ES2312356T3 - Procedimiento y kit para la inmunodeteccion de bacterias en sangre y tejidos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para determinar si una sangre de donante, un producto sanguíneo de donante o un tejido de donante de un mamífero donante, en el que el tejido de donante está almacenado en un fluido, es útil para transferir a un mamífero receptor, procedimiento que comprende: poner en contacto una muestra de la sangre de donante o de un producto sanguíneo de donante o un fluido con una serie de aglutinantes, en el que el conjunto de aglutinantes comprende anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno bacteriano Gram-negativo y presentan amplia especificidad para bacterias Gram-negativas, y anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno bacteriano Gram-positivo y presentan amplia especificidad para bacterias Gram-positivas, detectar la unión del conjunto de aglutinantes a la muestra, y determinar la cantidad de bacterias presentes en la sangre de donante, el producto sanguíneo de donante o el fluido, en el que la presencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en la sangre de donante, el producto sanguíneo de donante o el fluido indica que la sangre de donante, el producto sanguíneo de donante o el tejido de donante no es útil para la transferencia a un mamífero receptor, y la ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en la sangre de donante, el producto sanguíneo de donante o el fluido indica que la sangre de donante, el producto sanguíneo de donante o el tejido de donante es útil para la transferencia a un mamífero receptor.
Description
Procedimiento y kit para la inmunodetección de
bacterias en sangre y tejidos.
La invención se refiere al cribado en la sangre
o en un producto sanguíneo (incluyendo la sangre completa, las
células madre hematopoyéticas, los leucocitos, el plasma, el suero,
los glóbulos rojos y plaquetas) o en un tejido de donante de la
presencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias. Más
específicamente, la invención se refiere al cribado para la
presencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
contaminantes en la sangre y en los productos sanguíneos o en el
tejido de donante que se utilizará para transfusión o
trasplante.
La transfusión de sangre y de productos
sanguíneos es un aspecto terapéuticamente importante de la atención
del paciente. El trasplante de tejidos y órganos de donante es
asimismo terapéuticamente importante. La ausencia de niveles
clínicamente pertinentes de bacterias contaminantes en la sangre de
donante, el producto sanguíneo de donante, o un tejido u órgano del
donante es un requisito necesario para la seguridad, utilización
terapéutica de estos fluidos y tejidos donados para la transfusión o
el trasplante. Por ejemplo, la bacteriemia (invasión de bacterias
en la sangre) puede ser transitoria, continua o intermitente.
Wagner et al. (Clin. Microbiol. Rev. 7:
290-302 (1994)) y Goldman et al. (Trans.
Med. Revs. 5: 73-83 (1991)) dan a conocer que un
gran número de diferentes especies de bacterias se ha identificado
en la sangre contaminada transfundida a pacientes que, después de
la transfusión, desarrollaron septicemia. Tadler et al.
(J. Clin. Laboratory Analysis 2: 21-25
(1989)) da a conocer que aunque la bacteremia transitoria es
generalmente de pocas consecuencias, la bacteriemia continua o
intermitente puede presentar situaciones que ponen en riesgo la vida
en varias poblaciones de pacientes, particularmente pacientes
inmunodeprimidos, neonatos y geriátricos. Por lo tanto, si la
sangre contaminada con una cantidad clínicamente pertinente de
bacterias se transfunde a un paciente receptor, el paciente receptor
puede sufrir complicaciones, particularmente ya que las
transfusiones de sangre y/o productos sanguíneos se realizan con
frecuencia cuando el paciente está sometido a cirugía mayor o
es
vulnerable.
vulnerable.
Asimismo, los tejidos y órganos del donante
están preferentemente exentos de microbios que retardan y,
preferentemente, impiden el rechace por parte del receptor.
A pesar de la necesidad de un aporte de sangre o
de un producto sanguíneo seguro, exento de microbios, no existe
ningún producto rápido y eficaz para detectar la presencia de
bacterias contaminantes en la sangre o en un producto sanguíneo.
Aunque existen procedimientos para determinar si se infecta o no la
sangre con bacterias, la experimentación bacteriana más frecuente
se realiza en pacientes que se sospecha que tienen la sangre
infectada, con el primer intento de identificación del
microorganismo exacto que es causante de la infección, de modo que
la terapia antibiótica apropiada puede comenzar. En estos
procedimientos, para identificar la bacteria infecciosa, una
muestra de sangre del paciente se cultiva en un medio de cultivo que
favorece el crecimiento de las bacterias durante un periodo
relativamente prolongado de tiempo. Opcionalmente, el número de
microorganismos presentes está ampliado hasta el punto que exista
una cantidad razonable y puede ser detectada.
Aunque estas técnicas de identificación de la
sangre basadas en el cultivo son útiles para determinar el tipo
específico de bacterias que está infectando la sangre del paciente,
el periodo de tiempo requerido para realizar estas técnicas
convierte su utilización en impracticable para analizar la sangre
de donante y los productos sanguíneos o los órganos del donante.
Esto es debido a que la sangre de donante, los productos sanguíneos
y los órganos son necesarios con frecuencia para su utilización como
transfusiones o trasplantes en comunicaciones relativamente breves.
De este modo, puede que no exista tiempo para analizar la sangre (o
el producto sanguíneo) o el órgano donado con una técnica basada en
el cultivo antes de que la sangre u órgano donado se necesite para
su utilización.
Además, los órganos y la sangre o los productos
sanguíneos donados tienen un periodo de conservación relativamente
corto no solamente para una pérdida de su función o del material
donado, sino también para un aumento en la cantidad de cualquier
bacteria contaminante presente. Ya que las bacterias tienen una
rápida velocidad de propagación, incluso una pequeña cantidad de
bacterias contaminantes presentes en la sangre o productos
sanguíneos donados se ampliará rápidamente con el tiempo. Por
ejemplo, aunque las plaquetas donadas son funcionalmente viables
solamente 7 días después de la donación, se utilizan raramente más
de 5 días después de la donación por temor de la contaminación
bacteriana que, cuando se dona, puede no haber sido significativa,
pero, a lo largo del tiempo, puede haber aumentado hasta un nivel
que sea clínicamente pertinente. Además, estas técnicas de
identificación de la sangre basadas en el cultivo tardan demasiado
tiempo para identificar de forma rutinaria las plaquetas, que tienen
un periodo de conservación corto (aproximadamente 5 días después de
la donación) para su utilización en la transfusión.
Brecher et al. (Transfusion 34(9):
750-755 (1994)) da a conocer otra técnica para
detectar una bacteria contaminante específica en la sangre
utilizando sondas marcadas de ácido nucleico para hibridar al
material genético de potenciales contaminantes. Las sondas
utilizadas en estos estudios, sin embargo, están muy limitadas en el
número de microorganismos que pueden detectarse y,
desgraciadamente, ningún análisis comercialmente viable ha surgido
de esta tecnología. Dada su complejidad, estas técnicas son
demasiado laboriosas y utilizan demasiado tiempo para utilizarse de
forma rutinaria para identificar la contaminación bacteriana en la
sangre o productos sanguíneos.
Existe, sin embargo, necesidad de una técnica
para detectar rápidamente la presencia de una cantidad clínicamente
pertinente de cualquier bacteria contaminante en la sangre de
donante o en un producto sanguíneo o en el tejido de donante.
Teóricamente, las técnicas de unión del antígeno podrían utilizarse
rápida y eficazmente. Desgraciadamente, Wagner, S. J. (Int. J.
Med. Microbiol. Virol. Parasitol. Infect. Dis.
283(3):253-257 (1996)) da a conocer que no
existe una fuente antigénica común para la detección de bacterias
de base amplia. Por lo tanto, existe una necesidad de técnicas que
se basan en la unión del antígeno para detectar cantidades
clínicamente pertinentes de bacterias contaminantes en la sangre de
donante o en los productos sanguíneos o en los tejidos de
donante.
La invención proporciona procedimientos rápidos
basados en la unión del antígeno para detectar cantidades
clínicamente pertinentes de bacterias contaminantes en la sangre o
en los productos sanguíneos o en el tejido de donante,
particularmente en la sangre de donante o los productos sanguíneos
o en el tejido de donante que han de transferirse de un individuo a
otro.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la
invención da a conocer un procedimiento para identificar la
presencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en
la sangre de donante o en un producto sanguíneo de donante de un
mamífero donante para transferirlo a un mamífero receptor que
comprende poner en contacto una muestra de sangre o un producto
sanguíneo con un conjunto de aglutinantes, en el que el conjunto de
aglutinantes comprende aglutinantes que se unen específicamente a
un antígeno bacteriano Gram-negativo y aglutinantes
que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y detectar la unión del conjunto de
aglutinantes a la muestra, en el que la unión indica la presencia de
una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en la sangre o en
el producto sanguíneo de donante y la falta de unión indica la
ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en la
sangre o en el producto sanguíneo de donante.
En determinadas formas de realización del primer
aspecto de la invención, la muestra se trata antes de o de manera
concomitante con la puesta en contacto de la muestra con una serie
de aglutinantes. Preferentemente, el tratamiento expone un sitio de
unión del aglutinante del antígeno bacteriano
Gram-negativo o del antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de realización
del primer aspecto de la invención, la sangre de donante o el
producto sanguíneo determinado que presenta una ausencia de una
cantidad clínicamente pertinente de bacterias se administra al
mamífero receptor. Preferentemente, el mamífero donante y el
mamífero receptor son la misma especie. En determinadas formas de
realización preferidas, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden anticuerpos o derivados
del anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo del mismo
comprenden una molécula seleccionada de entre el grupo constituido
por un factor antilipopolisacárido de Limulus (LALF),
proteína que se une al lipopolisacárido (LBP), una proteína con
aumento de bactericida/permeabilidad (BPI) y un antibiótico, tal
como la polimixina o la bacitracina. Preferentemente, los
aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo que se une específicamente a la
estructura de lipopolisacárido de las bacterias
Gram-negativas. En determinadas formas de
realización preferidas, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno de la bacteria
Gram-positiva comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden un
antibiótico, en el que el antibiótico no es la vancomicina ni la
gentamicina. Preferentemente, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo que se une específicamente a la
estructura del ácido lipotecoico de las bacterias
Gram-positivas.
En varias formas de realización del primer
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo se marcan de forma detectable con una
primera molécula indicadora y los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se marcan de manera detectable con
una segunda molécula indicadora. En determinadas formas de
realización, la primera molécula indicadora y la segunda molécula
indicadora son iguales. En otra forma de realización, la primera
molécula indicadora y la segunda molécula indicadora no son
iguales. Preferentemente, una o ambas primera molécula indicadora y
segunda molécula indicadora es una molécula con actividad
enzimática, una molécula radiomarcada, una molécula de fusión, una
molécula fluorógena o un sol metálico, una partícula, una molécula
cromática o una molécula que está unida específicamente mediante un
aglutinante secundario.
En un segundo aspecto, la invención da a conocer
el procedimiento para identificar la presencia de una cantidad
clínicamente pertinente de bacterias Gram-positivas
en la sangre o producto sanguíneo de donante de un mamífero donante
para la transferencia a un mamífero receptor que comprende poner en
contacto una muestra de la sangre o de un producto sanguíneo de
donante con una serie de aglutinantes, en el que el conjunto de
aglutinantes comprende aglutinantes que se unen específicamente al
antígeno bacteriano Gram-positivo y determinar la
unión del conjunto de aglutinantes a la muestra, en el que la unión
indica la presencia de una cantidad clínicamente pertinente de
bacterias Gram-positivas en la sangre o en el
producto sanguíneo de donante y la ausencia de unión indica la
ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-positivas en la sangre o producto sanguíneo de
donante.
En determinadas formas de realización del
segundo aspecto de la invención, la muestra se trata antes de o
simultáneamente de poner en contacto la muestra con el conjunto de
aglutinantes. Preferentemente, el tratamiento expone un sitio de
unión para el aglutinante en el antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, la sangre o el producto sanguíneo determinado que
presenta ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de
bacterias Gram-positivas se transfiere a un mamífero
receptor. Preferentemente, el mamífero donante y el mamífero
receptor son de la misma especie. En determinadas formas de
realización preferidas, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano Gram-positivo
comprenden anticuerpos o derivados de anticuerpo que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden un
antibiótico, en el que el antibiótico no es la vancomicina ni es la
gentamicina. Preferentemente, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se unen a la estructura del ácido
lipotecoico de las bacterias Gram-positivas.
En varias formas de realización del segundo
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se marcan de manera detectable con
una molécula indicadora. Preferentemente, la molécula indicadora es
una molécula con actividad enzimática, una molécula radiomarcada,
una molécula de fusión, una molécula fluorógena, un sol metálico,
una partícula, una molécula cromática o una molécula que está unida
específicamente por un aglutinante secundario. En un tercer
aspecto, la invención proporciona un procedimiento para identificar
la presencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-negativas en la sangre de donante o en un
producto sanguíneo de un mamífero donante para la transferencia a
un mamífero receptor que comprende poner en contacto una muestra de
sangre o un producto sanguíneo con una serie de aglutinantes, en el
que el conjunto de aglutinantes comprende aglutinantes que se unen
específicamente a un agente bacteriano
Gram-negativo y determinar la unión del conjunto de
aglutinantes a la muestra, en el que la unión indica la presencia
de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-negativas en la sangre o en el producto
sanguíneo de donante y la falta de unión indica la ausencia de una
cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-negativas en la sangre o en el producto
sanguíneo de donante.
En determinadas formas de realización del tercer
aspecto de la invención, la muestra se trata antes de o
simultáneamente a poner en contacto la muestra con una serie de
aglutinantes. Preferentemente, el tratamiento expone un sitio de
unión del aglutinante en el antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de
realización, la sangre o producto sanguíneo de donante se determina
que presenta una ausencia de una cantidad clínicamente pertinente
de bacterias Gram-negativas se transfiere a un
mamífero receptor. Preferentemente, el mamífero donante y el
mamífero receptor son de la misma especie. En determinadas formas
de realización preferidas, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano Gram-negativo
comprenden anticuerpos o derivados de anticuerpo que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo comprenden una
molécula seleccionada de entre el grupo constituido por un factor
antilipopolisacárido de Limulus (LALF), una proteína de unión
al lipopolisacárido (LBP), una proteína bactericida, que aumenta la
permeabilidad (BPI) y un antibiótico, tal como polimixina o
bacitracina. Preferentemente, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano
Gram-negativo se unen a la estructura del
lipopolisacárido de las bacterias
Gram-negativas.
En varias formas de realización del tercer
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo se marcan de manera detectable con
una molécula indicadora. Preferentemente, la molécula indicadora es
una molécula con actividad enzimática, una molécula radiomarcada,
una molécula de fusión, una molécula fluorógena, un sol metálico,
una partícula, una molécula cromática o una molécula que se une
específicamente mediante un aglutinante secundario.
En un cuarto aspecto, la invención da a conocer
un kit para identificar la presencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias en la sangre de donante o un producto
sanguíneo de donante procedente de un mamífero donante para la
transferencia a un mamífero receptor que comprende una serie de
aglutinantes, en el que el conjunto de aglutinantes comprende
aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo y aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y un medio para detectar la unión del
conjunto de aglutinantes a una muestra de la sangre o producto
sanguíneo de donante, en el que la unión indica la presencia de una
cantidad clínicamente pertinente de bacterias en la sangre o
producto sanguíneo de donante y la falta de unión indica la ausencia
de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en la sangre o
producto sanguíneo de donante.
