CZ2002160A3 - Způsob imunologické detekce bakterií v darované krvi a tkáních a souprava pro tuto detekci - Google Patents

Description

Předložený vynález se týká vyšetření krve nebo krevního produktu (včetně plné krve, hematopoietických kmenových buněk, leukocytů, plazmy, séra, červených krvinek a krevních destiček) nebo darované tkáně na přítomnost klinicky závažného množství baktérií. Konkrétněji se předložený vynález týká vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v krvi nebo krevních produktech nebo v darované tkání, které se budou používat pro transfuzi nebo transplantaci.

Dosavadní stav techniky

Transfuze krve nebo krevních produktů je terapeuticky důležitým aspektem péče o pacienta. Transplantace darovaných tkání a orgánů je podobně terapeuticky důležitá. Absence klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v darované krvi dárce, darovaných krevních produktech nebo v darované tkáni nebo orgánech je základním požadavkem pro bezpečnost terapeutického použití těchto darovaných tekutin a tkání pro transfuzí nebo transplantací. Bakterémie může být například přechodná, trvalá nebo občasná. Wagner et al.

• ·· ·

• · · V « ·	• • ·	• ·
• 9 * • »·« * t *	• Φ •
99 99	»»·	• Φ

(Clin. Microbiol. Rev. 7: 290-302 (1994)) a Goldman et al. (Trans. Med. Revs. 5: 73-83 (1991)) uvádějí, že v kontaminované krvi transfundované pacientům se identifikoval velký počet rozdílných druhů baktérií a u pacientů se následkem transfuze rozvinula septikémie. Tadler et al. (J. Clin. Laboratory Analysis 2: 21-25 (1989)) uvádějí, že i když přechodná bakterémie má obecně malé následky, trvalá nebo občasná bakterémie může představovat životu nebezpečné situace pro některé populace pacientů, zejména pro pacienty s oslabenou imunitou, pro neonatální a geriatrické pacienty. Tedy, jestliže se má příjemci transfundovat krev kontaminovaná klinicky závažným množstvím baktérií, příjemce může trpět komplikacemi, zejména protože transfuze krve a/nebo krevních produktů se často provádí, když pacient podstupuje velkou operaci nebo je napadnutelný jiným způsobem.

Se*

Rovněž darované tkáně a orgányVftiají udržovat přednostně bez mikrobů a přednostně se má zabraňovat jejich rejekci příjemcem.

I když je potřebné bezpečné dodávání krve nebo krevního produktu bez mikrobů, pro detekci přítomnosti klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v krvi nebo krevním produktu existují účinné způsoby, které nejsou rychlé. I když existují způsoby určování, zda krev je nebo není infikována baktériemi, nej častější bakteriální testování se provádí u pacientů, u kterých se předpokládá infikovaná krev, s hlavním záměrem identifikovat přesně mikroorganismus, který způsobuje infekci tak, aby se mohlo začít s vhodnou terapií antibiotikem. U těchto způsobů identifikace infikujících baktérií se poměrně dlouhou dobu vzorek pacientovy krve kultivuje v kultivačním médiu, které podporuje růst těchto baktérií. Eventuálně se zvýší počet

• * *		*	* ·
• * ·	• tt	♦ ·	• · *
« · *	•		♦ ♦ · ·
• ··· ·			• · ·
J · ·· tttt	v • tttt	tttttt	tt» tttttt*

přítomných mikroorganismů na přiměřené množství, které se může detektovat.

I když jsou tyto testovací techniky krve založené na kultivaci užitečné pro určení jednotlivých typů baktérií, pro použití vyšetření darované krve a krevního produktu nebo darovaných orgánů jsou nepraktické v důsledku existence infikované pacientovy krve a délky doby potřebné pro provádění těchto způsobu. Je to kvůli tomu, že darovaná krev, krevní produkty a orgány jsou často potřebné pro použití jako transfuze nebo transplantace po poměrně krátkém hodnocení. Proto nemusí být čas pro vyšetření darované krve (nebo krevního produktu) nebo orgánu způsobem založeným na kultivaci předtím, než je potřebné použití darované krve nebo orgánu.

Kromě toho darované orgány a krev nebo krevní produkty mají poměrně krátkou životnost skladování v důsledku nejen ztráty funkce darovaného materiálu, ale také v důsledku zvýšení množství přítomných kontaminujících baktérií. Protože baktérie se rychle rozmnožují, dokonce malé množství kontaminujících baktérií přítomných v darované krvi nebo krevním produktu se bude s časem rychle zvyšovat. Například,i když darované krevní destičky jsou funkčně životaschopné pouze 7 dní po darování, málokdy se používají déle než 5 dní po darování kvůli nebezpečí bakteriální kontaminace, která nemusí být při darování signifikantní, ale po určité době se může zvýšit na úroveň, která je klinicky relevantní. Kromě toho tyto testovací techniky založené na kultivaci trvají příliš dlouho pro rutinní vyšetření krevních destiček, které mají krátkou životnost skladování (přibližně 5 dní po darování) pro použití pro transfuzi.

Brecher et al. (Transfusion 34(9): 750-755 (1994)) popisuje jiný způsob detekce .jednotlivých kontaminujících baktérií v krvi za použití značených sond nukleových kyselin za účelem hybridizace genetického materiálu možných kontaminujících látek. Sondy použité v této studii jsou však velmi omezené počtem mikroorganismů, které se mohou detektovat a naneštěstí ze z tohoto způsobu nevyvinul žádný komerčně realizovatelný test. V důsledku jejich obtížnosti jsou tyto techniky příliš náročné z hlediska práce a času na to, aby se rutinně používaly pro vyšetření krve nebo krevního produktu kvůli bakteriální kontaminaci.

Proto je potřebná technika rychlé detekce přítomnosti klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkáni. Ideální by byly techniky založené na navázání antigenů, které by se daly rychle a účinně použít. Bohužel Wagner, S. J.

(Int. J. Med. Microbiol. Virol. Parasitol. Infect. Dis. 283 (3):253-257 (1996)) uvádí, že neexistuje žádný běžný zdroj antigenů pro rozsáhlou detekci založenou na baktériích. Proto jsou potřebné metody detekce klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v darované krvi nebo krevních produktech nebo v darovaných tkáních založené na navázání antigenů.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje rychlé způsoby založené na navázání antigenů pro detekci klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v krvi nebo krevních produktech nebo v darované tkáni, zejména v darované krvi nebo krevních produktech nebo v darované tkání, které se mají přenášet z jednoho jednotlivce na druhého.

Tedy v prvním aspektu předložený vynález poskytuje způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující styk « * ·♦* ♦ vzorku krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen_z a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních prvního aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo grampozitivním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních prvního aspektu předloženého vynálezu se darovaná krev nebo krevní produkt, u kterých se stanovila absence klinicky závažného množství baktérií, podává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na jejich gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Límulus-antilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabílitu zvyšující protein (BP1) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií. V φ · φ

·*·· jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž antibiotíkem není vankomycin ani gentamycín. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních prvního aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou. V jistých provedeních jsou první oznamující molekula a druhá oznamující molekula stejné. V jiném provedení první oznamující molekula a druhá oznamující molekula nejsou stejné. Přednostně je první oznamující molekula nebo druhá oznamující molekula nebo obě molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu, částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

Ve druhém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující styk vzorku krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných • · • · ··« látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérii v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních druhého aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství grampozitivních baktérií se předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen. V jistých provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních druhého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny oznamující molekulou. Přednostně je oznamující molekulou molekula s enzymatickou aktivitou, molekula značená radioaktivním izotopem, fúzní molekula, fluorogenní molekula, sol kovu, částice, chromatická molekula nebo molekula, která se specificky váže na sekundární vazebnou látku.

<· · · • · * .

• ·♦· ♦ • · *· · ·· » » • » · • · ·♦·

Ve třetím aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující styk vzorku krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních třetího aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativních baktérií předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulusantilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

V různých provedeních třetího aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny oznamující molekulou. Přednostně je oznamující molekulou molekula s enzymatickou aktivitou, molekula značená radioaktivním izotopem, fúzní molekula, fluorogenní molekula, sol kovu, částice, chromatická molekula nebo molekula, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

Ve čtvrtém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krví nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a vazebné látky, které se vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu; přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a- žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních čtvrtého aspektu předloženého vynálezu dále souprava obsahuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních čtvrtého aspektu předloženého vynálezu darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se předává savčímu příjemci.

« * φ

··* * ··· ♦

Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulusantilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacítracín. Přednostně vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních čtvrtého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou. V jistých provedeních jsou první oznamující molekula a druhá oznamující molekula stejné. V jiném provedení první oznamující molekula « · a druhá oznamující molekula nejsou stejné. Přednostně je první oznamující molekula nebo druhá oznamující molekula nebo obě molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu, částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V pátém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitívních baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitívních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitívních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních pátého aspektu předloženého vynálezu dále souprava obsahuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenů. V jistých provedeních darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních se

* ·			• tt	•
	• ·	*	• ·	•
	•		tt * *	•
« ··♦ ·	•		« ·	«
• · ·· ··	* • tt·	···	• tt	•tt·

vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních pátého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny oznamující molekulou. Přednostně je oznamující molekulou molekula s enzymatickou aktivitou, molekula značená radioaktivním izotopem, fúzní molekula, fluorogenní molekula, sol kovu, částice, chromatická molekula nebo molekula, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V šestém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních šestého aspektu předloženého vynálezu dále souprava obsahuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegatívním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních darovaná krev nebo krevní produkt se « · »4« «4 ♦ ♦ • 4

49* 4

4«

4« «

stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativních baktérií se předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulusantilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI), antibiotikum, jako je.například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

V různých provedeních šestého aspektu předloženého vynálezu se vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou détektovatelně značeny oznamující molekulou. Přednostně je oznamující molekulou molekula s enzymatickou aktivitou, molekula značená radioaktivním izotopem, fúzní molekula, fluorogenní molekula, sol kovu, částice, chromatická molekula nebo molekula, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V různých provedeních prvního, druhého, třetího, čtvrtého, pátého a šestého aspektu předloženého vynálezu je krví nebo krevním produktem přednostně plná krev, hematopoietické kmenové buňky, leukocyty, červené krvinky, krevní destičky, plazma nebo sérum.

V sedmém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií ve tkání ze savce, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, «

0· * • · * • * * * » 0 * ···· • «a zahrnující styk vzorku tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních sedmého aspektu předloženého vynálezu se vzorek zpracovává před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních sedmého aspektu darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulus-antilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharídy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se » * • ** ·· φ · · • · · ϊ a • · · *

- ·♦ «·♦· specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen.

V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lípotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních sedmého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou.

V'jistých provedeních jsou první oznamující molekula a druhá oznamující molekula stejné. V jiném provedení první oznamující molekula a druhá oznamující molekula nejsou stejné. Přednostně je první oznamující molekula nebo druhá oznamující molekula nebo obě molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu, částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V osmém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkání ze savce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnující styk vzorku tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních i 4 baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních osmého aspektu předloženého vynálezu se vzorek zpracovává před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotíkem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních osmého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny oznamující molekulou. Přednostně je oznamující molekula molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V devátém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkání od savčího dárce *

pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnující styk vzorku této tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnost klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni a Žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních devátého aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních se darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativních baktérií předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulus-antilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

V různých provedeních devátého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na « « ·* *··· ··♦ » ··» « gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny oznamující molekulou. Přednostně je oznamující molekulou molekula s enzymatickou aktivitou, molekula značená radioaktivním izotopem, fúzní molekula, fluorogenní molekula, sol kovu, částice, chromatická molekula nebo molekula, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V desátém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni ze savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních desátého aspektu předloženého vynálezu dále souprava zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních desátého aspektu předloženého vynálezu darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce, od kterého se tkáň získala, a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se • Φ ···· φ · φ « * • φ φ « «φφ ·

specificky vážou na gramnegativní baktérie nebo jejich antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulus-antilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotíkem není vankomycin ani gentamycín. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních desátého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou.

V jistých provedeních jsou první oznamující molekula a druhá oznamující molekula stejné. V jiném provedení první oznamující molekula a druhá oznamující molekula nejsou stejné. Přednostně je první oznamující molekula nebo druhá oznamující molekula nebo obě molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu, částicí, • · •ft ···· ft ftft * • ft • ftft · •

•ft · chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V jedenáctém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomností klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni a žádné navázání je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních jedenáctého aspektu předloženého vynálezu dále souprava zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství grampozitivních baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vázou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

·« *

φ ·« · · ·«« * ··

V různých provedeních jedenáctého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny oznamující molekulou. Přednostně je oznamující molekula molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

Ve dvanáctém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérii v darované tkáni ze savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních dvanáctého aspektu předloženého vynálezu dále souprava zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenů. V jistých provedeních tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativních baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní • ·· * - .

♦ · 0 · ·· ·

0·* · Σ ··· 0 · ’ • · ' · ·

000 »0 0·0 ··· • 0 ·« 0000 bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulus-antilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericídní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

V různých provedeních dvanáctého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny oznamující molekulou. Přednostně je oznamující molekula molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V různých provedeních sedmého, osmého, devátého, desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu předloženého vynálezu je darovanou tkání přednostně srdce, plíce, játra, kůže, ledvina, pankreas, slezina nebo kostní dřeň.

