CN102448992B

CN102448992B - 固定化生物分子用稳定组合物

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Publication number: CN102448992B
Application number: CN201080023348.2A
Authority: CN
Inventors: 斯特凡·马格拉夫; A·布鲁尔; 马丁·肖尔茨; 延斯·阿尔特里克特
Original assignee: Leukocare AG
Current assignee: Leukocare AG
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2030-03-31
Also published as: JP2012522236A; CN104031151A; WO2010115835A2; US20180204137A1; EP2414400A2; EP3249405A2; WO2010115835A3; CN102448992A; JP5680055B2; DK3249405T3; US9797895B2; EP2414400B1; EP3249405B1; EP3249405A3; ES2757961T3; EP2236520A1; US20120107829A1

Abstract

本发明涉及一种组合物在使固体载体上固定的生物分子稳定中的应用，所述组合物包含(a)至少三种不同氨基酸，(b)至少两种不同氨基酸和皂苷，或者(c)至少一种二肽或三肽。本发明还涉及一种生产被稳定的生物分子的方法，所述方法包含将生物分子包埋在本发明的组合物中，并涉及一种生产其上附着有生物分子的固体载体的方法。本发明还涉及一种可通过或者通过本发明的方法生产的固体载体，和一种利用本发明的载体诊断疾病的方法。

Description

固定化生物分子用稳定组合物

本发明涉及一种组合物在使固定在固体载体上的生物分子稳定中的应用，所述组合物包含(a)至少三种不同氨基酸，(b)至少两种不同氨基酸和皂苷，或者(c)至少一种二肽或三肽。本发明还涉及一种生产被稳定的生物分子的方法，所述方法包含将生物分子包埋在本发明的组合物中，并涉及一种生产其上附着有生物分子的固体载体的方法。本发明还涉及一种通过本发明的方法可生产的或者生产出的固体载体，和一种利用本发明的载体诊断疾病的方法。

在本说明书中，引用了包含专利申请和制造商手册在内的许多文件。这些文件的公开内容应被认为与本发明的专利性无关，通过引用将其整体并入本说明书中。更具体而言，对所有参考文件通过引用并入的程度等同于具体且单独地指明各份单独文件通过引用并入。

在诊断和治疗应用中利用固定化生物分子(例如蛋白，如抗体)时的一个主要挑战是保留生物分子的活性。然而，由于生物功能分子的化学、物理或生理学性质通常会因化合物周围环境的变化而显著改变，因而保留生物分子的活性是一项艰巨的任务。例如，pH、离子强度、温度或存储的改变会导致化合物性质的可逆或不可逆改变。特别是，受到例如长期存储、运输或灭菌程序等逆境的生物分子必须被稳定以防止活性丧失。

对于临床免疫诊断而言，诊断化验中所使用的固定的生物分子的充分稳定，是“欧洲体外诊断指南(EU In Vitro Diagnostics Guideline)”(IVDD 98/79/EC)中所规定的产品市场准入所要求的。

根据植入物在人体中的位置，含有固定化生物分子的可植入的医疗装置例如会暴露于多种存在于人体组织中的生物试剂，例如酸、碱和离子等。这些试剂中有一些可以降解装置的生物分子，导致损坏甚至装置失效。

因此，含有固定化生物分子制剂的市售载体或装置含有如糖(例如海藻糖)和/或血清蛋白(例如白蛋白)等稳定剂，以保护生物分子使其免于降解(Polifke T.和Rauch P，Laborwelt(2007)第6卷，第1～4页)。

含有血浆蛋白的稳定剂的优点在于除其稳定作用外，还充当防止非特异性结合的封闭剂。然而，因为白蛋白等是人或动物来源的，所以它们可能含有例如病毒或朊病毒之类的病原体等。因此，必须采用复杂的成本和时间密集的净化方法以除去这些病原体。

防止如灭菌或长期存储等逆境中对于固定化生物分子损坏的常规方法的另一缺点在于，这些方法要求将所述生物分子冷冻(US 5,730,933；Cleland J.L.等，Journal ofPharmaceutical Sciences(2001)，第90卷，第3号，第310～321页)。例如，US 5,730,933公开了一种用于对抗体灭菌的方法，这些抗体的活性可以通过在灭菌过程中冷冻它们而得到保留。然而，冷冻会导致生物分子的构象改变，这会影响它们的生物功能，并且冷冻构成固定化生物分子的制备中的另一步骤，导致成本增加。此外，稳定组合物含有动物来源的血清蛋白如白蛋白等，因此具有将于其中温育的生物分子污染的风险。

因此，需要稳定和保护在治疗和诊断中所使用的固定化生物分子的改进的方法和要素。因此，本发明的目的是提供可以避免现有技术的缺点的稳定生物分子的方法和要素。

因此，本发明涉及一种包含至少两种不同氨基酸的组合物在使固体载体上固定的生物分子稳定中的应用。

具体而言，本发明涉及一种组合物在使固体载体上的生物分子稳定方面的应用，所述组合物包含(a)至少三种不同氨基酸，(b)至少两种不同氨基酸和一种皂苷，和/或(c)至少一种二肽。

取决于预期的应用或状态，根据本发明使用的组合物可以是液体或固体。如下所述的本发明的包被和/或包埋附着于载体的生物分子的组合物通常是固体，而在如下所述的本发明的载体的生产方法中组合物通常是液体。在除去组合物的液体部分和/或干燥后，如下所述的本发明的包被和/或包埋附着于载体的生物分子的组合物又成为固体。如果组合物是液体，则其优选为水性的。

氨基酸被定义为具有羧基和氨基官能团的有机分子。它们是蛋白的基本构建单元。关于本发明，术语“氨基酸”指游离氨基酸，它们未彼此结合形成寡聚物或聚合物，如二肽、三肽、寡肽或蛋白。

稳定组合物中所含的氨基酸可以选自天然氨基酸和人工氨基酸或其衍生物。天然氨基酸是例如20种构成蛋白的氨基酸甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸(关于本发明，术语“天冬氨酸”和“谷氨酸”也包括这些氨基酸的盐)、谷氨酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苏氨酸和色氨酸。其他天然氨基酸是例如肉碱、鸟氨酸、羟脯氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸、羟赖氨酸或β-丙氨酸。

氨基酸衍生物为例如n-乙酰基-色氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基苏氨酸、膦酰基酪氨酸、麦拉宁(melanin)、精氨琥珀酸及其盐或DOPA。人工氨基酸是具有不同侧链长度和/或侧链结构和/或在不同于α-C原子的位置具有氨基的氨基酸。

本发明的上下文中的术语“稳定”涉及根据本发明使用的组合物所引起的任何下述作用：(固定化)生物分子的结构和/或活性的稳定、生物分子储存期的延长和/或生物分子抵抗逆境的保护。这将使生物分子的生物活性得到极大程度的保留。

关于本发明使用并可与术语“应激损伤”互换使用的术语“逆境”是指引起生物分子活性丧失的任何环境影响。示例性逆境因素是热、干旱或辐射，如通过下述灭菌方法而引起的辐射等。另一种逆境因素是化学环境。例如，用于灭菌的环氧乙烷等气体会促进生物分子活性的丧失。

术语“生物活性”是指生物分子的天然活性。生物活性取决于具体分子，并包括对于其他(生物)分子的亲合力或催化活性。例如，抗体的生物活性需要与其抗原的特异性结合。核酸探针的生物活性例如需要其和与其互补的核酸靶特异性地杂交的能力。关于这一点，术语“极大程度的保留”是指，使已暴露于逆境的(固定化)生物分子的生物活性与未暴露于逆境的(固定化)生物分子相比保留至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，最优选至少80％。

术语“生物分子”描述了可由活体产生或由活体产生的任何有机分子，包括优选生物可降解性聚合分子如蛋白或肽、糖类和核酸，以及小分子，如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。术语“生物分子”不仅包含从活体中分离的天然分子，还包含通过合成、半合成或重组而产生的天然或人造分子。人造分子例如为由天然分子衍生的引入了变化的那些分子。除属于上述种类的那些分子之外的生物可降解性聚合分子有木质素和多羟基脂肪酸酯(polyhydroxylalcanoates)(天然聚合物)和聚亚烷基酯(polyalcyleneester)、聚乳酸及其共聚物、聚酰胺酯、聚乙烯酯、聚乙烯醇和聚酐(人造聚合物)。优选的生物分子发挥与药物、诊断和/或科学应用有关的性质。换言之，适用于本发明的生物分子优选发挥以下生物活性，所述生物活性使它们优选可用作或适合用作药物活性剂、诊断试剂和/或研究工具。

对于本领域技术人员而言可以理解的是，本发明中所使用的术语“生物分子”也包括包含在如真核或原核细胞、组织、病毒及其片段(例如细胞器官、膜或衣壳)等结构之中或之上的如上所述的生物分子。在本发明的该实施方式中，生物分子可以以分离的形式或者以包含在所述真核或原核细胞、组织、病毒或其片段之中或之上的形式附着于固体载体。作为另外一种选择，包含生物分子(优选在其表面上包含生物分子)的结构体可以充当本发明的载体。

可与此处所使用的术语“蛋白”互换使用的术语“多肽”描述的是一类分子，其包含一类由超过30个氨基酸构成的多肽。与其相反的是，由至多30个氨基酸构成的分子被称为“肽”。同样，根据该定义，术语“肽”描述的是长度为30个氨基酸以下的蛋白的片段。多肽或肽还可以形成二聚体、三聚体和更高级的低聚物，即由超过一个多肽或肽分子构成。形成这种二聚体、三聚体等的多肽或肽分子可以是相同的，也可以是不同的。相应的高阶结构体因此而称作同源或异源二聚体、同源或异源三聚体等。术语“多肽”、“蛋白”和“肽”也指天然修饰的多肽/蛋白和肽，其中所述修饰例如通过糖基化、乙酰化和磷酸化等进行。所述修饰在本领域中是公知的。

根据本发明，术语“核酸”或“核酸分子”包括如cDNA或基因组DNA等DNA，和如反义RNA或siRNA等RNA。还包含的是本领域已知的核酸模拟分子，如DNA或RNA的合成或半合成衍生物和混合的聚合物。所述核酸模拟分子或核酸衍生物包含硫代膦酸酯核酸(phosphorothioate nucleic acid)、氨基磷酸酯核酸(phosphoramidatenucleic acid)、2’-O-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)(参见Braasch和Corey，Chem Biol 2001，8：1)。LNA是其中核糖环受到2’-氧和4’-碳之间的亚甲基键的约束的RNA衍生物。如本领域技术人员很容易理解的那样，核酸分子可以含有另外的非天然或衍生的核苷酸碱基。核酸分子还包括核酶、适体、质粒和染色体。本发明的核酸分子可以以分离的形式或者以与其他生物分子(如蛋白等，例如组蛋白或核糖体的蛋白)复合的形式使用。

术语“糖类”是指作为具有多羟基的醛或酮的有机化合物，通常在每个不作为醛或酮官能团的一部分的碳原子上附加有一个羟基。根据分子的长度，糖类被称为单糖、寡糖或多糖。糖类一旦与非糖类分子结合，所获得的分子即被称作糖苷。经修饰的糖类具有例如N-乙酰酯、羧基或硫酸酯测量，并可含有葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖胺、葡萄糖胺。

优选的生物分子为蛋白、肽、核酸及其衍生物、糖类及其衍生物以及脂质和脂肪酸、多元醇及其组合或修饰物。蛋白的实例为抗体或其保留有其结合特异性的片段、酶、受体、膜蛋白(可选的是不具有其跨膜域)、生长因子、白蛋白、球蛋白、细胞因子、转运蛋白、凝血因子和蛋白激素。示例性糖类为支链淀粉、糖原、淀粉、α-和β-葡聚糖、右旋糖苷和糖胺聚糖，如透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素及其衍生物如糖苷。

特别优选的蛋白是抗体或其保留有结合特异性的片段。适用于本发明的抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。术语“抗体”也包含依然保留有其结合特异性的抗体的衍生物。抗体的片段包含但不限于Fab片段、F(ab′)₂或Fv片段。生产抗体及其片段的技术在本领域中是公知的，并描述于例如Harlow和Lane的“Antibodies，ALaboratory Manual”(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)和Harlow和Lane的“Using Antibodies：A Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1998)中。这些抗体例如可以用于所关注的分子的免疫沉淀反应或者用于从患者体液中除去不想要的分子。

术语“抗体”也包括如合成的、嵌合的、单链的和人源化的抗体或其仍保留有其结合特异性的衍生物或片段等实施方式。可以使用本领域中已知的各种程序来生产所述抗体和/或片段。此外，为生产单链抗体而描述的技术适于生产特异性地结合于所关注的分子或其片段的单链抗体。此外，可使用转基因动物表达人源化抗体。最优选的是，抗体是单克隆抗体。对于单克隆抗体的制备，可以使用任何提供通过连续细胞系温育产生的抗体的方法。这种技术的实例包括杂交瘤技术(和Milstein Nature256(1975)，495-497)、三源杂交瘤技术、人类B-细胞杂交瘤技术(Kozbor，ImmunologyToday 4(1983)，72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)来产生人类单克隆抗体。可以使用如BIAcore系统中所采用的表面等离子体共振来提高与所关注的生物分子的表位结合的噬菌体抗体的功效(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。根据本发明的上下文，术语“抗体”还包含可以在细胞中表达的抗体构建体，例如可通过例如病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。一旦获得抗体或其片段，抗体自身或为其编码的DNA可以进行测序以提供用于小或大规模地重组产生抗体或其片段的信息。生产重组抗体的方法是本领域技术人员所知道的。

