CZ300108B6 - Zpusob vyšetrování prítomnosti klinicky závažnéhomnožství grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkáni a souprava k provádení zpusobu - Google Patents

Abstract

Zpusob vyšetrování prítomnosti klinicky závažnéhomnožství grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi nebo krevním produktu nebov darované tkáni od savcího dárce pro prevod do organismu savcího príjemce, pri kterém je darovaná tkán uchovávána v tekutine, a pri nemž se vzorek darované krve nebo krevního produktu nebo tekutiny uvede do kontaktu se sadou vazebných látek obsahující vazebné látky, které se specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií a/nebo vazebné látky, které se specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií. Stanoví se navázání sady vazebnýchlátek ke vzorku, pricemž navázání ukazuje prítomnost a nenavázání ukazuje neprítomnost klinicky závažného množství grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi, krevním produktu nebo v darované tkáni od savcího dárce. Pro prevod do organismu savcího príjemce se hodí krev nebo krevní produkt nebo darovaná tkán, v nichž bylo zjišteno méne než 1 x 10.sup.6.n. CFU grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v 1 ml. Souprava pro vyšetrování prítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi, krevním produktu nebo tkáni obsahuje sadu vazebných látek, které se specificky vážou na antigen gramnegativních a/nebo grampozitivních bakterií a/nebo vazebné látky, a prostredky pro detekci navázání sady vazebných látek.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká vyšetření krve nebo krevního produktu (včetně plné krve, hematopoietiekýeh kmenových buněk, leukocytú, plazmy, séra, červených krvinek a krevních destiček) io nebo darované tkáně na přítomnost klinicky závažného množství baktérií. Konkrétněji se předložený vynález týká vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v krvi nebo krevních produktech nebo v darované tkáni, které se budou používat pro transfuzi nebo transplantaci.

Dosavadní stav techniky

Transfuze krve nebo krevních produktů je terapeuticky důležitým aspektem péče o pacienta. Transplantace darovaných tkání a orgánů je podobně terapeuticky důležitá. Absence klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v darované krvi dárce, darovaných krevních produktech nebo v darované tkáni nebo orgánech je základním požadavkem pro bezpečnost terapeutického použití těchto darovaných tekutin a tkání pro transfuzi nebo transplantaci. Bakterémie může být například přechodná, trvalá nebo občasná. Wagner et al. (Clin. Mierobiol. Kev. 7: 290-302 (1994)) a Goldman et al. (Trans. Med. Revs. 5:, 73-83 (1991)) uvádějí, že v kontaminované krvi přenesené transfúzí pacientům se identifikoval velký počet rozdílných druhů baktérií a u pacientů se následkem transfuze rozvinula septikémie. Tadler ct al. (J, Clin, Laboratoř)' Analysis 2: 21-25 (1989)) uvádějí, že i když přechodná bakterémie má obecně malé následky, trvalá nebo občasná bakterémie muže představovat životu nebezpečné situace pro některé populace pacientů, zejména pro pacienty s oslabenou imunitou, pro neonatální a geriatrické pacienty. Tedy, jestliže se má příjemci transfůndoval krev kontaminovaná klinicky závažným množstvím baktérií, příjemce může trpět komplikacemi, zejména protože transfuze krve a/nebo krevních produktů se často provádí, když pacient podstupuje velkou operaci nebo je napadnutéIný jiným způsobem.

Rovněž darované tkáně a orgány se mají udržovat přednostně bez mikrobů a přednostně se má zabraňovat jejich rejekei příjemcem.

I když je potřebné bezpečné dodávání krve nebo krevního produktu bez mikrobů, pro detekci přítomnosti klinicky závažného množství kontaminujících baktérii v krvi nebo krevním produktu

4o existují účinné způsoby, které nejsou rychlé. 1 když existují způsoby určování, zda krev je nebo není infikována baktériemi, nejěastější bakteriální testování se provádí u pacientu, u kterých se předpokládá infikovaná krev, s hlavním záměrem identifikovat přesně mikroorganismus, který způsobuje infekci tak, aby se mohlo začít s vhodnou terapií antibiotikem. u těchto způsobů identifikace infikujících baktérií sc poměrně dlouhou dobu vzorek pacientovy krve kultivuje v kulti45 vaěním médiu, které podporuje růst těchto baktérii. Eventuálně se zvýší počet přítomných mikroorganismů na přiměřené množství, které se může detektovat.

I kdy ž jsou ty to testovací techniky krve založené na kultivaci užitečné pro určení jednotlivých typů baktérií, pro použití vyšetření darované krve a krevního produktu nebo darovaných orgánů

5(i jsou nepraktické v důsledku existence infikované pacientovy krve a délky doby potřebné pro provádění těchto způsobů. Je to kvůli tomu. že darovaná krev, krevní produkty a orgány jsou často potřebné pro použití jako transfuze nebo transplantace po poměrně krátkém hodnocení. Proto nemusí být čas pro vyšetření darované krve (nebo krevního produktu) nebo orgánu způsobem založeným na kultivaci předtím, než jc potřebné použití darované krve nebo orgánu.

ÁS

Kromě toho darované, orgány a krev nebo krevní produkty mají poměrně krátkou životnost skladování v důsledku nejen ztráty funkce darovaného materiálu, ale také v důsledku zvýšení množství přítomných kontaminujících baktérií. Protože bakterie se rychle rozmnožují, dokonce malé množství kontaminujících bakterií přítomných v darované krvi nebo krevním produktu se bude s časem rychle zvyšovat. Například, i když darované krevní destičky jsou funkčně životaschopné pouze 7 dní po darování, málokdy se používají déle než 5 dní po darování kvůli nebezpečí bakteriální kontaminace, která nemusí být při darování signifikantní, ale po určité dobč se muže zvýšit na úroveň, která je klinicky relevantní. Kromě toho tyto testovací techniky založené na kultivaci trvají příliš dlouho pro rutinní vyšetření krevních destiček, které mají krátkou životnost skladoid vání (přibližné 5 dní po darování) pro použití pro transfuzi.

Brecher et al. (Transfusion 34(9): 750-755 (1994)) popisuje jiný způsob detekce jednotlivých kontaminujících baktérií v krvi za použití značených sond nukleových kyselin za účelem hybridizace genetického materiálu možných kontaminujících látek. Sondy použité v této studii jsou však i? velmi omezené počtem mikroorganismů, které se mohou detektovat a naneštěstí ze z tohoto způsobu nevyvinul žádný komerčně realizovatelný test. V důsledku jejich obtížnosti jsou tyto techniky příliš náročné z hlediska práce a času na to, aby se rutinně používaly pro vyšetření krve nebo krevního produktu kvůli bakteriální kontaminaci.

Proto je potřebná technika ry chlé detekce přítomnosti klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkáni. Ideální by byly techniky založené na navázání ant i genů, které by se daly rychle a účinné použít. Bohužel Wagner. S. J. (Int. J. Med. Mierobiol. Virol. Parasitol. Infcct. Dis. 283 (3):253-257 (1996)) uvádí, že neexistuje žádný běžný zdroj antigenů pro rozsáhlou detekci založenou na baktériích. Proto jsou potřebné metody detekce klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v darované krvi nebo krevních produktech nebo v darovaných tkáních založené na navázání antigenů.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje rychlé způsoby založené na navázání antigenů pro detekci klinicky závažného množství kontaminujících baktérii v krvi nebo krevních produktech nebo v darované tkáni, zejména v darované krvi nebo krevních produktech nebo v darované tkáni, které sc mají přenášet z jednoho jednotlivce na druhého.

Předmětem vynálezu je způsob vyšetřování přítomnosti klinicky závažného množství gram pozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkáni od savčího dárce pro převod do organismu savčího příjemce, přičemž darovaná tkáň je uchovávána v tekutině. Podstata tohoto způsobu spočívá v tom, že se vzorek darované krve nebo

4í> krevního produktu nebo tekutiny uvede do kontaktu sc sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vázou na antigen gramnegativních bakterií a/nebo vazebné látky, které se specificky vážou na antigen grarnpozitivních bakterií; a stanoví se navázání sady vazebných látek ke vzorku; přičemž, navázání ukazuje přítomnost klinicky závažného množství grarnpozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkáni a nenavázání ukazuje nepřítomnost klinicky závažného množství grarnpozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi, krevním produktu nebo v darované tkáni od savčího dárce; kde pro převod do organismu savčího příjemce se hodí krev nebo krevní produkt nebo darovaná tkáň. v nichž bylo zjištěno méně než 1 x 10° jednotek vytvářejících kolonie (CFU) grarnpozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v I ml.

5(1

Předmětem vynálezu jc dále také souprava k provádění výše uvedeného způsobu, která zahrnuje sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií a/nebo vazebné látky, které se specificky vážou na antigen grarnpozitivních bakterií, a prostředky pro detekci navázání sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu nebo tekutiny, přičemž navázání ukazuje

CZ 300108 Bó přítomnost klinicky závažného množství bakterií v darované krvi nebo v krevním produktu a nenavázání ukazuje nepřítomnost klinicky závažného množství bakterií v darované krvi nebo krevním produktu od savčího dárce, přičemž pro převod do organismu savčího příjemce se hodí krev nebo krevní produkt, v nichž bylo zjištěno méně než I x 10⁶ jednotek vytvářejících kolonie (C'FU) bakterií v 1 ml.