V jistých přednostních provedeních všech výše uvedených aspektů předloženého vynálezu je sada vazebných látek imobílizována na tuhém nosiči (například na mikrotitrační plotně). V přednostních provedeních prvního, druhého, třetího, čtvrtého, pátého, šestého, sedmého, osmého, devátého, desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu předloženého vynálezu je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

• ··· ·

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je schématickým znázorněním typické membrány grampozitivni buněčné steny.

Obrázek 2 je schématickým znázorněním struktury lipopolysacharidu {LPS) nacházejícího se v buněčné stěně gramnegativní baktérie.

Obrázky 3A až 3D jsou schématickým znázorněním zařízení podle provedení podle vynálezu. Obrázek 3A znázorňuje zařízení bez přídavku vzorku krve nebo krevního produktu (nebo bez přídavku tekutiny, ve které se skladuje darovaná tkáň). Obrázek 3B znázorňuje zařízení v časovém okamžiku, kdy se přidává vzorek krve nebo krevního produktu. Obrázek 3C znázorňuje styk vzorku tělní tekutiny se zařízením. Obrázek 3D znázorňuje pozitivní výsledek za použití zařízení podle vynálezu, indikující, že vzorek testované krve nebo krevního produktu byl kontaminován mikroorganismy.

Obrázky 4A až 4D jsou schématickým znázorněním způsobu podle vynálezu. Obrázek 4A znázorňuje přidání vzorku krve, krevního produktu nebo tekutiny, ve které se darovaná tkáň skladuje, do testovacího zařízení. Obrázek 4B znázorňuje přidání latexových perliček potažených protilátkami, které se specificky vážou na gramnegativní i grampozitivni baktérie, do testovacího zařízení. Obrázek 4C znázorňuje smíchání vzorku s latexovými perličkami potaženými protilátkami v testovacím zařízení. Obrázek 4D znázorňuje vizuální výsledky negativního navázání (tj. žádnou baktérii ve vzorku; vlevo) a navázání (tj. přítomnost baktérií ve vzorku, vpravo).

Obrázek 5 je grafickým znázorněním jistého počtu rozličných (indikovaných) grampozitivních baktérií specificky vázaných s neomezující vazebnou látkou podle vynálezu, protilátkou lipotechoové kyseliny.

• Β • » » • * ·· *

Β · · • ♦·· · • *· ΒΒΒ Β·

(indikovaných) gramnegativních baktérií specificky vázaných s neomezující vazebnou látkou podle vynálezu, protilátkou lipopolysacharidu.

Podrobný popis přednostních provedení

Vynález se týká detekce klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkání, zejména v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkání, které se mají přenášet z dárce k příjemci. Předložený vynález poskytuje rychlé způsoby založené na navázání antigenu pro detekci klinicky závažného množství mikroorganismů v krvi nebo v krevních produktech nebo v tekutině, ve které se darovaná tkáň skladuje, a soupravy k provádění těchto způsobů. Vynález je založen na zjištění, že přesná identita kontaminujících baktérií v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkáni, které se mají použít pro transfuzí nebo transplantaci, je irelevantní. Proto vynález poskytuje způsoby využívající vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní a rovněž na gramnegativní baktérie, za účelem detekce jakéhokoliv navázání ke vzorku krve nebo krevního produktu nebo ke vzorku tekutiny, ve které se skladuje darovaná tkáň. Tedy, pokud se detektuje jakékoliv navázání, znamená to, že krev nebo krevní produkt nebo darovaná tkáň jsou kontaminovány a přednostně nebudou použité pro předání jinému jednotlivci.

Publikovaná patentová a vědecká literatura, na kterou se v tomto textu odkazuje, potvrzuje poznatky, které jsou k dispozici odborníkům v tomto oboru. Udělené patenty, přihlášky a odkazy, které jsou zde citovány, jsou tímto začleněny pomocí odkazu ve stejném rozsahu, jako by byl každý • Φ ► · · ► · ·

I 0 ·

0000

0 β

«00

00 specificky a individuálně začleněn pomocí odkazu. Jakýkoliv rozpor mezi těmito publikacemi a předloženým vynálezem by se měl řešit ve prospěch předloženého vynálezu.

V prvním aspektu předložený vynález poskytuje způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci. Způsob zahrnuje styk vzorku krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V přednostních provedeních je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec (například kočka, kůň, prase).

Výraz „krev nebo krevní produkt, jak se používá v tomto textu, zahrnuje jakoukoliv buňku nacházející v krvi nebo kostní dřeni a jakýkoliv produkt pocházející z krve nebo kostní dřeně bez omezení včetně plné krve, hematopoietických kmenových buněk, červených krvinek, krevních destiček, plazmy, séra a leukocytů (včetně lymfocytů). Odborníkovi v oboru biologie bude zřejmé, že bez přidání protisrážlivého činidla, jako je například EDTA nebo heparin, bude se plná krev srážet za převádění většiny krevních buněk na nepoužitelné pro transfuzi. Proto je ve výrazu „krev nebo krevní produkt zahrnuta krev zpracovaná jakýmkoliv protisrážlivým činidlem. Kromě toho během izolace jednotlivých krevních produktů (například krevních destiček za použití kataforézy krevních destiček) se mohou ke krvi přidávat nekrevní složek, jako je například fyziologický roztok. Tedy výraz „krev nebo krevní produkt zahrnuje rovněž krev, ke které byla přidána jakákoliv biologicky inertní látka, jako je například fyziologický roztok, voda nebo skladovací živný roztok.

Výraz „klinicky závažné množství, jak se používá v tomto textu, znamená množství bakteriální kontaminace v krvi nebo krevním produktu, které je rovné nebo je vyšší než množství, které když je přítomné v krvi nebo krevním produktu transfundovaném typickému příjemci transfuze, vyvolává u příjemce transfuze bez omezení kterýkoliv z následujících symptomů: horečku, nachlazení, hypotenzi, rýmu, bolesti hlavy, dusnost, oligurie, průjem, bolest v místě infuze, kopřivku, pocení, bolest hrudníku, petecchiae a ecchymosis, roztroušenou nitrocévní koagulaci, septický šok, selhání orgánů a až smrt {viz například, Morduchowicz,

G. et al., Revíews of Infectious Diseases 13:307 (1991). V důsledku krátké doby dělení baktérií by mělo být množství baktérií v krvi určeno podle možností těsně před transfuzí. Typicky je v době transfuze klinicky závažné množství větší než 1 x IQ⁷ kolonie tvořících jednotek (CFU) na ml krve nebo krevního produktu. Přednostně je klinicky závažné množství v době transfuze větší než 1 x 10⁶ CFU/ml. Více přednostně je klinicky závažné množství v době transfuze větší než 1 x 10⁵ CFU/ml. Ještě více přednostně je klinicky závažné množství v době transfuze větší než 1 x 10⁴ CFU/ml. Ještě více přednostně je klinicky závažné množství v době transfuze větší než 1 x 10³ CFU/ml. Nejvíce přednostně je klinicky závažné množství v době transfuze větší než 1 x 10² CFU/ml. Samozřejmě pro odborníka v oboru transfúzní medicíny bude zřejmé, že i když někteří jedinci, jako jsou například pacienti s těžce oslabeným imunitním systémem nebo novorozenci, budou mít imunitní systém, který není schopný kompenzovat množství

I <

baktérií, které je nižší než klinicky závažné množství. Avšak běžní odborníci v praxi budou chápat, že tyto způsoby podle vynálezu budou postačující pro testování krve nebo krevních produktů, které se mají použít pro transfuzí u rozsáhlé většiny pacientů.

Výraz „specificky se váže, jak se používá v tomto textu, znamená, že vazebná látka (například protilátka) rozpoznává a váže se na jednotlivý ligand (například polypeptid, sacharid, lipid nebo glykoprotein), ale v podstatě nerozpoznává a neváže se na jiné molekuly ve vzorku, například v biologickém vzorku, který přirozeně obsahuje mnoho rozličných proteinů. Podobně ligand vázaný vazebnou látkou, která specificky váže tento ligand, je označován jako „specificky vázaný touto vazebnou látkou. Spojení vytvořené mezi vazebnou látkou a jejím ligandem může být kovalentní, ale přednostně je nekovalentní. Přednostně vazebná látka, která specificky váže ligand, tvoří spojení s tímto ligandem s afinitou alespoň 10⁶ M^_1, více přednostně alespoň 10⁷ M'¹, ještě více přednostně alespoň IQ⁸ M’¹, a nejvíce přednostně alespoň IQ⁹ M'¹ za fyziologických podmínek nebo podmínek, které se blíží fyziologickým podmínkám vzhledem ke koncentraci iontů, například 140 mM NaCl, 5 mM MgCl₂.

Výraz „antigen (například gramnegativní bakteriální antigen nebo grarapozitivní bakteriální antigen), jak se používá v tomto textu, znamená jakoukoliv molekulu z výjimkou molekul nukleových kyselin a peptidoglykanů, v jakékoliv strukturní konformaci, která se může specificky vázat S vazebnou látkou. Gramnegativním bakteriálním antigenem je například antigen, který je vylučován do vnitřku nebo přítomný na (nebo přes) buněčné membráně, buněčné stěně nebo periplazmatickém prostoru gramnegativní baktérie. Místo na antigenu, které se váže s vazebnou látkou, se nazývá „vazebné

V» φ • » ·· » t * φφφ φ · • · «· 4W· ·· »»

Φ » * * ♦ « < · * « • · · .

₉ 1« ΦΦ»« místo, Antigenem může být bez omezení protein, glykoprotein, sacharid nebo lipid. Specificky jsou z definice antigenu podle předloženého vynálezu vyjmuty peptidoglykany a molekuly nukleových kyselin, jako jsou například DNA nebo RNA.

Výraz „grampozitivní baktérie, jak se používá v tomto textu, znamená kmen, typ, druh nebo rod baktérii, který při vystavení zbarvení podle Grama si zachovává zbarvení, a tedy je zbarven modrofialově.

Výraz „gramnegativní baktérie, jak se používá v tomto textu, znamená kmen, typ, druh nebo rod baktérií, který při vystavení zbarvení podle Grama nezůstává zbarven, a tedy není zbarven modrofialově. Odborníkům v daném oboru je samozřejmě známo, že v závislosti na koncentraci barviva a na délce expozice mohou gramnegativní baktérie odnášet nepatrné množství Gramova barviva a zbarvují se slabě modrofialově. Avšak ve srovnání s grampozitivními baktériemi zbarvenými stejnou formulací Gramova barviva během stejné doby budou gramnegativní baktérie mnohem méně zbarveny než grampozitivní baktérie.

Bakteriální buněčná stěna je komplex semirigidní struktury, který vymezuje tvar organismu, obklopuje základní cytoplazmatickou membránu a chrání bakteriální buňku před vnějším prostředím. Bakteriální buněčná stěna je složena z makromolekulám! sítě známé jako peptidoglykan zahrnující sacharidy a polypeptidy, které tvoří strukturu kolem bakteriální buňky. Bakteriální buněčná stěna poskytuje mechanickou stabilitu pro bakteriální buňku a zabraňuje osmotické lýze. Nejzávažnější pro předložený vynález je chemické složení buněčné stěny, které se využívá pro rozlišení většiny druhů baktérií.

Buněčné stěny odlišných druhů baktérií se mohou odlišovat tloušťkou, strukturou a složením. Avšak existují dva hlavní typy bakteriální buněčné stěny a zda daný druh

ΦΦΦ φ φ · · φ« ·ΦΦ* φφφ φφ φ φφφ baktérie má jeden nebo druhý typ buněčné stěny, se může obecně určit pomocí reakce buňky s jistým barvivém.

Nejčastěji používaným barvivém pro barvení baktérií je Gramovo barvivo. Když se provádí barvení touto krystalovou violetí a jodem, baktérie, které zůstávají zbarveny, se nazývají grampozitivní a baktérie, které nezůstávají zbarveny, se nazývají gramnegativní.

Grampozitivní bakteriální buněčná stěna obsahuje poměrně silnou vrstvu peptidoglykanu. Tato struktura je umístěna jako opakující se sacharidové jednotky N-acetylglukosamínu (NAG) a N-acetylmuramové kyseliny spojené β-l,4-glykosidovými vazbami. Zbytky N-acetylmuramové kyseliny jsou zesítěny se sousedními řetězci (NAM-NAG)_X (kde x je jakékoliv číslo) přes tetrapeptidy, kde peptidy 2 a 3 mohou projevovat jistou variabilitu v povaze peptidu. Některé ze zesítěných se rozšiřují nad a pod rovinu vytvářejíc vícenásobnou vrstvu peptidoglykanu. Tyto polymery obklopují povrch buňky, a tím vymezují tvar organismu.

V grampozitivní buněčné stěně je umístěna lipopolymerní sloučenina obsahující lipotechoovou kyselinu (LTA), která může představovat značnou hmotnost buněčné stěny některých druhů. Tyto polymery zahrnují hlavně glycerolfosfát (nebo ribitolfosfát). Obrázek 1 znázorňuje schématicky typickou membránu grampozitivní bakteriální buňky. V důsledku její vysoké polarity a výsledného kladného náboje struktury lipotechoové kyseliny pravděpodobně regulují tok iontů a živin dovnitř a ven z bakteriální buňky. Struktury LTA jsou vysoce antigenní a mohou tvořit základ molekulární specifičnosti potřebné pro umožnění rozsáhlé detekce této třídy baktérií. Protože lipotechoové kyseliny jsou běžné v grampozitivních baktériích, testovací postupy, které rozpoznávají tuto strukturu by mohly být velmi indikativní při kontaminací grampozitivními baktériemi. Protože chemická • · · · · ¹ · · φ 440 4 ·

«04 ·· 0

0 »4 »·** struktura polymerů lipotechoové kyseliny je přiměřeně zachována mezi různými kmeny grampozitivních baktérií, sondování přítomnosti této struktury buněčné stěny umožňuje detekci mnohých grampozitivních baktérií.