如本领域中所公知的，抗体或其衍生物或片段还可以化学修饰。

抗体可以是任何种类的抗体。最优选的是，抗体是单克隆抗体，并属于IgG、IgM或IgY类。IgY抗体表示IgG抗体在鸡中的类似物。

可与术语“附着的”或“附着”互换使用的术语“固定化”或“固定”涉及生物分子在载体上的固着。所述固定或附着或固着可以是不可逆的，也可以是可逆的。固着可以是载体的材料与生物分子之间所形成的共价或非共价键造成的。示例性非共价相互作用包括引起吸附的那些作用。生物分子对于载体的固着可以通过现有技术中已知的任何技术来进行(参见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Technique(2008)，第2版)：

固着可以例如通过生物分子与固体载体的直接结合而实现。作为另外一种选择，固着可以通过间接结合实现，所述间接结合通过包被固体载体的如隔离和连接分子等第三化合物(例如，硅烷或如生物素、抗生物素蛋白或链亲和素等蛋白)来进行。在整个本发明中使用的术语“包被”包含对固体载体的完全包被和部分包被。在这两种供选方案中，结合可以是通过共价或非共价键的结合。共价键可以例如通过生物分子与载体材料之间的或者隔离/连接分子与生物分子之间的化学反应来实现。非共价结合的实例包含弱键，如范德华键或其他极性键。所述非共价键出现在例如多肽或肽与具有聚乙烯表面的固体载体之间。

在一个优选实施方式中，生物分子可逆地附着在所述固体载体上。

术语“可逆地附着”限定了当生物分子附着于载体时可以通过适当要素从所述载体上释放下来。根据附着的种类(例如附着是否为共价或非共价)，可以采用不同的释放生物分子的要素。实例是通过蛋白酶切割(在蛋白作为生物分子的情况下)、改变pH或改变温度。生物分子附着于载体，直至到了需要的时候并且只有在那时才从载体上释放下来。

上述技术只是将生物分子固定或可逆地附着在固体载体上的实例。但是，应当强调的是，本发明并不限于这些实例。相反，可以采用现有技术中已知的任何常用方法来将生物分子固定或可逆地附着在固体载体上。

选择生物分子的可逆附着，从而使生物分子能够从载体上迅速释放下来。关于这一点，术语“迅速”是指超过50％、如60％、70％或80％的所述生物分子可以在2小时以内、如在1小时、30分钟或20分钟内释放，其可以为任意组合，如60％在30分钟或20分钟释放、70％在30分钟或20分钟释放或者80％在30分钟或20分钟释放、优选超过85％在10分钟以下释放、最优选超过98％在1分钟内释放。这可以通过例如应用下述方法之一来实现。此外，选择生物分子的可逆附着，优选使在临床应用之前立时释放生物分子。

可逆附着与不可逆附着相似，可以是共价的或非共价的。

优选的是，非共价键是具有高亲合力和特异性的非共价键。所述非共价键的实例是链亲和素-生物素或抗生物素蛋白-生物素系统形成的那些非共价键。在此实例中，链亲和素/抗生物素蛋白共价偶联于适当的载体。然后生物素化的生物分子非共价但具有高亲合力地结合于链亲和素/抗生物素蛋白。通过添加过量的生物素，结合得到竞争性的抑制，并且生物素化的生物分子得到释放。

生物分子可以通过连接体、优选可切割的连接体而连接。适当的连接体可以选自但不限于

a)具有二硫桥的连接体如SDAD(NHS-SS-双吖丙啶)、SulfoSAND、DSP，其可以通过添加具有-SH基团的试剂如硫醇(thiols，mercaptanes)、半胱氨酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇而被轻易切割，

b)具有肽键的连接体，其可使用特定蛋白酶、优选人的酶切割，

c)可以通过超声切割的连接体，

d)具有酯键的连接体，如EGS，可由例如羟胺切割，

e)具有砜的连接体，如BSOCOES，可在ph较高(例如pH 11.6)时被切割

f)具有顺式二醇的连接体，如DST，可由偏高碘酸钠切割。

作为另外一种选择，生物分子可以通过如上所述的干燥而可逆地附着，在下文中将结合本发明的方法对其进行详细描述。在该实施方式中，可逆附着以下述方式实现：生物分子和用作稳定剂的分子(即，氨基酸，可选地结合皂苷和/或可选地结合与至少一个如上所述的二肽和/或三肽)和固体载体在干燥后粘附在一起。生物分子的释放于对上述化合物添加液体时发生，由此将生物分子和稳定分子从载体上溶解/溶液化下来。

在本发明的上下文中，术语“固体载体”定义了固体材料的载体。载体的材料可以是致密或多孔结构。如下文中所述，优选的是，载体材料是选自由玻璃、医用级不锈钢、金属合金(例如铬钴钼、氮氧化钛)、羟磷灰石、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚-L-乳酸；聚氨酯、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸(polyacryl)、聚丙烯腈、聚酰胺、PMMA、毛织填塞物(fleece wadding)、开孔泡沫塑料或玻璃和网状塑料或玻璃和衍生自于海绵(海绵动物)的结构。

在本发明的过程中，惊讶地发现了可以通过应用下述组合物而使固定在固体载体上的生物分子稳定，所述组合物包含(a)至少三种不同氨基酸、(b)至少两种不同氨基酸和皂苷或(c)至少一种二肽。该组合物包被或包埋生物分子并保护其免受不利影响。与术语“包被”类似，在整个本发明中所使用的术语“包埋”包括由根据本发明使用的组合物部分或完全包埋生物分子。如所附实施例中所示，由根据本发明使用的组合物包被或者包埋的固定化生物分子在抗逆境(如老化或灭菌等)方面显示了显著的提高，同时基本上保留了其生物活性。

本发明的稳定组合物的主要优点在于，氨基酸而不是血清蛋白(如白蛋白)被用作稳定剂。不像人或动物来源的血清蛋白，根据本发明使用的稳定组合物的氨基酸可以合成产生。因此，可以降低或者避免受到如病毒或朊病毒等病原体污染的风险。

除了对于生物分子的保护效果之外，稳定组合物还被发现具有下述附加作用，即，封闭其上附着有生物分子的固体载体上的自由结合位。

此外，如所附实施例中确认的那样，根据本发明使用的稳定组合物是普遍适用的：其适于保护不同的分子，如抗体(例如IgM、IgG)、酶(例如DNAse)或核酸。

本发明的稳定生物分子的方法还具有下述优点，即，与常规稳定方法不同，其不需要冷冻生物分子。由此可以避免冷冻过程中出现的构想变化。因此，本发明的冷冻方法特别适于不稳定或易变化的生物分子，如抗体，特别是IgM分子的复杂结构。

还惊讶地发现，通过在本发明的稳定组合物中温育如抗体等生物分子，这些生物分子发挥其生物活性的能力(例如在抗体的情况中，为结合其抗原的能力)在通过利用25kGy的辐射灭菌时与未处理的对照组相比可以保留至少65％。

即，使用本发明的稳定组合物，在利用25kGy辐射时，与常规稳定剂(例如公开于US 5,730,9333中的常规稳定剂)相比，可以实现包埋的生物分子保留的功能性的显著增加。

根据本发明使用的组合物优选不含有蛋白或非氨基酸、二肽和/或三肽的蛋白的片段。因此，在本发明的该优选实施方式中，组合物不含有蛋白或由超过三种氨基酸构成的蛋白片段，也不含有人源或动物源的水解蛋白。所述组合物具有下述优点，即，不存在污染其中包埋的生物分子的风险。其还是已知稳定组合物的具有成本效益的替代选择。

在本发明的一个优选实施方式中，稳定组合物包含2～18种不同氨基酸、更优选2～10种、进而更优选2～8种并且最优选2～5种或5～8种不同氨基酸。作为另外一种选择，组合物包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种以上不同氨基酸，如至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种或至少20种不同氨基酸。包含在组合物中的不同种氨基酸的数量优选不超过18。

从所附实施例中显而易见的是，当用于使固定化生物分子稳定时，本发明的组合物在存在两种或三种不同氨基酸时就已能发挥其有益效果。该效果然后会逐渐加强，并在稳定组合物中存在5～8种不同氨基酸时达到最大效果。根据用于测试稳定效果的程序，在存在5种不同氨基酸(例如对于增强的老化)或在存在8种不同氨基酸(例如对于灭菌)时达到最大效果。有益效果不会或者基本不会随着向根据本发明使用的稳定组合物中添加另外的不同的氨基酸而降低，但优选得到保留。因此，包含至少9种、至少10种、至少11种、如至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种或至少20种不同氨基酸的组合物也可以用于使固定化生物分子稳定。

在一个优选实施方式中，组合物包含至少4或至少5种氨基酸。

从实施例中显而易见的是，当包含至少4或至少5种氨基酸时，本发明的组合物对于固定在固体载体上的生物分子的稳定性具有更加有利的作用。根据氨基酸的组合，逆境暴露后保留的生物活性可达87％。

在一个更加优选的实施方式中，组合物包含以下每组中的至少一种氨基酸：(a)具有非极性脂肪族R基团的氨基酸；(b)具有极性不带电荷的R基团的氨基酸；(c)具有带正电荷的R基团的氨基酸；(d)具有带负电荷的R基团的氨基酸；和(e)具有芳香族R基团的氨基酸。

天然氨基酸可以归类于上述特征组中(Nelson D.L.& Cox M.M.，′LehningerBiochemie′(2005)，pp.122-127)，其中从每组中选择至少一种氨基酸用于本发明的组合物。天然氨基酸以外的其他氨基酸，如人造氨基酸等，也可以进行相应分类。尽管本发明的组合物中可以包含上述每组中的超过一种氨基酸，如至少两种或至少三种氨基酸，但是目前优选的是从每组中只选择一种氨基酸。本领域技术人员还会理解，根据本发明使用的组合物中存在的每组的氨基酸数量不必相同。相反，可以选择氨基酸的任何组合，只要每组中的至少一种氨基酸存在即可。

在一个优选实施方式中，组合物在至少两种或至少三种氨基酸的混合物中包含低于1干重％、优选低于0.5干重％的半胱氨酸。这也适用于包含至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种至少9种或至少10种以上不同氨基酸，如至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种或至少20种不同氨基酸的组合物。

由于半胱氨酸中包含SH基团，因此包含半胱氨酸的组合物可以在例如SH基团处发生氧化，引起令人不愉快的气味和/或可能使组合物颜色改变为棕色暗影。为最小化这些不合需要的作用，特别是在将组合物结合医疗装置使用时，应该使组合物中包含的半胱氨酸的量如上所述地降低。然而，即使这些作用不合需要，它们也不会影响包含较高百分比半胱氨酸(相反其导致棕色或发出令人不愉快的气味)的本发明的组合物的适合性。

在一个特别优选的实施方式中，包含在组合物中的氨基酸为丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸。尽管在本发明的某些实施方式中，本发明的组合物包含超过上述5种氨基酸，但在更优选的实施方式中，组合物中不包含除丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸之外的其他氨基酸。

在一个替代性优选实施方式中，组合物中包含的氨基酸为天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸。与上面类似，尽管在本发明的某些实施方式中，本发明的组合物包含超过上述5种氨基酸，但在更优选的实施方式中，组合物中不包含除天冬氨酸酯、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸之外的其他氨基酸。

在另一个优选实施方式中，组合物中包含的氨基酸为脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸；或酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸；或精氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和色氨酸。最后一种氨基酸组合，即精氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和色氨酸，已经显示了其在灭菌、特别是辐射后的性质是特别有利的。所述氨基酸组合显示了未发出任何令人不愉快的气味或在辐射后变色。

同样，尽管在本发明的某些实施方式中，本发明的组合物包含超过5、6或7种氨基酸，但在更优选的实施方式中，组合物中除该优选实施方式中所列组合的氨基酸之外不包含其他氨基酸。

在另一个优选实施方式中，组合物还包含低于1％、更优选低于0.3％的吐温(Tween)、优选吐温80。

吐温是用于聚山梨醇酯的通称，其为在某些药物和食品制剂中所使用的一类乳化剂和表面活性剂。它们通常用于使油性成分溶于水基产品中。聚山梨醇酯是源于被脂肪酸酯化的PEG化山梨聚糖(山梨糖醇的一种衍生物)的油性液体。聚山梨醇酯的实例为聚山梨醇酯20((吐温20或聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)、聚山梨醇酯40(吐温40或聚氧乙烯(20)山梨聚糖单棕榈酸酯)、聚山梨醇酯60(吐温60或聚氧乙烯(20)山梨聚糖单硬脂酸酯)和聚山梨醇酯80(吐温80或聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)。吐温80在本发明所使用的组合物中是最优选的。