Tedy v prvním aspektu předložený vynález poskytuje způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující kontakt vzorku krve nebo krevního produktu se io sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství i? baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních prvního aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně s kontaktem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo gram požit i v2íí ním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních prvního aspektu předloženého vynálezu se darovaná krev nebo krevní produkt, u kterých se stanovila absence klinicky závažného množství baktérií, podává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na jejich gramnegativní bakteriální antigen. zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limuhts-·antilipopolysa charidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), bakterie idní/permeabi litu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní so bakteriální antigen. se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií. V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na gram požit i vní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž antibio55 tikem není vankomycin ani gentamyein. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, sc přednostně specificky vážou na strukturu lipoleehoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních prvního aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se spéci40 fleky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. jsou dctekovatelnč značeny první oznamující molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detekovatelně značeny druhou oznamující molekulou. V jistých provedeních jsou první oznamující molekula a druhá oznamující molekula stejné. V jiném provedeni první oznamující molekula a druhá oznamující molekula nejsou stejné. Přednostně je první oznamující molekula nebo druhá oznamující molekula nebo obě molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, lluorogenní molekulou, sólem kovu, částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

Ve druhém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetřeni přítomnosti klinicky závaž5i) ného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující styk vzorku krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií

- ? CZ 300108 B6 v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních druhého aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně s kontaktem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství grampozítivních baktérií se předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na io grampozitivní bakteriální antigen. zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotcchoove kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních druhého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které sc specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detekovatelnč značeny oznamující molekulou. Přednostně je oznamující molekulou molekula s enzymatickou aktivitou, molekula značená radioaktivním izotopem, fúzní molekula, fluorogenní molekula, sol kovu, částice, chromatická molekula nebo molekula, která sc specificky váže na sekundární vazebnou látku.

Ve třetím aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující kontakt vzorku krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky so závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních třetího aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně s kontaktem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gram negativním bakteriálním antigenu. V jistých provede55 nich se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativních baktérií předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeni nich se vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího L/TwAv-antilipopoly sacharidový faktor (LALf). protein vázající lipopolysacharidy (LBP). bakterieidní/permeabililu zvyšující protein (BPl) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracín. Vazebné látky, které se specificky vázou na gramnegativní bakteriální antigen. se přednostně specificky vážou na lipopoly45 sacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

V různých provedeních třetího aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detekovatelnč značeny reportérovou molekulou. Přednostně je reportérovou molekulou molekula s enzymatickou aktivitou, molekula značená

5u radioaktivním izotopem, fúzní molekula, fluorogenní molekula, sol kovu, částice, chromatická molekula nebo molekula, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

Ve čtvrtém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předám savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada

-4CZ 300108 B6 vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. a vazebné látky, které se vážou na grampozitivní bakteriální antigen. a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních čtvrtého aspektu předloženého vynálezu dále souprava obsahuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na io grainnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních čtvrtého aspektu předloženého vynálezu darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky is nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Á/ww/w-antilipopolysacharidový faktor (LALE). protein vázající lipopolysacharidy (LEP), bakterieidní/permeabílitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polyinixin nebo bacitracin. Přednostně vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegalivních baktérií. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamyein. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérii.

V různých provedeních čtvrtého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificko kv vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detekovatelné značeny první reportérovou molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. jsou detekovatelné značeny druhou reportérovou molekulou. V jistých provedeních jsou první reportérova molekula a druhá reportérova molekula stejné. V jiném provedení první reportérova molekula a druhá reportcrová molekula nejsou stejné. Přednostně je první reportérova molekula nebo druhá reportérova molekula nebo obě molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fiuorogenní molekulou, sólem kovu. částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V pátém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krví nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních pátého aspektu předloženého vynálezu dále souprava obsahuje prostředky sn pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se předává savčímu příjemci.

Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které sc specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých

- š CZ 300108 B6 provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gcntamycin, Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. se přednostně specificky vážou na strukturu lipotcchoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních pátého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. jsou detekovatelnč. značeny oznamující molekulou. Přednostně je reportérovou molekulou molekula s enzymatickou aktivitou, molekula značená radioaktivním izotopem, fúzní molekula, fluorogenní molekula, sol kovu. částice, chromatická io molekula nebo molekula, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V šestém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gram negativ nich baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramncgativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu.

V jistých provedeních šestého aspektu předloženého vynálezu dále souprava obsahuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenů. V jistých provedeních darovaná krev nebo krevní pro25 dukt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramncgativních baktérií se předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. zahrnuj i protilátky nebo deriváty protilátek, které sc specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky so vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Litnulas antílípopolysacharidový faktor (LALF). protein vázající lípopolysacharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI). antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

V různých provedeních šestého aspektu předloženého vynálezu se vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. jsou detekovatelnč značeny oznamující molekulou. Přednostně je oznamující molekulou molekula s enzymatickou aktivitou, molekula značená radioaktivním izotopem, fúzní molekula, fluorogenní molekula, sol kovu, částice, chroma4o tická molekula nebo molekula, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V různých provedeních prvního, druhého, třetího, čtvrtého, pátého a šestého aspektu předloženého vynálezu je krví nebo krevním produktem přednostně plná krev, bematopoietické kmenové buňky, leukocyty, červené krvinky, krevní destičky, plazma nebo sérum.

V sedmém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií ve tkáni ze savce, přičemž tato tkán je skladována v tekutině, zahrnující kontakt vzorku tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen a vazebné látky.

5n které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované lkáni a žádné navázaní jc důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni.

-6C7. 300108 B6

V jistých provedeních sedmého aspektu předloženého vynálezu se vzorek zpracovává před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenů. V jistých provedeních sedmého aspektu darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství bakté5 rií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegatívní bakteriální antigen. zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegatívní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegatívní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou zc souboru ui zahrnujícího Linwlus-antilipopolysacharidový faktor (LAFF), protein vázající lípopoly sacharidy (LBP). bakterie idní/permeabi litu zvyšující protein (BPÍ) a antibiotikum, jako je například polvmixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegatívní bakteriální antigen. se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativníeh baktérií. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotecboové kyseliny

2d gram požiti v nich baktérií.

V různých provedeních sedmého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegatívní bakteriální antigen, jsou detekovatelně značeny první reportérovou molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detekovatelně značeny druhou reportérovou molekulou. V jistých provedeních jsou první reportérova molekula a druhá reportérova molekula stejné. V jiném provedení první reportérova molekula a druhá reportérova molekula nejsou stejné. Přednostně je první reportérova molekula nebo druhá reportérova molekula nebo obě molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu, částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V osmém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkání ze savce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnu jící kontakt vzorku tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomností klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného

4(i množství grampozitivních baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních osmého aspektu předloženého vynálezu se vzorek zpracovává před nebo současně s kontaktem vzorku se sadou vazebných látek. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenů. V jistých provedeních daro45 váná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gram5(i pozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin, Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoovc kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních osmého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které sc specific55 ky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detekovatelně značeny reportérovou

-7 CZ 300108 B6 molekulou. Přednostně je reportérova molekula molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V devátém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramncgativních baktérií v darované tkání od savčího dárce pro předaní savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkán je skladována v tekutině, zahrnující kontakt vzorku této tekutinv se sadou vazebných látek, přičemž lato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grarnnegativní bakteriální antigen. a stanovení navázaní sady vazební ných látek ke vzorku, přičemž, navázání je důkazem v přítomnosti klinicky závažného množství gramncgativních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramncgativních baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních devátého aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně s kontaktem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenů. V jistých provedeních se darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativníeh baktérií předává savčímu příjemci. Přednostně savci dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gram20 negativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grarnnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grarnnegativní bakteriální antigen. zahrnuji molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Z/ww/uv-antílipopolysacharidový faktor (I. A LP), protein vázající lipopolysaeharidy (LBP). baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPJ) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo baeitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grarnnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramncgativních baktérií.

V různých provedeních devátého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se so specificky vážou na grarnnegativní bakteriální antigen, jsou detekovatelně značeny reportérovou molekulou. Přednostně je reportérovou molekulou molekula s enzymatickou aktivitou, molekula značená radioaktivním izotopem, fúzní molekula, fluorogenní molekula, sol kovu, částice, chromatická molekula nebo molekula, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V desátém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni ze savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grarnnegativní bakteriální antigen a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a proto středky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérii v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních desátého aspektu předloženého vynálezu dále souprava zahrnuje prostřed45 ky pro zpracování vzorku, přičemž toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenů nebo na grampozitivním bakteriálním antigenů.

V jistých provedeních desátého aspektu předloženého vynálezu darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce, od kterého se tkáň získala, a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých před5i) nostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grarnnegativní bakteriální antigen. zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grarnnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grarnnegativní baktérie nebo jejich antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího A/ww/jzv-antilipopolysacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysaeharidy (FBP).

-8CZ 300108 B6 baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPÍ) a antibiotikum, jako jc například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vázou na gramncgativní bakteriální antigen.

se přednostně specificky vázou na lipopoly sacharidovou strukturu gramnegativních baktérií.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotcchoové kyseliny gramm pozitivních baktérií.

V různých provedeních desátého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramncgativní bakteriální antigen, jsou detekovatelně značeny první reportérovou molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální anti15 gen, jsou detekovatelně značeny druhou reportérovou molekulou. V jistých provedeních jsou první reportérova molekula a druhá reportérova molekula stejné. V jiném provedení první reportérova molekula a druhá reportérova molekula nejsou stejné. Přednostně je první reportérova molekula nebo druhá reportérova molekula nebo obě molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, luzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu, částici, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V jedenáctém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni od savčího dárce pro předaní savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání jc důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni a žádné navázání je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních jedenáctého aspektu předloženého vynálezu dále souprava zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních darovaná tkáň se stano55 vénou nepřítomností klinicky závažného množství grampozitivních baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní ao bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotcchoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních jedenáctého aspektu předloženého vy nálezu vazebné látky, které se spe45 cifieky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, jsou detekovatelně značeny reportérovou molekulou. Přednostně je reportérové molekula molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fůzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

5() Ve dvanáctém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni ze savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a prostředky pro detekcí navázaní sady vazebných látek kc

-9CZ 300108 Bó vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni.