En determinadas formas de realización del cuarto
aspecto de la invención, el kit comprende además un medio para
tratar la muestra, en el que el tratamiento expone un sitio de
unión para el aglutinante en el agente bacteriano
Gram-negativo o en el antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de realización
del cuarto aspecto de la invención, se determina que la sangre o
producto sanguíneo de donante presenta una ausencia de una cantidad
clínicamente pertinente de bacterias se transfiere a un mamífero
receptor. Preferentemente, el mamífero donante y el segundo mamífero
son de la misma especie. En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo comprenden
anticuerpos o derivados de anticuerpo que se unen específicamente a
un antígeno bacteriano Gram-negativo. En
determinadas formas de realización preferidas, los aglutinantes que
se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden una molécula seleccionada
entre el grupo constituido por un factor antilipopolisacárido de
Limulus (LALF), una proteína de unión al lipopolisacárido
(LBP), una proteína con aumento de bactericida/permeabilidad (BPI),
y un antibiótico, tal como la polimixina o la bacitracina.
Preferentemente, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo se unen
específicamente a la estructura de lipopolisacárido de la bacteria
Gram-negativa. En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente al
antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden
anticuerpos o derivados de anticuerpo que se unen específicamente a
un antígeno bacteriano Gram-positivo. En
determinadas formas de realización, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo comprenden un antibiótico, en el que
el antibiótico no es la vancomicina ni es la gentamicina.
Preferentemente, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo se unen
específicamente a la estructura de ácido lipotecoico de las
bacterias Gram-positivas.
En varias formas de realización del cuarto
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo se marcan de forma detectable con una
primera molécula indicadora y los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se marcan de manera detectable con
una segunda molécula indicadora. En determinadas formas de
realización, la primera molécula indicadora y la segunda molécula
indicadora son las mismas. En otra forma de realización, la primera
molécula indicadora y la segunda molécula indicadora no son las
mismas. Preferentemente, una o ambas de la primera molécula
indicadora y la segunda molécula indicadora es una molécula con
actividad enzimática, una molécula radiomarcada, una molécula de
fusión, una molécula fluorógena, un sol metálico, una partícula,
una molécula cromática o una molécula que está unida específicamente
por un aglutinante secundario.
En un quinto aspecto, la invención da a conocer
un kit para identificar la presencia de una cantidad clínicamente
pertinente de una bacteria Gram-positiva en la
sangre de donante o en un producto sanguíneo de donante de un
mamífero donante para la transferencia a un mamífero receptor que
comprende una serie de aglutinantes, en el que el conjunto de
aglutinantes comprende aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo y un medio para
detectar la unión de una serie de aglutinantes a una muestra de
sangre o de producto sanguíneo, en el que la unión indica la
presencia de una cantidad apropiada de bacterias
Gram-positivas en la sangre o en el producto
sanguíneo de donante y la falta de unión indica la ausencia de una
cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-positivas en la sangre o productos sanguíneos
del donante.
En determinadas formas de realización del quinto
aspecto de la invención, el kit comprende además un medio para
tratar la muestra, en el que el tratamiento expone un sitio de
unión para el aglutinante del antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, se determina que la sangre o producto sanguíneo de
donante presenta una ausencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias se transfiere a un mamífero receptor.
Preferentemente, el mamífero donante y el mamífero receptor son de
la misma especie. En determinadas formas de realización preferidas,
los aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno
bacteriano Gram-positivo comprenden anticuerpos o
derivados de anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno
bacteriano Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden un
antibiótico, en el que el antibiótico no es la vancomicina ni la
gentamicina. Preferentemente, los agentes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se unen específicamente a la
estructura de ácido lipotecoico de las bacterias
Gram-positivas.
En varias formas de realización del quinto
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se marcan de manera detectable con
una molécula indicadora. Preferentemente, la molécula indicadora es
una molécula con actividad enzimática, una molécula radiomarcada,
una molécula de fusión, una molécula fluorógena, un sol metálico,
una partícula, una molécula cromática, o una molécula que está
unida específicamente por un aglutinante secundario.
En un sexto aspecto, la invención proporciona un
kit para identificar la presencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias en la sangre de donante o un producto
sanguíneo de donante procedente de un mamífero donante para la
transferencia a un mamífero receptor que comprende una serie de
aglutinantes, en el que el conjunto de aglutinantes comprende
aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo y aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y un medio para detectar la unión del
conjunto de aglutinantes a una muestra de la sangre o producto
sanguíneo de donante, en el que la unión indica la presencia de una
cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-negativas en la sangre o producto sanguíneo de
donante y la falta de unión indica la ausencia de una cantidad
clínicamente pertinente de bacterias Gram-negativas
en la sangre o producto sanguíneo de donante.
En determinadas formas de realización del sexto
aspecto de la invención, el kit comprende además un medio para
tratar la muestra, en el que el tratamiento expone un sitio de
unión para el aglutinante en el agente bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de
realización, la sangre o producto sanguíneo de donante que se
determina que presenta ausencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias se transfiere a un mamífero receptor.
Preferentemente, el mamífero donante y el segundo mamífero son de
la misma especie. En determinadas formas de realización preferidas,
los aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno
bacteriano Gram-negativo comprenden anticuerpos o
derivados de anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno
bacteriano Gram-negativo. En determinadas formas de
realización preferidas, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden una molécula seleccionada
entre el grupo constituido por un factor antilipopolisacárido de
Limulus (LALF), una proteína de unión al lipopolisacárido
(LBP), una proteína con aumento de bactericida/permeabilidad (BPI),
y un antibiótico, tal como la polimixina o la bacitracina.
Preferentemente, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo se unen
específicamente a la estructura de lipopolisacárido de la bacteria
Gram-negativa.
En varias formas de realización del sexto
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo están marcados de manera detectable
con una molécula indicadora. Preferentemente, la molécula indicadora
es una molécula con actividad enzimática, una molécula
radiomarcada, una molécula de fusión, una molécula fluorógena, un
sol metálico, una partícula, una molécula cromática, o una molécula
que está unida específicamente por un aglutinante secundario.
En varias formas de realización de los primer,
segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto aspectos de la invención,
la sangre o producto sanguíneo es preferentemente sangre completa,
leucocitos, células madre hematopoyéticas, plaquetas, glóbulos
rojos, plasma o suero.
En un séptimo aspecto, la invención da a conocer
un procedimiento para identificar la presencia de una cantidad
clínicamente pertinente de bacterias en un tejido de un mamífero,
en el que el tejido está almacenado en un fluido, que comprende
poner en contacto una muestra del fluido con una serie de
aglutinantes, en el que el conjunto de aglutinantes comprende
aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo y aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y determinar la unión del conjunto de
aglutinantes a la muestra, en el que la unión indica la presencia
de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en el tejido
de do-
nante y la falta de unión indica la ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en el tejido de donante.
nante y la falta de unión indica la ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en el tejido de donante.
En determinadas formas de realización del
séptimo aspecto de la invención, la muestra se trata antes de o
simultáneamente a poner en contacto la muestra con una serie de
aglutinantes. Preferentemente, el tratamiento expone un sitio de
unión del aglutinante en el antígeno bacteriano
Gram-negativo o en el antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de realización
del séptimo aspecto de la invención, tejido de donante que se ha
determinado que presenta una ausencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias se transfiere a un mamífero receptor.
Preferentemente, el mamífero donante y el mamífero receptor son de
la misma especie. En determinadas formas de realización preferidas,
los aglutinantes que se unen específicamente al antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo comprenden una
molécula seleccionada de entre el grupo constituido por un factor
antilipopolisacárido de Limulus (LALF), una proteína de unión
al lipopolisacárido (LBP), una proteína bactericida, que aumenta la
permeabilidad (BPI) y un antibiótico, tal como polimixina o
bacitracina. Preferentemente, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano
Gram-negativo se unen a la estructura del
lipopolisacárido de las bacterias Gram-negativas. En
determinadas formas de realización preferidas, los aglutinantes que
se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden un
antibiótico, en el que el antibiótico no es la vancomicina ni la
gentamicina. Preferentemente, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se unen específicamente a la
estructura de ácido lipotecoico de la bacteria
Gram-positiva.
En varias formas de realización del séptimo
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo se marcan de manera detectable con
una primera molécula indicadora y los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se marcan de manera detectable con
una segunda molécula indicadora. En determinadas formas de
realización, la primera molécula indicadora y la segunda molécula
indicadora son iguales. En otra forma de realización, la primera
molécula indicadora y la segunda molécula indicadora no son
iguales. Preferentemente, una o ambas de la primera molécula
indicadora y la segunda molécula indicadora es una molécula con
actividad enzimática, una molécula radiomarcada, una molécula de
fusión, una molécula fluorógena, un sol metálico, una partícula,
una molécula cromática o una molécula que se une específicamente
mediante un aglutinante secundario.
En un octavo aspecto, la invención proporciona
un procedimiento para identificar la presencia de una cantidad
clínicamente pertinente de bacterias Gram-positivas
en un tejido de donante de un mamífero donante para transferirla a
un mamífero receptor, en el que el tejido de donante está
almacenado en un fluido, que comprende poner en contacto una
muestra del fluido con una serie de aglutinantes, en el que el
conjunto de aglutinantes comprende aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y que determinan la unión del conjunto
de aglutinantes a la muestra, en el que la unión indica la
presencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-positivas en el tejido de donante y la falta de
unión indica la ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de
bacterias Gram-positivas en el tejido de
donante.
En determinadas formas de realización del octavo
aspecto de la invención, la muestra se trata antes de o
simultáneamente a poner en contacto la muestra con una serie de
aglutinantes. Preferentemente, el tratamiento expone un sitio de
unión para el aglutinante en el antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, el tejido de donante que se ha determinado que presenta
una ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
se transfiere a un mamífero receptor. Preferentemente, el mamífero
donante y el mamífero receptor son de la misma especie. En
determinadas formas de realización preferidas, los aglutinantes que
se unen específicamente al antígeno bacteriano
Gram-positivo comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden un
antibiótico, en el que el antibiótico no es la la vancomicina ni la
gentamicina. Preferentemente, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano Gram-positivo
se unen específicamente a la estructura de ácido lipotecoico de las
bacterias Gram-positivas.
En varias formas de realización del octavo
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se marcan de forma detectable con una
molécula indicadora. Preferentemente, la molécula indicadora es una
molécula con actividad enzimática, una molécula radiomarcada, una
molécula de fusión, una molécula fluorógena o un sol metálico, una
partícula, una molécula cromática o una molécula que está unida
específicamente mediante un aglutinante secundario.
En un noveno aspecto, la invención proporciona
un procedimiento para identificar la presencia de una cantidad
clínicamente pertinente de bacterias Gram-negativas
en un tejido de donante de un mamífero donante para transferirla a
un mamífero receptor, en el que el tejido de donante está
almacenado en un fluido, que comprende poner en contacto una
muestra del fluido con una serie de aglutinantes, en el que el
conjunto de aglutinantes comprende aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y que determinan la unión del conjunto
de aglutinantes a la muestra, en el que la unión indica la
presencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-negativas en el tejido de donante y la falta de
unión indica la ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de
bacterias Gram-negativas en el tejido de
donante.
En determinadas formas de realización del noveno
aspecto de la invención, la muestra se trata antes de o
simultáneamente a poner en contacto la muestra con una serie de
aglutinantes. Preferentemente, el tratamiento expone un sitio de
unión para el aglutinante en el antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de
realización, el tejido de donante que se ha determinado que presenta
una ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-negativas se transfiere a un mamífero
receptor. Preferentemente, el mamífero donante y el mamífero
receptor son de la misma especie. En determinadas formas de
realización preferidas, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo comprenden
anticuerpos o derivados de anticuerpos que se unen específicamente
a un antígeno bacteriano Gram-negativo. En
determinadas formas de realización, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden una molécula seleccionada
del grupo constituido por el factor antilipopolisacárido de
Limulus (LALF), una proteína de unión al lipopolisacárido
(LBP), una proteína con aumento de bactericida/permeabilidad (BPI)
y un antibiótico, tal como polimixina o bacitracina.
Preferentemente los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo se unen
específicamente a la estructura de lipopolisacárido de las
bacterias Gram-negativas.
En varias formas de realización del noveno
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano Gram-negativo
se marcan de forma detectable con una molécula indicadora.
Preferentemente, la molécula indicadora es una molécula con
actividad enzimática, una molécula radiomarcada, una molécula de
fusión, una molécula fluorógena o un sol metálico, una partícula,
una molécula cromática o una molécula que está unida
específicamente mediante un aglutinante secundario.
En un décimo aspecto, la invención da a conocer
un kit para identificar la presencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias en un tejido de donante de un mamífero
donante para transferirla a un mamífero receptor, en el que el
tejido de donante está almacenado en un fluido, que comprende una
serie de aglutinantes, en el que el conjunto de aglutinantes
comprende aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno
bacteriano Gram-positivo y medios para detectar la
unión del conjunto de aglutinantes a la muestra del fluido, en el
que la unión indica la presencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias en el tejido de donante y la falta de unión
indica la ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de
bacterias en el tejido de donante.
En determinadas formas de realización del décimo
aspecto de la invención, el kit comprende además un medio para
tratar la muestra, en el que el tratamiento expone un sitio de
unión para el aglutinante en el antígeno bacteriano
Gram-negativo o en el antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de realización
del décimo aspecto de la invención, el tejido de donante que se ha
determinado que presenta una ausencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias se transfiere a un mamífero receptor.
Preferentemente, el mamífero donante del que se extrajo el tejido y
el mamífero receptor son de la misma especie. En determinadas
formas de realización preferidas, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a una
bacteria Gram-negativa o a un antígeno de la misma
comprenden una molécula seleccionada de entre el grupo constituido
por un factor antilipopolisacárido de Limulus (LALF), una
proteína de unión al lipopolisacárido (LBP), una proteína con
aumento de bactericida/permeabilidad (BPI), y un antibiótico, tal
como la polimixina o la bacitracina. Preferentemente, los
aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo se unen específicamente a la
estructura de lipopolisacárido de la bacteria
Gram-negativa. En determinadas formas de
realización preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente
al antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden
anticuerpos o derivados de anticuerpo que se unen específicamente a
un antígeno bacteriano Gram-positivo. En
determinadas formas de realización, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden un
antibiótico, en el que el antibiótico no es la vancomicina ni es la
gentamicina. Preferentemente, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se unen específicamente a la
estructura de ácido lipotecoico de las bacterias
Gram-positivas.
Gram-positivas.
En varias formas de realización del décimo
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano Gram-negativo
se marcan de forma detectable con una primera molécula indicadora y
los aglutinantes que se unen específicamente al antígeno bacteriano
Gram-negativo se marcan de forma detectable con una
segunda molécula indicadora. En determinadas formas de realización
la primera molécula indicadora y la segunda molécula indicadora son
las mismas. En otra forma de realización la primera molécula
indicadora y la segunda molécula indicadora no son las mismas.
Preferentemente, una o ambas de la primera molécula indicadora y de
la segunda molécula indicadora es una molécula con actividad
enzimática, una molécula radiomarcada, una molécula de fusión, una
molécula fluorógena o un sol metálico, una partícula, una molécula
cromática o una molécula que está unida específicamente mediante un
aglutinante secundario.
En un undécimo aspecto, la invención da a
conocer un kit para identificar la presencia de una cantidad
clínicamente pertinente de bacterias Gram-positivas
en un tejido de donante de un mamífero donante para transferirla a
un mamífero receptor, en el que el tejido de donante está
almacenado en un fluido, que comprende una serie de aglutinantes,
en el que el conjunto de aglutinantes comprende aglutinantes que se
unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y medios para detectar la unión del
conjunto de aglutinantes a la muestra del fluido, en el que la unión
indica la presencia de una cantidad clínicamente pertinente de
bacterias Gram-positivas en el tejido de donante y
la falta de unión indica la ausencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias Gram-positivas en el tejido
de donante.
En determinadas formas de realización del
undécimo aspecto de la invención, el kit comprende además un medio
para tratar la muestra, en el que el tratamiento expone un sitio de
unión para el aglutinante en el antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, el tejido de donante que se ha determinado que
presenta una ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de
bacterias Gram-positivas se transfiere a un mamífero
receptor. Preferentemente, el mamífero donante del que se extrajo
el tejido y el mamífero receptor son de la misma especie. En
determinadas formas de realización preferidas, los aglutinantes que
se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden un
antibiótico, en el que el antibiótico no es la vancomicina ni la
gentamicina. Preferentemente, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se unen específicamente a la
estructura de ácido lipotecoico de las bacterias
Gram-positivas.
