　４　＊　
ＡＮｓ）１ｄ中のＰＯＤＩＪＩ識した、Ｔ３に対する抗
体８０１！Ｌｔ）を賦料又は標準２００μｌと一緒に管
中３０分間２０℃及び３０℃で恒温保持した。水道水で
２回洗浄後、ＡＢＴＳ■基質溶液１−を加え２０℃で３
０分後に吸光度を４　０　５　ｎｍで測定した。

例　　６ 賦験管をＴＳＨ試験用に被覆した．そのために試験管を
例１に記載の条件下にＴＳＨに対する抗体（ＡＫ）２μ
ρ／ｄを含有する被覆溶液と共に恒温保持した．分離率
の試験で次の表８に紀載の結果が得られた． 表　　　８ 例　　７ ヨーロッパ公開特許第０２６９０９２号明細書によシス
トレゾタピジン及びサーモーＲ８Ａ一ストレプタピジン
（ＴＢＳ）で被覆した試験管を製造した．第１のパッチ
の場合は試験管を例１に記載の条件下にストレプタビジ
ン４μｇ／　ｍｌを含有するリン酸塩緩衝液４　０　ｍ
　ｍｏｌ　／　／，ｐＨ　７．４中の溶液によシ恒湛保
持した。第２のバッチでは試験管を、ＴＲＢ４μｇ／一
もしくは１６μｇ／−を含有する被覆溶液で恒温保持し
た。試験管を壁付着性もし〈はビオチン結合能（　Ｂｉ
Ｋａ　）について試験した。相対的なビオチン結合能の
測定にあたり、緩衝液口（リン酸塩４　０　ｍ　ｍｏｌ
　／ｌ　，　ｐｋ４　７．０、プルａニツクＦ６８０．
５％）１．２一中のピオチン１８ｄ及びビオチンーＰＯ
Ｄ一接合体７　０　ｍＵを管中で３０分間恒温保持した
．水道水で１回洗浄（５分間）後、ＡＢＴＳ■基質溶液
１−を加えかつ３０分後に４０５ｎｍで吸光度を測定し
た。結果は次の表９〜１１から明らかである。ストレグ
タピジン及びＴＲ８の光固定により壁付着性が部分的に
明瞭に改良されることが明らかである。

表 ９ ａ） ストレデタビジン管 ｎ−５ ｂ） サーモーＲＳＡ−ストレプタピジン管 表 １０ ａ） ストレゾタビジン管 ｂ） サーモーＲＳＡ−ストレプタピジン管 ｎ−５

【図面の簡単な説明】

第１図〜第５図は、本発明方法により被覆した被覆管及
び吸着的に被覆した管（以下１標準被覆管”と記載する
）の分離データをプロットした線図であり、第１図は２
０℃、λ−４０５ｎｍで測定したプロラクチン試験の検
量線を示す図であり、第２図は３７℃、λ−４　０　５
　ｎｍで測定したプロラクチン試験の検量線を示す図で
あや、第３図は２０’Ｃ，　　λ−４　０　５　ｎｍで
測定したＬＨ試験の検量線を示す図であシ、第４図は２
０℃、λ−４　０　５　ｎｍで測定したＴ４試験の検量
線を示す図であｂ１第５図は３０℃、λ−４　０　５　
ｎｍで測定したＴ３試験の検量線を示す図である。 ＦＩＧ．５ ポリスチレンー１８−５−二．”−；／′３ｏ°Ｃγ一
管、フ…一添加せず／３口℃ ボツスチレン、つ？−ｉ添加せス／３口°ＣＦＩＧ．１ ｛［ｌ］線２ 光固定管 ＦＩＧ．２ プロラクチン ＰＲＯＬＡＣＴＩＮ　ｎｇ／ｍｌ　（　３　７６Ｃ）曲
線１　：標準ｖｉ．覆管 曲線２：光固定管 ＦＩＧ．３ ＬＨ　　Ｕ／ｍｌ　　（　２　口’Ｃ）１＋Ｊ］線１．
標準被覆管（ル＝ラ／製）ｌＩＩ］線２６光固定管 ＦＩ　Ｇ　．　４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、支持材料を、 （ａ）免疫活性物質、 （ｂ）光活性化可能な官能基少なくとも２個と、支持材
   料及び免疫活性物質と吸着的に相互作用する部分少なく
   とも１個とを含有する化合物 より成る混合物で吸収被覆し、かつ引続いて照射して架
   橋させることを特徴とする、免疫活性物質で被覆された
   固相マトリツクスの製法。 ２、成分（ｂ）として、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＿１及びＲ＿２は疎水性部分であり、かつｘ＿
   １、ｘ＿２及びｙ＿１、ｙ＿２は相互に独立してそれぞ
   れＨ、ＮＯ＿２又はハロゲンを表わし、かつｚはスペー
   サ基を表わす〕の化合物を使用することを特徴とする、
   請求項１記載の方法。