Bakteriální buněčná stěna gramnegativního typu je jednoznačně vzhledově vrstvena a je mnohem tenčí než grampozitivní buněčná stěna. Gramnegativní bakteriální buněčná stěna je podobná grampozitivní tím, že je stavěna na lipidové dvoj vrstvě obsahující proteiny, avšak lipidy na vnitřní straně jsou fosfolipidy, zatím co lipidy na vnější straně zahrnují makromolekuly nazývané lipopolysacharidy (LPS). Tato lipopolysacharidová struktura tvoří silný záporný náboj na vnějším povrchu buňky, která se využívá pro rozpoznávání a přežití organismu. Tato lipopolysacharidová struktura rovněž poskytuje toxický účinek gramnegativní infekce a z toho důvodu se nazývá „endotoxin.

Struktura lipopolysacharidové složky byla popsána v mnohých studiích a je znázorněna na obrázku 2. Obecně se struktura lipopolysacharidového antigenu může popsat jako obsahující tři zřetelné oblasti. Krajní oblast, která se nazývá O-specifická oblast a skládá se z lineárních a rozvětvených řetězců sacharidů, je vysoce variabilní a je typicky odlišné pro jednotlivé druhy. Sérologické testy využívají tuto odlišnost pro identifikaci jednotlivých kmenů gramnegativních baktérií. Přítomnost O-řetězců způsobuje při mikroskopickém výzkumu hladký povrch. Naopak druhy nebo mutanty bez O-specifických postranních řetězců vypadají drsně. Většina divokých typů se proto označuje jako „hladké kmeny a mutanty bez této struktury se označují jako „drsné kmeny.

Zevnitř O-specifické oblasti v lipopolysacharidové struktuře je polysacharidové oblast jádra, která má vysoký stupeň homologie mezi druhy. Oblast jádra se může dále dělit na dvě oblasti, a to „vnitřní jádro a „vnější jádro. Vnější jádro oblasti jádra projevuje jistou variabilitu, ale má obvyklé elementy a obecně obsahuje glukózu, galaktózu, N-acetylglukosamin a jiné sacharidy. Vnitřní jádro oblasti jádra všech gramnegativních baktérii s lipopolysacharidovou strukturou obsahuje chemicky identické struktury. Vnitřní jádro je složeno ze zbytků heptózy a 2-keto-3-deoxyoktonátu (KDO).

Většina vnitřních složek s lipopolysacharidovou strukturou má lipidovou strukturu A, která tvoří chemicky nejvíce stejnorodou část lipopolysacharidu. Lipid A je složen z disacharidu β-glukosaminyl- (1—>6) -α-glukosamin, který je fosforylován na každém svém sacharidovém vzdáleném konci. Sacharidový hlavní řetězec je acylován na každém 2,3-centru substituovanými deriváty myristové kyseliny. Postranní řetězce mastné kyseliny projevují jistý nízký stupeň druhově závislé modifikace, ale tyto mastné kyseliny jsou včleněny do buněčné membrány a nejsou schopné imunologického rozpoznávání. Tvorba protilátek je pravděpodobně výsledkem opracované odhalené bifosforyl-glukosamin-disacharidové hlavní struktury, která je velmi dobře zachovávána.

Strukturní variabilita struktury LPS se snižuje od povrchové odhalené O-specifické oblasti k vnitřním a vnějším oblastem jádra k disacharidovému derivátu a lipidu A vloženému v membráně. Důvodem tohoto gradientu variability je pravděpodobně vyvinutý tlak působící proti gramnegativním baktériím. Dá se představit, že mikroby změnily svou odhalenou povrchovou strukturu v čase jako odpověď na tento tlak.

Stejně jako u struktur lipotechoové kyseliny v grampozitivních baktériích mohou se zachovávané lipopolysacharidové struktury mezi rody gramnegativních baktérií použít jako metodologie pro rozsáhlou detekci. Tyto ·

• 0 0 »00 ·

0·0· :

0*4 «0 ·· * • · · · · * · · ·*· ··« jedinečné terče (lipotechoové kyseliny v grampozitivních a lipid A nebo oblasti jádra LPS struktury v gramnegativních baktériích) jsou základem metodologie detekce tříd mikroorganismů.

Výraz „vazebná látka, jak se používá v tomto textu, znamená molekulu nebo makromolekulu schopnou vázat se na ligand, s tou výjimkou, že vazebná látka není přirozeně se vyskytující látkou nacházející se v ostrorepovi americkém (například Limulus polyphemus), která se váže s endotoxinem. Přednostně vazebná látka podle vynálezu není rekombinantní látkou odvozenou od látky nacházející se v ostrorepovi americkém (například Limulus polyphemus), která se váže s endotoxinem. Vazebnou látkou může být bez omezení protilátka, antibiotikum, protein, fúzní protein (například protein obsahující části dvou nebo více proteinů) nebe chemický chelaton. V jistých přednostních provedeních je vazebnou látkou podle vynálezu peptid nebo peptídomimetikum. Pro účely vynálezu je „peptid molekulou obsahující lineární část zbytků aminokyselin spojených navzájem v lineární části peptidovými vazbami. Takové peptidy podle vynálezu mohou zahrnovat přibližně tři až přibližně 500 aminokyselin a mohou dále obsahovat sekundární, terciární nebo kvartémí struktury a rovněž intermolekulární asociace s jinými peptidy nebo jinými nepeptidovými molekulami. Takové intermolekulární asociace se mohou uskutečňovat bez omezení prostřednictvím kovalentní vazby (například prostřednictvím disulfidových vazeb) nebo prostřednictvím chelatace, elektrostatických interakcí, hydrofobních interakcí, vodíkových vazeb, interakcí mezi ionty a dipóly, interakcí mezí dipóly a dipóly nebo prostřednictvím jakékoliv kombinace výše uvedených vazeb.

V jistých přednostních provedeních taková vazebná látka obsahuje oblast určující komplementaritu (CDR) protilátky, ♦ »

«··«

která se za fyziologických podmínek váže na epitop obsahující antigen lipopolysacharidové (LPS) struktury gramnegativních baktérií nebo na strukturu lipotechoové kyseliny (LTA) grampozitivních baktérií nebo peptidomíraetikům takové oblasti určující komplementaritu. Pro účely předloženého vynálezu je „oblast protilátky určující komplementaritu tou částí protilátky, která se za fyziologických podmínek váže na epitop včetně jakýchkoli strukturních oblastí potřebných pro takové navázání a která se přednostně skládá z podmnožiny aminokyselinových zbytků kódovaných oblastmi s humánními těžkými řetězci V, D a J a oblastmi s humánními lehkými řetězci V a J a/nebo jejich kombinacemi. Příklady přednostních provedení zahrnují protilátku nebo derivát protilátky, kterou více přednostně může být monoklonální protilátka, humánní protilátka, humanizovaná protilátka, protilátka s jednoduchým řetězcem, chimérická protilátka nebo fragment protilátky vázající antigen.

Odborníci v daném oboru jsou schopni vytvořit jakékoliv deriváty protilátek za použití standardních technik uznávaných v oboru. Například Jones et al. (Nátuře 321: 522525 (1986)) zveřejňuje nahrazení oblastí určujících komplementaritu (CDR) humánní protilátky oblastmi z myší protilátky. Marx (Science 229: 455-456 (1985)) pojednává o chimérických protilátkách, které mají myší variabilní oblasti a humánní konstantní oblasti. Todwell (Nátuře 342: 99-100 (1989)) pojednává o rozpoznávacích elementech s nižší molekulovou hmotností odvozených z informace CDR protilátky. Clackson (Br. J. Rheumatol. 3052: 36-39 (1991)) pojednává o geneticky zkonstruovaných monoklonálních protilátkách, včetně derivátů fragmentu Fv, o protilátkách s jednoduchým řetězcem, fúzních proteinech, chimérických protilátkách a humanizovaných protilátkách z hlodavců. Reichman et al. (Nátuře 332: 323-327 (1988)) zveřejňuje humánní protilátku, *

na kterou se naštěpovaly krysí hypervariabilní oblasti. Verhoeyen et al. (Science 239: 1534-1536 (1988)) zveřejňuje štěpování vazebného místa myšího antigenu do humánní protilátky.

Kromě toho odborníci v daném oboru jsou schopni navrhnout a vytvořit peptidomimetika s vazebnými charakteristikami podobnými nebo lepšími, než má taková oblast určující komplementaritu (viz například, Horvell et al., Bioorg. Med. Chem. 4: 1573 (1996); Liskamp et al., Reci. Trav. Chim. Pays-Bas 1: 113 (1994); Gante et al., Angew.

Chem. Int. Ed. Engl. 33: 1699 (1994); Seebach et al., Helv. Chim. Acta 79: 913 (1996)). Rovněž všechny takové deriváty protilátek a jejich peptidomimetika jsou zahrnuty do rozsahu předloženého vynálezu. Kompozice podle vynálezu může dále zahrnovat fyziologicky přijatelná ředidla, stabilizační činidla, lokalizační činidla nebo pufry.

Přídavné přednostní vazebné látky podle vynálezu zahrnují malé molekuly, které se mohou identifikovat za použití vyšetření nebo racionálních přístupů řešení, jak se zde dále uvádí.

Více přednostně jsou vazebnými látkami podle předloženého vynálezu protilátky, jako jsou například polyklonální protilátky nebo monoklonální protilátky a/nebo deriváty protilátek. Vytváření monoklonálních a polyklonálních protilátek je pro odborníka v oboru biologie známo (viz například Ausubel et al·., Current Protocois in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994). Při vytváření protilátek k požadovaným jedinečným terčovým antigenům je užitečných velký počet postupů. Výsledkem tradiční imunizace a technik shromažďování je tvorba polyklonálních protilátek zaměřených proti běžným determinantům terčových bakteriálních druhů (LTA nebo LPS). Přídavně se mohou použít celulární hybridizační techniky pro

• ··« ft »

Β « » • ft* 94 444 ··· produkci nesmrtelných hybridomových buněčných linií, které tvoří specifické monoklonální protilátky vůči terčovým druhům.

Protilátky, které jsou potenciálně užitečné pro rozsáhlou detekci grampozitivních baktérií zahrnují protilátky popsané v pracích Fisher et al., PCT přihláška č. WO98/57994; Jackson, D.E. et al., Infection and Immunity 43: 800 (1984); Hamada, S. et al., Microbiol, Immunol. 28: 1009 (1984); Aasjord, P. et al., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Séct. C, 93: 245 (1985); McDaniel, L.S, et al., Microbial Pathogenesis 3: 249 (1987); Tadler, M.B. et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis 3: 21 (1989); a Stuertz, K. et al., Journal of Clinical Microbiology 36: 2346 (1998) .

Protilátky, které jsou potenciálně užitečné pro rozsáhlou detekci gramnegativních baktérií zahrnují protilátky popsané v pracích Nelles, M.J. et al., Infect. Immun. 46: 677 (1984); Teng, N.N.H. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 1790 (1985); Dunn, D.L. et al., Surgery 98: 283 (1985); De Jongh-Leuvenink, J. et al., Eur. J. Clin. Microbiol. 5: 148 (1986); Bogard, W.C. et al., Infect. Immun. 55: 899 (1987); Pollack, M. et al., Bacterial Endotoxins: Pathophysiological Effects, Clinical Significance, and Pharmacological Control, pp. 327-338 Alan R. Liss, lne.

(1988); Priest, B.P. et al. Surgery 106: 147 (1989); Tyler, J.W. et al., Journal of Immunological Methods 129; 221 (1990); Siegel, S.A. et al., Infect. Immun. 61: 512 (1993); Shelburne, C.E. et al., J. Periodont. Res. 28: 1 (1993); Di Pardova, F.E. et al., Infect. Immun. 61:3863 (1993); a De Kievit, T.R. and Lam, J.S.J. Bacteriol. 176: 7129 (1994).

Výběr protilátky (protilátek), která se má použít, se může provádět klasickými technikami. Specifičnost protilátky, oblast navázání a kinetika se může charakterizovat empiricky fc fc ··* ··· · « ·« testováním každé protilátky v empirickým způsobem.

Mikrotitrační způsoby vyšetření jsou v literatuře dobře popsány za účelem charakterizace specifické odpovědi protilátky v jakékoliv dané formě imunoanalýzy. Podobně aktivity detektovatelně značených protilátek se mohou charakterizovat prováděním množství chemických konjugačních technik a vyšetřováním výsledného produktu pro optimální pracovní parametry. Zachycované protilátky a detektovatelně značené protilátky se mohou vyšetřovat proti klinickým izolátům baktérií ze zachycených vzorků krevních destiček nebo červených krvinek za účelem emulování provedení finální analýzy jako blízké k finálnímu produktovému provedení, pokud je to možné. Toto experimentování vede k výběru a optimalizaci činidel na bázi protilátek pro aplikaci v rozličných analýzách popsaných níže. Pokud se identifikují vazebné látky, které se lépe empiricky realizují než popsané nebo vytvořené alternativní protilátky, potom se vyhodnocují ve stejném empirickém formátu popsaném pro protilátky.

Monoklonální protilátky se specifitou vůči jedinečným rodově zkříženým terčům na povrchu bakteriální buňky se používají pro vývoj skupinové detekční analýzy. Pokud jednotlivé klony protilátek neposkytují požadovanou mez detekční citlivosti (jako například v případě se substitucemi ve struktuře LTA) pro každý druh, mohla by se použít směs monoklonálních protilátek. Rozšíření tohoto pro LPS by mohlo zahrnovat tvorbu polyklonálního antiséra se širokou specifitou pro odlišné gramnegativní druhy. Polyklonální protilátky se mohou rovněž nahradit v každé z níže popsaných forem analýzy.