在本发明过程中，已经发现，添加低于1％(优选相对于生物分子和氨基酸的干重低于1％)的吐温可避免在处理本发明的液体组合物的过程中发泡。

如上所述，本发明还涉及一种包含至少一种二肽和/或三肽的组合物用于稳定固定在固体载体上的生物分子的应用。适用时，以上给出的定义和如上所述的优选实施方式经过必要变更可应用于本发明的该实施方式。因此，组合物可以由至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种不同二肽和/或三肽构成。示例性二肽为甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln，与单独的谷氨酰胺相比显示了增强的稳定性)、甘氨酰酪氨酸(Gly-Tyr)、丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln，后二种与单独的酪氨酸相比显示了增强的水溶性)和双甘氨肽。其他天然二肽为肌肽((β-丙氨酰-L-组氨酸)、鹅肌肽(β-丙氨酰-N-甲基组氨酸)、高鹅肌肽(N-(4-氨基丁酰)-L-组氨酸)、京都酚(L-酪氨酰-L-精氨酸)、鲸肌肽(Balenine)(或蛇肉肽)(β-丙氨酰-Nτ-甲基组氨酸)、格里肽(Glorin)(N-丙酰-γ-L-谷酰基-L-鸟氨酸-δ-lac乙酯)和巴蒂肽(Barettin)(环-[(6-溴-8-en-色氨酸)-精氨酸])。其他人造二肽为阿斯巴甜(N-L-a-天冬氨酰-L-苯丙氨酸1-甲酯)和伪脯氨酸。示例性三肽为谷胱甘肽(γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸)及其类似物眼晶体酸(L-γ-谷氨酰-L-α-氨基丁酰-甘氨酸)和正眼酸(y-谷氨酰-丙氨酰-甘氨酸)。其他三肽为异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)、甘脯谷肽(Glypromate)(甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸)、促甲状腺素释放激素(TRH、促甲状腺素释放素或普罗瑞林)(L-焦谷氨酰-L-组氨酸基-L-脯氨酰胺)、促黑激素抑制素(脯氨酰-亮氨酰-甘氨酰胺)、亮抑蛋白酶肽(N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰胺)和爱森肽(pGlu-Gln-Ala-OH)。优选的是，用作稳定剂的至少一种三肽、更优选的是所有三肽在联系本发明的医疗应用(参见下文)而使用时不发挥任何药理性质。本发明的该实施方式的组合物优选不含有蛋白或非氨基酸、二肽或三肽的蛋白的片段。因此，在本发明的该优选实施方式中，组合物不含有蛋白或其由超过三种氨基酸构成的片段。相反，该实施方式的组合物优选还包含至少一种氨基酸、优选至少两种、更优选至少三种、进而更优选至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种以上不同氨基酸，如至少十一种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种或至少20种不同氨基酸。

在一个优选实施方式中，根据本发明使用的组合物包含皂苷。

皂苷是一类形成次级代谢物的化合物，其见于天然来源、衍生自天然来源或可化学合成。皂苷在各种植物物种中特别丰富。皂苷是两性苷，其可根据在水性溶液中震荡时产生的皂类泡沫按现象分类，也可以根据其与亲脂性三萜烯衍生物结合的一个以上亲水苷部分的组成按结构分类。皂苷的实例为甘草酸、甘草次酸、葡萄糖醛酸、七叶树皂角素、常春藤苷和毛地黄皂苷。优选的是，用作稳定剂的皂苷在联系本发明的医疗应用(参见下文)而使用时不发挥任何药理性质。

在一个更优选的实施方式中，皂苷包含在包含任意数量不同氨基酸的组合物中(所述氨基酸包含在上述最低数量的氨基酸名单中)，例如所述组合物包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种以上不同氨基酸，例如至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种或至少20种不同氨基酸。

在一个更优选的实施方式中，皂苷为甘草酸(glycyrrhizic acid，亦作：glycyrrhicicacid)，其也称作甘草甜素或甘草甜酸(glycyrrhizinic acid)，或者其衍生物。

甘草酸的衍生物是本领域公知的，包括通过甘草酸在羧基和羟基上的转化、通过将氨基酸残基偶联至糖类部分中或者将2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺引入甘草酸的苷链中而产生的那些衍生物。其他衍生物为甘草酸的酰胺、具有两个氨基酸残基以及游离的30-COOH官能团的甘草酸共轭物和至少一个氨基酸烷基酯在甘草酸分子的糖类部分中的共轭物。具体衍生物的实例可见于例如Kondratenko等的文献(RussianJournal of Bioorganic Chemistry，Vol 30(2)，(2004)，pp.148-153)。

在本发明过程中已经惊讶地发现，与使用仅包含氨基酸的组合物作为稳定剂相比，在向上述组合物中添加甘草酸时，生物分子保留有更多的其生物活性。关于这一点，特别值得注意的是，甘草酸单独对于固定化生物分子并不发挥任何稳定或保护效果。

在另一个优选实施方式中，稳定组合物还包含多元醇、优选糖或糖醇，其选自木糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇或肌醇。

在另一个优选实施方式中，组合物的液体实施方式优选是缓冲的、优选是水性的溶液，但也可以是水或非缓冲的优选水性的盐溶液。除其他因素之外，所使用的缓冲剂取决于所要包被/包埋的生物分子。通常适于与生物分子接触的缓冲剂例如为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、乳酸盐、铵、甘氨酸、巴比妥酸盐、HEPES、MOPS、MES、TRIS。示例性适于抗体的缓冲剂将在下文中进一步描述。

在另一个实施方式中，本发明涉及稳定生物分子或产生被稳定的生物分子的方法，所述方法包含(a)将所述生物分子附着于固体载体，和(b)将所述生物分子包埋在本发明的组合物中。可能的固定方式已在上文描述，并且可以应用于本方法中。优选的是，在步骤b)中，生物分子被部分或完全包被或包埋在组合物中。

包埋的详细程序将在下文中结合生产固体载体的本发明的方法、特别是其步骤(b)但可选的也可以是步骤(c)、(d)和/或(e)进一步描述。

本发明还涉及生产其上附着有生物分子的固体载体的方法，所述方法包含以下步骤

(a)将生物分子附着于固体载体；和

(b)将步骤(a)的载体在本发明所述的组合物中温育。

与生物分子相关的术语“附着”和“固定”已被定义，程序的详细情况在上文中也已进行描述。所述定义和描述可同样适用于本发明的方法和下文所描述的其他实施方式。特别是，如上所述生物分子的附着可以是可逆或不可逆的。

术语“温育”指在使步骤(a)中所述的化合物附着于载体并使步骤(a)的附着于固体载体的生物分子包埋在步骤(b)所述的稳定组合物中的条件下的温育。在该实施方式中，用于温育固体载体的组合物为液体，并优选为水性溶液。组合物最初可以是固体组合物。在该实施方式中，最初的固体组合物被溶解在优选为水性的介质中，由此包含在优选为水性的溶液中。

因此，在生物分子上和/或周围形成了后涂层，其通过减小生物分子可及面和通过联合生物分子三级结构的互补区域，与其他因素一起稳定生物分子。尽管组合物在应用于生物分子时是液体，但是其之后脱水，获得包埋或包被生物分子的固体组合物。在步骤b)中生物分子可以部分或完全包埋在组合物中。技术人员会理解，温育条件需要适合附着在固体载体上的生物分子。

温育条件包括根据步骤和温度将温育进行20分钟～12小时的那些条件。例如，抗体可以在37℃温育1小时，该温度是IgM抗体稳定的最高温度。IgG抗体可以在高达50℃温育。根据步骤和温育时间，温度范围可以为4℃～50℃，优选20℃～37℃。

在一个优选实施方式中，步骤(b)中的温育在室温进行1小时。应当理解，为加速程序或改善结果，温育时间和温度可以根据温育中所使用的物质而改变。技术人员会知道，术语“室温”根据位置和外部温度而意味着不同温度。其通常为17℃～23℃。

优选的是，步骤(b)中的液体组合物经缓冲的并且更优选具有低盐含量。本发明所述的低盐含量被定义为盐浓度为0.9重量％以下，优选低于0.2重量％。通常但并非绝对的是，对于如IgG和IgY抗体等抗体，可以使用偏碱性的缓冲液，例如由15mM碳酸钠和35mM碳酸氢钠水溶液制得(pH 9)，而对于IgM的附着而言，较中性的缓冲剂(pH 7.0～7.4)如PBS等磷酸盐缓冲剂更有利。

作为其上附着有生物分子的固体载体，由步骤(a)获得的固体载体在本发明的上下文中也称作“涂布”载体(“coated”carrier)。

作为与包被和/或包埋所附着生物分子的本发明的组合物温育的固体载体，由步骤(b)获得的固体涂布载体(solid coated carrier)在本发明的上下文中也称作“后涂布”载体(“postcoated”carrier)。

在一个优选实施方式中，该方法还包括步骤(c)：

(c)除去步骤(b)中应用的组合物。

步骤(a)、(b)和(c)以上述顺序进行。

术语“除去”指在步骤(b)后定性或定量地除去液体组合物。因此，之上将组合物除去至下述程度：组合物的残留量不显著改变本发明方法的后续步骤中所使用的溶液的品质。定量除去引起对载体的干燥。所述除去可以例如通过抽吸、浓缩或吹风进行，所述抽吸例如利用可附接移液管的普通泵进行。可选的是，这些步骤可以组合，并可以与空气干燥进一步组合。优选的是，除去至少95体积％的溶液，如至少98体积％或至少99体积％、99.5体积％或99.8％。

因此，在其中进行定量除去的一个更优选的实施方式中，本发明的方法包括步骤(c)：

(c)对固体载体进行干燥。

干燥可以使用如空气干燥、喷雾冷冻干燥(dryinglyophilisation)和沉淀等公知技术进行。其他适合的技术包括晶化和微晶化。当作为载体的是珠粒或纳米颗粒时，干燥可以通过冷冻干燥来进行，不过对于其他载体而言优选其他干燥技术。

在本发明的一个替代性的优选实施方式中，该方法还在步骤(b)之后包括步骤(c)：

(c)对载体进行干燥直至残留液体含量＜20重量％。

根据本发明的该优选实施方式，可以以已知用于确定木材的含水量的方式计算残留的液体含量。对于木材，木材的含水量百分比(x)通过以下方式确定：计算样品中水的质量(m_w)与含水木材样品的质量(m_u)的比率并乘以100。样品中水的质量(m_w)可以通过从含水木材样品质量(m_u)中减去脱水后样品质量来确定。因此，木材的含水量的百分比通过下式计算：

X (%) = \frac{m_{w}}{m_{u}} * 100

载体制备物的残留含水量可以以类似方式确定，其中m_w是载体样品中的水的质量，m_u是样品完全脱水后载体样品的质量。对于海绵状载体，在挤出孔中过量的水后确定m_w。

在本发明的另一个优选实施方式中，该方法还在步骤(a)之后包含步骤(a’)：

(a’)干燥载体直至组合物的残留液体含量低于最初应用的组合物的10％、优选低于5％、更优选低于2％，如低于1％、0.5％或0.2％。优选的干燥方法如上所述，并且也包括用于除去组合物的方法。最优选的是，干燥通过空气干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、沉淀、晶化或微晶化进行。

本发明的方法还可以在步骤(a)之后且在步骤(b)之前且可选的是在步骤(a’)之后包括步骤(a”)：

(a”)在包含封闭剂的缓冲水性溶液中温育载体并除去该水性溶液。

可以在生产固体载体的本方法中使用封闭剂，以防止该方法的后续步骤中添加的材料的非特异性结合。将载体在步骤(b)中于本发明的液体组合物中温育之前，所述封闭对于生物分子的构象稳定性也具有正面作用。

有鉴于此，本发明的组合物可以用作封闭剂。符合本发明的其他封闭剂包含但不限于人血清和所述血清的蛋白(例如白蛋白)、奶、蛋蛋白、植物源蛋白(例如大豆、小麦)，包括所述蛋白的水解产物(例如明胶、胶原)。

在另一个优选实施方式中，本发明的方法在步骤(b)、(c)或(d)之后还包括对固体载体灭菌的步骤(e)。除其他因素之外，对通过本发明的方法生产的固体涂布载体的灭菌能力使得可以在非无菌或半无菌条件下生产固体涂布载体，其中如此生产的载体仍然还可用在涉及固体涂布载体在体内、离体或体外与体液接触的下文所述的本发明的方法中。这代表了本发明的方法和如此生产的载体的另一优异特征，这是因为由于该特征，与生产不可灭菌的载体的成本相比，生产该固体载体的成本可以得到降低。这是因为，在生产工艺中，不要求无菌条件。公知的是，常规制备的载体不适于灭菌，必需在完全无菌的条件下生产。此外，有利于成本的特征在于，所述载体可以在其使用后通过灭菌回收。回收的载体可以随后用于同一患者或不同患者的进一步治疗或者用于另一诊断方法或同一诊断方法。