En varias formas de realización del undécimo
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano Gram-positivo
se marcan de forma detectable con una primera molécula indicadora.
Preferentemente, la molécula indicadora es una molécula con
actividad enzimática, una molécula radiomarcada, una molécula de
fusión, una molécula fluorógena o un sol metálico, una partícula,
una molécula cromática o una molécula que está unida específicamente
mediante un aglutinante secundario.
En un duodécimo aspecto, la invención da a
conocer un kit para identificar la presencia de una cantidad
clínicamente pertinente de bacterias Gram-negativas
en un tejido de donante de un mamífero donante para transferirla a
un mamífero receptor, en el que el tejido de donante está
almacenado en un fluido, que comprende una serie de aglutinantes,
en el que el conjunto de aglutinantes comprende aglutinantes que se
unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo y medios para detectar la unión del
conjunto de aglutinantes a la muestra del fluido, en el que la unión
indica la presencia de una cantidad clínicamente pertinente de
bacterias Gram-negativas en el tejido de donante y
la falta de unión indica la ausencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias Gram-negativas en el tejido
de donante.
En determinadas formas de realización del
duodécimo aspecto de la invención, el kit comprende además un medio
para tratar la muestra, en el que el tratamiento expone un sitio de
unión para el aglutinante en el antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de
realización, el tejido que se ha determinado que presenta una
ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-negativas se transfiere a un mamífero
receptor. Preferentemente, el mamífero donante y el mamífero
receptor son de la misma especie. En determinadas formas de
realización preferidas, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo comprenden una
molécula seleccionada del grupo constituido por el factor
antilipopolisacárido de Limulus (LALF), una proteína de unión
al lipopolisacárido (LBP), una proteína con aumento de
bactericida/permeabilidad (BPI) y un antibiótico, tal como
polimixina o bacitracina. Preferentemente, los aglutinantes que se
unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo se unen específicamente a la
estructura de ácido lipotecoico de las bacterias
Gram-negativas.
En varias formas de realización del duodécimo
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano Gram-negativo
se marcan de forma detectable con una molécula indicadora.
Preferentemente, la molécula indicadora es una molécula con
actividad enzimática, una molécula radiomarcada, una molécula de
fusión, una molécula fluorógena o un sol metálico, una partícula,
una molécula cromática o una molécula que está unida
específicamente mediante un aglutinante secundario.
En varias formas de realización de los séptimo,
octavo, noveno, décimo, undécimo y duodécimo aspectos de la
invención, el tejido de donante es preferentemente del pulmón,
corazón, hígado, piel, riñón, páncreas, bazo o médula ósea.
En determinadas formas de realización preferidas
de todos los aspectos anteriores de la invención, el conjunto de
aglutinantes se inmoviliza en un soporte en fase sólida (por
ejemplo una placa de microvaloración). En las formas de realización
preferidas de los primer, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto,
séptimo, octavo, noveno, décimo, undécimo y duodécimo aspectos de
la invención, el mamífero donante y/o receptor es un ser humano o
un animal domesticado.
La Figura 1 es una representación esquemática de
una membrana típica de la pared de la célula
gram-positiva. La Figura 2 es una representación
esquemática de la estructura de lipopolisacárido (LPS) encontrada
en la pared celular de bacterias Gram-negativas.
Las Figuras 3A-3D son
representaciones esquemáticas de un dispositivo según una forma de
realización de la invención. La Figura 3A presenta el dispositivo
sin adición de una muestra de sangre o de un producto sanguíneo (o
ausente la adición de un fluido en el que está almacenado un tejido
de donante). La Figura 3B muestra el dispositivo en el punto de
tiempo en el que se añade la muestra de sangre o el producto
sanguíneo.
La Figura 3C representa el contacto de la
muestra de fluido corporal con el dispositivo.
La Figura 3D presenta un resultado positivo
utilizando el dispositivo según la invención, lo que indica que la
muestra de sangre o el producto sanguíneo analizado estaba
contaminado con un microorganismo.
Las Figuras 4A-4D son
representaciones esquemáticas de un procedimiento según la
invención. La Figura 4A presenta la adición de una muestra de
sangre, de producto sanguíneo de un fluido en el que el tejido de
donante está almacenado en el dispositivo de análisis. La Figura 4B
presenta la adición de unas perlas de látex recubiertas con
anticuerpos que se unen específicamente tanto a las bacterias
Gram-negativas como Gram-positivas
en el dispositivo de análisis. La Figura 4C presenta la mezcla de la
muestra con las perlas de látex recubiertas de anticuerpo en el
dispositivo de análisis. La Figura 4D presenta los resultados
visuales de la unión negativa (es decir, sin bacterias en la
muestra; izquierda) y de la unión (es decir, la presencia de
bacterias en la muestra: derecha).
La Figura 5 es una representación gráfica del
número de bacterias Gram-positivas diferentes
(indicadas) unidas específicamente por un aglutinante no limitativo
de la invención, anticuerpo con ácido lipoteicoico.
La Figura 6 es una representación gráfica del
número de bacterias Gram-negativas diferentes
(indicadas) unidas específicamente por un aglutinante no limitativo
de la invención, anticuerpo con lipopolisacárido.
La invención se refiere a la detección de una
cantidad clínicamente pertinente de una bacteria contaminante en la
sangre, en un producto sanguíneo o en un tejido de donante,
particularmente en la sangre donada o en un producto sanguíneo
tejido donado que es transferido de un individuo donante a un
individuo receptor. La invención proporciona procedimientos rápidos
basados en la unión del antígeno para detectar cantidades
clínicamente pertinentes de microorganismos en la sangre o en
productos sanguíneos o en el fluido en el que está almacenado el
tejido de donante. La invención surge del reconocimiento de que la
identidad exacta de las bacterias contaminantes en la sangre de
donante, en un producto sanguíneo o en el tejido de donante que ha
de utilizarse para la transfusión o trasplante es inapropiada. Por
consiguiente, la invención proporciona procedimientos utilizando
aglutinantes que se unen específicamente tanto a bacterias
Gram-positivas como Gram-negativas
para detectar cualquier unión a una muestra de sangre o a un
producto de sangre o a una muestra de un fluido en el que está
almacenado el tejido de donante. Por lo tanto, si se detecta alguna
unión, la sangre o el producto sanguíneo o el tejido de donante es
conocido que está contaminado, y preferentemente no se utilizará
para la transferencia a otro individuo.
La patente publicada y la bibliografía
científica mencionada en la presente memoria constituyen el
conocimiento que está disponible para los expertos en la materia.
Las patentes, solicitudes y referencias publicadas que se mencionan
en la presente memoria están incorporadas a la misma como
referencia en la misma extensión que si cada una se indica
específica e individualmente para ser incorporadas como referencia.
Cualquier contradicción entre estas publicaciones y la presente
descripción se resolverá a favor de la presente descripción.
En un primer aspecto, la invención proporciona
un procedimiento, según la reivindicación 1, para identificar la
presencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en
la sangre de donante o en un producto sanguíneo de un mamífero
donante para transferirlo a un mamífero receptor. El procedimiento
comprende poner en contacto una muestra de sangre o un producto
sanguíneo con una serie de aglutinantes, en el que el conjunto de
aglutinantes comprende aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo y aglutinantes
que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y determinar la unión del conjunto de
aglutinantes a la muestra, en el que la unión indica la presencia
de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en la sangre o
en el producto sanguíneo de donante y la falta de unión indica la
ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias en la
sangre o en el producto sanguíneo de donante. En las formas de
realización preferidas el mamífero donante y/o receptor es un ser
humano o un mamífero domesticado (por ejemplo, un gato, perro,
caballo o cerdo).
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"sangre o producto sanguíneo" incluye cualquier célula
encontrada en la sangre o en la médula ósea, así como cualquier
producto obtenido de la sangre o de la médula ósea incluyendo, sin
limitación, la sangre completa, los glóbulos rojos, las plaquetas,
el suero, el plasma, las células madre hematopoyéticas y los
leucocitos (incluyendo los linfocitos). El biólogo experto
normalmente apreciará que sin adición de agentes anticoagulantes tal
como EDTA o heparina, la sangre completa se coagulará, haciendo
inutilizable la mayoría de las células sanguíneas en la
transfusión. Por consiguiente, la sangre tratada con cualquier
agente anticoagulante está incluida en la expresión, "sangre o
producto sanguíneo". Además, durante el aislamiento de productos
sanguíneos específicos (por ejemplo, las plaquetas utilizando
plaquetoforesis), pueden añadirse a la sangre compuestos no
sanguíneos, tal como la solución salina fisiológica. Por
consiguiente también está incluida en la expresión, "sangre o
producto sanguíneo" la sangre a la que se ha añadido cualquier
sustancia biológicamente inerte, tal como la solución salina
fisiológica, agua o una solución nutriente de almacenamiento.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "cantidad clínicamente pertinente" se utiliza para
significar una cantidad de contaminación bacteriana en una sangre o
producto sanguíneo que es igual o superior que una cantidad que,
cuando está presente en una sangre o producto sanguíneo se
tranfusiona en el receptor de la transfusión, produce, sin
limitación, cualquiera de los síntomas siguientes en el receptor
transfundido "fiebre, temblores, hipotensión, náuseas/vómitos,
cefalea, disnea, oliguria, diarrea, dolor en el punto de la
infusión, urticaria, lagrimeo, dolor de pecho, petequia y
equimosis, coagulación intravascular diseminada, choque séptico,
insuficiencia orgánica y muerte" (véase, por ejemplo,
Morduchowicz, G. et al., Reviews of Infectious
Diseases 13: 307 (1991)). Debido al tiempo rápido de división de
las bacterias, la cantidad de bacterias en la sangre debería
determinarse tan próxima al tiempo de transfusión como sea posible.
Por lo general, en el momento de la transfusión, una cantidad
clínicamente pertinente es mayor de 1x10^{7} unidades formadoras
de colonias (CFU) por ml de sangre o producto sanguíneo.
Preferentemente, en el momento de la transfusión, una cantidad
clínicamente pertinente es mayor de 1 x 10^{6} CFU/ml. Más
preferentemente, en el momento de la transfusión, una cantidad
clínicamente pertinente es mayor de 1 x 10^{5} CFU/ml. Aún más
preferentemente, en el momento de la transfusión una cantidad
clínicamente pertinente es mayor de 1 x 10^{4} CFU/ml. Aún más
preferentemente, en el momento de la transfusión una cantidad
clínicamente pertinente es mayor de 1 x 10^{3} CFU/ml. Con la
máxima preferencia, en el momento de la transfusión una cantidad
clínicamente pertinente es mayor de 1 x 10^{2} CFU/ml. Desde
luego, cualquier experto en la industria de la medicina de
transfusión reconocerá que aunque algunos individuos, tal como
pacientes o recién nacidos gravemente inmunoinsuficientes, tendrán
un sistema inmunitario que es incapaz de eliminar una cantidad de
bacterias que es inferior a una cantidad clínicamente pertinente.
Sin embargo, cualquier experto en la materia apreciará que los
procedimientos de la invención serán suficientes para la
identificación de sangre y productos sanguíneos que han de
utilizarse para la transfusión en la amplia mayoría de
pacientes.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"se une específicamente" significa que un aglutinante (por
ejemplo, un anticuerpo) reconoce y se une a un ligando específico
(por ejemplo, un polipéptido, carbohidrato, lípido o
glucoproteína), pero no reconoce sustancialmente ni se une a otras
moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica que
incluye naturalmente muchas proteínas diferentes. Asimismo, un
ligando unido por un aglutinante que se une específicamente a este
ligando se dice que está "específicamente unido" por este
aglutinante. La asociación formada entre el aglutinante y su
ligando puede ser covalente y preferentemente no es covalente.
Preferentemente, un aglutinante que se une específicamente a un
ligando forma una asociación con este ligando con una afinidad de
por lo menos 10^{6} M^{-1}, más preferentemente, por lo menos
10^{7} M^{-1}, aún más preferentemente, por lo menos 10^{8}
M^{-1} y aún más preferentemente, por lo menos 10^{9} M^{-1}
ya sea en agua, en condiciones fisiológicas, o en condiciones que se
aproximan a las condiciones fisiológicas con respecto a la fuerza
iónica, por ejemplo, NaCl 140 mM, MgCl_{2} 5 mM.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"antígeno" (por ejemplo, un antígeno bacteriano
Gram-negativo o un antígeno bacteriano
Gram-positivo) significa cualquier molécula, con la
excepción de moléculas de ácido nucleico y peptidoglucanos, en
cualquier configuración estructural que puede estar unido
específicamente por un aglutinante. Por ejemplo, un antígeno
bacteriano Gram-negativo es un antígeno que es
segregado por, interno a o presente en (o mediante) la membrana
celular, la pared celular o el espacio periplásmico de una bacteria
Gram-negativa. El punto en el antígeno que está
unido por el aglutinante se denomina "sitio de unión". Un
antígeno puede ser, sin limitación, una proteína, una
glucoproteína, un carbohidrato o un lípido. Se excluyen
específicamente de la definición de antígeno según la presente
invención los peptidoglucanos y las moléculas de ácido nucleico,
tal como ADN o ARN.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"bacteria Gram-positiva" significa una cepa,
tipo, especie o género de bacterias que, cuando se exponen a la cepa
Gram, conserva el color y está, de este modo, teñida de
azul-púrpura.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"bacteria Gram-negativa" significa una cepa,
tipo, especie o género de bacteria que, cuando se expone a la cepa
Gram no conserva el color ni está, de este modo, teñida de
azul-púrpura. Cualquier experto reconocerá, desde
luego, que dependiendo de la concentración del tinte y de la
duración de la exposición, una bacteria
Gram-negativa puede recoger una pequeña cantidad de
cepa Gram y llegar a teñirse de azul-púrpura claro.
Sin embargo, en comparación con una bacteria
Gram-positiva teñida con la misma formulación de la
cepa Gram para el mismo tiempo, una bacteria
Gram-negativa será mucho más
azul-púrpura clara en comparación con una bacteria
Gram-positiva.
La pared de la célula bacteriana es una
estructura compleja y semirrígida, que define la forma del
organismo, rodea la membrana citoplásmica frágil subyacente, y
protege la célula bacteriana del medio externo. La pared de la
célula bacteriana está compuesta por una red macromolecular
conocida como peptidoglucano, que comprende carbohidratos y
polipéptidos que forman una retícula alrededor de la célula
bacteriana. La pared de la célula bacteriana proporciona la
estabilidad mecánica de la célula bacteriana y evita la Tisis
osmótica. La más apropiada para la presente invención, es la
composición química de la pared celular que se utiliza para
diferenciar la principal especie de bacteria.
Las paredes celulares de diferentes especies de
bacterias pueden diferenciarse mucho en espesor, estructura y
composición. Sin embargo, existen dos tipos predominantes de pared
de célula bacteriana, y si una especie dada de bacteria presenta
uno u otro tipo de pared celular puede generalmente determinarse por
la reacción de la célula a determinados tintes. Quizás el tinte más
utilizado para teñir bacterias es la tinción Gram. Cuando se tiñen
con este violeta cristal y tinción de yodo, las bacterias que
conservan el tinte se denominan Gram-positivas y las
que no se denominan Gram-negativas.