Ještě dalším typem vazebné látky podle vynálezu jsou vazebné receptory, které jsou odlišné od imunoglobulinu.

Jisté přednostní metody využívají vytváření komplexů gramnegativních baktérií s takovými neomezujícími formami, »

· *

· 0

0* *·* * *

000 00 v

»0 ··· «

• «0 jako je například Limulus-antilipopolysacharidový faktor (LALF) , polymixiny, kationtový antimikrobiální protein (CAP18), sérový myloid P, magaininy, baktenecíny, receptor TLR-4 , protein vázající lipopolysacharidy (LBP) a bakterícidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a rovněž antibiotika, jako je například bacitracin a jiná antibiotika. Jisté přednostní metody využívají vytváření komplexů grampozitivních baktérií s takovými neomezujícími formami, jako je například protein vázající manózu (MBP), receptor TLR-2, histatiny a antibiotika, přičemž tímto antibiotikem neni vankomycin a gentamycin. Jisté přednostní metody využívají vytváření komplexů gramnegativních baktérií a grampozitivních baktérií s takovými neomezujícími formami, jako je například CD14, α-šroubovicové kationtové peptidy, laktoferricín B, mikrobiální proteiny krevních destiček a neutrofilní peptidy (defensiny). Každá z těchto vazebných látek má schopnost vázat se k rozsáhlým druhům baktérií a mohla by se použít v tandemu nebo jako imunní komplexotvorné činidlo.

Protilátky a vazebné látky popsané výše se mohou použít, jak jsou popsány nebo modifikované, když je potřebné vytvořit užitečné imunologické činidlo.

Podle prvního aspektu předloženého vynálezu se přítomnost nebo nepřítomnost navázání může stanovit standardními technikami včetně použití vazebných zkoušek podle vynálezu popsaných dále. Obecně stanovení „navázání (tj. přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v krvi nebo v krevním produktu) se konstatuje, když s.e vzorek od dárce váže alespoň 0,5x silněji, než je navázání pozadí, kde pozadí je vzorek krve nebo krevního produktu, který neobsahuje žádnou bakteriální kontaminaci. Například vzorek darovaných krevních destiček se porovnává s pozadím obsahujícím vzorek krevních destiček, které neobsahují žádnou » * * ··· · ·· φ » ·· bakteriální kontaminaci. Tedy, kde je pozadí 0,l· jednotek (například jak se stanoví pomocí čítače mikrotitrační plotny), konstatuje se stanovení „navázání tehdy, když je vzorek z darované krve nebo krevního produktu alespoň 0,15 jednotek. Více přednostně se stanovení „navázání konstatuje tehdy, když se vzorek od dárce váže alespoň 0,75x silněji, než je navázání pozadí. Ještě více přednostně se stanovení „navázání konstatuje, když se vzorek od dárce váže alespoň l,0x silněji než pozadí. Ještě více přednostně se stanovení „navázání konstatuje, když vzorek od dárce váže alespoň l,25x silněji než pozadí. Nejvíce přednostně se stanovení „navázání konstatuje, když se vzorek od dárce váže alespoň l,5x silněji než pozadí.

V jistých provedeních prvního aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo grampozitivním bakteriálním antigenu. Vazebné místo na bakteriálním antigenu se může odhalit například odštěpením antigenu z buněčné stěny nebo buněčné membrány baktérií, a tím odhalením vazebného místa; vyvoláním sekrece antigenu baktériemi, a tím odhalením vazebného místa; lýzou baktérií, čímž se uvolní intracelulární bakteriální antigen, a tím se odhalí vazebné místo na antigenu; nebo vyvoláním změny konformace na bakteriálním antigenu, a tedy odhalením vazebného místa. Taková zpracování zahrnují mechanické rozbití bakteriálních buněk ve vzorku fyzikálními prostředky, například bez omezení sonikací, varem nebo homogenizací za použití například Dounceova homogenízátoru. Zpracováním může být rovněž zpracování vzorku chemicky sloučeninou nebo kompozicí, jako je například detergent, zásaditý roztok (pro alkalickou lýzu), kyselý roztok (pro kyselou lýzu), EDTA, EGTA, kovový φ

»

Η·

·· »··· iont, aniont, kationt, povrchově aktivní látka, cheíatační činidlo a/nebo enzym, zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu.

V jednom provedení prvního aspektu předloženého vynálezu se darovaná krev nebo krevní produkt, u kterých se stanovila absence klinicky závažného množství baktérií, předává savčímu příjemci. Pod „předáním se rozumí podávání, transfuze, transplantace nebo přenos krve, krevního produktu a/nebo tkáně od savčího dárce savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce, od kterého se vzorek krve nebo krevního produktu získal, a savčí příjemce jsou stejného druhu. Podle způsobů podle předloženého vynálezu se darovaná krev nebo darovaný krevní produkt může rychle vyšetřit na přítomnost jakýchkoliv kontaminujících baktérii, bez ohledu na kmen nebo typ kontaminujících baktérií. Je samozřejmé, že v důsledku velké rychlosti množení baktérií v krví nebo krevním produktu je přednostní transfundovat určenému příjemci darovanou krev nebo krevní produkt bez klinicky závažného množství baktérií, jak se stanoví podle vynálezu, krátce po testování.

Přednostně se darovaná krev nebo krevní produkt bez klinicky závažného množství baktérií podává ve formě transfuze pacientovi ne později než 42 dnů po začátku testování, více přednostně ne později než 30 dní po testování, více přednostně ne později než 2 týdny po testování, více přednostně ne později než 7 dní po testování, ještě více přednostně ne později než 3 dny po testování a ještě více přednostně ne později než ne později než 2 dny po testování, ještě více přednostně ne později než 24 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 12 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 6 hodin po testování a nejvíce přednostně se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérii tt·· ·

transfunduje příjemci za 3 hodiny od začátku testování. Nejvíce přednostně je krví nebo krevním produktem plná krev, hematopoietické kmenové buňky, leukocyty, krevní destičky, červené krvinky, plazma nebo sérum.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulusantilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin, Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lípopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

Odborníkům v biologii bude zřejmé, že ve vynálezu se může použít jakákoliv kombinace jedné nebo více odlišných vazebných látek. Tedy antibiotikum, které se specificky váže na podskupinu grampozitivních baktérií, se může kombinovat s protilátkou, která se specificky váže na zbylé

I »

00« • 00

0* »0* · * « · * 0 0 · ♦ ♦

00*· grampozítivní baktérie, a druhou protilátkou, která se specificky váže na všechny gramnegativní baktérie.

V různých provedeních prvního aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou. V jednom provedení jsou první oznamující molekula a druhá oznamující molekula stejné. V jiném provedení první oznamující molekula a druhá oznamující molekula nejsou stejné. Přednostně první oznamující molekula nebo druhá oznamující molekula nebo obě jsou molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu (například sólem zlata nebo sólem stříbra), částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

Výrazem „sekundární vazebná látka se míní vazebná látka, která se specificky váže s vazebnou látkou, která se specificky váže s gramnegativními baktériemi, grampozitivními baktériemi nebo oběma druhy baktérií. Například, když vazebnými látkami, které se specificky vážou s gramnegativními baktériemi a grampozitivními baktériemi, jsou čisté myší monoklonální protilátky, sekundární vazebnou látkou může být antimyší protilátka.

Vzorek se může například testovat analýzou FACScan s vazebnými látkami, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, detektovatelně značený FITC, a vazebnými látkami, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, detektovatelně značený rhodaminem. Vyšetřením pro barvení FITC a/nebo rhodaminem se může stanovit, že vzorek neobsahuje žádnou kontaminaci grampozitivními baktériemi, ale může se zjistit, že obsahuje ' · ·

0000 *

··· *

·

0·» 0 · klinicky závažnou hladinu kontaminace gramnegativními baktériemi. Přednostně, kdyby byl tento vzorek z jednotky darované krve nebo krevního produktu, tato jednotka by se nepoužila pro transfuzi.

Výsledkem kovalentní vazby oznamující molekuly s vazebnou látkou (jako je například protilátka nebo antibiotikum) je to, že vazebná látka je detektovatelně značena. Převážně používanou oznamující molekulou v největším počtu imunoanalýz používaných v současnosti je molekula s enzymatickou aktivitou. Vazebné látky se obvykle chemicky vážou s enzymy. Tak vzniká komplex, který si zachovává imunologickou vazebnou schopnost a ještě současně umožňuje zvýšené meze detekce za použití amplifikační schopnosti páru enzym/substrát. Více než 20 různých značení enzymy se uvádí v literatuře pro produkcí enzymových konjugátů. Nej častěji se používá křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza a β-galaktozidáza. Požadovaná charakteristika pro značení enzymem zahrnuje vysokou specifickou aktivitu, malou velikost, dále aby reakční produkty byly snadno měřitelné a aby komplex byl stabilní. Křenová peroxidáza se použila s hydrogenperoxidovým substrátem a následujícími barvivý: ortho-fenylendiaminem (OPD), tetramethylbenzidinem (TMB) a diaminobenzidinem (DAB). Alkalická fosfatáza se použila s para-nitrofenylfosfátem (PNPP) a methylumbelliferonem. β-Galaktozidáza využívá jako svůj substrát O-nitrofenyl^-D-galaktopyranosid (ONPG).

Když je oznamující molekulou enzym, enzymatická aktivita je závislá na schopnosti enzymaticky aktivní detektovatelně značené vazebné látky specificky se vázat na terčový ligand (například LPA nebo LTA). Vazba enzymu s protilátkou by neměla významně ovlivňovat schopnost vazebné látky specificky se vázat s jejím terčem a neměla by významně ovlivňovat katalytickou aktivitu tohoto enzymu. Typické síťovací reakce využívají některé typy hetero- nebo homobifunkčního činidla •fc * · · • fc • fc* fc • * fcfc • · • * • fcfc fcfc* fcfc * • · * • · · • fc fc··* pro chemické navázání dvou složek dohromady. V současnosti existují komerčně dostupné systémy, které mohou snadno použít osoby, které nejsou specialisty.

Alternativami k enzymovému značení jako oznamující molekuly jsou značení částicemi. Tyto mohou zahrnovat latexové částice, latexové částice impregnované barvivém a kovové částice, jako je například zlato nebo stříbro. Částicové konjugáty jsou vhodné pro analýzy s vizuálním koncovým bodem. Komerčně dostupné částice jsou o velikostech v rozsahu nanometrů až mikrometrů. Velikost částic je důležitá, protože ovlivňuje koncový bod detekce. Latexové částice a částice kovů jsou dostupné s rozličnými chemicky reaktivními složkami na povrchu. Výrobci tyto vyrábějí tak, že se může využívat postup alternativní konjugace.

Tedy vazebná látka podle vynálezu se může delektovatelně značit oznamující molekulou prostřednictvím intermolekulární asociace nebo se může detektovatelně značit prostřednictvím vložených molekul k oznamující molekule prostřednictvím intermolekulární asociace. Takové intermolekulární asociace se mohou uskutečňovat bez omezení prostřednictvím kovalentní vazby (například prostřednictvím disulfidových vazeb) nebo prostřednictvím chelatace, elektrostatických interakcí, hydrofobních interakcí, vodíkových vazeb, interakcí mezi ionty a dipóly, interakcí mezi dipóly a dipóly nebo prostřednictvím jakékoliv kombinace výše uvedených vazeb. Přednostně oznamující molekuly zahrnují bez omezení radioaktivní izotopy, těžké kovy, fluorescenční značení, chromatické značení, chemiluminiscenční značení, enzymy a enzymové substráty. Biologické vzorky přednostně zahrnují krev, sérum, plazmu, červené krvinky, krevní destičky a bílé krvinky. V jistých přednostních provedeních způsob podle tohoto aspektu vynálezu má formu konvenční imunoanalýzy, jako *

v« • · • ·

Μ· * « ·· * » « · • φ ·Φ·

Φ· je například ELISA nebo RIA, V jiném přednostním provedení využívá tento způsob přímou nebo nepřímou imunofluorescenci.

V přednostním provedení prvního aspektu vynálezu je sada vazebných látek imobilizována na pevném nosiči (například na mikrotitrační plotně).

Ve druhém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci. Tento způsob zahrnuje styk vzorku darované krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu. Přednostně je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

Ve třetím aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci.

Způsob podle tohoto aspektu vynálezu zahrnuje styk vzorku krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi «· • « • φ φ • φφφ φ φ · φφφ φφ φ · φφ Φφ φ φ φ · φ φ φφφ φφ φφ ·· φ · · φ » · φφφ φφ φφφφ nebo v krevním produktu. Přednostně je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

Podle druhého a třetího aspektu vynálezu výrazy „navázání, „antigen, „krev nebo krevní produkt, „grampozitivní baktérie, „gramnegativní baktérie, „klinicky závažné množství, „specificky se váže a „vazebná látka jsou definovány výše. Mělo by se poznamenat, že způsoby podle prvního, druhého a třetího aspektu vynálezu se mohou provádět v době testování pro srovnání ABO, srovnání Rh a/nebo srovnání MHC mezi savčím dárcem a savčím příjemcem.

V jistých provedeních druhého a třetího aspektu tohoto vynálezu se vzorek před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenů a gramnegativním bakteriálním antigenů. Způsoby zpracování vzorku pro odhalení vazebného místa pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenů nebo gramnegativním bakteriálním antigenů jsou takové, jak se popisují pro první aspekt předloženého vynálezu.