优选的是，载体的灭菌或回收根据载体材料通过环氧乙烷(EO)、β-辐射、γ-辐射、X-射线、热灭活、高压灭菌或等离子灭菌进行。最优选的是，载体通过β-辐射或γ-辐射灭菌。在该实施方式中适当的是利用10MeV电子加速器的剂量为25千格雷(kgray)的β-辐射。在一定程度上，可将利用环氧乙烷的灭菌应用于本发明的载体。通常，必须选择灭菌的方法，以不伤害附着于/固定在固体载体上的生物材料的所需活性。这可以通过上述生物分子进行，所述生物分子可以是分离形式、彼此结合或与其他生物分子结合的形式、或者存在于如细胞或细胞的片段等更高级结构上。对于任何种类的活细胞而言，目前还不知道适当的灭菌方式。因此，将活细胞用作生物材料并对载体灭菌的实施方式不是本发明的一部分。

在步骤(b)、(c)、(d)或(e)之后，载体可以存储到需要使用时。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种可通过或者通过本发明的方法生产的固体载体。

在另一实施方式中，本发明涉及一种其上附着有生物分子的固体载体，其中所述生物分子部分或完全由本发明的组合物包被或包埋于本发明的组合物中。包含包埋的生物分子的所述固体载体(也称作“后涂布载体”)的一个实施方式示例性地显示在图1的示意图所示截面中。

根据本发明，术语“部分包被”或“部分包埋”优选表示至少20％、优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、更优选至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的生物分子被包被或包埋在本发明的组合物中。

除其他因素外，关于本发明的组合物和涉及生物分子、载体材料附着和温育程序或灭菌的本发明的方法而给出的定义和说明经过必要变更适用于本发明的固体载体。同样，本发明的固体载体的特别优异的特征已在以上表征本发明的方法的上下文中进行了描述。

根据本发明的固体后涂布载体的优选实施方式，附着于固体载体的生物分子例如为如上所述的蛋白、肽、核酸、糖类、脂质、脂肪酸、多元醇及其组合或修饰物。蛋白优选为抗体，更优选为IgG、IgY或IgM类抗体。其他优选蛋白为除抗体之外的细胞因子、蛋白激动剂或拮抗剂，例如酶、生长因子、白蛋白或球蛋白、受体、激素、膜蛋白、白蛋白、球蛋白、转运蛋白或凝血因子。

在另一个更优选的实施方式中，生物分子特异性地结合于指示疾病的标志物蛋白、病原体、优选非细胞病原体、细胞或毒素。

本发明的术语“特异性地结合”可与“与......特异性地相互作用”互换使用，是指生物分子不与或基本不与除病原体或指示疾病的标志物蛋白以外的其他结构或表位交叉反应。该实施方式的优选的生物分子是如上所述的抗体。所研究的一组抗体的交叉反应性可以例如通过评估该组抗体在常规条件下与所关注的结构/表位以及与(结构上和/或功能上)密切相关性较大或较小的结构/表位的结合而测试。只有与在其相关环境中结合所关注的结构/表位(例如指示疾病的蛋白的结构中的特定基序)但不或者基本不与任何其他结构/表位结合的那些抗体才被认为对于所关注的结构/表位具有特异性，由此成为根据本发明使用的抗体。例如Harlow和Lane(1988和1999，出处同上)描述了相应方法。

存在标志物蛋白的疾病的实例包括各种原因的严重高脂血症、纯合子家族性高胆固醇血症、杂合子家族性高胆固醇血症、缺陷性Apo B-100、分离的脂蛋白(a)升高、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征、混合性结缔组织病、扩张型心肌病(DCM)、与凝血因子的抑制剂关联的疾病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性溶血性贫血、高丙种球蛋白血症中的高粘滞综合征、重症肌无力、格林-巴利综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、异常蛋白血症多神经病、骨髓移植、内分泌眼病、I型糖尿病(IDDM)、肺出血肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、免疫球蛋白或免疫复合物沉积引起的肾病、冷球蛋白血症、天疱疮、特应性皮炎、移植物抗宿主(GvH)疾病、宿主抗移植物(HvG)疾病和各种形式的血管炎。

用于特定疾病的已知的标志物蛋白例如为降钙素原、细胞因子，如TNFα或IL6，和c-反应蛋白。

生物分子可结合的病原体包括引起传染病的那些病原体，如细菌或真菌等。引起传染病的非细胞病原体包括病毒和朊病毒。

所述病原体的实例为HIV、HBV、HCV、疱疹病毒，如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘带状疱疹病毒、革兰氏阳性菌(如链球菌、葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、绿脓杆菌)。

毒素也可以指示疾病或身体的某种状态。毒素时有毒物质，优选通过活细胞或生物体产生。毒素可以是例如这样的小分子、肽或蛋白：其能够在与身体组织接触或被其吸收时通过与如酶或细胞受体等生物大分子相互作用而引起疾病。毒素的严重性有很大差异，从通常很微小和很急剧的程度(如蜂蜇)至几乎立即致死的程度(如肉毒杆菌毒素)。

在本发明的另一个优选实施方式中，固体后涂布载体通过例如β-或γ-辐射来如上所述地灭菌，以用于本发明的应用和方法。适当的是利用10meV电子加速器的剂量为25kGy的β-辐射。

本发明的固体载体可用于治疗和诊断。

本发明的另一方面涉及本发明的组合物用于稳定其上附着有生物分子的固体载体以便长期存储和/或灭菌的应用。

生物分子的长期存储和灭菌的主要挑战是避免具有所需生物活性的生物分子的不可逆改变。这些变化可导致对生物分子的分子修饰，所述修饰在生物分子经受逆境时出现，还可导致所述生物分子的所需生物活性的损失，导致其存储稳定性降低，或导致新免疫/抗原性质，所述新免疫/抗原性质可使所述产物的接受者在施用或应用时有过敏性反应的风险。这对于具有复杂结构和/或非常不稳定的蛋白特别重要，所述蛋白例如为许多治疗性蛋白和单克隆抗体。

研究者已经尝试在使用环氧乙烷的灭菌过程中避免活性化合物发生不可逆改变。然而，环氧乙烷通常与蛋白反应。另外，由于已知的组织毒性和环氧乙烷的副产物的致癌潜力，食品药品管理局已经设定了环氧乙烷及其主要反应产物乙二醇和2-氯乙醇(ethylene chlorhydrin)的残留上限。本发明的一个优点在于，生物分子受本发明的组合物保护，使得灭菌也可以使用环氧乙烷进行。

与环氧乙烷不同，辐射灭菌具有高穿透能力、较低化学反应性和即时作用的优点，且无需控制温度、压力、真空度或湿度。辐射灭菌广泛用于许多产品行业，其剂量水平及其生物作用是公知的。通常公认电子束和伽马灭菌在杀灭微生物方面是等效的。

虽然足以有效杀灭微生物，但辐射通常会改变如蛋白、DNA、RNA等生物分子的结构，从而使其在未受保护或不稳定的情况下失去生物活性。因此，迫切需要有效和安全地对生物活性化合物灭菌而不有害地影响其化学、物理或生理性质的简单方法。根据本发明已经实现了这种方法。

向医疗市场引入新型或修改的产品需要确保它们可以存储更长时间(一至五年)，并且不会在使用产品时降低性能并影响安全性和有效性。由于这种产品通常不存在完整周期的环境老化样品，因此通常需要进行“加速老化”试验，以在可获得完整周期样品之前提供支持这些产品所要求保护的性能和储存寿命的实验数据。

在医疗装置的质量测试中使用加速老化技术的主要原因是为了在尽可能最早的时间将产品投入市场。目标是既利于患者(例如通过尽早获得寿命延长的装置)，也利于公司(产生额外的销售和市场份额)，而不使其暴露于任何不合理的风险。

加速老化可以被定义为寻求确定在正常使用条件下于相当长时间内装置或材料的反应，其方式是使产品在短得多的时间经受比正常环境或运作逆境更严苛或更频繁应用的逆境。试验方案效率的显著增强可以通过利用过度的环境逆境，如热、氧、化学品或辐射等实现。

一种加速老化的简化方法是基于下述测试，先在单增加温度下测试，然后应用下述规则，所述规则表述温度每增加10℃，化学反应的速率将提高Q₁₀倍。为常用医疗聚合物选择的典型的关系是Q₁₀＝2；即，在使用或存储温度之上温度每升高10℃反应速率增加一倍。

为获得用于诊断或治疗的生物分子的足够的储藏寿命，需要将这些生物分子冷冻以防止其变性(Cleland等，(2001)，Journal of Pharmaceutical Sciences第90卷，第310-321页)。此外，所关注的生物分子必须在含有如糖(例如蔗糖、海藻糖、甘露醇)或盐等所谓冻干保护剂的稳定溶液中温育。然而，由于存在生物分子受冷冻而变性的风险，需要在4℃或室温的存储方法，对于不稳定的生物分子如IgM抗体尤其如此。

令人惊讶的是，发现了通过在本发明的稳定组合物中温育生物分子，例如固定在固体载体上的抗体，这些生物分子可以在45℃存储7天而不显著丧失其生物活性。根据之前所述的规则，该“加速老化”相当于在5℃存储16周。此外，生物分子可以被灭菌，而不显著丧失其生物活性(参见所附实施例)。

在另一个实施方式中，本发明涉及包含本发明的载体的医疗和诊断产品和装置。

在另一个替代性实施方式中，本发明提供了本发明的固体载体在制备医疗或诊断产品和/或装置中的应用。所述装置是包含根据本发明而被稳定的生物分子的生物组分和非生物部分的组合，并且也被称作生物装置组合产品。

包埋在本发明的稳定组合物中或被其包被的其上附着有生物分子的固体载体可以用在许多诊断和医疗/治疗应用中。治疗应用或装置包括医疗植入物、导管、支架、管(它们可单独或与其他组件组合使用)、一旦被如体液等液体润湿则能够洗脱所附生物分子的基体，例如伤口绷带、或体外循环中所使用的医疗装置。诊断应用包括例如免疫测定，如ELISA(酶联免疫吸附测定)、蛋白芯片、多分析物测定、蛋白质印迹、斑点杂交、免疫组织化学、受体-配体测定和免疫-PCR。

治疗途径可以包含在使用医疗装置情况下本发明的载体的体内和离体应用。因此，包含固体后涂布载体的装置可以植入患者以用于体内应用。对于离体应用，包含固体涂布载体的装置可以与待处理的体液的循环相连。来自患者动脉或静脉的血可以例如通过所述装置传导，并随后泵回患者体内(与血流相连)。作为另外一种选择，可以将体液的样品与载体在体外温育。在后一种处理的后续步骤中，体液可以被再次引入患者体内。

医疗装置的一个实施方式适于例如通过将装置与患者的体液循环相连而能够接触、过滤或清洁患者体液(例如血、淋巴或脑脊髓液等)，由此如本说明书中上文所述地治疗患者。

此外，器件可以适于化合物的定性或定量检测，以及适用于在患者的体液样品中捕集某些细胞或细胞群，例如干细胞、胎细胞或肿瘤细胞，亦如本说明书下面部分中所描述。干细胞包含多能性干细胞(pluripotent stem cell)、多潜能干细胞(multipotentstem cell)或全能性干细胞(totipotent stem cell)。通常，不同细胞株、不同细胞种或细胞的不同发育阶段可以通过在细胞表面上不同抗原的存在来区分。这使得能够通过选择附着于本发明载体的生物分子如抗体或其片段等来选择性捕集所需细胞，其中所述生物分子特异性地结合于所述抗原中的一种。在捕集胎细胞的情况下，本发明的装置的应用避免了如羊膜穿刺等潜在危险技术，在本发明装置的应用中，由母亲获得的血液样品被用于捕集胎细胞而不会危及胎儿性命。此外，通过提供富含肿瘤细胞的样品，可以促进癌变疾病的诊断及其表征。

在整个本发明中所使用的术语“患者”包含患病对象和健康对象。本发明的患者是接受医疗关注、护理或治疗的任何人。该人经常但不始终患病或受伤，如果患病或受伤，则需要医师或其他医疗专业人员的治疗。在另一些情况中，术语“患者”可与“对象”互换使用，“对象”可以患病或不患病。对象可以是动物，优选哺乳动物，最优选人。根据上述内容，患者也可以是例如紧急或例行地诊断疾病或健康状况的健康人。在另一些部分中，本发明还用于查出患者是否患有某种疾病(或者疾病组合)、倾向于发展成所述疾病或疾病组合。

装置的一个实施方式包括临时或永久植入物，其特征在于表面至少部分地对应于本发明的固体涂布载体，或者附着有本发明的固体涂布载体。

这包括用于重建性外科手术的接骨装置、材料以及新类型的支架。所述新型种类的支架可以具有催化特征(例如，刺激性、抑制性或消除性特征)。关于这一点，示例性刺激性特征可以是交联细胞表面上的受体并可活化细胞如白细胞的结合载体的抗体或其片段。示例性抑制性特征是结合于细胞表面上的受体并可通过诱导失活信号(例如影响白细胞)或通过阻止活化分子结合而使细胞失活的结合载体的抗体或其片段。消除性特征的实例是可以结合可溶性因子并由此降低其在溶液中的浓度(例如耗尽所述因子)的结合载体的抗体或其片段(例如Ig-Therasorb或LDL-Therasorb)。