V jistých provedeních dvanáctého aspektu předloženého vy nálezu dále souprava zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu. V jistých provedeních tkáň sc stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativních baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních io vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. zahrnují molekulu zvolenou zc souboru zahrnujícího Limulus-antilipopolysacharidový faktor (LALP), protein vázající lipopoly sacharidy (LBP), baktericidní/-permeabilitu zvyšující protein (BP1) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopoly sacharidovou strukturu gramnegativních baktérií,

V různých provedeních dvanáctého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se spe2ii cificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, jsou detekovatelně značeny reportérovou molekulou. Přednostně je reportérova molekula molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V různých provedeních sedmého, osmého, devátého, desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu předloženého vynálezu je darovanou tkání přednostně srdce, plíce, játra, kůže. ledvina, pankreas, slezina nebo kostní dřeň.

V jistých přednostních provedeních všech výše uvedených aspektů předloženého vynálezu je sada vazebných látek imobilízována na tuhém nosiči (například na mikrotitrační plotně). V přednostních provedeních prvního, druhého, třetího, čtvrtého, pátého, šestého, sedmého, osmého, devátého, desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu předloženého vy nálezu je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec,

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je schématickým znázorněním typické membrány grampozitivní buněčné stěny.

jo Obrázek 2 je schématickým znázorněním struktury' lipopoly sacharidu (EPS) nacházejícího se v buněčné stěně gramnegativní baktérie.

Obrázky 3A až 3D jsou schématickým znázorněním zařízení podle provedení podle vynálezu. Obrázek 3A znázorňuje zařízení bez přídavku vzorku krve nebo krevního produktu (nebo bez přídavku tekutiny, ve které se skladuje darovaná tkáň). Obrázek 3B znázorňuje zařízení v časovém okamžiku, kdy se přidává vzorek krve nebo krevního produktu. Obrázek 3C znázorňuje kontakt vzorku tělní tekutiny sc zařízením. Obrázek 3D znázorňuje pozitivní výsledek za použití zařízení podle vynálezu, indikující, že vzorek testované krve nebo krevního produktu byl kontaminován mikroorganismy.

Obrázky 4A až 4D jsou schématickým znázorněním způsobu podle vynálezu. Obrázek 4A znázorňuje přidání vzorku krve, krevního produktu nebo tekutiny, ve které se darovaná tkáň skladuje, do testovacího zařízení. Obrázek 4B znázorňuje přidání latexových perliček potažených protilátkami, které se specificky vážou na gramnegativní i grampozitivní baktérie, do testovacího

- 10CZ 300108 B6 zařízení. Obrázek 4C znázorňuje smíchání vzorku s latexovými perličkami potaženými protilátkami v testovacím zařízení. Obrázek 40 znázorňuje vizuální výsledky negativního navázání (tj. žádnou baktérií ve vzorku, vlevo) a navázání (tj. přítomnost baktérií ve vzorku, vpravo).

Obrázek 5 je grafickým znázorněním jistého počtu rozličných (indikovaných) grarnpozitivních baktérií specificky vázaných s neomezující vazebnou látkou podle vynálezu, protilátkou lipotcchoové kyseliny.

Obrázek 6 je grafickým znázorněním jistého počtu rozličných (indikovaných) gramnegativních io baktérií specificky vázaných s neomezující vazebnou látkou podle vynálezu, protilátkou lípopolysacharidu.

Podrobný popis přednostních provedení

Vynález se týká detekce klinicky závažného množství kontaminujících baktérií v krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkání, zejména v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkáni, které se mají přenášet z dárce k příjemci. Předložený vynález poskytuje rychlé způsoby založené na navázání antigenu pro detekci klinicky závažného množství mikroorganismů v krvi nebo v krevních produktech nebo v tekutině, ve kterc se darovaná tkáň skladuje, a

2o soupravy k provádění těchto způsobů. Vynález jc založen na zjištění, že přesná identita kontaminujících baktérií v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkáni, které se mají použít pro transfuzi nebo transplantaci, je irelevantní. Proto vynález poskytuje způsoby vy užívající vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitívni a rovněž na gramnegativní bakterie, za účelem detekce jakéhokoliv navázání ke vzorku krve nebo krevního produktu nebo ke vzorku tekutiny, ve které se skladuje darovaná tkáň. Tedy, pokud se detekuje jakékoliv navázání, znamená to, že krev nebo krevní produkt nebo darovaná tkáň jsou kontaminovány a přednostně nebudou použité pro předání jinému jednotlivci.

Publikovaná patentová a vědecká literatura, na kterou se v tomto textu odkazuje, potvrzuje poznatky, které jsou k dispozici odborníkům v tomto oboru. Udělené patenty, přihlášky a odkazy, kterc jsou zde citovány, jsou tímto začleněny pomocí odkazu vc stejném rozsahu, jako by byl každý specificky a individuálně začleněn pomocí odkazu. Jakýkoliv rozpor mezi těmito publikacemi a předloženým vynálezem by sc mě! řešit ve prospěch předloženého vynálezu. V prvním aspektu předložený vynález poskytuje způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo krevním produktu od dárce pro předání savčímu příjemci. Způsob zahrnuje kontakt vzorku krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitívni bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu. V přednostních provedeních je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec (například kočka, kůň, prase).

Výraz „krev nebo krevní produkt, jak se používá v tomto textu, zahrnuje jakoukoliv buňku nacházející v krvi nebo kostní dřeni a jakýkoliv produkt pocházející z krve nebo kostní dřené bez omezení včetně plné krve, hematopoietíckýeh kmenových buněk, červených krvinek, krevních destiček, plazmy, séra a leukocytů (včetně Ivmfocytů). Odborníkovi v oboru biologie bude zřejmé, že bez přidáni protisrážlivého činidla, jako je například EDTA nebo heparin, bude se plná

5(i krev srážet za převádění většiny krevních buněk na nepoužitelné pro transfuzi. Proto je ve výrazu „krev nebo krevní produkt zahrnuta krev zpracovaná jakýmkoliv protisrážlivým činidlem.

Kromě toho během izolace jednotlivých krevních produktů (například krevních destiček za použití kataforézy krevních destiček) se mohou ke krvi přidávat nckrevní složky jako je například fyziologický roztok. Tedy výraz „krev nebo krevní produkt zahrnuje rovněž krev. ke které byl a

CZ 300108 Bó přidána jakákoliv biologicky inertní látka, jako je například fyziologický roztok, voda nebo skladovací živný roztok,

Výraz ..klinicky závažné množství'’, jak se používá v tomto textu, znamená množství bakteriální kontaminace v krvi nebo krevním produktu, které je rovné neboje vyšší než množství, které když je přítomné v krvi nebo krevním produktu transfundovaném typickému příjemci transfuze, vyvolává u příjemce transfuze bez omezení kterýkoliv z následujících symptomu: horečku, nachlazení, hypotenzi. rýmu, bolesti hlavy, dusnost, oligurie, průjem, bolest v místě infuze. kopřiv ku, pocení, bolest hrudníku, pcteeehiae a eeehymosis, roztroušenou nítrocévní koagulaci, m sept i ekv šok. selhání orgánů a až smrt (viz například, Morduchowiez. G. et af. Reviews of Infectious Diseases 13:3()7 (1991). V důsledku krátké doby dělení baktérií by mělo být množství baktérií v krvi určeno podle možností těsně před transfuzí. Typicky je v době transfuze klinicky závažné množství větší než. 1x10 kolonie tvořících jednotek (CFU) na ml krve nebo krevního produktu. Přednostně je klinicky závažné množství v době transfuze větší než 1 x 10^fl CFU/ml.

Více přednostně je klinicky závažné množství v době transfuze větší než lxlO CFU/ml. Ještě více přednostně je klinicky závažné množství v době transfuze větší než I χ 10⁴ CFU/ml. Ještč více přednostně je klinicky závažné množství v době transfuze větší než I \ 10' CFU/ml. Nejvíce přednostně je klinicky závažné množství v době transfuze větší než 1 x 10“ CFU/ml. Samozřejmě pro odborníka v oboru transfůzní medicíny bude zřejmé, že i když někteří jedinci, jako jsou

2o například pacienti s těžce oslabeným imunitním systémem nebo novorozenci, budou mít imunitní systém, který není schopný kompenzovat množství baktérií, které jc nižší než klinicky závažné množství. Avšak běžní odborníci v praxi budou chápat, že tyto způsoby podle vynálezu budou postačující pro testování krve nebo krevních produktů, které se mají použít pro transfuzi u rozsáhlé většiny pacientů.

Výraz „specificky sc váže“, jak se používá v tomto textu, znamená, že vazebná látka (například protilátka) rozpoznává a váže se na jednotlivý ligand (například polypeptid. sacharid, lipid nebo glykoprolcin), ale v podstatě nerozpoznává a neváže sc na jiné molekuly ve vzorku, například v biologickém vzorku, který přirozeně obsahuje mnoho rozličných proteinů. Podobně ligand ni vázaný vazebnou látkou, která specificky váže tento ligand, je označován jako „specificky vázaný touto vazebnou látkou. Spojení vytvořené mezi vazebnou látkou a jejím ligandem může být kovalentní, ale přednostně je nekovalentní. Přednostně vazebná látka, která specificky váže ligand, tvoří spojení s tímto ligandem s afinitou alespoň 1O⁽’ M více přednostně alespoň 10⁷ M ještě více přednostně alespoň 10* M a nejvíce přednostně alespoň 10' M ¹ za fyziologických podmínek nebo podmínek, které se blíží fyziologickým podmínkám vzhledem ke koncentraci iontů, například 140 mM NaCl, 5 mM MgCh.