V jistých provedeních se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství grampozitívních baktérií podle způsobu podle druhého aspektu předává savčímu příjemci. V jistých provedeních se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativních baktérií podle způsobu podle třetího aspektu předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, *

9« *

·«· ··· • · * • 99 99 ·*♦ přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Přednostně vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulusantilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), bakterícidní/permeabílitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vázou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

Ve Čtvrtém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a vazebné látky, které se vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu. V přednostním provedení je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

• 9 ♦··· » ** * ·· * · ·· ·* * · · ··· · * ! ί λ ·»· · · F · ♦ · · • · · · · · ·-, >·· ·« »·Φ ··· ·* ⁹*⁹

Podle čtvrtého aspektu vynálezu výrazy „navázání, „antigen, „krev nebo krevní produkt, „grampozitivní baktérie, „gramnegativní baktérie, „klinicky závažné množství, „specificky se váže a „vazebná látka jsou definovány výše.

Výraz „prostředky pro detekci navázání, jak se používá v tomto textu, znamená jakoukoliv metodu známou v oboru detekce navázání vazebné látky na terčový ligand (tj. na strukturu LPS nebo LTA antigenu). Přednostní prostředky pro detekci navázání zahrnují imunoanalýzy popsané níže. Odborníkům v oboru biologie jsou známy různé „prostředky pro detekci navázání a zahrnují bez omezení analýzu s postranním tokem, ELISA, RIA, analýzu FACScan, imunopijákování (western blotting), ímunoprecipitaci, aglutinační analýzy, analýzy založené na částicích a separační a neseparační analýzy. Separační („heterogenní) analýzy jsou analýzy, při kterých se oddělují navázané a volné značené složky. Neseparační („homogenní) analýzy jsou analýzy, při kterých navázání značených složek na komplementární vazebnou složku moduluje vlastnosti značení, a tím se vázané a volné složky mohou rozlišovat bez použití stupně separace. Separační analýzy se mohou rozdělit na dva základní druhy, a to kompetitivní analýzy, při kterých analyt a značený analyt soutěží o omezený počet vazebných míst, a sendvičové (extrakční) analýzy, při kterých činidlo v nadbytku extrahuje analyt ze vzorku. Činidla a vzorky se mohou smíchat současně nebo postupně v závislosti na vyvinutém protokolu. Pro zlepšení citlivosti analýzy se jedna složka může značit látkou, která může zesilovat signál pro detekci malého počtu uskutečněných navázání, tato může zahrnovat radioaktivní izotopy, fluorescenční barviva, enzymy, chemiluminiscenční sloučeniny, atomy kovů, sóly kovů nebo sloučenin, stabilní volné radikály, viry nebo bakteriofágy, kofaktory, substráty ·· · * • · · s latexovými částicemi, erytrocyty, protilátky, *·· ·4· ·* ···· inhibitory, apoenzymy, elektroaktivní látky, zamlžovací prostředky, spektrální senzibilizátory, barviva, fosforescenční barviva, liposomy a elektrofory.

Je samozřejmé, že jakýkoliv z těchto prostředků pro detekci navázání může využívat automatizaci pro provedení a/nebo analýzu výsledků analýzy.

V jistých provedeních čtvrtého aspektu předloženého vynálezu dále souprava obsahuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu.

Výraz „prostředky pro zpracování označuje jakoukoliv metodu nebo zpracování, které odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebe na grampozitivním bakteriálním antigenu. Takové prostředky zahrnují bez omezení fyzikální manipulaci včetně homogenizace (například pomocí Dounceova homogenizátoru), sonikace a varu. Jiné „prostředky pro zpracování zahrnují zpracování vzorku chemickými roztoky nebo sloučeninami bez omezení včetně detergentů (například SDS nebo triton-X), zásaditých lytických roztoků (například zásaditého roztoku), kyselých lytických roztoků (například kyselého roztoku), EDTA, EGTA, povrchově aktivních látek, kovových iontů, aniontů, kationtů, chelatonů a enzymů.

V jednom provedení Čtvrtého aspektu předloženého vynálezu darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se předává savčímu příjemci, přičemž savčí dárce, od kterého se vzorek krve nebo krevního produktu získal, a savčí příjemce jsou stejného druhu. Přednostně se souprava podle vynálezu umísťuje v místě (jako je například nemocnice), kde bude přijímajícímu pacientovi podávána transfuze darované krve « «* ·· ♦ ·

I · · • « ·* »· *

• * » »·« *» »» • * ♦ t · · * · · ·« ♦ ··♦ nebo krevního produktu. 2a použití soupravy podle vynálezu odborníci pro péči o zdraví mohou rychle stanovit, zda darovaná krev neobsahuje klinicky závažné množství kontaminujících baktérií. Jakmile se takové stanovení provede a zjistí se, že krev nebo krevní produkt neobsahuje klinicky závažné množství kontaminujících baktérií, krev nebo krevní produkt se může transfundovat přijímajícímu pacientovi.

V přednostním provedeních čtvrtého aspektu vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Límulus-antilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Přednostně vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampo2itivních baktérií.

V různých provedeních čtvrtého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na « wv V V* »' • t t · t« té t · · • · · · · · · • ··* · · · « · · • * · * · · · fcfcfc ·· fcfcfc ·«· ·· ··!

gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou. V jednom provedení jsou první oznamující molekula a druhá oznamující molekula stejné. V jiném provedení první oznamující molekula a druhá oznamující molekula nejsou stejné. Přednostně první oznamující molekula nebo druhá oznamující molekula nebo obě jsou molekulou s enzymatickou aktivitou, částicí {například částicí sólu zlata nebo latexovou částicí), molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou. Takové detektovatelně značené vazebné látky soupravy podle vynálezu jsou popsány výše. Je samozřejmé, že když oznamující molekulou detektovatelně označující vazebnou látku je molekula s enzymatickou aktivitou, substrát pro tento enzym je rovněž začleněn do soupravy podle vynálezu.

V přednostním provedení čtvrtého aspektu vynálezu je sada vazebných látek imobilizována na pevném nosiči (například na mikrotitrační plotně).

V pátém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství

444 * *

• 4 grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem je člověk nebo zdomácnělý savec.

V šestém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktů od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázán^. je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem je člověk nebo zdomácnělý savec.

Podle pátého a šestého aspektu vynálezu výrazy „prostředky pro navázání, „navázání, „antigen, „krev nebo krevní produkt, „grampozitivní baktérie, „gramnegativní baktérie, „klinicky závažné množství, „specificky se váže a „vazebná látka jsou definovány výše.

V přednostních provedeních pátého a šestého aspektu předloženého vynálezu dále souprava obsahuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu. „Prostředky pro zpracování jsou definovány ve čtvrtém aspektu vynálezu.

Jakékoliv soupravy podle čtvrtého, pátého a šestého aspektu vynálezu se mohou používat ve stejné době jako srovnání ABO, srovnání Rh a/nebo srovnání MHC darované krve nebo krevního produktu a určeného příjemce. Přednostně se • Φ · · φ φ * · · φ φφφ φφφ φ φ · ♦ • Φ φ φ φφφ φφφ φ · ♦ φ · · φ> φφφφ darovaná krev nebo krevni produkt bez klinicky závažného

I množství baktérií podává ve formě transfuze pacientovi ne později než 42 dnů po začátku testování, více přednostně ne později než 30 dnů po testování, více přednostně ne později než 2 týdny po testování, více přednostně ne později než 7 dní po testování, ještě více přednostně ne později než 3 dny po testování a ještě více přednostně ne později než 2 dny po testování, ještě více přednostně ne později než 24 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 12 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 6 hodin po testování a nejvíce přednostně se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií transfunduje příjemci za 3 hodiny od začátku testování. Nejvíce přednostně je krví nebo krevním produktem plná krev, hematopoietické kmenové buňky, leukocyty, krevní destičky, červené krvinky, plazma nebo sérum.

Vynález poskytuje rovněž způsoby a soupravy pro vyšetření přítomnosti jakýchkoliv kontaminujících baktérií v darované tkáni nebo orgánu před transplantací darované tkáně nebo orgánu savčímu příjemci, který je přednostně stejného druhů jako dárce. Darované tkáně a orgány se rutinně skladují, í když krátce v tekutině, jako je například fyziologický roztok nebo skladovací živný roztok. Přítomnost baktérií ve skladovací tekutině indikuje přítomnost kontaminujících baktérií ve tkáni. Takové kontaminující baktérie mohou urychlovat rejekci transplantované tkáně nebo orgánu savčím příjemcem. Proto v sedmém aspektu vynález poskytuje způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií ve tkáni ze savce, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující styk vzorku tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na ··· φ • Φ gramnegativní bakteriální antigen a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií ve tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií ve tkáni. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem je člověk nebo zdomácnělý savec.

Podle sedmého aspektu vynálezu výrazy „navázání, „antigen, „grampozitivní baktérie, „gramnegativní baktérie, „klinicky závažné množství, „specificky se váže a „vazebná látka jsou definovány výše.

Výraz „tkáň znamená jakoukoliv tkáň nebo orgán těla. Příklady tkání podle vynálezu bez omezení zahrnují ledvinu, játra, kůži, kostní dřeň, slezinu, brzlík, pankreas, tračník a neurologickou tkáň.

V jistých provedeních sedmého aspektu předloženého vynálezu se vzorek zpracovává před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek. V jistých provedeních toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu. Způsoby zpracování·', které odhalují vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu, jsou popsány v prvním aspektu vynálezu. V jistých provedeních sedmého aspektu darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce, od kterého se tkáň získala, a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých ·

► · ··* ··· přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulus-antilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharídy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Přednostně vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakterie nebo na jejich antigen, zahrnují protilátky pebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakterie nebo na jejich antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakterie nebo na jejich antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Přednostně vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních sedmého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou.

V jistých provedeních jsou první oznamující molekula a druhá oznamující molekula stejné. V jiném provedení první oznamující molekula a druhá oznamující molekula nejsou stejné. Přednostně první oznamující molekula nebo druhá oznamující molekula nebo obě jsou molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu, částicí, • « *

chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V jistém přednostním provedení sedmého aspektu vynálezu je sada vazebných látek imobilizována na pevném nosiči (například na mikrotitrační plotně).

V osmém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkání ze savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnující styk vzbrku tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem je člověk nebo zdomácnělý savec.

V devátém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkání od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnující styk vzorku této tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnost klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem je člověk nebo zdomácnělý savec.

• ** • · ·	• ··	··
« · · « ··· · . «	• • •
.M ··	···	··

Podle osmého a devátého aspektu vynálezu výrazy „navázání, „antigen, „tkáň, „grampozitivni baktérie, „gramnegativní baktérie, „klinicky závažné množství, „specificky se váže a „vazebná látka jsou definovány výše. Přednostně jakýkoliv ze způsobu podle sedmého, osmého a devátého aspektu vynálezu se provádí, když se tkáň testuje pro srovnání ABO, srovnání Rh a/nebo srovnání MHC s určeným příjemcem.

V jistých provedeních osmého a devátého aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Způsoby zpracování vzorku pro odhalování vazebného místa pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenu nebo gramnegativním bakteriálním antigenu jsou stejné, jako jsou popsány pro první aspekt vynálezu.

V jistých provedeních osmého a devátého aspektu vynálezu se darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství grampozitivních baktérií nebo se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativních baktérií předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce, od kterého se tkáň získala, a savčí příjemce jsou stejného druhu.

V desátém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivni bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií

• « ·

00··

0·· ·· • * · 0 · ·

000 ··· v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem je člověk nebo zdomácnělý savec.

V jedenáctém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni a žádné navázáni je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni. Přednostně je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

Ve dvanáctém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni ze savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni. Přednostně je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

• 9 *«* «:· ··· ·'

Podle desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu vynálezu výrazy „prostředky pro navázání, „navázání, „antigen, „tkáň, „grampozitivní baktérie, „gramnegativní baktérie, „klinicky závažné množství, „specificky se váže a „vazebná látka jsou definovány výše. V přednostních provedeních jedenáctého a dvanáctého aspektu vynálezu souprava dále zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu.

V jistých provedeních desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu vynálezu souprava dále zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu. Prostředky pro zpracování jsou popsány pro čtvrtý aspekt vynálezu. V různých provedeních darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce, od kterého se tkáň získala, a savčí příjemce jsou stejného druhu.

Přednostně se souprava podle vynálezu umísťuje na místě (jako je například nemocnice), kde bude přijímajícímu pacientovi předávána darovaná tkáň, například transplantací nebo transfuzí. 2a použití soupravy podle vynálezu odborníci pro péči o zdraví mohou rychle stanovit, zda darovaná tkáň neobsahuje klinicky závažné množství kontaminujících baktérií. Jakmile se takové stanovení provede a zjistí se, že darovaná tkáň neobsahuje klinicky závažné množství kontaminujících baktérií, darovaná tkáň se transplantuje přijímajícímu pacientovi.

Jakékoliv soupravy podle desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu vynálezu se mohou používat současně jako srovnání ABO, srovnání Rh a/nebo srovnání MHC darované tkáně •

• fcfc » fc ♦ fc • fc • fcfc fcfc · • · • fcfc fc · fcfcfc a určeného příjemce. Přednostně se darovaná tkáň vyšetřuje za použití způsobů a soupreiv podle sedmého, osmého, devátého, desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu vynálezu relativně krátkou dobu před transplantací tkáně. Přednostně se darovaná tkáň transplantuje pacientovi ne později než 42 dnů po začátku testování, více přednostně ne později než 30 dnů po testování, více přednostně ne později než 2 týdny po testování, více, přednostně ne později než 7 dní po testování, ještě více přednostně ne později než 3 dny po testování a ještě více přednostně ne později než 2 dny po testování, ještě více přednostně ne později než 24 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 12 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 6 hodin po testování a nejvíce přednostně se darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií transplantuje příjemci za 3 hodiny od začátku testování.