此外，医疗或诊断装置的另一些替代性实施方式是其内壁为本发明的固体涂布载体的装置或者内壁附着本发明的固体涂布载体的装置。所述装置包括但不限于离体接种容器、分离单采装置(apheresis device)、干细胞分离装置、清洗装置、注射器和临时或永久血液存储用装置(例如，用于血库中，但也可以用于常规研究实验室中的实验设备中)。诊断(医疗)装置的一个实例是ELISA板，其中所述板的表面(或至少其反应壁)至少部分地对应于本发明的固体涂布载体，或者附着有本发明的固体涂布载体。

本发明还涉及经灭菌容器，其包含载体、可逆地附着于所述载体的至少一种生物分子、部分或完全包被所附着的生物分子的本发明的稳定组合物；和可选的盖子。

可附着于载体的生物分子已在上文中有所描述。

在优选实施方式中，至少一种生物分子以其可以迅速地从载体上释放的方式附着于载体，优选可在使用前立即释放。取决于附着的种类(共价或非共价)，迅速释放可以例如通过蛋白酶切、pH值变化或温度变化而实现。

在优选实施方式中，载体为固体，更优选是多孔的。在另一个优选实施方式中，载体是半固体，并优选包含水凝胶或凝胶性蛋白混合物。在又一个优选实施方式中，载体是可溶性的并优选包含溶解在水性、可选的是缓冲的溶液中的蛋白和/或糖类结构物。

本发明还涉及生产生物分子的经灭菌的容器的方法，其包括：(a)向容器中插入载体；(b)将至少一种生物分子可逆地附着于所述载体；(c)在本发明的液体稳定组合物中温育带有所述至少一种可逆地附着的生物分子的该载体，从而使所述至少一种生物分子部分或完全地被所述稳定组合物包被；(d)密封该容器；和(e)对该容器灭菌。

在替代性实施方式中，本发明涉及生产生物分子的经灭菌的容器的方法，其包括：(a)将至少一种生物分子可逆地附着于载体，(b)将带有至少一种附着的生物分子的该载体插入容器中，(c)在本发明的液体稳定组合物中温育带有至少一种可逆地附着的生物分子的所述载体，从而使所述至少一种生物分子部分或完全被所述稳定组合物包被，(d)密封该容器；和(e)对该容器灭菌。

在另一个替代性实施方式中，本发明涉及生产生物分子的灭菌的容器的方法，其包括：(a)将至少一种生物分子可逆地附着于载体，(c)在本发明的液体稳定组合物中温育带有至少一种可逆地附着的生物分子的该载体，从而使是至少一种生物分子部分或完全被所述稳定组合物包被，(c)将所述带有至少一种可逆地附着的生物分子的该载体插入容器中，(d)密封该容器；和(e)对该容器灭菌。

上述方法还可以包括在如上所述的温育后干燥或除去组合物的液体部分的步骤。

在一个不同的实施方式中，本发明涉及一种通过本发明的方法生产的容器。

此外，本发明涉及本发明的容器用于如上所述的诊断或治疗中的应用。

在另一实施方式中，本发明提供了诊断疾病的方法，所述方法包含以下步骤：

(a)在适当条件下将获自患者的样品与本发明的固体载体接触，以使附着于特异性地结合指示疾病的标志物蛋白、优选非细胞病原体、细胞或毒素的载体的生物分子与所述病原体或标志物蛋白或细胞或毒素特异性地结合；和

(b)检测所述指示疾病的标志物蛋白、所述优选非细胞病原体、所述细胞或所述毒素是否已与生物分子结合。

样品包括体液或身体流体，如血液、血浆、血清、唾液、尿、支气管肺泡流体、胃肠分泌液、脑脊液、腹水、胸腔积液、伤口渗出液。

使附着于特异性地结合病原体或指示疾病的标志物蛋白的载体的生物分子与所述病原体或标志物蛋白特异性地结合的适当条件包括pH值为7.0～7.7，并且摩尔渗透压浓度为200mosmol/l～400mosmol/l。

上面已经描述了优选的生物分子。特别优选的生物分子包括膜结合的细胞内生物分子，如受体和可溶性生物分子或者受体或其功能片段。膜结合生物分子的优选功能性片段含有所述生物分子的细胞内或细胞外部分，由此省略了其跨膜的部分。优选的是，生物分子或受体是抗体或者如上所述的保留抗体结合活性和特异性的其片段或衍生物。最优选的是，抗体是单克隆抗体。

利用本发明的诊断方法诊断的疾病的实例包括本说明书上文中所述的疾病。所述病原体或标志物蛋白可以例如通过使用抗体如anti-p24(HIV)(参见例如Schupbach等，J.Aquir.Immune Defic.Syndr.(2005)，第40卷，第250-256页)或anti-IgB(HCMV)(参见例如Just-Nubling G.等，Infection(2003)，318-323)来检测。

病原体或指示疾病的标志物蛋白与所附着抗体特异性结合的适当条件可以通过以下方式实现：在生理条件下将患者体液样品与本发明的抗体包被的固体载体接触。生理条件包括pH值为7.0～7.7，并且摩尔渗透压浓度为200mosmol/l～400mosmol/l。

对病原体或指示疾病的标志物蛋白是否已结合于生物分子的检测可以通过本领域公知的和如上所述的方法来进行。示例性方法包含ELISA和免疫沉淀。

在优选实施方式中，本发明的诊断方法包含下述步骤，即，在细胞培养条件下温育体液样品的材料，以在将该样品与本发明的载体接触(步骤(a))之前使其富含非细胞病原体(如病毒)、细胞(如细菌)或单细胞真核病原体。细胞培养条件包括在25℃～40℃的培养基中pH值为7.0～7.7，并且摩尔渗透压浓度为200mosmol/l～400mosmol/l。

此外，本发明提供了一种诊断组合物，所述诊断组合物包含根据本发明后涂布的固体涂布载体。本发明的诊断组合物将优选用于利用上位对于检测标志物蛋白、优选非细胞病原体、细胞和毒素描述的方法来诊断疾病。

利用本发明的诊断组合物诊断的疾病的实例已描述于本说明书的上文中。

本发明还涉及用于使固定化生物分子稳定的试剂盒。本发明的试剂盒包括(a)本发明的至少一种稳定组合物和(b)用于将固定化生物分子与有效量的所述至少一种稳定组合物接触以产生被稳定的生物分子组合物的说明书。

在优选实施方式中，稳定组分包括一种以上固体材料(例如，现有技术中已知的冻干或粉末试剂或其他化合物)。

试剂盒的各组分可以包装在一个或多个容器中，如包装在一个或多个小瓶中。除所述组分之外，小瓶还可以包含用于储存的防腐剂或缓冲剂。

附图说明

图1：生物分子(例如抗体)附着于固体载体，其优选使用隔离体分子和连接体分子附着。抗体被后涂布溶液包埋，由此保护其免受如辐射等逆境影响。

图2和图3：氨基酸后涂层的保护效果随所使用的不同氨基酸的数量而增加(与氨基酸无关)。选择以下各组的代表作为所述氨基酸：具有芳香性的/带正电荷的/带负电荷的/极性不带电荷的/非极性脂肪族侧链的氨基酸。

由5种不同氨基酸组成的后涂层在利用25kGy辐射后，与未辐射的对照组相比，约65％的抗原结合能力得到保留；在加速老化程序(在45℃持续7天)后，与未处理的对照组相比，约85％的抗原结合能力得到保留。

图4和图5：将氨基酸数量增加到超过5不能进一步增强氨基酸后涂层的保护效果。与未处理的对照组相比，利用25kGy辐射后，对于含有超过5种氨基酸的所有后涂层而言，有约70％的抗原结合能力得到保留；加速老化(在45℃持续7天)后，有约85％的抗原结合能力得到保留。

图6和图7：相对于未灭菌的对照组，氨基酸的组合分别显示了65％(4种氨基酸)和85％(8种氨基酸)的保护效果，而单种氨基酸的平均作用分别为22％(4种氨基酸)和33％(8种氨基酸)的抗原结合能力。单种氨基酸的最大效果分别为28％(4种氨基酸)和55％(8种氨基酸)。

图8：向氨基酸后涂层添加1mM甘草酸可将所有后涂层的保护效果增加至70％～80％的最大值(与未辐射对照组相比的抗原结合能力)。

图9：与未处理的对照组相比，由五种不同氨基酸(200mM)和1mM甘草酸组成的氨基酸后涂层在辐射(25kGy)后和在加速老化程序后对抗原结合能力分别显示了80％和85％的保护效果。由白蛋白和甘露醇组成的后涂层在辐射(25kGy)后显示了仅65％的保留活性。经过在45℃持续7天的加速老化之后，白蛋白和甘露醇几乎未保留活性，这与不具有任何后涂层的对照组相似。

图10：使用18种氨基酸的混合物来封闭对ELISA板的非特异性结合，而且不抑制特异性抗原-抗体相互作用。封闭效率与标准白蛋白封闭液相当。

图11：辐射(25kGy)后，由18种不同氨基酸(20g/l)和0.25mM甘草酸组成的氨基酸后涂层与未处理的对照组相比显示了为83％DNAse活性的保护效果。由白蛋白和甘露醇组成的后涂层在辐射(25kGy)后显示了95％的保留活性。

图12：与未处理的对照组相比，由18种不同氨基酸(在PBS中20g/l的溶液)组成的氨基酸后涂层在辐射(25kGy)后和在加速老化程序后分别显示了85％和90％的抗原结合能力的保护效果。与未处理的对照组相比，向氨基酸后涂层中添加1mM甘草酸在辐射(25kGy)后和加速老化程序后，保护效果分别为92％和95％的抗原结合能力。

图13：由18种不同氨基酸(在PBS中20g/l的溶液)组成的氨基酸后涂层显示了55％～60％的保护效果。在没有后涂层的情况下，完整ds-DNA的量降低至20％，通过白蛋白和甘露醇可有85％得到保留。

图14：用于保护抗肝炎抗体的氨基酸组合物在冻干和灭菌后的抗甲型肝炎测试(功能ELISA)。

图15：皂苷的结构类型具有增强氨基酸组合的保护效果的能力。

图16：在采用50kGy β辐射时，至少3种氨基酸的组合和2种氨基酸与附加的甘草酸(GA)的组合提供了对固定化抗体的最大保护。

图17：氨基酸组合物在不同逆境条件下提供保护。对于不同剂量的β-辐射和升温下的人工老化，提供了最佳保护。对于γ-辐射或环氧乙烷灭菌的保护较小，但仍具相关性。

图18和图19：含有至少5种氨基酸的氨基酸后涂层在长期存储过程中提供保护。对于非灭菌样品而言，在45℃持续62天后约80％抗原结合能力得到保留。灭菌样品(β，25kGy)在45℃持续62天后保留其抗原结合能力的约70％。不考虑灭菌，在存储过程中，含有仅2种氨基酸的氨基酸后涂层仅保留有约40％的抗原结合能力。无后涂层的则仅保留了20％～30％的活性。

图20和图21：向后涂层溶液中添加1mM甘草酸可增强保护效果。含有至少5种氨基酸和甘草酸的氨基酸后涂层在长期存储过程中提供保护。对于非灭菌样品而言，在45℃持续62天后约90％抗原结合能力得到保留。灭菌样品(β，25kGy)在45℃持续62天后保留其抗原结合能力的约80％。不考虑灭菌，在存储过程中，含有2种氨基酸和甘草酸的氨基酸后涂层保留有约70％的抗原结合能力。无后涂层的则仅保留了20％～30％的活性。

图22：在使用含有18种氨基酸的氨基酸后涂层保护时，以γ-辐射灭菌的样品保留约85％活性；该效果不会被甘草酸进一步增强；使用5种氨基酸时保留活性为75％；使用2种氨基酸时仅保留40％。添加甘草酸改善了使用2种氨基酸的保护，此处其保留的活性为65％。当使用含有18种氨基酸的氨基酸后涂层保护时，使用ETO灭菌的样品保留约85％的活性；此效果不会被甘草酸进一步增强。含有5种或2种氨基酸的后涂层仅具有很小的保护效果；添加甘草酸可以边际性地增强保护。

图23：氨基酸、二肽或其混合物组成的氨基酸后涂层，可选含有甘草酸。

图24

显示了一个实例，其中小瓶自身是载体。首先，通过干燥使生物分子附着于载体。然后，添加稳定剂溶液并再干燥。若不添加稳定剂，则在后续的灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为白介素8＝IL8)将失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。显示的是IL8对于人嗜中性粒细胞的趋化活性。

图25

显示了一个实例，其中小瓶自身是载体。首先，通过干燥使生物分子附着于载体。然后，添加稳定剂溶液并再干燥。若不添加稳定剂，则在加速存储(45℃)过程中生物分子(此处为白介素8＝IL8)将失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。显示的是IL8对于人嗜中性粒细胞的趋化活性。

图26

显示了一个实例，其中小瓶自身是载体。首先，通过干燥使生物分子附着于载体。然后，添加稳定剂溶液并再干燥。若不添加稳定剂，则在后续的灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为ds-DNA)将失去其部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。显示的是以占初始值的百分比表示的可检测的DNA量。

图27

显示了一个实例，其中稳定剂自身是载体。添加生物分子和稳定剂溶液并一起干燥。若不添加稳定剂，则在后续的灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为白介素8＝IL8)将失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。显示的是IL8对于人嗜中性粒细胞的趋化活性。