Výraz „antigen“ (například gramnegativní bakteriální antigen nebo grampozitivní bakteriální antigen), jak se používá v tomto textu, znamená jakoukoliv molekulu z výjimkou molekul nukleových kyselin a peptidoglykanů. v jakékoliv strukturní konformaei. která se může specificky vázat s vazebnou látkou. Gramnegativním bakteriálním antigenem je například antigen, který je vylučován do vnitřku nebo přítomný na (nebo přes) buněčné membráně, buněčné stěně nebo periplazmatickém prostoru gramnegativní baktérie. Místo na antigenů. které se váže s vazebnou látkou, se nazývá „vazebné místo. Antigenem může být bez omezení protein.

glykoprolcin, sacharid nebo lipid. Specificky jsou z definice antigenů podle předloženého vynálezu vyjmuty' peptidoglvkany a molekuly nukleových kyselin, jako jsou například DNA nebo RNA.

Výraz „grampozitivní baktérie, jak se používá v tomto textu, znamená kmen, typ, druh nebo rod

5(i baktérií, který při vystavení zbarvení podle Grama si zachovává zbarvení, a tedy je zbarven modrofialově.

Výraz „gramnegativní baktérie“, jak se používá v tomto textu, znamená kmen. ly p. druh nebo rod baktérií, který při vystavení zbarvení podle Grama nezůstává zbarven, a tedy není zbarven modrofialově. Odborníkům v daném oboru je samozřejmě známo, že v závislosti na koncentraci

barviva a na délce expozice mohou gramnegativní baktérie odnášet nepatrné množství Gramova barviva a zbarvují se slabě modrofialově. Avšak ve srovnání s grampozitívními baktériemi zbarvenými stejnou formulací Gramova barviva během stejné doby budou gramnegativní baktérie mnohem méně zbarveny než grampozitivní baktérie.

Bakteriální buněčná stěna je komplex semirigidní struktury, který vymezuje tvar organismu, obklopuje základní cytoplazmatickou membránu a chrání bakteriální buňku před vnějším prostředím. Bakteriální buněčná stena je složena z makromolekulami sítě známé jako peptidoglykan zahrnující sacharidy a polypeptidy, které tvoří strukturu kolem bakteriální buňky, iti Bakteriální buněčná stěna poskytuje mechanickou stabilitu pro bakteriální buňku a zabraňuje osmotickc lyže. Nejzávažnější pro předložený vynález je chemické složení buněčné stěny, které se využívá pro rozlišení většiny druhů baktérií.

Buněčné stěny odlišných druhů baktérií se mohou odlišovat tloušťkou, strukturou a složením. t5 Avšak existují dva hlavní typy bakteriální buněčné stěny a z.da daný druh baktérie má jeden nebo druhý typ buněčné stěny, se může obecně určit pomocí reakce buňky s jistým barvivém.

Nejěastěj i používaným barvivém pro barveni baktérií je Gramovo barvivo. Když se provádí barvení touto krystalovou violetí a jodem, baktérie, které zůstávají zbarveny, se nazývají grampozitivní a baktérie, které nezůstávají zbarveny, se nazývají gramnegativní.

Grampozitivní bakteriální buněčná stěna obsahuje poměrně silnou vrstvu peptidoglykanu. Tato struktura je umístěna jako opakující se sacharidové jednotky N-acetylglukosaminu (NAG) a N acctylmuramove kyseliny spojené β 1,4-glykosidovými vazbami. Zbytky N-acetvlmuramové kyseliny jsou zesíleny se sousedními řetězci (NAM-NAGK (kde x je jakékoliv číslo) přes tetrapcptidy, kde peptidy 2 a 3 mohou projevovat jistou variabilitu v povaze peptidů. Některé ze zesítěných se rozšiřují nad a pod rovinu vytvářejíc vícenásobnou vrstvu peptidoglykanu. Tyto polymery obklopují povrch buňky, a tím vymezují tvar organismu,

V grampozitivní buněčné stěně je umístěna lipopolymerní sloučenina obsahující lipotechoovou kyselinu (LTA), která může představovat značnou hmotnost buněčné steny některých druhů. Tyto polymery' zahni ují hlavně glycerol fosfát (nebo ribitol fosfát). Obrázek 1 znázorňuje schématicky typickou membránu grampozitivní bakteriální buňky. V důsledku její vysoké polarity a výsledného kladného náboje struktury lipotechoové kyseliny pravděpodobně regulují tok iontů a živin dovnitř a ven / bakteriální buňky. Struktury' LTA jsou vysoce anti genní a mohou tvořit základ molekulární specifičnost i potřebné pro umožnění rozsáhlé detekce této třídy baktérii. Protože lipotechoové kyseliny jsou běžné v grampozitivníeh baktériích, testovací postupy, které rozpoznávají tuto strukturu by mohly být velmi indikativní při kontaminací grampozitívními baktériemi. Protože chemická struktura polymerů lipotechoové kyseliny je přiměřeně zachována mezi různými kmeny grampozitivníeh baktérií, sondování přítomnosti této struktury buněčné io stěny umožňuje detekci mnohých grampozitivníeh baktérií.

Bakteriální buněčná stěna gramnegativniho typu je jednoznačně vzhledově vrstvena a je mnohem tenčí než grampozitivní buněčná stěna. Gramnegativní bakteriální buněčná stěna je podobná grampozitivní tím, že je stavěna na lipidové dvojvrstvě obsahující proteiny, avšak lipidy na vnitřní straně jsou fosfolipidy, zatím co lipidy na vnější straně zahrnují makromolekuly nazývané lipopolysaeharidy (LPS). Tato lipopolysacharidová struktura tvoří silný záporný náboj na vnějším povrchu buňky, která se využívá pro rozpoznávání a přežití organismu. Tato lipopolysacharidová struktura rovněž poskytuje toxický účinek gramnegativní infekce a z toho důvodu se nazývá „endotoxin.

Struktura Iipopolysacharidové složky byla popsána v mnohých studiích a je znázorněna na obrázku 2. Obecně se struktura lipopolysacharidového antigenu může popsal jako obsahující tři zřetelné oblasti. Krajní oblast, která se nazývá O-speci tícká oblast a skládá se z lineárních a rozvětvených řetězců sacharidů, je vysoce variabilní a je typicky odlišné pro jednotlivé druhy.

Sérologické testy využívají tuto odlišnost pro identifikaci jednotlivých kmenů gramnegativních

- 13CZ 300108 B6 baktérií. Přítomnost O-řetčzců způsobuje při mikroskopickém výzkumu hladký povrch. Naopak druhy nebo mutanty bez O-specifických postranních řetězců vypadají drsně. Většina divokých typu se proto označuje jaku ..hladké” kmeny a mutanty bez této struktury se označují jako ..drsné kmeny.

Zevnitř O-specifiekc oblasti v lipopolysacharidové struktuře jc polysacharidová oblast jádra, která má vy soký stupeň homologie mezi druhy. Oblast jádra se může dále dělit na dvě oblasti, a to ..vnitřní jádro” a ..vnější jádro. Vnější jádro oblasti jádra projevuje jistou variabilitu, ale má obvyklé elementy a obecné obsahuje glukózu, galaktózu, N-acetyl glukosa min a jiné sacharidy, io Vnitřní jádro oblasti jádra všech gramnegativních baktérií s 1 ipopolysacharidovou strukturou obsahuje chemicky identické struktury . Vnitřní jádro jc složeno ze zbytků heptózy a 2 kcto-3dcoxyoktonátu (KDO).

Většina vnitřních složek s lipopolysacharidovou strukturou má lipidovou strukturu A, která tvoří chemicky nejvíce stejnorodou část lipopolysacharidu. Lipid A je složen z disacharidu β-glukosaminyl--(1—>6)-a-glukosamin. který je fosforylován na každém svém sacharidovém vzdáleném konci. Sacharidový hlavní řetězec je acylován na každém 2.3-centru substituovanými deriváty myristové kyseliny. Postranní řetězce mastné kyseliny projevují jistý nízký stupeň druhově závislé modifikace, ale tyto mastné kyseliny jsou včleněny do buněčné membrány a nejsou schopné imunologického rozpoznávání. Tvorba protilátek je pravděpodobně výsledkem opracované odhalené bifosforyl-glukosamin-disaeharidové hlavní struktury, která je velmi dobře zachovávána.

Strukturní variabilita struktury LPS se snižuje od povrchové odhalené O-speeifíekc oblasti k vnitřním a vnějším oblastem jádra k d i sacharidovému derivátu a lipidu A vloženému v menv bráně. Důvodem tohoto gradientu variability je pravděpodobně vyvinutý tlak působící proti gramnegativním baktériím. Dá sc představit, že mikroby změnily svou odhalenou povrchovou strukturu v čase jako odpověď na tento tlak.

Stejně jako u struktur lipotechoové kyseliny v grampozitivních baktériích mohou se zachovávané so lipopolysacharidové struktury mezi rody gramnegativních baktérií použít jako metodologie pro rozsáhlou detekci. Tyto jedinečné terče (lipotechoové kyseliny v grampozitivních a lipid A nebo oblasti jádra LPS struktury v gramnegativních baktériích) jsou základem metodologie detekce tříd mikroorganismů.

Výraz ..vazebná látka”, jak se používá v tomto textu, znamená molekulu nebo makromolekulu schopnou vázat se na ligand, s tou výjimkou, že vazebná látka není přirozeně se vyskytující látkou nacházející se v ostrorepovi americkém (například íiinulus polyphemus), která se váže s endotoxinem. Přednostně vazebná látka podle vynálezu není rekombinantní látkou odvozenou od látky nacházející se v ostrorepovi americkém (například Limu/us polyphetnus). která se váže s endotoxinem. Vazebnou látkou může být bez omezení protilátka, antibiotikum, protein, fúzní protein (například protein obsahující části dvou nebo více proteinů) nebo chemický chelaton.