V následujících příkladech popisuje nevyčerpávající počet možných imunoanalýz, které při použití v spojitosti s LTA nebo LPS specifickou vázající látkou mohou vytvářet celou všeobecnou analýzu pro skupinovou mikrobiální detekci. Tedy následující příklady jsou určeny pro další ilustraci jistých obzvláště přednostních provedení vynálezu a nejsou určeny pro omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Způsob detekce baktérií podle vynálezu se může provádět pomocí konvenční imunoanalýzy s využitím částic. V tomto smyslu se vazebné látky, které se specificky vážou na antigenní oblast na bakteriální buněčné stěně, mohou použít jako imunologické terče a mohou vytvářet základ pro detekci baktérií v krevních produktech. Schéma zařízení použitého •

·· · • · • * • * ··♦ « • · • tt· ·« ··· * v tomto příkladu je znázorněno na obrázcích 3A až 3D. V jednom provedení se vazebné látky, které se specificky vážou • na grampozitivní baktérie, gramnegativní baktérie nebo na grampozitivní baktérie i na gramnegativní baktérie, se shromáždí navzájem a potom se rozdělí tak, aby každá z těchto dvou populací vazebných látek obsahovala směs vazebných látek. Jedna populace se váže na membránu u základny zařízení znázorněného na obrázcích 3A až 3D. Druhá populace se používá na potažení pestře zbarvených latexových částic (tj. latexové částice potažené vazebnými látkami byly impregnovány barvivém » tak, aby byly intenzivně zbarveny.)

V jiném provedení stejná vazebná látka (tj. všechny molekuly vazebné látky specificky rozeznávají stejný antigenní epitop) jsou rozděleny do dvou populací. Jedna populace se zase váže na membránu u základny zařízení znázorněného na obrázcích 3A až 3D a druhá populace se využívá na potaženi pestře zbarvených latexových částic.

Mohla by se využít stejná vazebná látka (tj. molekuly, které se specificky vážou na stejný epitop), protože na bakteriálním povrchu jsou přítomna vícenásobná rozpoznávací místa.

Perličky potažené vazebnou látkou se umístí do zařízení tak, aby se nevázaly na membránu.

Při použití zařízení znázorněného na obrázcích 3A až 3D pro detekci přítomnosti klinicky závažného množství baktérií • v krvi nebo v krevním produktu se provádějí následující stupně. Nejdříve se za sterilních podmínek extrahuje z darované krve nebo z darovaného krevního produktu vzorek. Alternativně se vzorek může extrahovat z tekutiny, ve které se skladuje darovaný orgán nebo tkáň (například ze živné skladovací tekutiny, ve které se skladuje darovaná ledvina).

Dále se vhodný objem vzorku aplikuje na testovací zařízení, jak je znázorněno na obrázcích 3A až 3D. Vzorek se φ

• φ φ ♦ · ♦ * » ♦

Φ • Φ* ·· · φ.

může testovat přímo (tj. nezředěný nebo nezpracovaný) nebo se může zředit pufrovacím/extrakčním činidlem nebo se může zpracovat fyzikálními nebo chemickými prostředky, čímž se vystavuje pro zpracování vazebné místo pro vazebnou látku na baktériích (nebo jejich antigenu) přítomných ve vzorku. Například výsledkem zpracování může být protržení bakteriální buněčné stěny. V jiném příkladu může být výsledkem zpracování antigen odštěpený z buněčné stěny, a tím odhalení vazebného místa na antigenu.

Vzorek prochází předem určenou dráhou v zařízení způsobenou tamponováním absorpční membrány. Baktérie přítomné ve vzorku se vážou na latexové částice značené vazebnou látkou.

Vzorek se smíchá s latexovými Částicemi značenými vazebnou látkou a migruje podél absorpčního tampónu k předem definované oblasti, kde byly imobilizovány antibakteriální protilátky. Imobilizované vazebné látky zachytí komplexy zbarvených latexových perliček potažených baktériemiantibaktériemi a barevná skvrna indikuje pozitivní výsledek.

Příklad II

V jiném provedení způsobu popsaného v příkladu I jsou vazebnými látkami navázanými na latexu vazebné látky, které specificky rozpoznávají gramnegativní baktérie nebo grampozitivní baktérie nebo oba druhy baktérií. Avšak každá z těchto antibakteriálních vazebných látek má epitop, který je společný pro všechny vazebné látky. V tomto příkladu jsou všechny antibakteriální vazebné látky myšími protilátkami. Vazebné látky navázané na membráně se nevážou specificky na baktérie, spíše specificky vážou na myší determinanty na konstantních oblastech myších antibakteriálních protilátek. Tyto antimyší vazebné látky se nazývají sekundární vazebné látky, protože se nevážou specificky na baktérie, ale spíše ·· · · se specificky vážou na vazebnou látku, která je specificky navázána na baktériích.

Příklad III

Dalším způsobem detekce klinicky závažného množství baktérií v krvi, krevním produktu nebo v tekutině z darované tkáně je aglutinační zkouška. V tomto příkladu aglutínační zkoušky se využívají latexové částice potažené vazebnými látkami, které se specificky vážou na bakteriální druhy. Tyto latexové částice aglutínují v přítomnosti klinicky závažného množství bakteriálních druhů-. Pozitivní reakce se ukazuje vývojem aglutinovaného obrazce. Při negativní reakci se latex neaglutinuje a mléčný vzhled zůstává v podstatě nezměněn.

V tomto způsobu se využívá zařízení, které je znázorněno na obrázcích 4A až 4D. Vzorek extrahovaný za sterilních podmínek z darované krve nebo krevního produktu se aplikuje na testovací zařízení. Alternativně se vzorek může extrahovat z tekutiny, ve které se skladuje darovaný orgán nebo tkáň. Vzorek se může testovat přímo (tj. nezředěný nebo nezpracovaný), zředěný pufrovacím/extrakčním činidlem nebo zpracovaný tak, aby se tímto-zpracováním odhalilo vazebné místo pro vazebnou látkou na kterýchkoliv baktériích (nebo jejich antigenů) přítomných ve vzorku. Dále se k biologickému vzorku v testovacím zařízení přidají latexové perličky potažené vazebnými látkami, které se specificky vážou na baktérie. Obsah se míchá kvůli dosažení homogenity složek.

Baktérie v biologickém vzorku se budou specificky vázat na antibakteriální protilátky na latexových perličkách. Následkem vícenásobných antigenních míst na bakteriálním povrchu vytvářejí latexové částice potažené protilátkami můstek mezi sousedními bakteriálními buňkami. V přítomnosti klinicky závažného množství bakteriálních buněk v biologickém vzorku se vytváří zesítěná matrice. Vedle předem definovaného ·

• 4« · 4 · 44 • * * 4 · *44 4> · ·

4 4 * •44 44 444 ··· klinicky závažného množství baktérií ve vzorku (který je definován výše) roste matrice až do zviditelnění jako „aglutinační obrazec ve zkušební jamce. Po předem určené době pro umožnění růstu takové matrice se výsledky vizuálně odčítají, přítomnost bakteriálního antigenu ukazuje vytvoření charakteristického obrazce znázorněného na obrázku 4D.

Příklad IV

Ještě dalším způsobem detekce přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v krvi nebo v krevním produktu využívá standardní formu enzymových imunoadsorbentových analýz (ELISA) (enzyme linked immunosorbant assays). Mikrotitrační (tj. 96-jamková) plotna pro ELISA využívá četné oddělené reakční jamky, přičemž každá představuje j_edinečné testovací prostředí. Mikrotitrační plotny poskytují vyšší přechodnou testovací kapacitu, aplikaci automatického ovládání vzorku, přidávání činidla, detekce reakce a kvantitativní vyhodnocení výsledků. Vývoj ELISA s mikrotitračními plotnami je dobře znám a využíván. Pro detekci rozsáhlých druhů s velkou molekulovou hmotností a s vícenásobnými vazebnými místy jako bakteriálními povrchovými antigeny je přednostní sendvičová imunoanalýza. Sendvičové imunoanalýzy spočívají na pasivním nebo kovalentním umístění vazebné látky, která se specificky váže na gramnegativní nebo grampozitivní baktérie (nebo na oba druhy baktérií) na polystyrénovém povrchu (nebo na jiném materiálu) jamky mikrotitrační plotny tak, že se vazebná látka zachytí na povrchu jamky mikrotitrační plotny. Imunologická detekce se provádí následujícím způsobem.

Nejdříve se vzorek extrahuje za sterilních podmínek z darované krve nebo darovaného krevního produktu nebo z tekutiny, ve které je skladován darovaný orgán nebo tkáň.

Vzorek se může zředit nebo se nemusí zředit nebo se může ·· • · · · • · · ·· ··♦♦ zpracovat tak, aby toto zpracování odhalilo^vazebné místo pro vazebnou látku na jakýchkoliv baktériích (nebo jejich antigenu) nacházejících se ve vzorku, Do testovací jamky se aplikuje vhodný objem vzorku. Baktérie přítomné v biologickém vzorku budou vytvářet specifický komplex s povrchově vázanými antibakteriálními vazebnými látkami na povrchu jamky mikrotitrační plotny. Dále se z jamky odstraňuje (nebo vysypává) nevázaný vzorek v jamce. Do jamky se přidá specificky připravený promývací roztok pro vymytí nespecificky vázaných baktérií (a jiných složek vzorku) z povrchu jamky mikrotitrační ploty.

Dále se do reakční jamky přidá roztok obsahující vazebnou látku detektovatelně značenou oznamující molekulou, Detektovatelně značená vazebná látka v tomto roztoku se specificky váže na antigen, který definuje typ baktérii přítomných v biologickém vzorku, a může být .odlišná nebo stejná jako povrchově vázaná vazebná látka. Detektovatelně značená vazebná látka se chemicky váže s oznamující molekulou (s oznamující molekulou s enzymatickou aktivitou, v specifickém případě z ELISA), která se používá pro důkaz nepřítomnosti nebo přítomnosti baktérií ve vzorku. Je potřebné poznamenat, že oznamující molekula může být tvořena rozličnými typy a je zvolena pro minimalizací interference s reakcí navázání protilátky. Enzymy se využívají především v enzymových imunoadsorbentových analýzách (ELISA), ale mohou se použít rovněž jiné oznamující molekuly, bez omezeni například chromofory, fluorofory, radioizotopy, chemiluminiscenční sloučeniny, elektrochemicky aktivní sloučeniny, kovy, částice, magnetické systémy a sekundární značení, jako je například biotin/avidin nebo jiné podobné typy. Detektovatelně značená vazebná látka, která je výsledkem chemické vazby specifické vazebné látky s oznamující molekulou, se nechá vytvořit komplex s komplexem * 0 «00 0 000· 0 0

00« 0« «V «*«« antibakteriální vazebná látka/baktérie za vytvoření „sendviče” antibakteriální vazebná látka/baktéríe/antibakteriální detektovatelně značená vazebná látka.

Po vhodné době se roztok detektovatelně značené vazebné látky odstraní z jamky. Jamka se potom může vymýt specificky připraveným promývacím roztokem pro oddělení navázaného konjugátu od nenavázaného konjugátu v jamce mikrotitrační plotny.

Specificky vázaná detektovatelně značená vazebná látka v jamce mikrotitrační ploty se může detektovat vhodnými prostředky. Tyto zahrnují přímé měřeni v případě fluoroforů, chromoforů, chemiluminiscenčních sloučenin, elektroaktivních látek a nepřímé měření v případě značení, jako jsou například enzymy. Počet specificky vá-zaných detektovatelně značených vazebných látek je přímo úměrný množství baktérií přítomných v biologickém vzorku. Tato přímá úměrnost je základem metodologie pro stanovení množství, která se může použít pro specifické stanovení množství baktérií přítomných ve vzorku. Standardní reakční křivka se může stanovit měřením reakce specificky navázané detektovatelně značené vazebné látky jako funkce známého množství baktérií přítomných v kalibrovaných vzorcích. Interpolace výsledků ze standardní reakční křivky popisuje koncentraci baktérií v neznámém biologickém vzorku.

Příklad V

Přídavným způsobem vyšetření přítomností klinicky závažného množství baktérií v krvi, krevním produktu nebo v tekutině, ve které se darovaná tkáň skladuje, využívá kompetitivní imunoanalýzu. Pro detekci druhů s malou molekulovou hmotností s jednoduchými vazebnými místy, jako jsou například sekretované lipopolysacharidové struktury z gramnegativních baktérií je samozřejmě přednostní kompetitivní imunoanalýza. Kompetitivní imunoanalýzy jsou * * založeny na pasivním nebo kovalentním umístění vazebné látky, která se specificky váže na sekretovanou LPS strukturu (jako je například navázání na část lipidu A LPS struktury) na polystyrénovém povrchu {nebo na jiném materiálu) jamky míkrotitrační plotny tak, že se vazebná látka zachytí na povrchu jamky míkrotitrační plotny.