图28

显示了一个实例，其中稳定剂自身是载体。添加生物分子和稳定剂溶液并一起干燥。若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)将失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。显示的是与抗原的特异性结合。

图29

不同解吸液对于生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)的生物活性的影响。除0.5MH₂SO₄外，本实验中测试的其他解吸液对于生物分子的生物活性没有显著影响。显示的是与抗原的特异性结合。

图30

在将生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)附着于开孔聚氨酯泡沫(supplier A，大孔)后测试生物分子的解吸。虽然pH 4.75的柠檬酸盐缓冲剂和1M NaCl仅解吸少量生物分子，但1M NaCl+0.02M咪唑和磷酸盐缓冲盐水分别可以解吸明显更多的生物分子。显示的是与抗原的特异性结合。

图31

在将生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)附着于开孔聚氨酯泡沫(supplier B，较小孔)后测试生物分子的解吸。pH 4.75的柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲盐水解吸得比含有或不含有0.02M咪唑的1M NaCl强少许。显示的是与抗原的特异性结合。

图32

在将生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)附着于开孔聚氨酯泡沫(supplierSmith&Nephews，小孔)后测试生物分子的解吸。若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)将失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。抗体的回收几乎为100％(5μg/ml)。显示的是与抗原的特异性结合。

图33

在使生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)附着于PVA-水凝胶之后测试生物分子的解吸。若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子将失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。洗脱的抗体的回收率非常高。显示的是与抗原的特异性结合。

图34

可切割的连接体的实例的化学结构。

所述实例说明了本发明。

材料和方法

所有实验都基于相同基本ELISA测定设计。

LO-MM-3对ELISA板的吸附和后涂层的应用

使单克隆抗体LO-MM-3(anti-mouse-IgM，Acris，SM1495P)吸附在96孔ELISA板(Greiner Bio-one，655061)的表面上。将LO-MM-3在PBS(无Ca²⁺/Mg²⁺，PAA，H15-002)中稀释至浓度为2μg/ml。向各孔中移入100μl抗体溶液并在5℃温育过夜。使用洗涤缓冲剂(25倍浓缩液，Invitrogen，WB02)洗涤该板2次。

在各孔中移入200μl各测定的稳定组合物(后涂布)。利用相同的后涂布同样地处理至少4个孔，以在后续的分析中计算平均值和标准差。在环境温度将该板与后涂布液温育1小时。弃掉后涂布液，并在环境温度干燥该板至少1小时。

用于后涂层的氨基酸为：L-丙氨酸(Sigma-Aldrich，A7627)、L-精氨酸(Sigma-Aldrich，A5131)、L-天冬酰胺(Sigma-Aldrich，A0884)、L-天冬氨酸盐(Sigma-Aldrich，A9256)、L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich，1276)、L-谷氨酰胺(AppliChem，A1420)、L-谷氨酸盐(Sigma-Aldrich，G1251)、甘氨酸(Merck，1042010)、L-组氨酸(Sigma-Aldrich，H8125)、L-异亮氨酸(Sigma-Aldrich，I2752)、L-亮氨酸(Sigma-Aldrich，L8000)、L-赖氨酸(Sigma-Aldrich，L5626)、L-甲硫氨酸(Sigma-Aldrich，M9625)、L-苯丙氨酸(Sigma-Aldrich，P2126)、L-脯氨酸(Sigma-Aldrich，P0380)、L-丝氨酸(Sigma-Aldrich，S4500)、L-苏氨酸(Sigma-Aldrich，T8625)、L-色氨酸(Sigma-Aldrich，T0254)、L-酪氨酸(Sigma-Aldrich，T3754)、L-缬氨酸(Sigma-Aldrich，V0500)。

经涂布表面的逆境暴露

将三块相同处理的板暴露于不同环境条件。一块板通过辐射灭菌(β，25kGy)。辐射在Beta-Gamma-Service(德国Bruchsal)进行。一块板通过加速老化程序(在45℃持续7天)处理。根据简化的阿雷尼乌斯方程(Arrhenius equation)，假定存储温度每升高10℃，反应(即，老化)速度变为两倍(Hemmerich，1998：General Aging Theory andSimplified Protocol for Accelerated Aging of Medical Devices)。这意味着，在45℃持续7天的加速老化相当于冷却存储(5℃)16周的实际时间老化。

使用未进行逆境暴露的同样的板充当各个实验中的对照组。保护效果被计算为逆境条件后保留的抗体功能与未处理的对照组之比。

LO-MM-3功能的ELISA检测

通过洗涤板3次来从孔中除去干燥的后涂层。在各孔中移入300μl封闭液(在PBS中的10g/l的白蛋白溶液)并在环境温度温育1小时，从而封闭ELISA板。洗涤该板3次。

将LO-MM-3、CH11(小鼠IgM，MBL，SY001)的抗原稀释至125ng/ml，并将200μl抗原溶液移入各孔中。在环境温度温育该板1小时并洗涤3次。

通过以PBS稀释至50ng/ml的检测抗体LO-MM-9(生物素化的抗小鼠IgM，AbDserotec，MCA199B)检测结合的抗原。向各孔中添加200μl，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。

使用PBS将链亲和素(辣根过氧物酶(HRP)标记，Pierce，21126)稀释至100ng/ml。向各孔中添加200μl，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。

将HRP用即用型ELISA底物溶液(TMB＝四甲基联苯胺，Invitrogen，00-2023)用蒸馏水以1∶2比例稀释，并向各孔移入200μl。在该板环境温度避光温育20分钟。为停止显色反应，向各孔添加50μl H₂SO₄(使用蒸馏水以1∶5稀释，Merck，1007311000)。通过测量在波长为450nm处的吸收检测所获得的黄色(FusionPhotometer A153601，PerkinElmer)。

实施例1：由至少5种氨基酸组成的后涂层显示抵抗逆境的最大保护。

实验：

将氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck，106482)或0.5M HCl(Merck，100319)中以获得具有最高浓度的储液。将氨基酸储液混合在一起以使后涂布液中总氨基酸浓度达到200mM。这些氨基酸以等摩尔比例使用(2种氨基酸：2x 100mM；3种氨基酸：3x 67mM：4种氨基酸：4x 50mM；5x40mM；等等)。

将氨基酸混合物的pH设为约7.0；并将混合物进一步在PBS中稀释，以使最终浓度为200mM。

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对板的吸附和后涂层的应用；灭菌和加速老化；以及一般性ELISA程序。

结果：

如图2和图3中所示，氨基酸后涂层的保护效果随所使用的不同种氨基酸的数量而增加。选择以下各组的代表作为所述氨基酸：具有芳香性的/带正电荷的/带负电荷的/极性不带电荷的/非极性脂肪族侧链的氨基酸。并非必须使用特定氨基酸；它们可以分别由来自同一组或具有相似特性的不同氨基酸取代(Taylor，1985：TheClassification of Amino Acid Conservation)。

由5种不同氨基酸组成的后涂层在利用25kGy辐射后，与未辐射的对照组相比，约65％的抗原结合能力得到保留(图1)；在加速老化程序(在45℃持续7天)后，与未处理的对照组相比，约85％的抗原结合能力得到保留(图2)。

将氨基酸数量增加到超过5不能进一步增强氨基酸后保护层的保护效果。如图4和图5所示，含有8、10或者甚至18种氨基酸的后涂层具有实际上相同的效果。

实施例2：氨基酸的组合揭示了保护效果并不是由于特定的一种氨基酸。

实验：

将氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck，106482)或0.5M HCl(Merck，100319)中以获得具有最高浓度的储液。将氨基酸储液混合在一起以使后涂布液中总氨基酸浓度达到200mM。氨基酸以等摩尔比例来使用(4种氨基酸：4x 50mM；8种氨基酸：8x 25mM)。对于单种的氨基酸溶液，将氨基酸以最大溶解浓度(可能的话为400mM)溶于蒸馏水。将所有后涂布液的pH调为约7.0。单种的氨基酸的浓度为：Ala 400mM，Glu 100mM，Lys 400mM，Thr 400mM，Asn 200mM，Asp 100mM，His 300mM，Pro 400mM，Ser 400mM，Trp 60mM，Val 400mM。

结果：

从图6和图7中可以看出，氨基酸混合物的保护效果不能归因于混合物中的某一种氨基酸的保护效果。

相对于未灭菌的对照组，氨基酸的组合显示了65％(4种氨基酸)和85％(8种氨基酸)的保护效果，而这些混合物中的单种的氨基酸的平均效果为22％(4种氨基酸)和33％(8种氨基酸)的抗原结合能力。单种氨基酸的最大效果为28％(4种氨基酸)和55％(8种氨基酸)。

实施例3：向溶液中添加甘草酸可进一步提高氨基酸后涂层的保护效果。

实验：

将氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck，106482)或0.5M HCl(Merck，100319)中以获得具有最高浓度的储液。将氨基酸储液混合在一起以使后涂布液中总氨基酸浓度达到200mM。这些氨基酸以等摩尔比例使用(2种氨基酸：2x 100mM；3种氨基酸：3x 67mM：4种氨基酸：4x 50mM；等等)。

将甘草酸(铵盐，Fluka，50531)溶解在50％的乙醇(无水，Sigma-Aldrich，32205)中以获得25mM的储液。将甘草酸在后涂布液中以1∶25稀释，从而得到1mM的浓度。

将氨基酸混合物的pH设为约7.0；并将混合物进一步在PBS中稀释，以使最终氨基酸浓度为200mM。

结果：

如图8所示，向不同的氨基酸后涂层添加甘草酸可将所有后涂层的保护效果增加至75％～80％的最大值(与未辐射对照组相比的抗原结合能力)。甘草酸单独作为后涂层不具有保护效果。

实施例4：氨基酸后涂层提供了抵抗逆境条件的保护，该保护至少与含有如白蛋白和甘露醇等常规保护物质的后涂层的保护相当。

实验：

如实施例3中所述制备氨基酸后涂层。分别以在PBS中稀释至20g/l和10g/l的浓度使用人白蛋白和甘露醇。

结果：

如图9中所示，氨基酸后涂层提供了保护效果，取决于所施加的逆境的形式，该保护效果与基于白蛋白和甘露醇的后涂层的保护效果相当，或者甚至优于后者。

与未处理的对照组相比，由五种不同氨基酸(200mM)和1mM甘草酸组成的氨基酸后涂层在辐射(25kGy)后和在加速老化程序后分别显示了80％和85％的抗原结合能力的保护效果。辐射(25kGy)后，由白蛋白和甘露醇组成的后涂层显示了未处理的对照组的65％的活性。经过在45℃持续7天的加速老化之后，通过白蛋白和甘露醇几乎未保留活性，这与不具有任何后涂层的对照组相似。

实施例5：氨基酸混合物封闭非特异性结合(例如封闭对ELISA板的非特异性结合)。

实验：

如“材料和方法”中所述使LO-MM-3吸附于ELISA板。通过在环境温度使用300μl封闭液对孔温育1小时来封闭板表面。作为封闭液，使用10g/l人白蛋白在PBS中的溶液或20g/l的18种氨基酸混合物在PBS中的溶液。之后的ELISA程序如“材料和方法”部分中所述进行。

结果：

氨基酸混合物也可以封闭对于表面的非特异性结合，如图10中所示。使用18种氨基酸的混合物封闭对ELISA板的非特异性结合，而不抑制特异性抗原-抗体相互作用。封闭效率与标准白蛋白封闭液相当。

实施例6：氨基酸混合物为诸如DNAse等酶提供抵抗逆境的保护。

实验：

DNAse对ELISA板的吸附和后涂层的应用

使酶DNAse(Sigma Aldrich，DN25)吸附至96孔ELISA板(Greiner Bio-one，655061)的表面。将DNAse在PBS(无Ca²⁺/Mg²⁺，PAA，H15-002)中稀释至浓度为1mg/ml。将100μl酶溶液吸移至各孔中并在5℃温育过夜。使用PBS^-/-洗涤该板2次。

以相同方式处理四个孔，以在之后的分析中计算平均值和标准差。每孔使用200μl封闭液封闭对板的非特异性结合，并在环境温度下温育1小时。使用PBS^-/-洗涤该板2次。在每孔移入200μl各后涂布液。使用后涂布液在环境温度温育该板1小时。弃掉后涂布液，并在环境温度干燥该板。

封闭液和后涂布液：

-封闭液：

20g/l人白蛋白(Biotest Pharma)在PBS^-/-中的溶液。

-后涂布液：

20g/l人白蛋白+10g/l甘露醇(Serag Wiesner，219675)在PBS^-/-中的溶液。

-封闭液：

20g/l氨基酸(Ala，Asp，Arg，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val)在PBS^-/-中的溶液。

-后涂布液：

20g/l氨基酸(Ala，Asp，Arg，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val)+0025mM甘草酸(铵盐，Fluka，50531)在PBS^-/-中的溶液。

经涂布的表面的逆境暴露

一块板通过辐射灭菌(β，25kGy)。辐射在Beta-Gamma-Service(德国Bruchsal)进行。

使用一块未经逆境暴露的相似的板充当对照组。保护效果被计算为逆境条件后保留的DNAse功能与未处理的对照组之比。

DNAse功能的检测

使用PBS^-/-洗涤该板3次。将Ds-DNA标准品(Sigma Aldrich，D1501)在PBS(含有Ca²⁺/Mg²⁺，Hyclone，SH3026401)中稀释至1μg/ml。向各孔中添加50μl该DNA溶液并在37℃温育1小时。将荧光DNA染料Picogreen(Molecular Probes，P7581)以1∶1000稀释(PBS)，并在每孔的DNA溶液中添加150ml该染料。