La pared celular bacteriana
Gram-positiva contiene una capa relativamente espesa
de peptidoglucano. Esta estructura está dispuesta en forma de
unidades repetidas de carbohidrato de
N-acetilglucosamina (NAG) y ácido
N-acetilmurámico (NAM) unido por enlaces
\beta-1,4 glucosídicos. Los restos de ácido
N-acetilmurámico se reticulan a cadenas adyacentes
(NAM-NAG))_{x} (donde x=cualquier número) mediante
tetrapéptidos donde los péptidos 2 y 3 pueden presentar alguna
variabilidad en la naturaleza del péptido. Algunas de las
reticulaciones se extienden por encima y por debajo del plano que
hace las capas múltiples del peptidoglucano. Estos polímeros rodean
la superficie de la célula, con lo que definen la forma del
organismo.
Dentro de la pared celular
Gram-positiva está situado un compuesto de
lipopolímero que contiene ácidos lipoteicoicos (LTA) que pueden
construir una masa considerable de las paredes celulares de algunas
especies. Estos polímeros están compuestos de fosfato
principalmente de glicerol (o ribitol). La Figura 1 presenta una
representación esquemática de una membrana de la pared celular
bacteriana Gram-positiva típica. Debido a su gran
polaridad y carga neta positiva, las estructuras de ácido
lipoteicoico se cree que regulan el flujo iónico y de nutrientes
dentro y fuera de la célula bacteriana. Las estructuras de LTA son
muy antigénicas y pueden formar las bases de la especificidad
molecular requerida para permitir la amplia detección de esta clase
de bacterias. Debido a que los ácidos lipoteicoicos son comunes en
las bacterias Gram-positivas, los procedimientos
analíticos que reconocen esta estructura serían muy indicadores de
la contaminación por bacterias Gram-positivas. Dado
que la estructura química de los polímeros del ácido lipoteicoico
se conserva razonablemente entre varias cepas de bacterias
Gram-positivas, el sondado para la presencia de esta
estructura de la pared celular permite la detección de múltiples
bacterias Gram-positivas.
La pared celular de las bacterias de tipo
Gram-negativo está estratificada de manera distinta
en aspecto y es mucho más gruesa que la pared celular de las
Gram-positivas. La pared celular de las bacterias
Gram-negativas es similar a las de las
Gram-positivas porque está construida sobre una
proteína que contiene la bicapa de lípido; sin embargo, los lípidos
que se enfrentan internamente son fosfolípidos, mientras que los
lípidos que se enfrentan externamente incluyen macromoléculas
denominadas lipopolisacáridos (LPS). Esta estructura LPS crea una
fuerte carga negativa en la superficie externa de la célula, que es
utilizada para el reconocimiento y supervivencia del organismo.
Esta estructura LPS también proporciona el efecto tóxico de una
infección Gram-negativa y por esta razón es
denominada también "endotoxina".
La estructura del componente LPS, se ha descrito
en numerosos estudios y se presenta en la Figura 2. En general, la
estructura del antígeno LPS puede describirse como que contiene
tres zonas distintas. La zona más externa, que se denomina zona
específica para O y está constituida por cadenas lineales o
ramificadas de carbohidratos, es muy variable y por lo general es
distinta en cada una de las especies. Los ensayos de serología
utilizan esta diferencia para permitir la identificación de cepas
específicas de bacterias Gram-negativas. La
presencia de las cadenas O crea un aspecto de una superficie lisa
al examen microscópico. En cambio, las especies de mutantes sin las
cadenas laterales específicas para O parecen rugosas. La mayoría de
los tipos naturales se denominan por consiguiente cepas
"lisas", mientras que los mutantes sin esta estructura se
denominan cepas "rugosas".
Interna a la zona específica para O en la
estructura LPS está la zona del polisacárido del núcleo, que
presenta un elevado grado de homología entre los géneros. La zona
del núcleo puede dividirse más en dos zonas el "núcleo interno"
y el "núcleo externo". El núcleo externo de la zona del núcleo
presenta alguna variabilidad pero tiene elementos comunes, y
generalmente contiene glucosa, galactosa,
N-acetil-glucosamina y otros
carbohidratos. El núcleo interno de la zona del núcleo de todos los
LPS que expresan bacterias Gram-negativas contiene
estructuras químicamente idénticas. El núcleo interno se compone de
restos de heptosa y
2-ceto-3-deoxi-octonato
(KDO).
El componente más interno de la estructura de
LPS es la estructura de lípido A, que constituye la parte
químicamente más uniforme del LPS. El lípido A está compuesto por un
disacárido
\beta-glucosaminil-(1\rightarrow6)-\alpha-glucosamina
que está fosforilado en cada uno de los terminales de carbohidrato
distales. El eje central del carbohidrato está acilado en cada uno
de los 2,3 centros por derivados sustituidos del ácido mirístico.
Las cadenas laterales de ácido graso presentan algunos grados
menores de modificación dependiente de la especie, pero estos
ácidos grasos están incorporados en la membrana celular y no están
disponibles para inmunorreconocimiento. La generación del anticuerpo
es probablemente resultado de la estructura del eje central del
disacárido bisfosforil-glucosamina expuesto en la
superficie que está muy conservada.
La variabilidad estructural de la estructura de
LPS disminuye a partir de la zona específica para O expuesta en
superficie en las zonas del núcleo más interno y más externo al
derivado del disacárido y el componente del lípido A impregnado en
la membrana. La razón de este gradiente de variabilidad se cree que
es la presión cambiante ejercida en la bacteria
Gram-negativa. Es concebible que los microbios
cambien su estructura de la superficie expuesta a lo largo del
tiempo para responder a esta presión.
Como en las estructuras de ácido lipoteicoico en
las bacterias Gram-positivas, pueden utilizarse las
estructuras de lipopolisacárido conservadas entre los géneros en las
bacterias Gram-negativas como metodología para la
detección amplia. Estas dianas únicas (ácidos lipoteicoicos en las
zonas Gram-positiva y lípido A o centrales de la
estructura LPS de bacterias Gram-negativas) son la
base de la metodología de detección de la clase del
microorganismo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
"aglutinante" es una molécula o macromolécula capaz de unirse
a un ligando, con la excepción de que el aglutinante no es un
agente natural presente en el cangrejo de herradura (por ejemplo,
Limulus polyphemus) que se une a la endotoxina.
Preferentemente, el aglutinante de la invención no es un agente
recombinante derivado de un agente presente en el cangrejo de
herradura (por ejemplo, Limulus polyphemus) que se une a la
endotoxina. Un aglutinante puede ser, sin limitación, un
anticuerpo, un antibiótico, una proteína, una proteína de fusión
(es decir, una proteína que comprende porciones de dos o más
proteínas) o un quelante químico. En determinadas formas de
realización preferidas, un aglutinante según la invención es un
péptido o un péptido mimético. En el contexto de la invención, un
"péptido" es una molécula compuesta por una red lineal de
restos de aminoácidos conectada entre sí en la disposición lineal
de enlaces peptídicos. Dichos péptidos según la invención pueden
incluir desde aproximadamente tres a aproximadamente 500
aminoácidos, y pueden incluir además estructuras secundarias,
terciarias o cuaternarias, así como asociaciones intermoleculares
con otros péptidos u otras moléculas no peptídicas. Dichas
asociaciones intermoleculares pueden ser aunque, sin limitación,
enlace covalente (por ejemplo, mediante enlaces disulfuro), o por
quelación, interacciones electrostáticas, interacciones hidrófobas,
enlace de hidrógeno, interacciones ión-dipolo,
interacciones dipolo-dipolo o cualquier combinación
de las anteriores.
En determinadas formas de realización
preferidas, dicho aglutinante comprende una zona determinante de
complementariedad (CDR) de un anticuerpo que se une en condiciones
fisiológicas a un epítopo que contiene antígeno de una estructura de
lipopolisacárido (LPS) de una bacteria
Gram-negativa o una estructura de ácido lipotecoico
(LTA) de una bacteria Gram-positiva o un
peptidomimético de dicha zona determinante de complementariedad. En
el contexto de la invención, una "zona determinante de
complementariedad de un anticuerpo" es la fracción de un
anticuerpo que se une en condiciones fisiológicas a un epítopo,
incluyendo cualquier zona del marco necesaria para dicha unión, y
que está preferentemente compuesta por un subconjunto de restos de
aminoácidos codificados por la cadena pesada humana V, D y las zonas
J, la cadena ligera humana V y las zonas J y/o combinaciones de las
mismas. Ejemplos de dichas formas de realización preferidas
incluyen un anticuerpo, o un derivado del anticuerpo, que puede más
preferentemente ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano,
un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo
híbrido o un fragmento de anticuerpo que se une al antígeno.
Los expertos en la materia podrán preparar
cualquiera de dichos derivados de anticuerpo utilizando técnicas
habituales reconocidas en la materia. Por ejemplo, Jones et
al. (Nature 321: 522-525 (1986)) da a
conocer la sustitución de las CDR de un anticuerpo humano con las
de un anticuerpo de ratón. Marx (Science 229:
455-456 (1985) expone anticuerpos híbridos que
tienen zonas variables de ratón y zonas constantes humanas. Rodwell
(Nature 342: 99-100 (1989)) expone elementos
de reconocimiento de peso molecular inferior procedentes de la
información de la CDR del anticuerpo. Clackson (Br. J.
Rheumatol. 3052: 36-39 (1991)) expone
anticuerpos monoclonales modificados genéticamente, que incluyen
derivados de fragmento Fv, anticuerpos monocatenarios, proteínas de
fusión, anticuerpos híbridos y anticuerpos de roedor humanizado.
Reichman et al. (Nature 332: 323-327
(1988)) da a conocer un anticuerpo humano en el que se ha injertado
zonas hipervariables. Verhoeyen et al. (Science 239:
1534-1536 (1988)) da a conocer el injerto de una
zona de unión del antígeno de ratón sobre un anticuerpo humano.
Además, los expertos en la materia pueden
diseñar y producir peptidomiméticos que tienen características de
unión similares o superiores a dicha zona determinante de
complementariedad (véase por ejemplo, Horwell et al.,
Bioorg. Med. Chem. 4: 1573 (1996); Liskamp et al.,
Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1: 113 (1994);
Gante et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 1699
(1994); Seebach et al., Helv. Chim. Acta 79: 913
(1996)). Por consiguiente, se considera que todos los dichos
derivados del anticuerpo y peptidomiméticos del mismo están dentro
del alcance de la presente invención. Las composiciones según la
invención pueden incluir además diluyentes, agentes estabilizantes,
agentes de localización o tampones fisiológicamente aceptables.
Los aglutinantes adicionales preferidos para la
invención incluyen pequeñas moléculas, que pueden identificarse
utilizando métodos de diseño de identificación o racional como los
expuestos a continuación en la presente memoria.
Aún más preferentemente, los aglutinantes de la
presente invención son anticuerpos, tales como anticuerpos
policlonales o anticuerpos monoclonales y/o derivados de
anticuerpo. La generación de anticuerpos monoclonales y policlonales
resultarán evidentes para cualquier experto en materia de biología
(véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, NY,
1994). Numerosos procedimientos son útiles en la producción de
anticuerpos contra los antígenos diana únicos deseados. La
inmunización tradicional y las técnicas de recogida darán como
resultado la creación de anticuerpos policlonales dirigidos contra
determinantes comunes de la especie bacteriana de diana (LTA o LPS).
Además, pueden utilizarse técnicas de hibridación celular para
producir estirpes celulares de hibridoma inmortal que generen
anticuerpos monoclonales específicos contra la especie de la
diana.
\newpage
Los anticuerpos que presentan utilidad potencial
para las bacterias Gram-positivas que se detectan
ampliamente incluyen las descritas en Fisher et al.,
publicación PCT nº WO 98/57994; Jackson, D.E. et al.,
Infection and Immunity 43: 800 (1984); Hamada, S. et
al., Microbiol. Immunol. 28: 1009 (1984); Aasjord, P.
et al., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect.
C, 93: 245 (1985); McDaniel, L.S. et al., Microbial
Pathogenesis 3: 249 (1987); Tadler, M.B. et al.,
Journal of Clinical Laboratory Analysis 3: 21 (1989); y
Stuertz, K. et al., Journal of Clinical Microbiology
36: 2346 (1998).
Los anticuerpos con utilidad potencial para
detectar ampliamente bacterias Gram-negativas
incluyen los descritos en Nelles, M.J. et al., Infect.
Immun. 46: 677 (1984); Teng, N.N.H. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82: 1790 (1985); Dunn, D.L. et al.,
Surgery 98: 283 (1985); De Jongh-Leuvenink,
J. et al., Eur. J. Clin. Microbiol. 5: 148 (1986);
Bogard, W.C. et al., Infect. Immun. 55: 899 (1987);
Pollack, M. et al., Bacterial Endotoxins:
Pathophysiological Effects, Clinical Significance, and
Pharmacological Control págs. 327-338 Alan R.
Liss, Inc. (1988); Priest, B.P. et al., Surgery 106:
147 (1989); Tyler, J.W. et al., Journal of Immunological
Methods 129: 221 (1990); Siegel, S.A. et al., Infect.
Immun. 61: 512 (1993); Shelburne, C.E. et al., J.
Periodont. Res. 28: 1 (1993); Di Pardova, F.E. et al.,
Infect. Immun. 61: 3863 (1993); y De Kievit, T.R. y Lam, J.S.
J. Bacteriol. 176: 7129 (1994).
La selección en cuanto a qué
anticuerpo(s) utilizar puede realizarse mediante técnicas
clásicas. La especificidad del anticuerpo, la extensión del enlace y
las cinéticas pueden caracterizarse experimentando prácticamente
cada anticuerpo en un formato empírico. Los formatos de
identificación por microvaloración están bien documentados en la
bibliografía para ayudar a caracterizar la respuesta específica al
anticuerpo en cualquier formato de inmunoanálisis dado. Asimismo,
las actividades de los anticuerpos marcados detectablemente pueden
caracterizarse porque ejecutan una variedad de técnicas de
conjugación química y de identificar el producto resultante para los
parámetros de rendimiento óptimo. El anticuerpo de captura y el
anticuerpo marcado de manera detectable pueden identificarse frente
a cepas clínicas de bacterias de plaquetas retenidas o de muestras
de glóbulos rojos para emular el rendimiento del ensayo final tan
cerca de la forma de realización del producto final como sea
posible. Esta experimentación conduce a la selección y optimización
de reactivos del anticuerpo para aplicación en varios formatos de
análisis descritos a continuación. Si se identifican aglutinantes
que realizan prácticamente mejor que las alternativas de anticuerpo
descritas o generadas, entonces se evalúan en el mismo formato
empírico descrito para los anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales con especificidad
hacia las dianas de cruce de género exclusivas en las superficies
celulares bacterianas se utilizan para desarrollar un formato de
ensayo de detección de clase. Si los únicos clones de anticuerpo no
proporcionan el límite de sensibilidad de detección deseado (tal
como puede ser el caso con las sustituciones en la estructura de
LTA) para cada especie, pueden utilizarse mezclas de anticuerpos
monoclonales. Extensiones más allá de ésta para LPS podrían incluir
la creación de antisueros policlonales con amplia especificidad a
través de las diferentes especies Gram-negativas.
Los anticuerpos policlonales pueden también sustituirse en cada uno
de los formatos analíticos descritos a continuación.
Incluso otro tipo de aglutinante de la invención
son los receptores de unión que son distintos de las
inmunoglobulinas.
Determinados procedimientos preferidos utilizan
el acomplejado de bacterias Gram-negativas con
dichas especies no limitativas como el factor antilipopolisacárido
de Limulus (LALF), polimixinas, proteína catiónica
antimicrobiana (CAP18), Miloide P del suero, magaininas,
bactenecinas, receptor 4 similar a Toll (TLR-4),
proteína de unión al lipopolisacárido (LBP) y proteína con aumento
de bactericida/permeabilidad (BPI), así como antibióticos tales
como Bacitracina y otros antibióticos. Determinados procedimientos
preferidos utilizan el acomplejado de bacterias
Gram-positivas con dichas especies no limitativas
como la proteína de unión a la manosa (MBP), el receptor 2 de tipo
Toll (TLR-2), histatinas y antibióticos, donde el
antibiótico no es la vancomicina ni la genamicina. Determinados
procedimientos preferidos utilizan el acomplejado tanto de
bacterias Gram-negativas como bacterias
Gram-positivas con dichas especies no limitativas
como CD14, péptidos catiónicos
\alpha-helicoidales, lactoferricina B, proteínas
microbianas de plaquetas y péptidos neutrófilos (defensinas). Cada
uno de estos aglutinantes tiene capacidad para unirse a amplios
géneros de bacterias y podría utilizarse en tándem o como
alternativa para los reactivos de acomplejado inmunitario.