V jednom příkladu kompetitivní imunoanalýzy pro detekci přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií se imunologická detekce se provádí následujícím způsobem. Nejdříve se vzorek extrahuje za sterilních podmínek z darované krve nebo darovaného krevního produktu nebo z tekutiny, ve které je skladován darovaný orgán nebo tkáň. Vzorek se může zředit nebo se nemusí zředit nebo se může zpracovat tak, aby toto zpracování odhalilo vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativních baktériích, (nebo jejich antigenu), jako je například vazebné místo na složce lipidu A struktury LPS. Do testovací jamky, která obsahuje vazebnou látku, která se specificky váže na LPS, se aplikuje vhodný objem vzorku. Do testovací jamky se současně nebo postupně přidá vhodný objem roztoku obsahujícího detektovatelně značenou molekulu LPS. Detektovatelně značená molekula LPS v tomto roztoku se specificky váže na vazebnou látku v testovací jamce. Detektovatelně značená molekula LPS se chemicky váže s oznamující molekulou (jako je například oznamující molekula s enzymatickou aktivitou, v specifickém případě z ELISA), která se používá pro důkaz nepřítomnosti nebo přítomnosti baktérií ve vzorku. Je potřebné poznamenat, že oznamující molekula může být tvořena rozličnými typy a je zvolena pro minimalizaci interference s reakcí navázání protilátky. Enzymy se využívají především v enzymových imunoadsorbentových analýzách (ELISA), ale mohou se použít rovněž jiné oznamující molekuly, bez omezení například chromofory, fluorofory, radioizotopy, chemiluminiscenční • * • · 0 · , 0 · · ··· 0 0 0000 0

0 0 0 0 •· 000 000 0· 0000 sloučeniny, elektrochemicky aktivní sloučeniny, kovy, částice, magnetické složky a sekundární značení, jako je například biotin/avidin nebo jiné podobné typy. Detektovatelně značená molekula LPS se nechá vytvořit komplex s imobilizovanou vazebnou látkou v přítomnosti LPS pocházejícího z buněčné stěny za ustálení vazebné rovnováhy. Přednostně je testovací jamkou jamka mikrotitrační plotny.

Po vhodné době se roztok detektovatelně značené molekuly LPS/LPS pocházejícího z kontaminující bakteriální buňky odstraní z testovací jamky. Jamka se potom může vymýt specificky připraveným promývacím roztokem pro oddělení navázaného konjugátu od nenavázaného konjugátu v jamce mikrotitrační plotny. Vazebná rovnováha ustálená v testovací jamce je funkcí koncentrace LPS pocházejícího z buňky. V nepřítomnosti jakéhokoliv kontaminujícího klinicky závažného množství gramnegativních baktérií ve vzorku, a tedy žádného LPS pocházejícího z bakteriální buňky se detektovatelně značená molekula LPS komplexně váže na povrchově vázanou vazebnou látku. Při zvýšených hladinách baktérií, a tedy při zvýšených hladinách LPS pocházejícího z kontaminujících bakteriálních buněk se vazba s povrchově vázanou vazebnou látkou rozdělí mezí tyto dva druhy LPS podle koncentrace. Při nízkých hladinách LPS pocházejícího z kontaminujících bakteriálních buněk se větší část vazebných míst vazebné látky komplexně váže s detektovatelně značenou molekulou LPS a pozoruje se zvýšená hladina oznamujícího signálu. Při vysokých hladinách LPS pocházejícího z bakteriálních buněk se větší část vazebných míst vazebné látky komplexně váže s LPS pocházejícím z bakteriálních buněk a pozoruje se snížená hladina oznamujícího signálu. Tedy počet specificky vázaných detektovatelně značených molekul LPS je nepřímo úměrný k množství kontaminujících gramnegativních baktérií přítomných v biologickém vzorku. Standardní reakční křivka se • * ·

·« · * ·

4 4

444 4

4 *4 4 44 4 může stanovit měřením reakce detektovatelně značené molekuly LPS jako funkce známého množství baktérií přítomných v kalibrovaných vzorcích. Interpolace výsledků ze standardní reakční křivky popisuje koncentraci gramnegativních baktérií v neznámém biologickém vzorku.

Příklad VI

Ještě další způsob detekce přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v krvi nebo v krevním produktu využívá homogenní imunoanalýzu. Homogenní imunoanalýzy jsou charakterizovány schopností současného měření vázaných a volných složek komplexotvorné reakce vazebné složky s ligandem. Vlastnosti značení se modifikují na základě vázání komplementárního reaktantu, takže separace vázaných složek od nevázaných není potřebná.

Nejdříve se extrahuje vzorek za sterilních podmínek z darované krve nebo darovaného krevního produktu nebo z tekutiny, ve které je skladován darovaný orgán nebo tkáň. Vhodný objem testovacího vzorku se smíchá s předběžně zpracovaným činidlem tak, aby se vytvořily malé fragmenty struktury buněčné stěny. Takové činidlo může zahrnovat (ale bez omezení) povrchově aktivní látky, chelatony a enzymy pro degradaci přirozené antigenní struktury na složky s nižší molekulovou hmotností. Přídavně se může využít mechanická fragmentace (jako je například sonikace) nebo kinetická energie (jako je například var) pro rozbití buněčné stěny na její nižší složky. V tomto případě zpracování odhalí vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativních baktériích nebo jejich antigenu za odstranění a degradace lipopolysacharidové struktury v gramnegativních baktériích na jejich lipidové A jednotky nebo jádrové jednotky.

Vzorek fragmentů degradovaných buněčných stěn se smíchá s činidlem obsahujícím lipidový A (nebo jádrový) antigen, « · ··· * 0 ·· který se chemicky vázal s fluorescenční značkou. K reakční směsi se přidá známé množství anti-lipidové A (nebo antijádrové) vazebné látky. Antigeny, které se vážou s vazebnou látkou, budou ukazovat sníženou hladinu molekulární rotace, zatímco nevázané budou ukazovat poměrně zvýšenou hladinu rotace. V poli polarizovaného světla bude polarizované světlo přednostně excitovat ty molekuly, které jsou paralelní s rovinou dopadajícího světla. Orientace emisních druhů bude determinovat stupeň polarizace emitovaného světla. Jestliže molekulární pozice emisních druhů je poměrně stabilní, fluorescence bude částečně polarizována. Jestliže molekuly jsou ve stavu rychlé oscilace místo toho, aby byly fixovány, molekulární pohyb bude snižovat stupeň polarizace. Fluorescenční světlo emitované z reaktantové směsi lipídového A (nebo jádrového) antigenu z fragmentů buněčné stěny z jakýchkoliv kontaminujících gramnegativních baktérií přítomných ve vzorku, fluorescenčně značeného lipidu A (nebo jádra) a vazebné látky bude projevovat vysoký stupeň polarizace světla při nízkých hladinách lipidu A (nebo jádra) z fragmentů buněčné stěny (tj. při nízkých hladinách kontaminace baktériemi ve vzorku) a nízký stupeň polarizace světla při vysokých hladinách lipidu A (nebo jádra) z fragmentů buněčné stěny (tj. při vysokých hladinách kontaminace gramnegativními baktériemi ve vzorku) ve srovnání s vazebnou látkou plus fluorescenčně značeným lipidem A (nebo jádrem) bez jakéhokoliv vzorku. Reakce odlišných hladin polarizace světla jako funkce lipidu A (nebo jádra) z fragmentů buněčné stěny se může využít jako základ vazebné zkoušky pro stanovení neznámých koncentrací lipidu A (nebo jádra) a konečně pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti gramnegativních baktérií ve vzorku.

Výše uvedená detekční technika s využitím protilátky jako vazebné látky, je v oboru známa jako fluorescenční • fc ·”· fcfcfc fc fcfcfc fc fc fc fc·· fcfc • fc ·· · · · fc fc fcfcfc • fcfcfc* · • · · · · • fc* ·· · ·« fcfcfc* polarizační imunoanalýza, příbuzné techniky zahrnují fluorescenční zhášecí imunoanalýzu, fluoroimunoanalýzu s časovým rozlišením, imurtoanalýzu s potencovanou fluorescencí, fluorescenční imunoanalýzu s excitačním přenosem a imunoanalýzu s uvolněním fluoroforu. Pro detekci menších fragmentů složek bakteriální buněčné stěny (a tedy pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti bakteriální kontaminace) se může jako alternativní homogenní imunoanalýza alternativně použít modulace enzymatické aktivity jako funkce komplexotvorné reakce vazebné látky. Každá z těchto metod je dobře dokumentována a dobře známa u odborníků v tomto oboru.

Příklad VII

Modifikace způsobu popsaného v příkladu VI bude sloužit k vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií ve vzorku z darované krve, darovaného krevního produktu a/nebo tekutiny, ve které se darovaná tkáň skladuje. V tomto příkladu se vzorek extrahuje za sterilních podmínek z darované krve, darovaného krevního produktu a/nebo tekutiny, ve které se darovaná tkáň skladuje. Vhodný objem testovaného vzorku se smíchá s předem zpracovaným činidlem tak, aby se vytvořily malé fragmenty struktury buněčné stěny.

Tímto zpracováním, jehož výsledkem je odhalení vazebného místa pro vazebnou látku na grampozitivních baktériích (nebo na jejich antigenu), může být zpracování chemikálií, jako je například povrchově aktivní látka, chelaton a/nebo enzym pro degradaci přirozené antigenní struktury na složky s nižší molekulovou hmotností. Zpracováni se může provést rovněž mechanickými prostředky za použití mechanické fragmentace (jako je například sonikace) nebo kinetické energie (jako je například var) pro rozbití buněčné stěny na její nižší složky, a tím pro odhalení vazebného místa pro vazebnou látku na antigenní složce struktury LTA. Specifickým příkladem může • 0 • 0 · 0 • 0 ·00 • 0

0

0·0 0 být izolace póly(glycerofosforečnanového) řetězce ze struktur lípotechoové kyseliny. Odbornici v tomto oboru mohou snadno předpokládat jiné struktury stěny grampozítivní buňky.

Dále se vzorek fragmentů degradovaných buněčných stěn smíchá s činidlem obsahujícím póly(glycerofosforečnanový) antigen, který se chemicky vázal s enzymovým značením za účelem vytvoření enzymového konjugátu. Konjugace s enzymem se provede tak, aby se při vytváření komplexů s vazebnou látkou modulovala enzymatická aktivita konjugátu. Prostřednictvím maskování aktivního místa nebo modifikacemi konformace na enzymu se snižuje enzymatická aktivita, když vazebná látka vytváří komplex s enzymovým konjugátem, a enzymatická aktivita se obnovuje, když vazebná látka nevytváří komplex s enzymovým konjugátem. Tato modulace enzymatické aktivity je základem běžně používané homogenní analýzy.

Dále se přidá známé množství anti-poly(glycerofosforečnanové) vazebné látky k reakční směsi, která obsahuje stálé množství vazebné látky a enzymového konjugátu. Potom se přidá známý objem krve (nebo krevního produktu nebo tekutiny z tkáně) zpracované za účelem degradace složek bakteriální buněčné stěny. Pokud nejsou v krvi, krevním produktu nebo v tekutině ze vzorku darované tkáně přítomné žádné baktérie, potom dostupná vazebná místa na vazebné látce mohou vytvářet komplexy s enzymovým konjugátem. Enzymový konjugát bude ukazovat sníženou úroveň enzymatické aktivity ve vázaném stavu a konverze substrátu bude minimální. Při vysokých hladinách antigenů pocházejícího z buněčné stěny z vysoké hladiny kontaminujících grampozitivních baktérií přítomných ve vzorku bude většina vazebných míst na vazebné látce obsazena přirozeným antigenem buněčné stěny (jako je například póly(glycerofosforečnan)), a tím se umožní, aby enzymový konjugát existoval ve stavu bez vytvoření komplexu.

» φφ ·· ♦ · · • φ φ • φφφ * • · φφφ φφ · • · Β φ φ φ ♦ · · • φ φ φφ φφφφ

V tomto stavu bez vytvoření komplexu se enzymatická aktivita obnovuje a pozorují se zvýšené hladiny konverze substrátu.

Mírná modifikace postupu zahrnuje použití enzymových fragmentů, přičemž jeden z nich je značen antigenním fragmentem. V přítomnosti vazebné látky je enzymový fragment nedostupný pro vytváření komplexu s potřebným přídavným fragmentem pro vytvoření úplného funkčního enzymu. Když vazebná látka vytváří komplex s antigenem pocházejícím z buněčné stěny kontaminujících grampozitivních baktérií přítomných ve vzorku, je nedosažitelné vytváření komplexu s enzymovými fragmenty, a tím umožnění, aby se slučovaly a vytvářely aktivní enzym. Modifikace těchto postupů jsou dobře známy pro odborníky v tomto oboru jako vazebné analýzy s enzymovou modulací.

Příklad VIII

Modifikace analýz popsaných v příkladech IV, V, VI a VII zhrnují využití automatického analytického zařízení pro provádění analýz a výpočet výsledků. Automatizace umožňuje aplikaci technologie více reprodukovatelným způsobem, a tím umožnění zlepšené provádění analýz a detekci snížené úrovně bakteriální kontaminace. Komerčně dostupných je mnoho komplexních systémů pro imunoanalýzu a používají se pro rutinní imunodiagnostické testování v nemocničních ústředních laboratořích. Může se snadno předpokládat, že aplikace výše uvedené technologie se může začlenit do kteréhokoliv z těchto automatických systémů. V rámci tohoto vynálezu se může rovněž předpokládat použití alternativních separačních technologií (tuhá fáze, kapalná fáze, magnetické částice, rozdělení na základě elektrického náboje atd.). Podobně se mohou předpokládat alternativní detekční metodologie (například chromogenní, fluorogenní, elektrochemické, chemiluminiscenční nebo radiometrické) předpokládanými modifikacemi

9

9 ··· ·

444 94 • 0 detekční metody na bázi systémů s detektovatelně značenými vazebnými látkami a rovněž odpovídající změny detekčního systému automatického zařízení pro imunoanalýzu.