V jistých přednostních provedeních je vazebnou látkou podle vynálezu peptid nebo peptidomimetikum. Pro účely vynálezu je „peptid molekulou obsahující lineární část zbytků aminokyselin spojených navzájem v lineární části peptidovými vazbami. Takové peptidy podle vyná45 lezu mohou zahrnovat přibližně tři až přibližně 500 aminokyselin a mohou dále obsahovat sekundární, terciární nebo kvartémí struktury' a rovněž intermolekulární asociace s jinými peptidy nebo jinými nepeptidovými molekulami. l akové intermolekulární asociace se mohou uskutečňovat bez omezení prostřednictvím kovalentní vazby (například prostřednictvím disulťídových vazeb) nebo prostřednictvím chelatace, elektrostatických interakcí, hydrofobních interakcí, so vodíkových vazeb, interakcí mezi ionty a dipóly, interakcí mezi dipóly a dipóly nebo prostřednictvím jakékoliv kombinace výše uvedených vazeb.

V jistých přednostních provedeních taková vazebná látka obsahuje oblast určující komplementaritu (CDR) protilátky, která se za fyziologických podmínek váže na epitop obsahující antigen lipopolysacharidové (LPS) struktury gramnegativních baktérií nebo na strukturu lipotechoové

- 14Cl 300108 B6 kyseliny (L I A) grampozitivních baktérií nebo peptidomimetikum takové oblasti určující komplementaritu. Pro účely předloženého vynálezu je ..oblast protilátky určující komplementaritu” tou částí protilátky, která sc za fyziologických podmínek váže na epitop včetně jakýchkoli strukturních oblastí potřebných pro takové navázání a která se přednostně skládá z podmnožiny amino5 kyselinových zbytků kódovaných oblastmi s humánními těžkými řetězci V. D a J a oblastmi s humánními lehkými řetězci V a J a/nebo jejich kombinacemi. Příklady přednostních provedení zahrnují protilátku nebo derivát protilátky, kterou více přednostně může být monoklonální protilátka. humánní protilátka, humanizovaná protilátka, protilátka s jednoduchým řetězcem, chimérická protilátka nebo fragment protilátky vázající antigen.

io

Odborníci v daném oboru jsou schopni vytvořit jakékoliv deriváty protilátek za použití standardních technik uznávaných v oboru. Například Jones et al. (Nátuře 321: 522-525 (1986)) zveřejňuje nahrazení oblastí určujících komplementaritu (CDR) humánní protilátky oblastmi z myší protilátky. Marx (Science 229: 455 456 (1985)) pojednává o chimérických protilátkách.

které mají myši variabilní oblasti a humánní konstantní oblasti. Todwell (Nátuře 342: 99 100 (1989)) pojednává o rozpoznávacích elementech s nižší molekulovou hmotnosti odvozených z informace CDR protilátky. Clackson (Br. J. Rheumatol. .3052: 36-39 (1991)) pojednává o geneticky zkonstruovaných monoklonálních protilátkách, včetně derivátu fragmentu fv, o protilátkách s jednoduchým řetězcem, fúzních proteinech, chimérických protilátkách a humanizo20 váných protilátkách z hlodavců. Reichman et al. (Nátuře 332: 323-327 (1988)) zveřejňuje humánní protilátku, na kterou se naštčpovaly krysí hypervariabilní oblasti. Verhoeyen et al. (Science 239: 1534-1536 (1988)) zveřejňuje štěpování vazebného místa myšího antigenu do humánní protilátky.

Kromě toho odborníci v daném oboru jsou schopni navrhnout a vytvořit peptidomimetika s vazebnými charakteristikami podobnými nebo lepšími, než má taková oblast určuj ící komplementaritu (viz například, Horvell et al., Bioorg. Med. Chem. 4: 1573 (1996); Liskamp et al.. Reci, Trav. Chim. Pays-Bas 1:113 (1994); Gante et al„ Angew. Chem. Int. Rd. Engl, 33: 1699 (1994); Seebaeh et al., Helv. Chim. Acta 79: 913 (1996)). Rovněž všechny takové deriváty protilátek a jejich peptidomimetika jsou zahrnuty do rozsahu předloženého vynálezu. Kompozice podle vynálezu může dále zahrnovat fyziologicky přijatelná ředidla, stabilizační činidla, lokalizační činidla nebo pufry.

Přídavné přednostní vazebné látky podle vynálezu zahrnují malé molekuly, kterc se mohou identifikovat za použití vyšetření nebo racionálních přístupů řešení, jak se zde dále uvádí.

Více přednostně jsou vazebnými látkami podle předloženého vynálezu protilátky, jako jsou například polyklonální protilátky nebo monoklonální protilátky a/nebo deriváty protilátek. Vytváření monoklonálních a polyklonálních protilátek je pro odborníka v oboru biologie známo (viz například Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons. New York, NY. 1994). Při vytváření protilátek k požadovaným jedinečným terčovým antigenům je užitečných velký počet postupů. Výsledkem tradiční imunizace a technik shromažďování je tvorba polyklonálních protilátek zaměřených proti běžným determinantům terčových bakteriálních druhů (ETA nebo EPS). Přídavně se mohou použít eelulární hybridizační techniky pro produkci nesmrtelných hybridomových buněčných linií, které tvoři specifické monoklonální protilátky vůči terčovým druhům.

Protilátky, které jsou potenciálně užitečné pro rozsáhlou detekci grampozitivních baktérií zahrnují protilátky popsané v pracích Fisher et al.. PCT přihláška e. WO 98/57994; Jackson, D.E. ct al.,

5d Infeetion and lmmunitv 43: 800 (1984); Hamada, S. et al., Microbiol, Immunol. 28: 1009 (1984);

Aasjord. P. ct al.. Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Séct. C. 93; 245 (1985); McDaniek

L.S. el al., Microbial Pathogencsis 3: 249 (1987); Tadler, M.B. et al., Journal of Clinical

Laboratory Analysis 3: 21 (1989); a Stuertz. K. et al., Journal oťClinieal Microbiology 36: 2346 (1998).

- 15CZ 300108 Bó

Protilátky, které jsou potenciálně užitečné pro rozsáhlou detekci gramnegativních baktérií zahrnují protilátky popsané v pracích Nelles, M.J. et al., Infect. Immun. 46: 677 (1984); Teng,

N.N.H. et al.. Proe, Nati. Acad. Sci. USA 82: 1790 (1985); Dunu, D.L, et a!., Surgery 98: 283 (1985); De Jongh-Leuvenink. J. et al., Eur, J. Clin. Microbiol. 5: 148 (1986); Bogard. W.C. et al..

? Infect, Immun. 55: 899 (1987); Pollack, M. et al., Bacterial Endotoxins. Pathophysiological Effccts. Clinical Significance, and Pharmacological Control. pp. 327-338 Alan R. Liss. Inc. (1988); Priest. B.P, et al. Surgery 106; 147 (1989); Tyler, J.W. et al., Journal of lmmunological Methods 129; 221 (1990); Siegel. S.A. et al., Infect. Immun, 61: 512 (1993); Shelburne, C.E. et al., J. Periodont. Res. 28; 1 (1993); Di Pardova. F.E. et al., Infect. Immun. 61:3863 (1993); a De io Kievit. T.R. and Lam, J.S.J. Bacteriol. 176: 7129 (1994).

Výběr protilátky (protilátek), která se má použít, se může provádět klasickými technikami. Specifičnost protilátky, oblast navázáni a kinetika se může charakterizovat empiricky testováním každé protilátky empirickým způsobem. Mikrotitrační způsoby vyšetřeni jsou v literatuře dobře popsá15 ny za účelem charakterizace specifické odpovědi protilátky v jakékoliv dané formě iniunoanalýz.y. Podobně aktivity detekovatelně značených protilátek se mohou charakterizovat prováděním množství chemických konjugačních technik a vyšetřováním výsledného produktu pro optimální pracovní parametry. Zachycované protilátky a detekovatelně značené protilátky se mohou vyšetřoval proti klinickým izolátům baktérií ze zachycených vzorků krevních destiček nebo

2o červených krvinek za účelem emulování provedení finální analýzy jako blízké k finálnímu produktovému provedení, pokud je to možné, foto experimentovaní vede k výběru a optimalizací činidel na bázi protilátek pro aplikaci v rozličných analýzách popsaných níže. Pokud se identifikují vazebné látky, které se lépe empiricky realizují než popsané nebo vytvořené alternativní protilátky, potom se vyhodnocují vc stejném empirickém formátu popsaném pro protilátky.

Monoklonální protilátky se specifitou vůči jedinečným rodově zkříženým terčům na povrchu bakteriální buňky se používají pro vývoj skupinové detekční analýzy. Pokud jednotlivé klony protilátek neposkytují požadovanou mez detekční citlivosti (jako například v případě se substitucemi ve struktuře L ΓΛ) pro každý druh, mohla by se použil směs monoklonálních protilátek.

Rozšíření tohoto pro LPS by mohlo zahrnovat tvorbu polyklonálního antiséra se širokou specifitou pro odlišné gram negativní druhy. Polyklonální protilátky se mohou rovněž, nahradit v každé z níže popsaných forem analýzy.

Ještě dalším typem vazebné látky podle vynálezu jsou vazebné receptory. které jsou odlišné od

3? imunoglobulinů.

Jisté přednostní metody využívají vytváření komplexů gramnegativních baktérií s takovými neomezujícími formami, jako je například Limuhts-antilipopolysacharidový faktor (LALF), polymixiny. kationtový antimikrobiální protein (CAP 18), sérový myloid P. magaininy. bakteκι neciny. reeeptor TLR-4, protein vázající lipopolysaebaridy (LBP) a baklerieidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a rovněž antibiotika, jako je například bacitracin a jiná antibiotika. Jisté přednostní metody využívají vytváření komplexů grampozitivníeh baktérií s takovými neomezujícími formami, jako je například protein vázající manózu (MBP). reeeptor TLR-2. h i stát iny a antibiotika, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin a gentamyein. Jisté přednostní metody využívají vytváření komplexů gramnegativních baktérií a grampozitivníeh baktérií s takovými neomezujícími formami, jako jc například CD 14, α-šroubovicové kationtové peptidy, laktoferricin B, mikrobiální proteiny krevních destiček a neutrofilní peptidy (defensiny). Každá /těchto vazebných látek má schopnost vázat se k rozsáhlým druhům baktérií a mohla by se použít v tandemu nebo jako imunní komplexotvorné činidlo.