Los anticuerpos y los aglutinantes indicados
anteriormente pueden utilizarse como se describió o modificarse
según sea necesario para producir un reactivo inmunológico
útil.
Según el primer aspecto de la invención, la
presencia o ausencia de unión puede determinarse según las técnicas
habituales, incluyendo la utilización de ensayos de unión según la
invención, tal como se describe a continuación. En general, una
determinación de "unión" (es decir, la presencia de una
clínicamente pertinente bacteria en la sangre o producto sanguíneo)
se encuentra cuando la muestra del donante se une por lo menos a
0,5\times mayor que la unión de fondo, en la que el fondo es una
muestra de sangre o producto sanguíneo que está exenta de cualquier
contaminación por bacterias. Por ejemplo, una muestra de plaquetas
del donante se compara con un fondo que comprende una muestra de
plaquetas que está exenta de cualquier contaminación por bacterias.
De este modo, cuando el fondo es de 0,1 unidades (por ejemplo,
determinado por un lector de placas de microvaloración), se
encuentra una determinación de "enlace" cuando la muestra de
la sangre de donante o el producto sanguíneo es por lo menos 0,15
unidades. Más preferentemente, se encuentra una determinación de
"enlace" cuando la muestra del donante se une por lo menos
0,75\times superior a la unión de fondo. Aún más preferentemente,
se encuentra una determinación de "aglutinante", cuando la
muestra del donante se une al menos a 1,0\times mayor que el
fondo. Aún más preferentemente, se encuentra una determinación de
"aglutinante" cuando la muestra del donante se une al menos
1,25\times mayor que el fondo. Más preferentemente, se encuentra
una determinación de "aglutinante" cuando la muestra del
donante se une al menos a 1,5\times superior al fondo.
En determinadas formas de realización del primer
aspecto de la invención, la muestra se trata antes de o de manera
concomitante poniendo en contacto la muestra con el conjunto de
aglutinantes. Preferentemente, el tratamiento expone un sitio de
unión para el aglutinante o el antígeno bacteriano
Gram-negativo o en el antígeno bacteriano
Gram-positivo. Un sitio de unión en un antígeno
bacteriano puede exponerse, por ejemplo separando un antígeno de la
pared celular o membrana celular de la bacteria, exponiendo de este
modo el sitio de unión; provocando que la bacteria segregue el
antígeno, exponiendo de este modo el sitio de unión; lisando la
bacteria, liberando de este modo un antígeno bacteriano
intracelular y exponiendo de este modo el sitio de unión en el
antígeno; o provocando un cambio de configuración en el antígeno
bacteriano, exponiendo de este modo el sitio de unión. Dichos
tratamientos incluyen la destrucción mecánica de las células
bacterianas en la muestra por medios físicos, incluyendo, sin
limitación, tratamiento con ultrasonidos, ebullición, o utilizando
la homogeneización, por ejemplo, un homogeneizador Dounce. El
tratamiento puede ser también el tratamiento de la muestra por
medios químicos con un compuesto o composición, tal como un
detergente, una solución básica (para Tisis alcalina), una solución
ácida (para Tisis ácida), EDTA, EGTA, un ión metálico, un anión, un
catión, un tensioactivo, un quelante, y/o una enzima, el
tratamiento expone un sitio de unión para el aglutinante en el
antígeno bacteriano Gram-negativo o en el antígeno
bacteriano Gram-positivo.
En una forma de realización del primer aspecto
de la invención, la sangre o el producto sanguíneo de donante que
se ha determinado que presenta ausencia de una cantidad
clínicamente pertinente de bacterias se transfiere a un mamífero
receptor. "Transferencia" significa la administración,
transfusión, trasplante o transmitancia de la sangre, producto
sanguíneo y/o tejido de un donante mamífero a un mamífero receptor.
Preferentemente, el mamífero donante del que se obtuvo la muestra de
sangre o de producto sanguíneo y el mamífero receptor son de la
misma especie. Según los procedimientos de la presente invención,
en la sangre de donante o un producto sanguíneo de donante puede
identificarse rápidamente la presencia de cualquier bacteria
contaminante, a diferencia de la cepa o tipo de bacteria
contaminante. Se entenderá que dada la rápida velocidad de
propagación de las bacterias en la sangre o en un producto
sanguíneo, es preferible hacer la transfusión del receptor deseado
con la sangre o producto sanguíneo de donante que carece de una
cantidad clínicamente pertinente de bacterias, tal como se
determinó según la invención, después de una breve experimentación.
Preferentemente, la cantidad clínicamente pertinente de sangre o
producto sanguíneo de donante exenta de bacterias se administra como
una transfusión al paciente no más de 42 días después del comienzo
de la experimentación, más preferentemente, no más de 30 días
después de la experimentación, más preferentemente, no más de 2
semanas después de la experimentación, más preferentemente no más
de 7 días después de la experimentación, aún más preferentemente no
más de 3 días después de la experimentación, aún más
preferentemente, no más de 2 días después de la experimentación,
todavía más preferentemente, no más de 24 horas tras la
experimentación, todavía más preferentemente, no más de 12 horas
tras la experimentación, todavía más preferentemente, no más de 6
horas después de la experimentación y todavía más preferentemente,
la sangre o producto sanguíneo de donante se observa que carece de
una cantidad clínicamente pertinente de bacterias se transfunde en
el receptor dentro de las 3 horas de la iniciación de la
experimentación. Aún más preferentemente, la sangre o producto
sanguíneo es sangre completa, células madre hematopoyéticas,
leucocitos, plaquetas, glóbulos rojos, plasma o suero.
En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo comprenden
anticuerpos o derivados de anticuerpo que se unen específicamente a
un antígeno bacteriano Gram-negativo. En
determinadas formas de realización preferidas, los aglutinantes que
se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden una molécula seleccionada
del grupo constituido por el factor antilipopolisacárido de
Limulus (LALF), una proteína de unión al lipopolisacárido
(LBP), una proteína con aumento de bactericida/permeabilidad (BPI)
y un antibiótico, tal como polimixina o bacitracina.
Preferentemente los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo se unen
específicamente a la estructura de lipopolisacárido de las
bacterias Gram-negativas.
En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente al antígeno
bacteriano Gram-positivo comprenden anticuerpos o
derivados de anticuerpo que se unen específicamente al antígeno
bacteriano Gram-positivo. En determinadas formas de
realización, los aglutinantes que se unen específicamente al
antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden un
antibiótico, en el que el antibiótico no es la vancomicina ni es la
genamicina. Preferentemente, los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano Gram-positivo
se unen específicamente a la estructura de ácido lipotecoico de
bacterias Gram-positivas.
Cualquier biólogo experto apreciará que en la
invención puede utilizarse cualquier combinación de uno o más
aglutinantes diferentes. Por lo tanto, un antibiótico que une
específicamente un subconjunto de bacterias
Gram-positivas puede combinarse con un anticuerpo
que se une específicamente a las bacterias
Gram-positivas restantes y un segundo anticuerpo
que se une específicamente a todas las bacterias
Gram-negativas.
En varias formas de realización del primer
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo se marcan de manera detectable con
una primera molécula indicadora y los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivos se marcan de manera detectable con
una segunda molécula indicadora. En una forma de realización, la
primera molécula indicadora y la segunda molécula indicadora son
las mismas. En otra forma de realización, la primera molécula
indicadora y la segunda molécula indicadora no son las mismas.
Preferentemente, una o ambas de la primera molécula indicadora y la
segunda molécula indicadora es una molécula con actividad
enzimática, una molécula radiomarcada, una molécula de fusión, una
molécula fluorógena, un sol metálico (por ejemplo, sol de oro o sol
de plata), una partícula, una molécula cromática, o una molécula
que está unida específicamente por un aglutinante secundario.
"Aglutinante secundario" significa un aglutinante que se une
específicamente al aglutinante que se une específicamente a la
bacteria Gram-negativa, a la bacteria
Gram-positiva o a ambas. Por ejemplo, cuando los
aglutinantes que se unen específicamente a bacterias
Gram-negativas y bacterias
Gram-positivas son todos anticuerpos monoclonales
murinos, un aglutinante secundario puede ser un anticuerpo
antimurino.
Por ejemplo, puede analizarse una muestra por
análisis FACScan con los aglutinantes que se unen específicamente a
un antígeno bacteriano Gram-positivo marcado de
manera detectable con FITC y los aglutinantes que se unen
específicamente al antígeno bacteriano
Gram-negativo marcado de manera detectable con
rodamina. Identificando FITC y/o la tinción con rodamina, puede
determinarse que la muestra no presenta ninguna contaminación
bacteriana Gram-positiva, pero puede observarse que
presenta un nivel clínicamente apropiado de contaminación bacteriana
Gram-negativa. Preferentemente, cuando esta muestra
procede de una unidad de sangre o producto sanguíneo de donante, la
unidad no se utilizaría para la transfusión.
El enlace covalente de una molécula indicadora a
un aglutinante (tal como un anticuerpo o antibiótico) da como
resultado que este aglutinante esté marcado de manera detectable.
La molécula indicadora utilizada principalmente en la mayoría de los
formatos de inmunoanálisis hoy en día es una molécula con actividad
enzimática. Los aglutinantes están por lo general químicamente
acoplados a enzimas. Esto produce un complejo que conserva
capacidad de unión inmunológica incluso al mismo tiempo permite
límites de detección aumentados utilizando la capacidad de
ampliación del par enzima/sustrato. Más de 20 marcadores de enzimas
diferentes se han descrito en la bibliografía para la producción de
conjugados enzimáticos. La peroxidasa del rábano picante, la
fosfatasa alcalina y la \beta-galactosidasa son
con mucho los más utilizados habitualmente. Las características
deseadas para un marcador enzimático incluyen, gran actividad
específica, pequeño tamaño, los productos de reacción se determinan
fácilmente y la estabilidad del complejo. La peroxidasa de rábano
picante se ha utilizado con un sustrato de peróxido de hidrógeno y
los colorantes siguientes: orto-fenilendiamina
(OPD), tetra-metilbencidina (TMB) y
diaminobencidina (DAB). La fosfatasa alcalina se ha utilizado con
fosfato de paranitrofenilo (PNPP) y
metil-umbiliferona. La
\beta-galactosidasa utiliza el
O-nitrofenil
\beta-D-galactopiranósido (ONPG)
como su sustrato.
Cuando la molécula indicadora es una enzima, la
actividad enzimática depende de la capacidad del aglutinante
enzimáticamente activo marcado de manera detectable para unir
específicamente al ligando diana (por ejemplo, LPA o LTA). El enlace
de la enzima al anticuerpo no debería afectar de manera
significativa la capacidad del aglutinante para unirse
específicamente a su diana, y no debería afectar de manera
significativa a la actividad catalítica de la enzima. Las
reacciones de reticulación típicas utilizan algún tipo de reactivo
hetero- u homo-bifuncional para unirse químicamente
a las dos especies conjuntamente. Existen actualmente sistemas
comercializados que pueden ser utilizados fácilmente por no
expertos.
Las alternativas a los marcadores enzimáticos
como moléculas indicadoras son los marcadores de partículas. Estos
pueden incluir partículas de látex; partículas de látex impregnadas
de colorante y partículas metálicas tales como oro o plata. Los
conjugados de partículas resultan adecuados para los ensayos de
punto final visible. Las partículas disponibles en el comercio
están comprendidas en el intervalo de tamaños de nanómetro a
micrómetro. El tamaño de partícula es importante ya que influye en
la detección del punto final. Las partículas de látex así como las
partículas metálicas están disponibles con varios grupos
químicamente reactivos en la superficie. Los fabricantes preparan
éstas de modo que pueden utilizarse procedimientos de conjugación
alternativos.
Por lo tanto, un aglutinante de la invención
puede marcarse de manera detectable con una molécula indicadora por
asociación intermolecular, o puede marcarse de manera detectable
por moléculas intermedias a la molécula indicadora por asociación
intermolecular. Dichas asociaciones intermoleculares pueden ser
aunque, sin limitación, enlace covalente (por ejemplo mediante
enlaces disulfuro), o mediante quelación, interacciones
electrostáticas, interacciones hidrófobas, enlace de hidrógeno,
interacciones ión-dipolo, interacciones
dipolo-dipolo o cualquier combinación de las
anteriores. Las moléculas indicadoras preferidas incluyen, sin
limitación, radioisótopos, metales pesados, marcadores
fluorescentes, marcadores cromáticos, marcadores
quimioluminiscentes, enzimas y sustratos enzimáticos. Las muestras
biológicas preferidas incluyen sangre, suero, plasma, glóbulos
rojos, plaquetas y glóbulos blancos. En determinadas formas de
realización preferidas, el procedimiento según este aspecto de la
invención toma la forma de un inmunoanálisis convencional, tal como
ELISA o RIA. En otra forma de realización preferida, el
procedimiento utiliza inmunofluorescencia directa o indirecta.
En una forma de realización preferida del primer
aspecto de la invención, el conjunto de aglutinantes está
inmovilizado en un soporte en fase sólida (por ejemplo, una placa
de microvaloración).
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un procedimiento según la reivindicación 2 para identificar la
presencia de una cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-positivas en la sangre o en un producto
sanguíneo de donante procedente de un mamífero donante para
transferirlo a un mamífero receptor. El procedimiento comprende
poner en contacto una muestra de la sangre de donante o un producto
sanguíneo con una serie de aglutinantes, en el que el conjunto de
aglutinantes comprende aglutinantes que se unen específicamente a
un antígeno bacteriano Gram-positivo y determinar
la unión del conjunto de aglutinantes a la muestra, en la que la
unión indica la presencia de una cantidad clínicamente relevante de
bacterias Gram-positivas en la sangre de donante o
en el producto activo y la falta de unión indica la ausencia de una
cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-positivas en la sangre de donante o en el
producto sanguíneo. Preferentemente el donante y/o el mamífero
receptor es un ser humano o un animal domesticado.
En un tercer aspecto, la invención proporciona
un procedimiento según la reivindicación 3 para identificar la
presencia de una cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-negativas en la sangre o en un producto
sanguíneo de donante procedente de un mamífero donante para
transferirlo a un mamífero receptor. El procedimiento según este
aspecto de la invención comprende poner en contacto una muestra de
la sangre de donante o un producto sanguíneo con una serie de
aglutinantes, en el que el conjunto de aglutinantes comprende
aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y determinar la unión del conjunto de
aglutinantes a la muestra, en la que la unión indica la presencia de
una cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-negativas en la sangre de donante o en el
producto activo y la falta de unión indica la ausencia de una
cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-negativas en la sangre de donante o en el
producto sanguíneo. Preferentemente el donante y/o el mamífero
receptor es un ser humano o un animal domesticado.
Según los segundo y tercer aspectos de la
invención, la terminología, "unión", "antígeno",
"sangre o producto sanguíneo", "bacterias
Gram-positivas", "bacterias
Gram-negativas", "cantidad clínicamente
relevante", "se une es específicamente" y "aglutinante"
y está definida anteriormente. Debe señalarse que los procedimientos
de los primer, segundo y tercer aspectos de la invención pueden
realizarse en el momento de la experimentación para compatibilidad
de ABO, compatibilidad de Rh, y/o compatibilidad de MHC entre el
mamífero donante y el receptor.