测量picogreen荧光，将激发滤光片设定为485nm，并检测530nm处的发射(Fusion Photometer A153601，PerkinElmer)。荧光信号与DNA浓度相关。DNAse活性被确定为DNA的减少，也即荧光信号的减少。

结果：

如图11所示，氨基酸后涂层对诸如DNAse等酶也提供了抵抗逆境(辐射)的保护效果。该保护与基于白蛋白和甘露醇的后涂层的保护相当。

辐射(25kGy)后，由18种不同氨基酸(20g/l)和0.25mM甘草酸组成的氨基酸后涂层显示了与未处理的对照组相比为83％DNAse活性的保护效果。辐射(25kGy)后，由白蛋白和甘露醇组成的后涂层显示了未处理的对照组的95％的活性。

实施例7：氨基酸后涂层对诸如IgG英夫利西单抗(Infliximab)等治疗抗体提供了抵抗逆境条件的保护。

实验：

使治疗抗体英夫利西单抗(人源化IgG，抗人TNF-α，Centocor，DD7701504)吸附于ELISA板表面。使用PBS-/-将英夫利西单抗稀释至1μg/ml的浓度，并将100μl该溶液移入至各孔中。在5℃温育该板过夜并使用洗涤缓冲剂洗涤该板2次。

如“材料和方法”部分所述进行后涂层的应用；灭菌和加速老化。

英夫利西单抗功能的ELISA检测

通过洗涤板3次来从孔中除去干燥的后涂层。通过在各孔中移入300μl封闭液(10g/l的白蛋白在PBS中的溶液)并在环境温度温育1小时来封闭ELISA板。洗涤该板3次。

将英夫利西单抗的抗原TNF-α(重组人TNF-α，R&D，Cat 210-TA)稀释至1ng/ml，并在各孔移入200μl该抗原溶液。在环境温度温育该板1小时并洗涤3次。

通过检测抗体(HRP标记的anti-human-TNF-α，R&D，Cat DTA00C)来检测结合的抗原。使用PBS将检测抗体的即用型溶液以1∶2稀释。向各孔中添加200μl，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。

将200μHRP的即用型ELISA底物溶液(TMB＝四甲基联苯胺)移入至各孔。在环境温度避光温育该板20分钟。为停止显色反应，向各孔添加50μl H₂SO₄(使用蒸馏水以1∶5稀释)。通过测量在波长为450nm处的吸收检测所获得的黄色。

结果：

如图12中所示，不具有甘草酸或具有甘草酸的氨基酸后涂层提供了保护效果，取决于所施加的逆境的形式，该保护效果与基于白蛋白和甘露醇的后涂层的保护效果相当，或者甚至优于后者。

与未处理的对照组相比，由18种不同氨基酸(在PBS中20g/l的溶液)组成的氨基酸后涂层在辐射(25kGy)后和在加速老化程序后分别显示了85％和90％的抗原结合能力的保护效果。与未处理的对照组相比，通过向氨基酸后保护层添加1mM甘草酸，在辐射(25kGy)后和加速老化程序后，保护效果分别为92％和95％的抗原结合能力。辐射(25kGy)后，由白蛋白和甘露醇组成的后涂层显示了未处理的对照组的72％的活性。经过在45℃持续6天的加速老化之后，通过白蛋白和甘露醇仅保留15％的活性，这与不具有任何后涂层的对照组相似。

实施例8：氨基酸后保护层为核酸(dsDNA)提供抵抗逆境条件的保护

实验：

使Ds-DNA(Sigma，D1501)吸附至ELISA板表面。将DNA溶解在具有1mMEDTA(Fluka，50531)的PBS^-/-(1mg/ml)中以抑制可能的DNAse活性。使用PBS按照1∶64将DNA稀释至15μg/ml，并将100μl溶液移入至各孔中。在5℃温育该板过夜并使用PBS^-/-洗涤该板2次。

如“材料和方法”部分所述进行后涂层的应用和灭菌。

使用Picogreen对完整的ds-DNA的检测

通过洗涤板3次来从孔中除去干燥的后涂层。向各孔中添加100μl Picogreen染料(在PBS^-/-中以1∶1000稀释，Molecular Probes，P7581)。立即测量picogreen荧光，将激发滤光片设定为485nm，并检测530nm处的发射(Fusion Photometer A153601，PerkinElmer)。荧光信号与完整的ds-DNA的浓度相关。

结果：

如图13所示，氨基酸后涂层提供了55％～60％的保护效果，其不依赖甘草酸或甘露醇的添加。在没有后涂层的情况下，当使用25kGy辐射时，完整的ds-DNA的量降低至20％。如白蛋白和甘露醇等常用稳定物质提供了约85％的保护。

实施例9：特定氨基酸组合物的保护效果

将20mg人抗甲型肝炎抗体(Beriglobin(人IgG，AK)，CSL Behring)和40mg保护组合物溶在水中，使每个样品的总体积为525μl并将其冻干。然后，将样品溶解在1ml水中，并使用HAV(甲型肝炎病毒)IgGELISA测试功能。

组成：

20g精氨酸

20g组氨酸

20g赖氨酸

3g谷氨酸

2g色氨酸

20g甘氨酸

15g丙氨酸

0.2g吐温80

1g甘草酸铵盐

使用NaOH和/或NaCl将pH调节至约7.2。然后，将该溶液进行无菌过滤。

将400μl溶液(对应于40mg固体化合物)与125μl Beriglobin(对应于20mg抗体)混合。

冻干：

冻干如下进行：

初始冷冻温度为-40℃；

冷冻3小时后初始真空度为0.1mBar；

以约1.5℃/小时的速度升温23小时；

在6℃和0.004mBar下过夜干燥6小时。

灭菌：

利用25kGy对冻干样品辐射，一份样品用50kGy β-辐射。

结果：

HAV-ELISA的结果如图14所示。

干燥并灭菌后，获得白色、无味、固有稳定性的饼状物。向每种样品中添加1ml水并监视溶解行为。溶解在少于30秒内发生，并且不存在聚集物。甚至24小时后，也未检测到肉眼可见的或用显微镜可见的聚集物。

结论：

与未经辐射的对照组相比，该组合物的应用使得Beriglobin的甲型肝炎抗体部分仅有很小的损失。

实施例10：作为稳定化合物的不同皂苷的试验。皂苷的结构类型对于抗体具有稳定作用。

材料和方法

所有实验都基于相同基本ELISA测定设计。(参见上文)

LO-MM-3对ELISA板的吸附和后涂层的应用

经涂布的表面的逆境暴露

LO-MM-3功能的ELISA检测

实验：

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对于板的吸附和后涂层的应用以及灭菌；和一般性ELISA程序。辐射剂量(电子束)为50kGy。

结果：

实验结果如图15所示。皂苷的结构类型具有增强氨基酸组合的保护性效果的潜能。优选的是使用皂苷甘草酸。

实施例11：包含至少3种不同氨基酸或至少两种不同氨基酸和如甘草酸等皂苷的稳定组合物提供非常好的保护

材料和方法

所有实验都基于相同基本ELISA测定设计。(参见上文)

LO-MM-3对ELISA板的吸附和后涂层的应用

经涂布的表面的逆境暴露

LO-MM-3功能的ELISA检测

实验：

将氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck，106482)或0.5M HCl(Merck，100319)中以获得具有最高浓度的储液。将氨基酸储液以不同组合混合在一起，使在后涂布液中总氨基酸浓度为20g/l。

将氨基酸混合物的pH定为约7.0。

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对板的吸附和后涂层的应用以及灭菌；和一般性ELISA程序。辐射剂量(电子束)为50kGy。

结果：

实验结果如图16所示。在采用50kGy β辐射时，至少3种氨基酸的组合和2种氨基酸与附加的甘草酸的组合提供了对固定化抗体的最大保护(超过75％)。

实施例12：优选的氨基酸组合物在不同逆境条件下提供保护。

材料和方法

所有实验都基于相同基本ELISA测定设计。(参见上文)

LO-MM-3对ELISA板的吸附和后涂层的应用

经涂布的表面的逆境暴露

LO-MM-3功能的ELISA检测

实验：

所使用的组合物：

保护组合物A(化合物/升)

20g精氨酸

20g组氨酸

20g赖氨酸

3g谷氨酰胺

2g色氨酸

20g甘氨酸

15g丙氨酸

0.2g吐温80

1g甘草酸铵盐

使用NaOH和/或HCl将pH调节至约7.2。然后，将该溶液进行除菌过滤。

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对于板的吸附和后涂层的应用以及灭菌；和一般性ELISA程序。

结果：实验结果如图17所示。氨基酸组合物在不同逆境条件下提供保护。对于不同剂量的β-辐射和升温下的人工老化提供了最佳保护。对于γ-辐射或环氧乙烷灭菌的保护较小，但具相关性。

实施例13：氨基酸后涂层在长期存储过程中提供保护

实验：

将氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck，106482)或0.5M HCl(Merck，100319)中以获得具有最高浓度的储液。将氨基酸储液混合在一起以使后涂布液中总氨基酸浓度达到200mM。这些氨基酸以等摩尔比例使用。

18种氨基酸：Ala，Arg，Asp，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val

5种氨基酸(1)：Asp，Arg，Phe，Ser，Val

5种氨基酸(2)：Ala，Glu，Lys，Thr，Trp

2种氨基酸(1)：Asp，Val

2种氨基酸(2)：Ala，Glu

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对板的吸附和后涂层的应用以及灭菌；和一般性ELISA程序。通过加速老化程序模拟长期存储。将板在45℃存储，并在存储0、10、25、41和62天后确定抗体活性。这相当于在5℃实际时间为0、6、12、24和36个月的老化。

结果：

含有至少5种氨基酸的氨基酸后涂层在长期存储过程中提供保护。对于非灭菌样品而言，在45℃持续62天后约80％抗原结合能力得到保留。灭菌样品(β，25kGy)在45℃持续62天后保留其抗原结合能力的约70％。不考虑灭菌，在存储过程中，含有仅2种氨基酸的氨基酸后涂层仅保留有约40％的抗原结合能力。向后涂布溶液添加1mM甘草酸可增强保护效果：对于含有至少5种氨基酸和甘草酸的非灭菌样品而言，在45℃持续62天后约90％的抗原结合能力得到保留。灭菌样品(β，25kGy)在45℃持续62天后保留其抗原结合能力的约80％。在存储过程中，含有2种氨基酸和甘草酸的氨基酸后涂层保留有约70％的抗原结合能力。

实施例14：氨基酸后涂层在不同灭菌过程中提供保护

实验：

5种氨基酸：Asp，Arg，Phe，Ser，Val

2种氨基酸：Asp，Val

如“材料和方法”部分所述进行LO-MM-3对板的吸附和后涂层的应用以及灭菌；和一般性ELISA程序。对一块板进行辐射(γ，25kGy)。辐射在Beta-Gamma-Service(德国Bruchsal)进行。另一块板通过EO(ETO BO1 cycle)灭菌；灭菌在Rose GmbH(德国Trier)进行。

结果：

利用γ-辐射灭菌的样品在使用含有18种氨基酸的氨基酸后涂层保护时保留约85％活性；该效果不会因使用甘草酸而进一步增强；使用5种氨基酸时保留活性为75％；使用2种氨基酸时仅保留40％。添加甘草酸改善了使用2种氨基酸的保护；此处其保留的活性为65％。当使用含有18种氨基酸的氨基酸后涂层保护时，经ETO灭菌的样品保留约85％的活性；使用甘草酸不会进一步增强此效果。含有5或2种氨基酸的后涂层仅具有很小的保护效果；添加甘草酸可以增强边际保护。

实施例15：由氨基酸和二肽组成的后涂层提供抵抗高辐射剂量的保护

材料和方法

-所有实验都基于相同基本ELISA测定设计。(参见上文)

-LO-MM-3对ELISA板的吸附和后涂层的应用

-经涂布的表面的逆境暴露

-LO-MM-3功能的ELISA检测

实验：

将氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck，106482)或0.5M HCl(Merck，100319)中以获得具有最高浓度的储液。将氨基酸储液混合在一起以使后涂布液中总氨基酸浓度达到20g/l。二肽以10g/l的浓度单独使用，和以2g/l的浓度与氨基酸组合使用。

7种氨基酸：Arg，His，Lys，Glu，Trp，Gly，Ala

2种二肽：甘氨酰酪氨酸(Gly-Tyr)，甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln)

将氨基酸混合物的pH设定为约7.0。

结果：

当使用含有仅7种氨基酸的氨基酸后涂层保护时，经50kGy β-辐射灭菌的样品保留约60％的活性；该效果在添加如Gly-Tyr等二肽或二肽组合时得到进一步增强。甘草酸不进一步增强氨基酸二肽组合的保护效果。