Protilátky a vazebné látky popsané výše se mohou použít, jak jsou popsány nebo modifikované, když jc potřebné vytvořit užitečné imunologické činidlo.

Podle prvního aspektu předloženého vynálezu se přítomnost nebo nepřítomnost navázání může stanovit standardními technikami včetně použití vazebných zkoušek podle vynálezu popsaných

- 16CZ 300108 B6 dále. Obecně stanovení „navázáni” (tj. přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v krvi nebo v krevním produktu) se konstatuje, když se vzorek od dárce váže alespoň (),5x silněji, než je navázání pozadí, kde pozadí je vzorek krve nebo krevního produktu, který neobsahuje žádnou bakteriální kontaminaci. Například vzorek darovaných krevních destiček se porovnává s pozadím obsahujícím vzorek krevních destiček, které neobsahují žádnou bakteriální kontaminaci. Tedv. kde je pozadí 0.1 jednotek (například jak se stanov í pomocí čítače mikrotitrační plotny), konstatuje se stanovení „navázání tehdy, když je vzorek z darované krve nebo krevního produktu alespoň 0.15 jednotek. Více přednostně se stanovení „navázání” konstatuje tehdy, když se vzorek od dárce váže alespoň 0,75x silněji, než je navázání pozadí. Ještě v íce přednostně se sianovení io „navázání“ konstatuje, když se vzorek od dárce váže alespoň l.Ox silněji než pozadí. Ještě více přednostně se stanovení „navázání konstatuje, když vzorek od dárce váže alespoň 1,25x silněji než pozadí. Nejvíce přednostně se stanovení „navázání” konstatuje, když se vzorek od dárce váže alespoň 1,5x silněji než pozadí.

V jistých provedeních prvního aspektu předloženého vynálezu se vzorek před nebo současně sc stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grainnegativním bakteriálním antigenu nebo grampozitivním bakteriálním antigenu. Vazebné místo na bakteriálním antigenu se muže odhalit například odštěpením antigenu z buněčné stěny nebo buněčné membrány baktérií, a tím odhalením va/eb2o ného místa; vyvoláním sekrece antigenu baktériemi, a tím odhalením vazebného místa; lýzou baktérií, čímž se uvolní intraeelulární bakteriální antigen. a tím se odhalí vazebné místo na anligenu; nebo vyvoláním změny konformaee na bakteriálním antigenu. a tedy odhalením vazebného místa. Taková zpracování zahrnují mechanické rozbití bakteriálních bunčk ve vzorku fyzikálními prostředky, například bez omezení sonikací. varem nebo homogenizací za použití například

Dounceova liomogenizatoru. Zpracováním může být rovněž zpracování vzorku chemicky sloučeninou nebo kompozicí, jako je například detergent, zásaditý roztok (pro alkalickou lýzu). kyselý roztok (pro kyselou lýzu), EDTA, ED I A, kovový iont, aniont. kationt, povrchově aktivní látka, chclatační činidlo a/nebo enzym, zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grainnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu.

V jednom provedení prvního aspektu předloženého vynálezu se darovaná krev nebo krevní produkt, u kterých se stanovila absence klinicky závažného množství baktérií, předává savčímu příjemci. Pod „předáním” se rozumí podávání, transfuze, transplantace nebo přenos krve, krevního produktu a/nebo tkáně od savčího dárce savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce, od kterého se vzorek Krve nebo krevního produktu získal, a savčí příjemce jsou stejného druhu. Podle způsobů podle předloženého vynálezu se darovaná krev nebo darovaný krevní produkt může rychle vyšetřit na přítomnost jakýchkoliv kontaminujících baktérií, bez ohledu na kmen nebo typ kontaminujících baktérií. Je samozřejmé, že v důsledku velké rychlosti množení baktérií v krvi nebo krevním produktu je přednostní transfundoval určenému příjemci darovanou krev nebo krevní produkt bez klinicky závažného množství baktérií, jak se stanoví podle vynálezu, krátce po testování. Přednostně se darovaná krev nebo krevní produkt bez klinicky závažného množství baktérií podává ve formě transfuze pacientovi ne později než 42 dnů po začátku testování, více přednostně ne později než 30 dní po testování, více přednostně ne později než 2 týdny po testování, více přednostně ne později než 7 dní po testováni, ještě více přednostně ne později než 3 dny po testování a ještě více přednostně ne později než ne později než 2 dny po testování, ještě více přednostně ne později než 24 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 12 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 6 hodin po testování a nejvíce přednostně se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií přenese příjemci transfúzí za 3 hodiny od začátku testovaní. Nejvíce přednostně je krví nebo krevním produktem plná krev, hematopoietické kmenové buňky, leukocy ty, krevní destičky, červené krvinky, plazma nebo sérum.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou ua gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které sc specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se

- 17CZ 300108 Bó specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Lhmrfus-antilipopolysaeharidový faktor (FALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP). baktericidní/permeabílitii zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polv mixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na li popoly sacharidovou strukturu gramnegatívních baktérií.

V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na gram pozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky. které se specificky vážou io na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují antibiotikum, přičemž tímto anlibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které s.e specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. se přednostně specificky vážou na strukturu li potec hoové kyseliny gram pozitivních baktérií.

Odborníkům v biologii bude zřejmé, že ve vynálezu se může použít jakákoliv kombinace jedné nebo více odlišných vazebných látek. Tedy antibiotikum, které se specificky váže na podskupinu grampozitivníeh baktérií, se může kombinovat s protilátkou, která se specificky váže na zbylé grampozitivní baktérie, a druhou protilátkou, která se specificky váže na všechny gramnegativní baktérie.

V různých provedeních prvního aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální, antigen, jsou detekovatelnč značeny první reportérovou molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. jsou detekovatelně značeny druhou reportérovou molekulou. V jednom provedení jsou první reporte25 rová molekula a druhá reportérova molekula stejné. V jiném provedení první reportérové molekula a druhá reportérové molekula nejsou stejné. Přednostně první reportérové molekula nebo druhá reportérova molekula nebo obě jsou molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, soleni kovu (například sólem zlata nebo sólem stříbra), částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, kteráje

3o specificky vázána sekundární vazebnou látkou. Výrazem „sekundární vazebná látka se míní vazebná látka, která se spec i f ekv váže s vazebnou látkou, která se specificky váže s gramnegativními baktériemi, grampozitivními baktériemi nebo oběma druhy baktérií. Například, když vazebnými látkami, které se specificky vážou s gramnegativními baktériemi a grampozitivními baktériemi, jsou čisté myší monoklonální protilátky, sekundární vazebnou látkou může být anti myší protilátka.

Vzorek se může například testovat analýzou TAC Scan s vazebnými látkami, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. detekovatelně značený FITC, a vazebnými látkami, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, detekovatelně značený rhodaio mi nem. Vyšetřením pro barvení FITC a/nebo rhodaminem se může stanovil, že vzorek neobsahuje žádnou kontaminaci grampozitivními baktériemi, ale může se zjistit, že obsahuje klinicky závažnou hladinu kontaminace gramnegativními baktériemi. Přednostnč, kdyby byl tento vzorek z jednotky darované krve nebo krevního produktu, tato jednotka by se nepoužila pro transfuzi.

Výsledkem kovalentní vazby oznamující molekuly s vazebnou látkou (jakoje například protilátka nebo antibiotikum) je to, že vazebná látka je detekovatelně značena. Převážně používanou oznamující molekulou v největším počtu imunoanalýz používaných v současnosti je molekula s enzymatickou aktivitou. Vazebné látky se obvykle chemicky vážou s enzymy. lak vzniká komplex, který si zachovává imunologickou vazebnou schopnost a ještě současně umožňuje so zvýšené meze detekce za použití ampliflkační schopnosti páru enzym/substrát. Více než 20 různých značení enzymy se uvádí v literatuře pro produkci enzymových konjugátů. Nejčastěji se používá křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza a β-galaktozidáza. Požadovaná charakteristika pro značení enzymem zahrnuje vysokou specifickou aktivitu, malou velikost, dále aby reakční produkty byly snadno měřitelné a aby komplex byl stabilní. Křenová peroxidáza se použila

- 18CZ 300108 B6 s hydrogenperoxidovým substrátem a následujícími barvivý: ortho-fenylendiaminem (OPD). tetramethyl benzidinem (TMB) a diaminobenzidinem (DAB). Alkalická fosfatáza se použila s para-nitrofenylfosfátem (PNPP) a methy lumbelliferoncm. β-Galaktozidáza využívá jako svůj substrát O-nitrofenyl-p-D-galaktopyranosid (ONPG).

Když je oznamující molekulou enzym, enzymatická aktivita je závislá na schopnosti enzymaticky aktivní detekovatelnč značené vazebné látky specificky se vázat na terčový ligand (například LP A nebo LTA). Vazba enzymu s protilátkou by neměla významně ovlivňovat schopnost vazebné látky specificky se vázat s jejím terčem a nemela by významně ovlivňovat katalytickou io aktivitu tohoto enzymu. Typické sít ovací reakce využívají některé typy hetero- nebo homobifunkčního činidla pro chemické navázání dvou složek dohromady. V současnosti existují komerčně dostupné systémy, které mohou snadno použít osoby, které nejsou specialisty.

Alternativami k enzymovému značení jako oznamující molekuly jsou značení částicemi. Tyto mohou zahrnoval latexové částice, latexové částice impregnované barvivém a kovové částice, jako je například zlato nebo stříbro. Částicové konjugáty jsou vhodné pro analýzy s vizuálním koncovým bodem. Komerčně dostupné částice jsou o velikostech v rozsahu nanometrů až mikrometrů. Velikost částic je důležitá, protože ovlivňuje koncový bod detekce. Latexové částice a částice kovu jsou dostupné s rozličnými chemicky reaktivními složkami na povrchu. Výrobci

211 tyto v y rá bé j í ta k, že se m ů že vy u ž í v at po st u p a l te rn at i v n i kon j u ga c e.