En determinadas formas de realización de los
segundo y tercer aspectos de la invención, la muestra se trata
antes de o simultáneamente a la puesta de contacto de la muestra
con el conjunto de aglutinantes. Preferentemente, el tratamiento
expone un sitio de unión del aglutinante en el antígeno bacteriano
Gram-positivo o en el antígeno bacteriano
Gram-negativo. Los procedimientos para tratar la
muestra que ha de exponerse al sitio de unión del aglutinante o el
antígeno bacteriano Gram-positivo o el antígeno
bacteriano Gram-negativo son tal como se describe
para el primer aspecto de la invención.
En determinadas formas de realización, la sangre
de donante o el producto sanguíneo determinado que presenta una
ausencia de una cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-positivas según el procedimiento del segundo
aspecto de la invención se transfiere a un mamífero receptor. En
determinadas formas de realización, la sangre de donante o el
producto sanguíneo se determina que presenta ausencia de una
cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-positivas según el procedimiento del tercer
aspecto de la invención se transfiere a un mamífero receptor.
Preferentemente, el mamífero donante y el mamífero receptor son de
la misma especie.
En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo comprenden
anticuerpos o derivados de anticuerpos que se unen específicamente
a un antígeno bacteriano Gram-positivo. En
determinadas formas de realización, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo comprenden un antibiótico, en el que
el antibiótico no es la vancomicina ni la gentamicina.
Preferentemente, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo se unen
específicamente a la estructura de ácido lipotecoico de la bacteria
Gram-positiva. En determinadas formas de
realización preferidas, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de
realización, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo comprenden una
molécula seleccionada de entre el grupo constituido por un factor
de lipopolisacárido de Limulus (LALF), una proteína de unión
del lipopolisacárido (LBP), una proteína bactericida con aumento de
bactericida/permeabilidad (BPI) y un antibiótico, tal como la
polimixina o la bacitracina. Preferentemente, los aglutinantes que
se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo se unen específicamente a la
estructura de lipopolisacárido de la bacteria
Gram-negativa.
La invención proporciona también procedimientos
para la identificación de la presencia de cualquier bacteria de
contaminación en un tejido u órgano del donante antes de
trasplantar el tejido u órgano del donante a un mamífero receptor,
que preferentemente es de la misma especie que la especie del
donante. Los tejidos y órganos del donante está almacenadon de
manera rutinaria, aunque brevemente, en un fluido, tal como una
solución salina fisiológica o un tampón de almacenamiento del
nutriente. La presencia de bacterias en el fluido de almacenamiento
indica la presencia de bacterias contaminantes en el tejido. Dichas
bacterias contaminantes pueden acelerar el rechazo del tejido u
órgano trasplantado por el mamífero receptor. Por consiguiente, en
un séptimo aspecto, la invención proporciona un procedimiento según
la reivindicación 1 para identificar la presencia de una cantidad
clínicamente relevante de bacterias en un tejido de un mamífero, en
el que el tejido está almacenado en un fluido, que comprende poner
en contacto una muestra del fluido con una serie de aglutinantes,
en el que el conjunto de aglutinantes comprende aglutinantes que se
unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo y aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y determinar la unión del conjunto de
aglutinantes a la muestra, en el que la unión indica la presencia
de una cantidad clínicamente relevante de bacterias en el tejido y
la falta de unión indica la ausencia de una cantidad clínicamente
relevante de bacterias en el tejido. Preferentemente, el mamífero
donante y/o receptor es un ser humano o un mamífero
domesticado.
Según el séptimo aspecto de la invención, la
terminología, "unión", "antígeno", "bacterias
Gram-negativas", "bacterias
Gram-positivas", "cantidad clínicamente
relevante", "se une específicamente", y "aglutinante"
se definió anteriormente.
El término "tejido" significa cualquier
tejido u órgano del cuerpo. Ejemplos de tejidos de la invención
incluyen, sin limitación, el riñón, hígado, corazón, piel, médula
ósea, bazo, timo, páncreas, intestinos y tejido neurológico.
En determinadas formas de realización del
séptimo aspecto de la invención, la muestra se trata antes de o de
manera concomitante con la puesta en contacto de la muestra con el
conjunto de aglutinantes. En determinadas formas de realización, el
tratamiento expone un sitio de unión del aglutinante en el agente
bacteriano Gram-negativo o en el antígeno bacteriano
Gram-positivo. Los procedimientos de tratamiento
que exponen un sitio de unión en el aglutinante o en un antígeno
bacteriano Gram-negativo o en un antígeno bacteriano
Gram-positivo son los descritos para el primer
aspecto de la invención. En determinadas formas de realización del
séptimo aspecto de la invención, el tejido de donante que se ha
determinado que presenta ausencia de una cantidad clínicamente
relevante de bacterias se transfiere a un mamífero receptor.
Preferentemente, el mamífero donante del que se ha obtenido el
tejido y el mamífero receptor son de la misma especie. En
determinadas formas de realización preferidas, los aglutinantes que
se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo comprenden anticuerpos o derivados de
anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo. En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo comprenden una
molécula seleccionada de entre el grupo constituido por un factor de
lipopolisacárido de Limulus (LALF), una proteína de unión
del lipopolisacárido (LBP), una proteína bactericida que aumenta la
permeabilidad (BPI) y un antibiótico, tal como la polimixina o la
bacitracina. Preferentemente, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo se unen específicamente a la
estructura de lipopolisacárido de la bacteria
Gram-negativa. En determinadas formas de realización
preferidas, los aglutinantes que se unen específicamente a
bacterias Gram-positivas o a un antígeno de las
mismas comprenden anticuerpos o derivados de anticuerpo que se unen
específicamente a una bacteria Gram-positiva o a un
antígeno de la misma. En determinadas formas de realización, los
aglutinantes que se unen específicamente a bacterias
Gram-positivas o a un antígeno de las mismas
comprenden un antibiótico, en el que el antibiótico no es la
vancomicina ni la gentamicina. Preferentemente los aglutinantes que
se unen específicamente a antígeno bacteriano
Gram-positivo se unen específicamente a la
estructura de ácido lipotecoico de la bacteria
Gram-positiva.
En varias formas de realización del primer
aspecto de la invención, los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo se marcan de forma detectable con una
primera molécula indicadora y los aglutinantes que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo del mismo se marcan de manera
detectable con una segunda molécula indicadora. En determinadas
formas de realización, la primera molécula indicadora y la segunda
molécula indicadora son iguales. Preferentemente, una o ambas de la
primera molécula indicadora y segunda molécula indicadora es una
molécula con actividad enzimática, una molécula radiomarcada, una
molécula de fusión, una molécula fluorógena o un sol metálico, una
partícula, una molécula cromática o una molécula que está unida
específicamente mediante un aglutinante secundario.
En determinadas formas de realización preferidas
del séptimo aspecto de la invención, el conjunto de aglutinantes
está inmovilizado en un soporte en fase sólida (por ejemplo, una
placa de microvaloración).
En un octavo aspecto, la invención proporciona
un procedimiento según la reivindicación 2 para identificar la
presencia de una cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-positivas en un tejido de donante procedente de
un mamífero donante para transferirlo a un mamífero receptor, en el
que el tejido de donante está almacenado en un fluido, que
comprende poner en contacto una muestra de fluido con una serie de
aglutinantes, en el que el conjunto de aglutinantes comprende
aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y determinar la unión del conjunto de
aglutinantes a la muestra, en la que la unión indica la presencia de
una cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-positivas en el tejido de donante y la falta
de unión indica la ausencia de una cantidad clínicamente relevante
de bacterias Gram-positivas en el tejido de
donante. Preferentemente el mamífero donante y/o receptor es un ser
humano o un mamífero domesticado.
En un noveno aspecto, la invención proporciona
un procedimiento según la reivindicación 3 para identificar la
presencia de una cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-negativas en un tejido de un mamífero donante
procedente de un mamífero donante para transferirlo a un mamífero
receptor, en el que el tejido de donante está almacenado en un
fluido, que comprende poner en contacto una muestra de fluido con
una serie de aglutinantes, en el que el conjunto de aglutinantes
comprende aglutinantes que se unen específicamente a un antígeno
bacteriano Gram-negativo y determinar la unión del
conjunto de aglutinantes a la muestra, en la que la unión indica la
presencia de una cantidad clínicamente relevante de bacterias
Gram-negativas en el tejido de donante.
Preferentemente el mamífero donante y/o receptor es un ser humano o
un mamífero domesticado.
Según los octavo y noveno aspectos de la
invención, la terminología, "unión", "antígeno",
"sangre o producto sanguíneo", "bacterias
Gram-positivas", "bacterias
Gram-negativas", "cantidad clínicamente
relevante", "se une específicamente" y "aglutinante"
está definida anteriormente. Preferentemente, cualquiera de los
procedimientos de los séptimo, octavo y noveno aspectos de la
invención se realiza cuando en el tejido se prueba la
compatibilidad de ABO, la compatibilidad de Rh, y/o compatibilidad
de MHC con el receptor deseado.
En determinadas formas de realización de los
octavo y noveno aspectos de la invención, la muestra se trata antes
de o simultáneamente a la puesta de contacto de la muestra con el
conjunto de aglutinantes. Los procedimientos para tratar la muestra
que ha de exponerse al sitio de unión del aglutinante o el antígeno
bacteriano Gram-positivo o el antígeno bacteriano
Gram-negativo son tal como se describe para el
primer aspecto de la invención.
En determinadas formas de realización de los
octavo y noveno aspectos de la invención, el tejido de donante que
se ha determinado que presenta una ausencia de una cantidad
clínicamente pertinente de bacterias Gram-positivas
o ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-negativas se transfiere a un mamífero receptor.
Preferentemente, el mamífero donante del que se extrae el tejido y
el mamífero receptor son de la misma especie.
Aunque no exhaustivos, se describen numerosos
formatos potenciales de inmunoanálisis en los ejemplos siguientes
que, cuando se utilizan junto con el aglutinante específica LTA o
LPS, pueden generar un ensayo pangenérico para la detección de la
clase microbiana. De este modo, se pretende que los ejemplos
siguientes ilustren con mayor detalle determinadas formas de
realización particularmente preferidas de la invención sin
pretender que limiten el alcance de la invención.
El procedimiento de detección bacteriana de la
invención puede seguir un formato de inmunoanálisis a base de
partículas convencionales. En este método, los aglutinantes que se
unen específicamente a una zona antigénica en la pared de la célula
bacteriana pueden utilizarse como dianas inmunológicas y pueden
formar la base para detectar las bacterias en los productos
sanguíneos. Un esquema del dispositivo utilizado en este ejemplo se
presenta en las Figuras 3A a 3D. En una forma de realización, los
aglutinantes que se unen específicamente a bacterias
Gram-positivas, bacterias
Gram-negativas, o a ambas, se mezclan y a
continuación se dividen rápidamente, de modo que cada una de las
dos poblaciones de aglutinantes comprende una mezcla de
aglutinantes. Una población está unida a la membrana en la base del
dispositivo mostrado en las Figuras 3A a 3D. La segunda población
se utiliza para recubrir partículas de látex coloreadas con brillo
(es decir, partículas de látex recubiertas con el aglutinante se han
impregnado con un colorante de modo que están intensamente
coloreadas).
En otra forma de realización, el mismo
aglutinante (es decir, todas las moléculas de aglutinante reconocen
especialmente el mismo epítopo antigénico) se divide en dos
poblaciones. De nuevo, una población está unida a la membrana en la
base del dispositivo de las Figuras 3A a 3D, mientras que la
segunda población se utiliza para recubrir partículas de látex
intensamente coloreadas. El mismo aglutinante (es decir, moléculas
que se unen específicamente al mismo epítopo) podría utilizarse, ya
que están presentes muchos puntos de reconocimiento sobre la
superficie bacteriana.
Las perlas recubiertas con aglutinante se
colocan en el dispositivo, de modo que no se unen a la
membrana.
Al utilizar el dispositivo representado en las
Figuras 3A a 3B para detectar la presencia de una cantidad
clínicamente relevante en una sangre o producto sanguíneo, se
realizan las etapas siguientes. En primer lugar, se extrae una
muestra en condiciones estériles de la sangre de donante o de un
producto sanguíneo de donante. Alternativamente, puede extraerse
una muestra del fluido en el que un órgano del donante o un tejido
se está almacenando (por ejemplo, el fluido de almacenamiento del
nutriente en el que está almacenado un riñón del donante).
A continuación, se aplica un volumen aproximado
de la muestra al dispositivo de análisis, como se muestra en las
Figuras 3A a 3D. La muestra puede analizarse directamente (es
decir, sin diluir o sin tratar) o puede haber sido diluida con un
reactivo de tamponación/extracción, o puede tratarse por medios
físicos o químicos, con lo que el tratamiento expone un sitio de
unión del aglutinante en la bacteria (o antígeno de la misma)
presente en la muestra. Por ejemplo, el tratamiento puede producir
la destrucción de la pared celular bacteriana. En otro ejemplo, el
tratamiento puede producir un antígeno que está escindido de la
pared celular, y exponiendo de este modo un sitio de unión en el
antígeno.
La muestra se desplaza por una trayectoria
prefijada en el dispositivo debido a la acción de drenaje de una
membrana absorbente. La bacteria presente en la muestra se une a
las partículas de látex marcadas con el aglutinante.
La muestra se mezcla con las partículas de látex
marcadas con el aglutinante y se desplaza a lo largo de la mecha
absorbente a una zona predefinida donde los anticuerpos
antibacterianos se han inmovilizado. Los aglutinantes inmovilizados
capturan los complejos de la perla de látex coloreada recubierta
con bacteria-antibacteria y unas formas de manchas
coloreadas que indican un resultado positivo.
En otra forma de realización del procedimiento
descrito en el Ejemplo I, los aglutinantes unidos a látex son
aglutinantes que reconocen específicamente bacterias
Gram-negativas o bacterias
Gram-positivas o ambas. Sin embargo, cada uno de
estos aglutinantes antibacterias tiene un epítopo que es común a
todos los aglutinantes. En este ejemplo, todos los aglutinantes
antibacterias son anticuerpos murinos. Los aglutinantes unidos a la
membrana no se unen específicamente a bacterias; más bien, se unen
específicamente a determinantes murinos en la zona constante de los
anticuerpos antibacterias murinos. Estos aglutinantes antirratón se
denominan aglutinantes secundarios, porque no se unen
específicamente a las bacterias, sino más bien, se unen
específicamente al aglutinante que está unido específicamente a la
bacteria.
Un análisis de aglutinación es además otro
procedimiento para detectar cantidades clínicamente relevantes de
bacterias en la sangre, un producto sanguíneo o un fluido de un
tejido de donante. En este ejemplo de un ensayo de aglutinación, se
utilizan partículas de látex recubiertas con aglutinantes que se
unen específicamente a especies bacterianas. Estas partículas de
látex se aglutinan en presencia de cantidades clínicamente
relevantes de especies bacterianas. Una reacción positiva está
indicada por el desarrollo de un patrón aglutinado. En una reacción
negativa, el látex no se aglutina y la apariencia lechosa permanece
sustancialmente inalterada.
En este procedimiento, se utiliza un dispositivo
analítico tal como el representado en las Figuras 4A a 4D. A este
dispositivo analítico se aplica una muestra extraída en condiciones
estériles de una sangre de donante o de un producto sanguíneo.
Alternativamente, puede aplicarse al dispositivo analítico una
muestra extraída de un fluido en el que está almacenado un órgano o
tejido de donante. La muestra puede analizarse directamente (es
decir, sin diluir o sin tratar), se diluye con un reactivo de
tamponación/extracción o se trata de modo que el tratamiento expone
un sitio de unión del aglutinante o cualquier bacteria (o antígeno
del mismo) presente en la muestra. A continuación, las perlas de
látex recubiertas con aglutinantes que se unen específicamente a
las bacterias se añaden a la muestra biológica del dispositivo
analítico. Los contenidos se mezclan para asegurar la homogeneidad
del componente.