实施例16：对玻璃瓶中的白介素-8灭菌，瓶自身是载体。

实验：

将白介素-8(IL-8，R&D，208-IL)在PBS(不具有Ca²⁺/Mg²⁺，PAA，H15-002)中稀释至10μg/ml。向玻璃瓶中添加5μl该溶液(50ng IL-8)并旋转4小时，直至干燥。添加25μl稳定溶液(20g/l氨基酸混合物和1mM甘草酸(铵盐，Fluka，50531))并旋转/干燥过夜。

利用≥25kGy(β-辐射)对瓶灭菌。在冷藏条件下存储未灭菌的对照组。

测定：

从10％ACDA全血中分离嗜中性粒细胞。利用2ml HES(Grifols 662650)沉降20mlACDA血(10％)。将上清液移入至7ml Percoll(L6143)中并以2000x g离心分离20分钟。将分离的粒细胞再悬浮于1％自体血清中，并将细胞计数设定为0.5x 10⁶个/ml。

将阳性对照组5μl IL-8溶液(50ng)溶解在25μl稳定溶液(A和B)中。向各无菌瓶中添加1ml PBS(具有Ca²⁺/Mg²⁺，Hyclone，SH3026401)(具有1％自体血清)以溶解干燥的膜。

为检测样品的趋化活性，将无菌和非无菌瓶中以及对照组的全部IL-8溶液移入至12孔板中。插入迁移过滤器(3μm，Corning，3462)，并将500μl粒细胞悬浮液移入至过滤器中。将该板在37℃温育30分钟。通过FACS和计数珠(Invitrogen，C36950)对各孔中的细胞计数，从而检测迁移的细胞数。

结果：

参见图26

若不添加稳定剂，则在后续的灭菌(≥25kGy辐射)过程中生物分子(此处为白介素8＝IL8)将失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。显示的是IL8对于人嗜中性粒细胞的趋化活性。

实施例17：对玻璃瓶中的白介素-8灭菌，稳定剂自身是载体。

实验：

将白介素-8(IL-8)在PBS(不具有Ca²⁺/Mg²⁺，PAA，H15-002)中稀释至10μg/ml。将5μl溶液(50ng IL-8)和25μl稳定溶液(20g/l氨基酸混合物和1mM甘草酸(铵盐，Fluka，50531))混合并移入至玻璃瓶中。旋转/干燥该瓶过夜。

利用≥25kGy的辐射对瓶灭菌。在冷藏条件下存储未灭菌的对照组。

测定：

从10％ACDA全血中分离嗜中性粒细胞。利用2ml HES(Grifols 662650)沉降20ml ACDA血(10％)。将上清液移入至7ml Percoll(L6143)中并以2000x g离心分离20分钟。将分离的粒细胞再悬浮于1％自体血清中，并将细胞计数设定为0.5x 10⁶个/ml。

将阳性对照组5μl IL-8-溶液(50ng)溶解在25μl稳定溶液(A和B)中。向各无菌瓶中添加1ml PBS(具有Ca²⁺/Mg²⁺，Hyclone，SH3026401)(含有1％自体血清)以溶解干燥的膜。

为检测样品的趋化活性，将无菌和非无菌瓶中的全部IL-8溶液和对照组移入至12孔板中。插入迁移过滤器(3μm)，并将500μl粒细胞悬浮液移入至过滤器中。将该板在37℃温育30分钟。对各孔中的细胞计数(通过FACS和计数珠)，从而检测迁移的细胞数。

结果：

参见图29

实施例18：对玻璃瓶中的抗小鼠IgG灭菌，稳定剂自身是载体。

实验：

将抗小鼠IgG(生物素化的，Jackson ImmunoResearch，115-065-003)在PBS(不具有Ca²⁺/Mg²⁺，PAA，H15-002)中稀释至4μg/ml。将25μl(100ng)该抗体溶液和25μl2x浓缩的稳定溶液(20g/l氨基酸混合物和1mM甘草酸(铵盐，Fluka，50531))混合并移入至玻璃瓶中。旋转/干燥该瓶过夜。

测定：

使用抗原(小鼠IgG，Innovativ Research，Ir-Ms-Gf)涂布ELISA板(Greiner Bio-one，655061)：将抗原稀释至1μg/ml，取100μl移入至各孔中并在4℃温育过夜。使用洗涤缓冲剂(25x浓缩，Invitrogen，WB02)洗涤该板2次。使用白蛋白(5％)封闭该板并再洗涤3次。

向所有样品瓶中添加200μl PBS以溶解干燥的膜(理论上为5μg/ml)。使用PBS将样品稀释至10ng/ml。为计算抗体浓度，制备新鲜抗体的系列稀释液。

将样品和标准品移入至ELISA板(各自为2x 200μl)中，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。向各孔中添加200μl链亲和素液(以辣根过氧化物酶(HRP)标记，Pierce，21126，在PBS中稀释至0.1μg/ml)，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。将HRP发色底物TMB(TMB＝四甲基联苯胺，Invitrogen，00-2023)在H₂O中以1∶2稀释，并向各孔中添加200μl。在环境温度避光温育该板15分钟。为停止显色反应，添加50μl稀H₂SO₄(使用蒸馏水以1∶5稀释，Merck，1007311000)。在450nm处检测板的吸收(Fusion Photometer A153601，PerkinElmer)。

结果：

参见图30

若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(≥25kGy辐射)过程中生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)将失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的稳定剂溶液保护了生物分子。显示的是与抗原的特异性结合。

实施例19：对抗小鼠IgG灭菌，载体是聚氨酯泡沫。

实验：

从微孔聚氨酯(PU)泡沫(Smith&Nephew，66012608)冲压具有规定直径(1cm)的样品。将抗小鼠IgG(生物素化的，Jackson ImmunoResearch，115-065-003)附着于样品：将抗体在PBS(不具有Ca²⁺/Mg²⁺，PAA，H15-002)中或在稳定溶液(20g/l氨基酸混合物和1mM甘草酸(铵盐，Fluka，50531))中稀释至5μg/ml，并使用抗体溶液包被PU样品。将该样品在37℃温育1小时。

除去抗体溶液，并空气干燥PU样品2小时。通过β-辐射(25kGy)对样品灭菌，并在冷藏条件下存储未灭菌的对照组。

测定：

使用PBS包被PU样品并在环境温度温育1小时。收集样品溶液，并使用PBS以1∶20稀释，进而以1∶4连续稀释。为计算样品的抗体浓度，制备新鲜抗体的连续稀释液。

结果：

若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液保护生物分子。抗体的回收几乎为100％(5μg/ml)。显示的是与抗原的特异性结合。

实施例20：对抗小鼠IgG灭菌，载体是PVA水凝胶。

实验：

制备7％(m/v)的聚乙烯醇(PVA，Sigma，341584-25G)水溶液(加热至85℃)。将该溶液冷却至环境温度。将抗小鼠IgG(生物素化的，Jackson ImmunoResearch，115-065-003)在PBS中稀释至200μg/ml。

水凝胶混合物由以下物质组成：

-6.75ml PVA溶液(7％)

-4.5μl抗小鼠IgG(200μg/ml)

-2.25PBS或稳定溶液((20g/l氨基酸混合物和1mM甘草酸(铵盐，Fluka，50531))在PBS中的溶液)

将PVA水凝胶注入小型陪替氏皿(直径35mm，2ml溶液)中。将水凝胶膜空气干燥48小时。通过β-辐射(25kGy)对样品灭菌，并在冷藏条件下存储未灭菌的对照组。

测定：

使用抗原(小鼠IgG，Innovativ Research，Ir-Ms-Gf)涂布ELISA板(Greiner Bio-one，655061)：抗原被稀释至1μg/ml，将100μl移入至各孔中并在4℃温育过夜。使用洗涤缓冲剂(25x浓缩，Invitrogen，WB02)洗涤该板2次。使用白蛋白(5％)封闭该板并再洗涤3次。

将PVA水凝胶置入6孔板中并使用2ml PBS(不具有Ca²⁺/Mg²⁺，PAA，H15-002)包被。30分钟、1小时和2小时后收集PBS并使用新鲜PBS置换。

将样品的系列稀释液和标准品移入至ELISA板(各自为2x 200μl)中，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。向各孔中添加200μl链亲和素液(辣根过氧化物酶(HRP)标记，Pierce，21126，在PBS中稀释至0.1μg/ml)，并在环境温度温育1小时。洗涤该板3次。将HRP发色底物TMB(TMB＝四甲基联苯胺，Invitrogen，00-2023)在H₂O中以1∶2稀释，并向各孔中添加200μl。在环境温度避光温育该板15分钟。为停止显色反应，添加50μl稀H₂SO₄(使用蒸馏水以1∶5稀释，Merck，1007311000)。在450nm处检测板的吸收(Fusion Photometer A153601，PerkinElmer)。

结果：

若不添加稳定剂，则在后续的存储和/或灭菌(25kGy辐射)过程中生物分子(此处为抗小鼠IgG抗体)将失去其大部分生物功能。相反，稳定剂溶液保护生物分子。洗脱的抗体的回收率非常高。显示的是与抗原的特异性结合。

Claims

1.一种组合物在使固体载体上固定的生物分子稳定中的应用，所述组合物包含

至少两种不同氨基酸和皂苷，所述皂苷为甘草酸或其衍生物、甘草次酸、葡萄糖醛酸、七叶树皂角素、常春藤苷和毛地黄皂苷，甘草酸衍生物选自通过甘草酸在羧基和羟基上的转化、通过将氨基酸残基偶联至糖类部分中或者将2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺引入甘草酸的苷链中而产生的那些衍生物，和甘草酸的酰胺、具有两个氨基酸残基以及游离的30-COOH官能团的甘草酸共轭物和至少一个氨基酸烷基酯在甘草酸分子的糖类部分中的共轭物。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述生物分子可逆地附着在所述固体载体上。

3.如权利要求1或2所述的应用，其中使生物分子稳定包括稳定生物分子的结构和/或活性、增加生物分子的储存期和/或保护生物分子抵抗逆境介导的损伤。

4.如权利要求1或2所述的应用，其中所述组合物包含至少4种或至少5种不同氨基酸。

5.如权利要求1或2所述的应用，其中所述组合物包含以下每组中的至少一种氨基酸

(a)具有非极性脂肪族R基团的氨基酸；

(b)具有极性不带电荷的R基团的氨基酸；

(c)具有带正电荷的R基团的氨基酸；

(d)具有带负电荷的R基团的氨基酸；和

(e)具有芳香性R基团的氨基酸。

6.如权利要求1或2所述的应用，其中所述组合物中含有的氨基酸是选自以下(a)至(e)的一组氨基酸：

(a)丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸；

(b)天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸；

(c)脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸；

(d)酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸；和

(e)精氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸。

7.如权利要求1或2所述的应用，其中所述组合物在至少两种或至少三种氨基酸的混合物中包含低于1干重％的半胱氨酸。

8.如权利要求1或2所述的应用，其中所述组合物还包含低于1％的吐温。

9.如权利要求8所述的应用，其中所述组合物包含低于0.3％的吐温。

10.如权利要求8所述的应用，其中所述组合物包含吐温80。

11.一种生产被稳定的生物分子的方法，所述方法包括

(a)将所述生物分子附着于固体载体，和

(b)将所述生物分子包埋在权利要求1～10中任一项所述的组合物中，从而使得所包埋的生物分子被权利要求1～10中任一项所述的组合物部分地或完全地包被。

12.一种生产其上附着有生物分子的固体载体的方法，所述方法包括以下步骤

(a)将所述生物分子附着于所述固体载体，和

(b)将步骤(a)的载体在权利要求1～10中任一项所述的组合物中温育。

13.如权利要求11或12所述的方法，所述方法还包括

(c)对所述固体载体进行干燥。

14.如权利要求11或12所述的方法，所述方法还包括在步骤(b)后对所述固体载体灭菌。

15.如权利要求13所述的方法，所述方法还包括在步骤(b)后或步骤(c)后对所述固体载体灭菌。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述载体的灭菌通过环氧乙烷、β-辐射、γ-辐射、X-射线、热灭活、高压灭菌或等离子灭菌进行。

17.一种固体载体，所述固体载体可通过权利要求12～16中任一项所述的方法生产，或者是通过权利要求12～16中任一项所述的方法生产的。

18.如权利要求17所述的固体载体，其中所述生物分子为蛋白、肽、核酸、糖类、脂质、脂肪酸、多元醇及其组合或修饰物。

19.如权利要求18所述的固体载体，其中所述蛋白为酶、受体、细胞因子、激素、膜蛋白、白蛋白、球蛋白或凝血因子。

20.如权利要求18所述的固体载体，其中所述蛋白为生长因子。

21.如权利要求18所述的固体载体，其中所述蛋白为抗体。

22.如权利要求18所述的固体载体，其中所述蛋白为转运蛋白。

23.如权利要求17～22所述的固体载体，其中所述生物分子特异性地结合指示疾病的标志物蛋白、非细胞病原体、细胞或毒素。

24.如权利要求17～23中任一项所述的固体载体在医疗装置制备中的应用。

25.如权利要求24所述的应用，其中所述医疗装置为植入物、管、支架、伤口敷料或体外循环中所使用的医疗装置。

26.如权利要求24所述的应用，其中所述医疗装置为导管。