Tedy vazebná látka podle vynálezu se může detekovatelnč značit oznamující molekulou prostřednictvím intennolekulární asociace nebo se může detekovatelnč značit prostřednictvím vložených molekul k oznamující molekule prostřednictvím intennolekulární asociace. l akové intermoleku25 lární asociace se mohou uskutečňovat bez omezení prostřednictvím kovalentní vazby (například prostřednictvím disulfidových vazeb) nebo prostřednictvím chelatace, elektrostatických interakcí, hydrofobních interakcí, vodíkových vazeb, interakcí mezi ionty a dipóly, interakcí mezi dipóly a dipóly nebo prostřednictvím jakékoliv kombinace výše uvedených vazeb. Přednostně oznamující molekuly zahrnují bez omezení radioaktivní izotopy, těžké kovy. fluorescenční značení, chrornatické značení, chem i luminiscenční značení, enzymy a enzymové substráty. Biologické vzorky přednostně zahrnují krev, sérum, plazmu, červené krvinky, krevní destičky a bílé krvinky.

V jistých přednostních provedeních způsob podle tohoto aspektu vynálezu má formu konvenční imunoanalýzy, jako je například ELISA nebo RIA. V jiném přednostním provedení využívá tento způsob přímou nebo nepřímou imunofluorescenci.

V přednostním provedení prvního aspektu vynálezu je sada vazebných látek imobil izována na pevném nosiči (například na mi krotit rač ní plotně).

Ve druhém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závaž4o ného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci. Tento způsob zahrnuje styk vzorku darované krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gram4? pozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu. Přednostně je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

Ve třetím aspektu poskytuje předložený vynález způsob vy šetření přítomnosti klinicky závažného množství gramncgativních baktérií v darované krvi nebo krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci. Způsob podle tohoto aspektu vynálezu zahrnuje kontakt vzorku krve nebo krevního produktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a stanovení navá55 zání sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky

- 19CZ 300108 B6 závažného množství gramnegativních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázání jc důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované krv i nebo v krevním produktu. Přednostně je savčím dárcem a/ncbo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

Podle druhého a třetího aspektu vynálezu výrazy „navázání, „antigen“. „krev nebo krevní produkt“, „grampozitivní baktérie“, „gramnegativní baktérie. ..klinicky závažné množství, „specificky se váže“ a „vazebná látka jsou definovány výše. Mělo by se poznamenat, že způsoby podle prvního, druhého a třetího aspektu vynálezu se mohou provádět v době testování pro srovnání ABO. srovnání Rh a/nebo srovnání MHC mezi savčím dárcem a savčím příjemcem.

V jistých provedeních druhého a třetího aspektu tohoto vynálezu se vzorek před nebo současné s kontaktem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Přednostně zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenu a gramnegativním bakteriálním antigenu. Způsoby zpracování vzorku pro odhalení vazebného místa pro vazebnou látku na grampozitivním bakteriálním antigenu nebo gramnegativním bakteriálním antigenu jsou takové, jak se popisují pro první aspekt předloženého vynálezu.

V jistých provedeních se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství grampozitivních baktérií podle způsobu podle druhého aspektu předává savčímu příjemci. V jistých provedeních se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativních baktérií podle způsobu podle třetího aspektu předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.

V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Přednostně vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na gramncgativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulus -antilipopolysacharidový faktor (l.ALh), protein vázající lipopolysaeharidy (LBP), baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako je například polymixin nebo bacitracin. Vazebné látky, které se specificky vážou na gramncgativní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na lipopolysaeharidovon strukturu gramnegativních baktérií.

Ve čtvrtém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. a vazebné látky, které se vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu. V přednostním provedení je savčím dárcem a/ncbo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

Podle čtvrtého aspektu vynálezu výrazy „navázání“, „antigen“. „krev nebo krevní produkt, „grampozitivní baktérie, „gramnegativní baktérie“, „klinicky závažné množství, „specificky .se váže a „vazebná látka“ jsou definovány výše.

-20CZ 300108 B6

Výraz „prostředky pro detekci navázání, jak se používá v tomto textu, znamená jakoukoliv metodu známou v oboru detekce navázání vazebné látky na terčový ligand (tj. na strukturu LPS nebo LTA antigenu). Přednostní prostředky pro detekci navázání zahrnují irnunoanalýzy popsané níže. Odborníkům v oboru biologie jsou známy různé „prostředky pro detekcí navázání a zahrnují bez omezení analýzu s postranním tokem. PUSA. RIA. analýzu PACScan. imunopijákování (western bio tt ing). imunoprecipitaei. aglu ti načni analýzy, analýzy založené na částicích a separační a neseparační analýzy. Separační („heterogenní”) analýzy jsou analýzy, při kterých se oddělují navázané a volné značené složky. Neseparační („homogenní) analýzy jsou io analýzy, pří kterých navázání značených složek na komplementární vazebnou složku moduluje vlastnosti značení, a tím se vázané a volné složky mohou rozlišovat bez použití stupně separace. Separační analýzy sc mohou rozdělit na dva základní druhy, a to kompetitivní analýzy, při kterých analyt a značený analyt soutěží o omezený počet vazebných míst, a sendvičové (extrakčni) analýzy, při kterých činidlo v nadbytku extrahuje analyt ze vzorku. Činidla a vzorky se mohou smíchat současně nebo postupně v závislosti na vyvinutém protokolu. Pro zlepšení citlivosti analýzy se jedna složka může značit látkou, která může zesilovat signál pro detekci malého počtu uskutečněných navázání, tato může zahrnovat radioaktivní izotopy, fluorescenční barviva. enzymy, chemiluminiscenční sloučeniny, atomy kovů, sóly kovů nebo sloučenin, stabilní volné radikály, viry nebo bakteriofágy, kofaktory, substráty s latexovými částicemi, erytrocyty,

2u protilátky, inhibitory, apoenzymy, elektroaktivní látky, zamlžovací prostředky, spektrální senzibilizálory. barviva, fosforescenční barviva, liposomy a elektrofory.

Je samozřejmé, že jakýkoliv z těchto prostředků pro detekci navázání může využíval automatizaci pro provedení a/nebo analýzu výsledků analýzy .

V jistých provedeních čtvrtého aspektu předloženého vynálezu dále souprava obsahuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu.

to Výraz „prostředky pro zpracování“ označuje jakoukoliv metodu nebo zpracování, které odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu. Takové prostředky zahrnují bez omezení fyzikální manipulaci včetně homogenizace (například pomocí Dounccova homogenizátorů). sonikaee a varu. Jiné „prostředky pro zpracování“ zahrnují zpracování vzorku chemickými roztoky nebo sloučeninami bez omezení včetně detergentů (například SDS nebo triton-X), zásaditých lytických roztoků (například zásaditého roztoku), kyselých lytických roztoků (například kyselého roztoku). EDTA. EGTA, povrchově aktivních látek, kovových iontů, aniontú, kationtů. chelatonů a enzymů.

V jednom provedení čtvrtého aspektu předloženého vynálezu darovaná krev nebo krevní produkt

4d se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií sc předává savčímu příjemci.

přičemž savčí dárce, od kterého se vzorek krve nebo krevního produktu získal, a savčí příjemce jsou stejného druhu. Přednostně se souprava podle vynálezu umísťuje v místě (jako je například nemocnice), kde bude přijímajícímu pacientovi podávána transfuze darované krve nebo krevního produktu. Za použití soupravy podle vynálezu odborníci pro peci o zdraví mohou ry ch le stanovit, zda darovaná krev neobsahuje klinicky závažné množství kontaminujících baktérií. Jakmile se takové stanovení provede a zjistí se, Že krev nebo krevní produkt neobsahuje klinicky závažné množství kontaminujících baktérií, krev nebo krevní produkt se může transfundovat přijímajícímu pacientovi.

5u V přednostním provedeních čtvrtého aspektu vynálezu vazebné látky, které se spec i Pícky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních se vazebné látky, které se specificky vážou na gram negativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Limulus antilipopolysacharidový faktor (LAPF). protein vázající lipopolysacharidy (LBP). baktericidní/permeabilitu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako

CZ 300108 Bó jc například polymixin nebo baeitracin. Přednostně vazebné látky, které se specificky vážou na grarnnegativní bakteriální antigen. se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu granv negativních baktérií. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou

11a grampozitivní bakteriální antigen, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specí5 fieky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotíkem není vankomycin ani gentamycin. Vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, se přednostně specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních baktérií.

V různých provedeních čtvrtého aspektu předloženého vynálezu vazebné látky, které se specificky vážou na grarnnegativní bakteriální antigen, jsou detekovatelně značeny první reportérovou molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. jsou detekovatelně značeny druhou reportérovou molekulou. V jednom, provedení jsou první reporterová molekula a druhá reportérova molekula stejné. V jiném provedení první reportérova molekula a druhá reporterová molekula nejsou stejné. Přednostně první reporterová molekula nebo druhá reporterová molekula nebo obě jsou molekulou s enzymatickou aktivitou, částicí (například částicí sólu zlata nebo latexovou částicí), molekulou značenou radioaktivním izotopem, tužní molekulou, fluorogenní molekulou, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou. Takové detekovatelně značené vazebné látky soupravy podle vynálezu jsou popsány výše. Je samozřejmé, že když reportérovou molekulou detekovatelně označující vazebnou látku jc molekula s enzymatickou aktivitou, substrát pro tento enzym je rovněž začleněn do soupravy podle vynálezu.

V přednostním provedení čtvrtého aspektu vynálezu jc sada vazebných látek imobilizována na pevném nosiči (například na mikrotitracní plotně).