Las bacterias en las muestras biológicas se
unirán específicamente a los anticuerpos antibacteria en las perlas
de látex. Como resultado de los muchos puntos antigénicos en la
superficie bacteriana, las partículas de látex recubiertas con
anticuerpo forman un puente entre las células bacterianas
adyacentes. En presencia de cantidades clínicamente relevantes de
células bacterianas en la muestra biológica se forma una matriz
reticulada. Más allá de la cantidad de bacterias clínicamente
aplicable predefinida en la muestra (tal como se definió
anteriormente), la matriz crece hasta el punto de llegar a ser
visible como un patrón de "aglutinación" en el pocillo de
análisis. Después de un tiempo predeterminado para permitir el
crecimiento de dicha matriz los resultados se leen a simple vista,
la presencia del antígeno bacteriano produce la formación del patrón
característico mostrado en la Figura 4D.
Además otro procedimiento para detectar la
presencia de una cantidad clínicamente aplicable de bacterias en
una sangre o producto sanguíneo utiliza un formato patrón de Ensayo
Inmunosorbente con Enzima Ligada (ELISA). Los formatos de ELISA en
placa de microvaloración (es decir, 96 pocillos) utilizan muchos
pocillos para reacción discreta, representando cada uno un medio
analítico único. Los formatos en placa de microvaloración permiten
una capacidad analítica de resultado superior, la aplicación de la
manipulación de la muestra automática, la adición del reactivo, la
detección de la reacción y la interpretación de los resultados
cuantitativos. El desarrollo de los ELISA en placa de
microvaloración es bien conocido y puesto en práctica. Para la
detección de especies de gran peso molecular con múltiples sitios
de unión, como con antígenos de la superficie bacteriana, un
formato de inmunoanálisis en sándwich es un formato preferido. Los
inmunoanálisis en sándwich se construyen colocando de manera pasiva
o covalente un aglutinante que se une específicamente a bacterias
Gram-negativas o Gram-positivas (o
ambas) sobre la superficie de poliestireno (u otros materiales) del
pocillo de la placa de microvaloración, de modo que el aglutinante
se adhiere a la superficie del pocillo de la placa de
microvaloración. La detección inmunológica procede de la manera
siguiente.
En primer lugar, se extrae una muestra en
condiciones estériles de una sangre de donante o de un producto
sanguíneo de donante, o del fluido en el que está almacenado un
órgano o tejido de donante. La muestra puede estar diluida o sin
diluir, o se trata de modo que el tratamiento expone un sitio de
unión del aglutinante o cualquier bacteria (o antígeno de la misma)
presente en la muestra. Un volumen apropiado de la muestra se
aplica al pocillo de análisis. Las bacterias presentes en la muestra
biológica se acomplejarán específicamente con los aglutinantes
antibacteria unidos en la superficie sobre la superficie del
pocillo de la placa de microvaloración. El pocillo se aspira a
continuación (o se descarga) para retirar la muestra no unida en el
pocillo. Se añade una solución de lavado específicamente formulada
al pocillo para bacterias de lavado unidas de manera no específica
(y otros constituyentes de la muestra) de la superficie del pocillo
de la placa de microvaloración.
A continuación, una solución que contiene un
aglutinante marcado de manera detectable con una molécula
indicadora se añade al pocillo de reacción. El aglutinante marcado
de manera detectable en esta solución se une específicamente a un
antígeno que define el tipo de bacterias presentes en la muestra
biológica, y puede ser diferente o igual al aglutinante unido a la
superficie. El aglutinante marcado de manera detectable se acopla
químicamente a una molécula indicadora (una molécula indicadora con
actividad enzimática, en el caso específico de un ELISA) que se
utiliza para indicar la ausencia o presencia de bacterias en la
muestra. Debe indicarse que la molécula indicadora puede crearse a
partir de una variedad de especies, y se selecciona para minimizar
la interferencia con la reacción de unión del anticuerpo. Las
enzimas se utilizan principalmente en ensayos inmunosorbentes con
enzima ligada (ELISA), pero otras moléculas indicadoras pueden
utilizarse también, incluyendo, sin limitación, cromóforos,
fluoróforos, radioisótopos, compuestos quimioluminiscentes,
compuestos electroquímicamente activos, metales, partículas,
especies magnéticas y marcadores secundarios tales como
biotina/avidina u otras especies similares. El aglutinante marcado
de manera detectable que procede del acoplamiento químico del
aglutinante específico con la molécula indicadora se permite que se
acompleje con el complejo aglutinante antibacteria/bacteria
formando un "sándwich" aglutinante
antibacteria/bacteria/aglutinante antibacteria marcado de manera
detectable.
Tras un periodo de tiempo apropiado, la solución
del aglutinante marcado de manera detectable se separa de la pared.
La pared puede lavarse a continuación con una solución de lavado
formulada específicamente para separar el conjugado unido del
conjugado no unido en el pocillo de la placa de microvaloración.
\newpage
El aglutinante marcado de manera detectable
unido específicamente en el pocillo de la placa de microvaloración
puede detectarse por medios apropiados. Esto incluye la medición
directa en el caso de fluoróforos, cromóforos, medición
quimioluminiscente, electroactiva e indirecta en el caso de
marcadores tales como enzimas. El número de aglutinantes marcados
de manera detectable unidos específicamente es directamente
proporcional a la cantidad de bacterias presentes en la muestra
biológica. Esta proporcionalidad es la base de una metodología de
cuantificación que puede utilizarse para determinar específicamente
la cantidad de bacterias presentes en la muestra. Una curva de
respuesta patrón puede crearse midiendo la respuesta del aglutinante
marcado de manera detectable unido específicamente como función de
cantidades conocidas de bacterias presentes en las muestras de
calibrador. La interpolación de los resultados de la curva de
respuesta patrón describe la concentración de bacterias en la
muestra biológica desconocida.
Otro procedimiento para identificar la presencia
de una cantidad clínicamente aplicable de bacterias en la sangre,
producto sanguíneo o el fluido en el que un tejido de donante está
almacenado utiliza un formato competitivo de inmunoanálisis. De
hecho, para la detección de especies de peso molecular pequeño con
un solo sitio de unión, tal como las estructuras de
lipopolisacárido segregadas procedentes de bacterias
Gram-negativas, un formato competitivo de
inmunoanálisis es un formato preferido. Los inmunoanálisis
competitivos se construyen colocando de forma pasiva o covalente un
aglutinante que se une específicamente a la estructura LPS segregada
(tal como la unión al fragmento Lípido A de la estructura LPS en la
superficie de poliestireno (u otro material) del pocillo de la
placa de microvaloración, de modo que el aglutinante se adhiere a la
superficie del pocillo de la placa de microvaloración.
En un ejemplo de este formato de inmunoanálisis
competitivo para detectar la presencia de una cantidad clínicamente
relevante de bacterias Gram-negativas, la detección
inmunológica procede de la manera siguiente. En primer lugar, se
extrae una muestra en condiciones estériles de sangre, de producto
sanguíneo o de fluido del donante en el que está almacenado el
órgano o tejido de donante. La muestra puede estar diluida o sin
diluir, o tratada de modo que se expone el sitio de unión de un
aglutinante en las bacterias Gram-negativas (o un
antígeno del mismo), tal como un sitio de unión en el componente
del Lípido A del LPS. Se aplica un volumen apropiado de la muestra
al pocillo de ensayo, que contiene un aglutinante que se une
específicamente al LPS. Un volumen apropiado de la solución que
contiene una molécula de LPS marcada de manera detectable se añade
simultánea o sucesivamente al pocillo de ensayo. La molécula de LPS
marcada de manera detectable en esta solución se une específicamente
al aglutinante en el pocillo de ensayo. La molécula de LPS marcada
de manera detectable se acopla químicamente a la molécula
indicadora (tal como una molécula indicadora con actividad
enzimática en el caso específico de un ELISA) que se utiliza para
indicar la presencia o ausencia de bacterias en una muestra. Debe
apuntarse que la molécula indicadora puede crearse a partir de
varias especies, y se selecciona para minimizar la interferencia
con la reacción de unión del anticuerpo. Se utilizan enzimas
principalmente en ensayos inmunosorbentes con enzima ligada
(ELISA), pero pueden utilizarse también otras moléculas
indicadoras, incluyendo, sin limitación, cromóforos, fluoróforos,
radioisótopos, compuestos quimioluminiscentes, compuestos
electroquímicamente activos, metales, partículas, especies
magnéticas y marcadores secundarios tales como biotina/avidina u
otras especies similares. La molécula de LPS marcada de manera
detectable se deja que se acompleje con el aglutinante inmovilizado
en presencia del LPS procedente de la pared celular, estableciendo
un equilibrio de unión. Preferentemente, el pocillo de ensayo es un
pocillo en una placa de microvaloración.
Tras un periodo de tiempo apropiado, la molécula
de LPS marcada de manera detectable/solución de LPS procedente de
las células bacterianas contaminantes se separa del pocillo de
ensayo. El pocillo puede lavarse con una solución de lavado
formulada específicamente para separar el conjugado unido del
conjugado no unido en el pocillo de microvaloración. El equilibrio
de unión creado en el pocillo de ensayo es función de la
concentración de LPS procedente de la célula. En ausencia de
cualquier cantidad contaminante clínicamente aplicable de bacterias
Gram-negativas en la muestra, y por consiguiente
sin LPS procedente de las células bacterianas, la molécula de LPS
marcada de manera detectable se acompleja con el aglutinante unido
a la superficie. A concentraciones elevadas de bacterias, y por
consiguiente concentraciones elevadas de LPS procedente de las
células bacterianas contaminantes, la fijación al aglutinante unido
a la superficie se divide entre las dos especies LPS basadas en la
concentración. A bajas concentraciones de LPS procedente de las
células bacterianas contaminantes, la mayoría de los sitios de
unión del agente de fijación se acomplejan con una molécula de LPS
marcada de manera detectable y se observa un aumento de
concentración de la señal indicadora. A grandes concentraciones de
LPS procedente de las células bacterianas, la mayoría de los sitios
de unión del agente de fijación se acomplejan con un LPS procedente
de la célula bacteriana y se observa una disminución de
concentración de la señal indicadora. De este modo, el número de
moléculas de LPS marcadas de manera detectable unidas
específicamente es inversamente proporcional a la cantidad de
bacterias Gram-negativas contaminantes presentes en
la muestra biológica. Una curva de respuesta patrón puede crearse
midiendo la respuesta de la molécula de LPS marcada de manera
detectable en función de cantidades conocidas de bacterias presentes
en las muestras calibradoras. La interpolación de resultados de la
curva de respuesta patrón describe la concentración de bacterias
Gram-negativas en la muestra biológica
desconocida.
Aún otro procedimiento para detectar la
presencia de una cantidad clínicamente aplicable de bacterias en
una sangre o producto sanguíneo utiliza un formato homogéneo de
inmunoanálisis. Los inmunoanálisis homogéneos están caracterizados
porque presentan la capacidad de los componentes unido y libre de
la reacción de acomplejamiento aglutinante-ligando
que debe medirse simultáneamente. Las propiedades del marcador se
modifican en el momento de la unión del reactivo complementario de
modo que no se necesita la separación del unido del no unido.
En primer lugar, se extrae una muestra en
condiciones estériles de la sangre o producto sanguíneo de donante,
o de un fluido en el que está almacenado un tejido u órgano del
donante. Un volumen apropiado de la muestra de ensayo se mezcla con
un reactivo de pretratamiento de modo que se crean pequeños
fragmentos de la estructura de la pared celular. Dicho reactivo
puede incluir (pero no limitarse a) tensioactivos, quelantes y
enzimas para degradar la estructura antigénica natural a
subcomponentes de peso molecular más pequeño. Además, puede
utilizarse la fragmentación mecánica (tal como tratamiento por
ultrasonido) o la energía cinética (tal como la ebullición) para
destruir la pared celular en sus subcomponentes. En este ejemplo,
el tratamiento expone un sitio de unión del aglutinante en las
bacterias Gram-negativas o antígenos de las mismas
dando como resultado la separación y degradación de la estructura de
lipopolisacárido en las bacterias Gram-negativas a
su Lípido A o unidades del núcleo.
Una muestra de los fragmentos de la pared
celular degradados se mezcla con un reactivo que contiene un agente
del Lípido A (o núcleo) que se ha acoplado químicamente con un
marcador fluorescente. Una cantidad conocida de aglutinante
antiLípido A (o antinúcleo) se añade a la mezcla de reacción. Los
antígenos que se unen al aglutinante presentarán un nivel
disminuido de rotación molecular mientras que los que no se unen
presentarán un nivel de rotación relativamente aumentado. En un
campo de luz polarizada, la luz polarizada excitará preferentemente
las moléculas que son paralelas al plano de la luz incidente. La
orientación de la especie de emisión determinará el grado de
polarización de la luz emitida. Si la posición molecular de la
especie emisora es relativamente estable, la fluorescencia se
polarizará parcialmente. Si en lugar de estar fijas, las moléculas
están en un estado de oscilación rápida, el movimiento molecular
disminuirá el grado de polarización. La luz fluorescente emitida
desde la mezcla de reacción del antígeno del Lípido A (o núcleo)
del fragmento de pared celular de cualquier bacteria
Gram-negativa contaminante presente en la muestra,
el Lípido A (o núcleo) marcado de manera fluorescente y el
aglutinante presentarán un grado elevado de polarización de la luz
a concentraciones bajas de Lípido A (o núcleo) del fragmento de
pared celular (es decir, concentraciones bajas de contaminación
bacteriana en la muestra) y un bajo grado de polarización de la luz
a concentraciones altas de Lípido A (o núcleo) del fragmento de
pared celular (es decir, grandes concentraciones de contaminación de
bacterias Gram-negativas en la muestra), en
comparación con el aglutinante más el Lípido A (o núcleo) marcado
de manera fluorescente sin ninguna muestra. Esta respuesta de
concentraciones diferenciales de la polarización de la luz en
función del Lípido A (o núcleo) del fragmento de la pared celular
puede utilizarse como base de un ensayo de unión para determinar
concentraciones desconocidas de Lípido A (o núcleo) y finalmente
determinar la presencia o ausencia de bacterias
Gram-negativas en una muestra.
Utilizando un anticuerpo como aglutinante, la
tecnología de detección anterior es bien conocida en el campo como
inmunoanálisis de polarización por fluorescencia, las técnicas
relacionadas incluyen el inmunoanálisis de extinción de
fluorescencia, el fluoroinmunoanálisis con resolución temporal, el
inmunoanálisis con fluorescencia aumentada, el inmunoanálisis de
transferencia de excitación de fluorescencia y el inmunoanálisis de
liberación de fluoróforo. Alternativamente, la modulación de la
actividad enzimática en función del acomplejamiento del aglutinante
puede utilizarse también como un formato alternativo de
inmunoanálisis homogéneo para detectar fragmentos más pequeños de
constituyentes de la pared celular bacteriana (y por consiguiente
determinar la presencia o ausencia de la contaminación bacteriana).
Cada uno de estos métodos está bien documentado y es bien conocido
por los expertos en la materia.
Una modificación del procedimiento descrito en
el Ejemplo VI identificará la presencia de una cantidad
clínicamente aplicable de bacterias Gram-positivas
en una muestra recogida de la sangre de donante, producto sanguíneo
de donante y/o el fluido en el que el tejido de donante está
almacenado. En este ejemplo, se extrae una muestra en condiciones
estériles de la sangre de donante, del producto sanguíneo de donante
o del fluido en el que está almacenado un tejido de donante. Un
volumen apropiado de la muestra de ensayo se mezcla con un reactivo
de pretratamiento de modo que se crean pequeños fragmentos de la
estructura de la pared celular. Este tratamiento que da como
resultado la exposición de un sitio de unión de un aglutinante en la
bacteria Gram-positiva (o un antígeno del mismo)
puede ser tratamiento con un producto químico, tal como un
tensioactivo, un quelante y/o una enzima para degradar la estructura
antigénica natural en subcomponentes de peso molecular más bajo. El
tratamiento puede ser también por medios mecánicos, utilizando
fragmentación mecánica (tal como tratamiento con ultrasonidos) o
energía cinética (tal como ebullición) para destruir la pared
celular en sus subcomponentes exponiendo de este modo un sitio de
unión de un aglutinante en un componente antigénico de la
estructura de LTA. Un ejemplo específico puede ser el aislamiento
de la cadena de poli(glicerofosfato) de las estructuras de
ácido lipoteicoico. Los expertos en la materia pueden prever
fácilmente otras estructuras de la pared de las células
Gram-positivas.