Příklad IX

Obecná druhová specifita dvou reprezentativních, neomezujících vazebných látek podle vynálezu byla vyhodnocena sondováním povrchové antigenní struktury grampozitivních a gramnegativních baktérií. Vazebnou látkou, která se specificky váže na grampozitivní bakteriální antigen, a to na lipotechoovou kyselinu, byl klon monoklonální protilátky 96-110 ((IgGl) popsaný v Fisher et al., PCT publikace č. WO 98/57994). Vazebnou látkou, která se specificky váže na gramnegativní bakteriální antigen, a to na lipid A, byl klon monoklonální protilátky 26-5 (IgG2b) (komerčně dostupný od firmy Biodesign International, Saco, Maine, katalogové číslo C61212M).

Pro vazebnou charakterizaci bylo vybráno čtrnáct baktérií: sedm grampozitivních baktérií a sedm gramnegativních baktérií (viz obrázky 5 a 6). Tyto baktérie byly vybrány, protože repřezentují bakteriální druhy, které byly identifikovány během tří velkých národních studií transfúzních reakci (včetně studie BaCon ve Spojených státech, Hemovigílaňce study ve Francii a SHOT ve Velké Britanii).

Pro charakterizování vazby grampozitivních a grampozitivních baktérií s anti-lipotechoová kyselinamonoklonální protilátkou a anti-lipid A-monoklonální protilátkou se bakteriální druhy z klinických izolátů naočkovaly na plotny s agarem obsahujícím 5 % ovčí krve (BBL) a kultivovaly se přes noc při 37 °C. Výsledné kolonie se naočkovaly do tryptózového sójového bujónu (30 mg/ml, Sigma) v PBS a třepaly se přes noc při 37 °C. Počet baktérií se r <

kvantifikoval turbidimetrickým měřením při 620 nm. Celé buňky baktérií se peletizovaly 15 minut při 5000 ot./min. Peletizované baktérie se resuspendovaly v PBS na jednotky. (CPU)/ml tvořící přibližně 10⁸ kolonií ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). 100 μΐ suspenze baktérii se přidalo do každé jamky jednoho řádku 96-jamkových mikrotitračních ploten. Postup se opakoval pro každou ze sedmi grampozítivnich baktérií a každou ze sedmi gramnegativních baktérií. Plotny se inkubovaly jednu hodinu při 37 °C a potom skladovaly přes noc při 4 °C. Plotny se potom promyly pětkrát'pomocí 200 μΙ/jamku 0,05% Tween-20 a skladovaly za sucha při -20 °C do dalšího použití.

Pro minimalizaci nespecifické vazby se plotny pokryté baktériemi blokovaly 300 μΙ/jamku 5% sušeného mléka/0,05% Tween-20 v PBS. Plotny se blokovaly přes noc při teplotě místnosti a potom se třikrát promyly PBS/Tween. Vazebné látky (tj. anti-lípotechoová kyselína-monoklonální protilátka a anti-lipid A-monoklonální protilátka) se zředily na 5 gg/ml v PBS obsahujícím 4 % BSA a 0,05 % Tween-20. Roztoky se smíchaly a filtrovaly přes 0,22 μπι filtry. 100 μΐ roztoku se přidalo do každé jamky a vazebné látky se nechaly reagovat jednu hodinu při 37 °C. Plotny se potom promyly pětkrát 0,05% Tween-20. Komerčně dostupná sekundární protilátka, konjugát kozího antimyšího IgG (těžké a lehké řetězce) a HRP se zředil 1:5000 v PBS/1,5% BSA a 0,005 Tween-20. 200 μΐ roztoku sekundární protilátky se přidal do každé jamky a sekundární protilátka se nechala vázat jednu hodinu při 37 °C. Plotny se potom jednou promyly PBS/0,05% Tween-20 a ještě třikrát PBS samotným. Pro kvantifikaci vazeb baktérií se do každé jamky přidalo 200 μΐ substrátu peroxidázy TMB (Sigma). V kinetické úpravě ve čtecím zařízení mikrotitrační plotny Dynax se odečetla absorbance (OD 370 nm).

·· 4 4 • · ♦ * 4·4 · • 4 • W · ·· «4 <

• 4 *·· • »9 • · 4 • * 4

4 4 ···«

Jak znázorňuje obrázek 5 a 6 každá ze sedmi grampozitivních a sedmi gramnegativních baktérií byla specificky rozpoznána anti-lipotechoová kyselina-monoklonální protilátkou (grampozitivní; obrázek 5) a antí-lipid Amonoklonální protilátkou (gramnegativní; obrázek 6).

(Průměrné výsledky z trojnásobného měření se znázornily jako funkce každé z rozpoznávaných baktérií). Jak znázorňují obrázky 5 a 6, rozsah rozpoznávání se mění mezí bakteriálními druhy, ale ve všech případech baktérií je alespoň dvojnásobné než pozadí. Tyto údaje jasně ukazují možnost použití běžné vazebné látky pro rozpoznávání všech druhů gramnegativních i grampozitivních baktérií. Tyto baktérie jsou specificky důležité, protože představují exaktní druhy baktérií identifikovaných jako příčinné látky při transfúzních reakcích • ·

Claims (66)

1. Způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující styk vzorku darované krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivni bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

2. Způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující styk vzorku darované krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivni bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

3. Způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krví nebo v krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu • · * ft « • · ftftftft • ftft ftft příjemci, zahrnující styk vzorku darované krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

4. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačuj í cí se tím, že vzorek se před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává.

5. Způsob podle nároku 4,vyznačující se tím, že zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo grampozitivním bakteriálním antigenu.

6. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačuj í cí se tím, že darovaná krev nebo krevní produkt od savčího dárce se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se předává savčímu příjemci.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.

8. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačuj í cí se tím, že darovaná krev nebo krevní produkt je zvolen ze souboru zahrnujícího plnou krev, leukocyty, hematopoietické kmenové buňky, krevní destičky, červené .,· krvinky, plazmu a sérum.

9. Způsob podle nároku 1 nebo 3, vyznačuj ící se t i m , že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se specificky vážou na lípopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, nebo že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulusantilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že antibiotikem je polymixin nebo bacitracin.

11. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ící se t í m , že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií; že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, nebo že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnuji antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin a přičemž tímto antibiotikem není gentamycin.

12. Způsob podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačuj Ιοί se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou, a vazebné »

··· ·· ···· látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že první oznamující molekula a druhá oznamující molekula jsou stejné nebo nejsou stejné.

14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že alespoň první oznamující molekula nebo alespoň druhá oznamující molekula je zvolena ze souboru zahrnujícího molekulu s enzymatickou aktivitou, molekulu značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulu, fluorogenní molekulu, sol kovu, částici, chromatickou molekulu a molekulu, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

15. Způsob podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačuj i cí se tím, že sada vazebných látek je imobilizována na pevném nosiči.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že pevným nosičem je mikrotitrační plotna.

17. Způsob podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačuj í cí se tím, že alespoň savčí dárce nebo alespoň savčí příjemce je člověk nebo zdomácnělý savec.

18. Souprava pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a vazebné látky, které se • φ specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomností klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

19. Souprava pro vyšetření přítomností klinicky závažného množství grampozitívních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo darovaného krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitívních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitívních baktérií v darované krví nebo v krevním produktu.

20. Souprava pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství • * gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

21. Souprava podle nároků 18, 19 nebo 20, vyznačující se tím, že dále zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu.

22. Souprava podle nároků 18, 19 nebo 20, vyznačující se t í m , že se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií od savčího dárce předává savčímu příjemci.

23. Souprava podle nároků 18, 19 nebo 20, vyznačující se tím, že savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.

24. Souprava podle nároků 18, 19 nebo 20, vyznačující se tím, že darovaná krev nebo krevní produkt je zvolen ze souboru zahrnujícího plnou krev, leukocyty, hematopoietické kmenové buňky, krevní destičky, Červené krvinky, plazmu a sérum.

25. Souprava podle nároků 18 nebo 20, vyznačující se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen nebo že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní • * · ► . ··· I · «φφ Φ· bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulus-antílipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum.

26. Souprava podle nároků 25, vyznačuj ící se t i m , že antibiotíkem je polymixin nebo bacitracin.

27. Souprava podle nároků 18 nebo 19, vyznačující se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií, že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen,nebo že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotíkem není vankomycin a tímto antibiotíkem není ani gentamycin.

28. Souprava podle nároků 18, 19 nebo 20, vyznačující se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou.

29. Souprava podle nároku 28, vyznačuj ící se t i m , že první oznamující molekula a druhá oznamující molekula jsou stejné nebo nejsou stejné.

* * «·«

83 ··· ·· ··· ·*· *’

30. Souprava podle nároku 28, vyznačující se t í m , že alespoň první oznamující molekula nebo alespoň druhá oznamující molekula je zvolena ze souboru zahrnujícího molekulu s enzymatickou aktivitou, molekulu značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulu, fluorogenní molekulu, sol kovu, částici, chromatickou molekulu a molekulu, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

31. Souprava podle nároků 18, 29 nebo 20, vyznačující se tím, že sada vazebných látek je imobilizována na pevném nosiči.

32. Souprava podle nároku 31, vyznačuj ící se t í m , že pevným nosičem je mikrotitrační plotna.

33. Souprava podle nároků 18, 19 nebo 20, vyznačující se tím, že alespoň savčí dárce nebo alespoň savčí příjemce je člověk nebo zdomácnělý savec.

34. Způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnující styk vzorku tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni.

35. Způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkání od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnující styk vzorku tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grarapozitivních baktérií v darované tkáni.

36. Způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkání od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnující styk vzorku této tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni.

37. Způsob podle nároku 34, 35 nebo 36, vyznačující se tím, že vzorek se před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává.

38. Způsob podle nároku 37,vyznačující se tím, že zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo grampozitivním bakteriálním antigenu.

39. Způsob podle nároku 34, 35 nebo 36, vyznačující se tím, že se darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií předává druhému savci.

40. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.

41. Způsob podle nároku 34, 35 nebo 36, vyznačující se tím, že darovaná tkáň je zvolena ze souboru zahrnujícího srdce, plíce, játra, kůži, ledvinu, pankreas, slezinu a kostní dřeň.

42. Způsob podle nároku 34 nebo 36, vyznačuj i cí se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, nebo že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulus-antilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum.

43. Způsob podle nároku 42,vyznačující se tím, že antibiotíkem je polymixin nebo bacitracin.

4 4

44. Způsob podle nároku 34 nebo 35, vyznačuj í cí se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, se specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií; že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, nebo vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin.

45. Způsob podle nároku 34, 35 nebo 36, vyznačující se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozítivní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou.

46. Způsob podle nároku 45,vyznačující se tím, že první oznamující molekula a druhá oznamující molekula jsou stejné nebo nejsou stejné.

47. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že alespoň první oznamující molekula nebo druhá oznamující molekula je zvolena ze souboru zahrnujícího molekulu s enzymatickou aktivitou, molekulu značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulu, fluorogenní molekulu, sol kovu, částici, chromatickou molekulu a molekulu, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

48. Způsob podle nároku 34, 35 nebo 36, vyznaču87 jící setím, že sada vazebných látek je imobilizována na pevném nosiči.

49. Způsob podle nároku 48, vyznačující se tím, že pevným nosičem je mikrotitrační plotna,

50. Způsob podle nároku 34, 35 nebo 36, vyznačující se tím, že alespoň savčí dárce nebo savčí příjemce je člověk nebo zdomácnělý savec.

51. Souprava pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni a žádné navázání je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni.

52. Souprava pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství

0 ·

0 *

0 ·

0 0 * · »·♦ 00 grampozitivních baktérií v darované tkáni a žádné navázání je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni.

53. Souprava pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni.

54. Souprava podle nároku 51, 52 nebo 53, vyznačující se tím, že dále zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigeryu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu.

55. Souprava podle nároku 51, 52 nebo 53, vyznačující se tím, že se darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií předává savčímu příjemci.

56. Souprava podle nároku 55, vyznačuj ící se t í m , že savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.

57. Souprava podle nároku 51, 52 nebo' 53, vyzná89 čující se tím, že darovaná tkáň je zvolena ze souboru zahrnujícího srdce, plíce, játra, kůži, ledvinu, pankreas, slezinu a kostní dřeň.

58. Souprava podle nároku 51 nebo 53, vyznačující se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, nebo že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího limulus-antilipopolysacharidový faktor (LAUF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP) , baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum.

59. Souprava podle nároku 58, vyznačující se t í m , že antibiotikem je polymixin nebo bacitracin.

60. Souprava podle nároku 51 nebo 52, vyznačující se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií, že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, nebo že vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin a tímto antibiotikem není ani gentamycin.

61. Souprava podle nároku 51, 52 nebo 53, vyznačující se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny první oznamující molekulou a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivni bakteriální antigen, jsou detektovatelně značeny druhou oznamující molekulou.

62, Souprava podle nároku 61, vyznačuj ící se t í m , že první oznamující molekula a druhá oznamující molekula jsou stejné nebo nejsou stejné.

63. Souprava podle nároku 61, vyznačující se t í m , že alespoň první oznamující molekula nebo alespoň druhá oznamující molekula je zvolena ze souboru zahrnujícího molekulu s enzymatickou aktivitou, molekulu značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulu, fluorogenní molekulu, sol kovu, Částici, chromatickou molekulu a molekulu, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

64. Souprava podle nároku 51, 52 nebo 53, vyznačující se tím, že sada vazebných látek je imobiíizována na pevném nosiči.

65. Souprava podle nároku 64, vyznačuj ící se t í m , že pevným nosičem je mikrotitrační plotna.

66. Souprava podle nároku 51, 52 nebo 53, vyznačující se tím, že alespoň savčí dárce nebo alespoň savčí příjemce je člověk nebo zdomácnělý savec.