A continuación, una muestra de los fragmentos de
la pared celular degradados se mezcla con el reactivo que contiene
el antígeno con poli(glicerofosfato) que se ha acoplado
químicamente con un marcador enzimático para formar un conjugado
enzimático. La conjugación de la enzima se realiza de tal forma que
durante el acomplejamiento con un aglutinante se modula la
actividad enzimática del conjugado. Mediante el enmascarado del
punto activo, o con modificaciones de la configuración a la enzima,
cuando un aglutinante está acomplejado con el conjugado enzimático
se reduce la actividad enzimática, sin el aglutinante acomplejado
con la actividad enzimática del conjugado se restablece. Esta
modulación de la actividad enzimática es la base de un formato de
ensayo homogéneo normalmente utilizado.
A continuación, se añade una cantidad conocida
de aglutinante antipoli(glicerofosfato) a una mezcla de
reacción que contiene cantidades fijas de aglutinante y conjugado
enzimático. Además, se añade un volumen conocido de sangre (o
producto sanguíneo o fluido tisular) tratada para degradar los
constituyentes de la pared celular bacteriana. Si no está presente
ninguna bacteria en la sangre, producto sanguíneo o fluido de una
muestra del tejido de donante, entonces los sitios de unión
disponibles en el aglutinante se acomplejarán con el conjugado
enzimático. El conjugado enzimático mostrará un nivel reducido de
actividad enzimática en estado unido y tendrá lugar la conversión
mínima del sustrato. A concentraciones elevadas del antígeno
procedente de la pared celular procedentes de una bacteria
Gram-positiva contaminante presente en la muestra,
la mayoría de los sitios de unión en el aglutinante estarán ocupados
por el antígeno de la pared de la célula natural
(poli(glicerofosfato) como ejemplo) permitiendo de este modo
que exista el conjugado enzimático en estado no acomplejado. En este
estado no acomplejado, la actividad enzimática se restablece y se
observan concentraciones elevadas de renovación del sustrato.
Una ligera modificación al procedimiento implica
la utilización de fragmentos de enzima, uno de los cuales está
marcado con un fragmento de antígeno. En presencia de aglutinante
el fragmento enzimático está indisponible para el complejo con el
fragmento adicional requerido para crear una enzima funcional
completa. Cuando el aglutinante está acomplejado con el antígeno
derivado de la pared celular procedente de bacterias
Gram-positivas contaminantes presentes en la
muestra, está indisponible para acomplejarse con los fragmentos de
enzima permitiéndoles de este modo combinarse y formar una enzima
activa. Las modificaciones a estos métodos son bien conocidas y
comprendidas por los expertos en este campo como formatos del
ensayo de aglutinante de modulación enzimática.
Las modificaciones de los ensayos descritos en
los Ejemplos IV, V, VI y VII incorporan la utilización de equipo
analítico automático para la ejecución de análisis y el cálculo de
resultados. La automatización permite la aplicación de la tecnología
en un formato más reproducible permitiendo de este modo el
rendimiento del análisis mejorado así como el nivel de detección
reducido de contaminación bacteriana. Numerosos sistemas de
inmunoanálisis comprensivos están disponibles en el mercado y se
utilizan para experimentación de inmunodiagnóstico de rutina en el
laboratorio central de los hospitales. La aplicación de la
tecnología descrita anteriormente puede preverse fácilmente estando
incorporada en cualquiera de estos sistemas automatizados. La
utilización de metodologías de separación alternativas (fase sólida,
fase líquida, partículas magnéticas, reparto de la carga eléctrica,
etc.) puede también preverse sin esta exposición. Análogamente, las
metodologías alternativas de detección (tal como la cromógena,
fluorógena, electroquímica, quimioluminiscente o radiométrica)
pueden asimismo preverse por modificaciones anticipadas al
procedimiento de detección de los sistemas del aglutinante marcados
de manera detectable así como un cambio correspondiente en el
sistema de detección del sistema de inmunoanálisis automatizado.
La especificidad pan-genera de
dos aglutinantes representativos y no limitativos de la invención
se evaluó sondando estructuras de antígeno de superficie tanto en
bacterias Gram-positivas como
Gram-negativas. El aglutinante que se une
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo, a saber el ácido lipoteicoico, era el
clon 96-110 del anticuerpo monoclonal ((IgG1)
(descrito en Fisher et al., publicación PCT nº WO 98/57994).
El aglutinante que se une específicamente al antígeno bacteriano
Gram-negativo, a saber el lípido A, fue el clon
26-5 del anticuerpo monoclonal (IgG2b) (disponible
en el mercado en Biodesign International, Saco, Maine, número de
catálogo C61212M).
Se seleccionaron catorce bacterias para la
caracterización de la unión: siete bacterias
Gram-positivas y siete
Gram-negativas (véanse las Figuras 5 y 6,
respectivamente). Estas bacterias se seleccionaron porque
representan las especies bacterianas que han sido identificadas
durante los tres estudios de reacción de transfusión nacional
mayores (incluyendo el estudio BaCon en los Estados Unidos, el
estudio Hemovigilance en Francia y el estudio SHOT en el Reino
Unido).
Para caracterizar la unión de bacterias
Gram-positivas y Gram-positivas con
el anticuerpo monoclonal del ácido antipoteicoico y el anticuerpo
monoclonal antiLípido A, respectivamente, las especies bacterianas
de cepas clínicas se rallaron en placas de agar-agar
con sangre de oveja al 5% (BBL) y se cultivaron durante la noche a
37ºC. Las colonias resultantes se inocularon en Tryptic Soy Broth
(30 mg/ml, Sigma) en PBS y se rotaron durante la noche a 37ºC. El
recuento bacteriano se cuantificó por medición turbidométrica a 620
nm. Las bacterias totales se sedimentaron a 5.000 rpm durante
quince minutos. Las bacterias sedimentadas se volvieron a poner en
suspensión en PBS para aproximadamente 10^{8} unidades formadoras
de colonia (CFU)/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
Se añadieron 100 \mul de suspensión bacteriana a cada pocillo de
una sola fila de las placas de microvaloración de 96 pocillos. Este
procedimiento se repitió para cada una de las siete bacterias
Gram-positivas y cada una de las siete bacterias
Gram-negativas. Se incubaron las placas una hora a
37ºC y a continuación está almacenadoron durante la noche a 4ºC.
Las placas se lavaron a continuación cinco veces con 200
\mul/pocillo de Tween-20 al 0,05% y está
almacenado en seco a -20ºC hasta su utilización.
Para minimizar la unión no específica, las
placas recubiertas con bacterias se bloquearon con 300
\mul/pocillo de leche en polvo al 5%/Tween 20 en PBS al 0,05%. Las
placas se bloquearon toda la noche a temperatura ambiente y a
continuación se lavaron 3^{x} con PBS/Tween. Los aglutinantes (es
decir, el anticuerpo monoclonal del ácido antilipoteicoico y el
anticuerpo monoclonal del antiLípido A) se diluyeron hasta 5
\mug/ml en PBS que contenía BSA al 4% y Tween-20
al 0,05%. Se mezclaron las soluciones y se filtraron a través de
filtros de 0,22 \mum. Se añadió 100 \mul de solución a cada
pocillo y se dejaron reaccionar los aglutinantes durante una hora a
37ºC. Se lavaron a continuación las placas 5 veces con
Tween-20 al 0,05%. Un anticuerpo secundario
disponible en el mercado, el conjugado de HRP de IgG antirratón de
cabra (cadenas pesada y ligera) se diluyó 1:5.000 en PBS/BSA al
1,5% y Tween-20 al 0,5%. Se añadieron 200 \mul de
la solución de anticuerpo secundario a cada pocillo y se dejó al
anticuerpo secundario unirse durante una hora a 37ºC. Las placas se
lavaron sucesivamente una vez con PBS/Tween al 0,05% y tres veces
más con PBS solo. Para cuantificar la unión bacteriana, se
añadieron a cada pocillo 200 \mul de sustrato de peroxidasa TMB
(Sigma). Se leyó la absorbancia (D.O. 370 nm) en un formato
cinético en el lector de placas del microvalorador Dynax.
Como se muestra en las Figuras 5 y 6,
respectivamente, cada una de las siete bacterias
Gram-positivas y siete
Gram-negativas fueron reconocidas específicamente
por el anticuerpo monoclonal del ácido antilipoteicoico
(Gram-positiva; Figura 5) y el anticuerpo
monoclonal antiLípido A (Gram-negativa; Figura 6),
(los resultados medios de una medición por triplicada se
representan en función de cada una de las bacterias reconocidas).
Como muestran las Figuras 5 y 6, la extensión del reconocimiento
varía entre las especies bacterianas pero en todos los casos las
bacterias son superiores al fondo por lo menos dos veces. Estos
datos indican claramente la fiabilidad de utilizar un aglutinante
común para reconocer de manera genérica tanto las bacterias
Gram-negativas como Gram-positivas.
Estas bacterias son de interés específico ya que representan las
especies exactas de bacterias identificadas como agentes etiológicos
en las reacciones de transfusión.
Claims (18)
1. Procedimiento para determinar si una sangre
de donante, un producto sanguíneo de donante o un tejido de donante
de un mamífero donante, en el que el tejido de donante está
almacenado en un fluido, es útil para transferir a un mamífero
receptor, procedimiento que comprende: poner en contacto una
muestra de la sangre de donante o de un producto sanguíneo de
donante o un fluido con una serie de aglutinantes, en el que el
conjunto de aglutinantes comprende anticuerpos que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-negativo y presentan amplia especificidad para
bacterias Gram-negativas, y anticuerpos que se unen
específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo y presentan amplia especificidad para
bacterias Gram-positivas,
detectar la unión del conjunto de aglutinantes a
la muestra, y determinar la cantidad de bacterias presentes en la
sangre de donante, el producto sanguíneo de donante o el fluido, en
el que la presencia de una cantidad clínicamente pertinente de
bacterias en la sangre de donante, el producto sanguíneo de donante
o el fluido indica que la sangre de donante, el producto sanguíneo
de donante o el tejido de donante no es útil para la transferencia
a un mamífero receptor, y la ausencia de una cantidad clínicamente
pertinente de bacterias en la sangre de donante, el producto
sanguíneo de donante o el fluido indica que la sangre de donante,
el producto sanguíneo de donante o el tejido de donante es útil
para la transferencia a un mamífero receptor.
2. Procedimiento para determinar si una sangre
de donante, un producto sanguíneo de donante o un tejido de donante
de un mamífero donante, en el que el tejido de donante está
almacenado en un fluido, es útil para la transferencia a un mamífero
receptor, comprendiendo dicho procedimiento: poner en contacto una
muestra de la sangre de donante, un producto sanguíneo de donante o
un fluido con un conjunto de aglutinantes, en el que el conjunto de
aglutinantes comprende anticuerpos que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-positivo y presentan amplia
especificidad para bacterias Gram-positivas,
detectar la unión del conjunto de aglutinantes a
la muestra, y determinar la cantidad de bacterias
Gram-positivas presentes en la sangre de donante, el
producto sanguíneo de donante o el fluido, en el que la presencia
de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-positivas en la sangre de donante, el producto
sanguíneo de donante o el fluido, indica que la sangre de donante,
el producto sanguíneo de donante o el tejido de donante no es útil
para la transferencia al mamífero receptor, y la ausencia de una
cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-positivas en la sangre de donante, en el
producto sanguíneo de donante o en el fluido indica que la sangre de
donante, el producto sanguíneo de donante o el tejido de donante es
útil para la transferencia a un mamífero receptor.
3. Procedimiento para determinar si una sangre
de donante, un producto sanguíneo de donante o un tejido de donante
de un mamífero donante, en el que el tejido de donante está
almacenado en un fluido, es útil para la transferencia a un mamífero
receptor, comprendiendo dicho procedimiento: poner en contacto una
muestra de la sangre de donante, del producto sanguíneo de donante o
fluido con un conjunto de aglutinantes, en el que el conjunto de
aglutinantes comprende anticuerpos que se unen específicamente a un
antígeno bacteriano Gram-negativo y presentan amplia
especificidad para las bacterias
Gram-negativas,
detectar la unión del conjunto de aglutinantes a
la muestra, y determinar la cantidad de bacterias
Gram-negativas presentes en la sangre de donante, en
el producto sanguíneo de donante o en el fluido, en el que la
presencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-negativas en la sangre de donante, en el
producto sanguíneo de donante o en el fluido, indica que la sangre
de donante, el producto sanguíneo de donante o el tejido de donante
no es útil para la transferencia al mamífero receptor, y la
ausencia de una cantidad clínicamente pertinente de bacterias
Gram-negativas en la sangre de donante, en el
producto sanguíneo de donante o en el fluido indica que la sangre
de donante, el producto sanguíneo de donante o el tejido de donante
es útil para la transferencia a un mamífero
receptor.
receptor.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que la muestra se trata antes de o de manera concomitante
con la puesta en contacto de la muestra con un conjunto de
aglutinantes.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el tratamiento expone un sitio de unión del aglutinante en
el antígeno bacteriano Gram-negativo o en el
antígeno bacteriano Gram-positivo.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que la sangre o el producto sanguíneo se selecciona de
entre el grupo constituido por sangre completa, leucocitos, células
madre hematopoyéticas, plaquetas, glóbulos rojos, plasma, y
suero.
7. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 3,
en el que los anticuerpos que se unen específicamente al antígeno
bacteriano Gram-negativo se unen específicamente a
la estructura de Iipopolisacárido de las bacterias
Gram-negativas.
8. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que los anticuerpos que se unen específicamente al antígeno
bacteriano Gram-positivo se unen específicamente a
la estructura de ácido lipotecoico de las bacterias
Gram-positivas.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que los anticuerpos que se unen específicamente al
antígeno bacteriano Gram-negativo se marcan de
manera detectable con una primera molécula indicadora y los
anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno bacteriano
Gram-positivo se marcan de manera detectable con
una segunda molécula indicadora.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que la primera molécula indicadora y la segunda molécula
indicadora son iguales o no son iguales.
11. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que por lo menos una de entre la primera molécula indicadora y
la segunda molécula indicadora se selecciona de entre el grupo
constituido por una molécula con actividad enzimática, una molécula
radiomarcada, una molécula de fusión, una molécula fluorógena, un
sol metálico, una partícula, una molécula cromática, y una molécula
que está unida específicamente mediante un aglutinante
secundario.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que el conjunto de aglutinantes está inmovilizado sobre un
soporte en fase sólida.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el soporte en fase sólida es una placa de
microvaloración.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que por lo menos uno del mamífero donante y el mamífero
receptor es un ser humano o un mamífero domesticado.
15. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que la cantidad clínicamente pertinente es superior a
1\times10^{6} unidades formadoras de colonias (CFU) de
bacterias por ml de la sangre de donante, del producto sanguíneo de
donante o de fluido.
16. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que la cantidad clínicamente pertinente es superior a
1\times10^{5} CFU de bacterias por ml de la sangre de donante,
del producto sanguíneo de donante o de fluido.
17. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que la cantidad clínicamente pertinente es superior a
1\times10^{4} CFU de bacterias por ml de la sangre de donante,
del producto sanguíneo de donante o de fluido.
18. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que la cantidad clínicamente pertinente es superior a
1\times10^{3} CFU de bacterias por ml de la sangre de donante,
del producto sanguíneo de donante o de fluido.
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