V pátém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem jc člověk nebo zdomácnělý savec.

V šestém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramncgativních baktérií v darované krvi nebo v darovaném krevním produktu od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu, přičemž navázána je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gram negativ nich baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu a Žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativníeh baktérií v darované krvi nebo v krevním produktu. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem je člověk nebo zdomácnělý savec.

5o Podle pátého a šestého aspektu vynálezu výrazy „prostředky pro navázán i, „navázání, „antigen“, „krev nebo krevní produkt, „grampozitivní baktérie, „grarnnegativní baktérie, „klinicky závažné množství, „specificky se váže a „vazebná látka jsou definovány výše.

V přednostních provedeních pátého a šestého aspektu předloženého vynálezu dále souprava

5? obsahuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro

- 22 CZ 300108 B6 vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu. „Prostředky pro zpracování jsou definovány ve čtvrtém aspektu vynálezu.

Jakékoliv soupravy podle čtvrtého, pátého a šestého aspektu vynálezu se mohou používat ve stejné dobč jako srovnání ABO. srovnání Rh a/nebo srovnání MHC darované krve nebo krevního produktu a určeného příjemce. Přednostně se darovaná krev nebo krevní produkt bez klinicky závažného i množství baktérií podává ve formě transfuze pacientovi ne později než 42 dnů po začátku testování, více přednostně ne později než 30 dnů po testování, více přednostně ne později než 2 týdny po testování, více přednostně ne později než 7 dní po testování, ještě více přednostně ne později než 3 dny po testování a ještě více přednostně ne později než 2 dny po testování, ještě více přednostně ne později než 24 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 12 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 6 hodin po testování a nejvíce přednostně se darovaná krev nebo krevní produkt se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií předává transfuzí příjemci za 3 hodiny od začátku testování. Nejvíce přednostně je krv í nebo krevním produktem plná krev, hematopoietické kmenové butiky leukocyty, krevní destičky, červené krvinky, plazma nebo sérum.

Vynález poskytuje rovněž způsoby a soupravy pro vyšetření přítomnosti jakýchkoliv kontaminujíc íeh baktérií v darované tkáni nebo orgánu před transplantací darované tkáně nebo orgánu savčímu příjemci, který je přednostně stejného druhů jako dárce. Darované tkáně a orgány se rutinně skladují, i když krátce v tekutině, jako je například fyziologický roztok nebo skladovací živný roztok. Přítomnost baktérií ve skladovací tekutině indikuje přítomnost kontaminujících baktérií ve tkáni. Takové kontaminující bakterie mohou urychlovat rejekci transplantované tkáně nebo orgánu savčím příjemcem. Proto v sedmém aspektu vynález poskytuje způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií ve tkáni ze savec, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující kontakt vzorku tekutiny se sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen a vazebné látky, kterc se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen. a stanovení navázaní sady vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií ve tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií ve tkáni, Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem je člověk nebo zdomácnělý savec.

Podle sedmého aspektu vynálezu výrazy „navázání, „antigen. „grampozitivní baktérie, ..gramnegativní baktérie, „klinicky závažné množství, „specificky se váže a „vazebná látka jsou definovány výše.

Výraz „tkán znamená jakoukoliv tkáň nebo orgán těla. Příklady tkání podle vynálezu bez. omezení zahrnují ledvinu, játra, kůži. kostní dřeň, slezinu, brzlík, pankreas, tračník a neurologickou tkáň.

V jistých provedeních sedmého aspektu předloženého vynálezu se vzorek zpracovává před nebo současně se stykem vzorku se sadou vazebných látek. V jistých provedeních toto zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu. Způsoby zpracování, které odhalují vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenu nebo na grampozitivním bakteriálním antigenu. jsou popsány v prvním aspektu vynálezu. V jistých provedeních sedmého aspektu darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se předává savčímu příjemci. Přednostně savčí dárce, od kterého se tkáň získala, a savci příjemce jsou stejného druhu. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, zahrnují molekulu zvolenou ze souboru zahrnujícího Zňm//zo-anlilipopolvsacharidový faktor (LALF), protein vázající lipopolysacharidy (LBP), bakterie idní/permeabi litu zvyšující protein (BPI) a antibiotikum, jako jc

-23 C7. 300108 Bó například polymixin nebo bacitracin. Přednostně vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních baktérií. V jistých přednostních provedeních vazebné látky, které sc specificky vážou na grampozitívni bakterie nebo na jejich antigen. zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek.

které se specificky vážou na grampozitívni bakterie nebo na jejich antigen. V jistých provedeních vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitívni bakterie nebo na jejich antigen. zahrnují antibiotikum, přičemž tímto antibiotikem není vankomycin ani gentamycin. Přednostně vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitívni bakteriální antigen, se specificky vážou na strukturu lipotcchoové kyseliny grarnpozitivních baktérií.

11.1

V různých provedeních sedmého aspektu předloženého vynálezu vazebně látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. jsou detckovatelné značeny první reportérovou molekulou, a vazebné látky; které sc specificky vážou na grampozitívni bakteriální antigen, jsou detekovalclnč značeny druhou reportérovou molekulou, V jistých provedeních jsou i? první reportérova molekula a druhá reportérova molekula stejné. V jiném provedení první reporterová molekula a druhá reportérova molekula nejsou stejné. Přednostně první reportérova molekula nebo druhá reporterová molekula nebo obé jsou molekulou s enzymatickou aktivitou, molekulou značenou radioaktivním izotopem, fúzní molekulou, fluorogenní molekulou, sólem kovu, částicí, chromatickou molekulou nebo molekulou, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.

V jistém přednostním provedení sedmého aspektu vynálezu je sada vazebných látek mobilizována na pevném nosiči (například na mikrotitrační plotně).

V osmém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grarnpozitivních baktérií v darované tkání ze savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň jc skladována v tekutině, zahrnující kontakt vzorku tekutiny sc sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky; které se specificky vážou na grampozitívni bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady vazebných látek tu ke vzorku, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivílích baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grarnpozitivních baktérií v darované tkáni. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím pří jemcem je člověk nebo zdomácnělý savec.

V devátém aspektu poskytuje předložený vynález způsob vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkání od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato darovaná tkáň je skladována v tekutině, zahrnující kontakt vzorku této tekutiny sc sadou vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen, a stanovení navázaní sady

4o vazebných látek ke vzorku, přičemž navázání jc důkazem přítomnost klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativních baktérií v darované tkáni. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem je člověk nebo zdomácnělý savec,

4? Podle osmého a devátého aspektu vynálezu výrazy „navázání, „antigen, „tkáň, „grampozitívni baktérie“, „gramnegativní baktérie, „klinicky závažné množství“, „specificky se váže a „vazebná látka“ jsou definovány výše. Přednostně jakýkoliv ze způsobu podle sedmého, osmého a devátého aspektu vynálezu se provádí, když sc tkáň testuje pro srovnání ΛΒΟ, srovnání Rh a/nebo srovnání MHC s určeným příjemcem.

V jistých provedeních osmého a devátého aspektu předloženého vynálezu sc vzorek před nebo současné se stykem vzorku se sadou vazebných látek zpracovává. Způsoby zpracování vzorku pro odhalování vazebného místa pro vazebnou látku na grampozitivnim bakteriálním antigenu nebo gramnegativním bakteriálním antigenu jsou stejné, jako jsou popsány pro první aspekt vynálezu.

-24CZ 300108 Bó

V jistých provedeních osmého a devátého aspektu vynálezu se darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství grampozitivních baktérií nebo se stanuveuou nepřítomností klinicky závažného množství gramnegativníeh baktérií předává savčímu příjemci.

Přednostně savčí dárce, od kterého se tkáň získala, a savci příjemce jsou stejného druhu.

V desátém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované lkáni od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gram negativní bakteriální antigen, a vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v darované tkáni a žádné navázaní je důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství bakterií v darované lkáni. Přednostně savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem je člověk nebo zdomácnělý savec.

V jedenáctém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni od savčího dárce pro předání savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek.

2n přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které sc specificky vážou na grampozitivní bakteriální antigen, a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni a žádné navázání jc důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií v darované tkáni. Přednostně je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

Vc dvanáctém aspektu poskytuje předložený vynález soupravu pro vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství gramnegativníeh baktérií v darované tkáni ze savčího dárce pro předaní savčímu příjemci, přičemž tato tkáň je skladována v tekutině, zahrnující sadu vazebných látek, su přičemž tato sada vazebných látek obsahuje vazebné látky, které se specificky vážou na gramnegativní bakteriální antigen. a prostředky pro detekci navázaní sady vazebných látek ke vzorku tekutiny, přičemž navázání je důkazem přítomnosti klinicky závažného množství gram negativních baktérií v darované tkáni a žádné navázaní jc důkazem nepřítomnosti klinicky závažného množství gramnegativníeh baktérií v darované tkání. Přednostně je savčím dárcem a/nebo savčím příjemcem člověk nebo zdomácnělý savec.

Podle desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu vynálezu výrazy „prostředky pro navázání, „navázání, „antigen. „tkáň, „grampozitivní baktérie, „gramnegatívní baktérie, „klinicky závažné množství, „specificky se váže a „vazebná látka jsou definovány výše, V přednostních provedeních jedenáctého a dvanáctého aspektu vynálezu souprava dále zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenů nebo na grampozitivním bakteriálním antigenů.

V jistých provedeních desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu vynálezu souprava dále zahrnuje prostředky pro zpracování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativním bakteriálním antigenů nebo na grampozitivním bakteriálním antigenů. Prostředky pro zpracování jsou popsány pro čtvrtý aspekt vynálezu. V různých provedeních darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství baktérií se přenáší do savčího příjemce. Přednostně savčí dárce, od kterého se tkáň získala, a savčí příjemce jsou stejného druhu.

Přednostně se souprava podle vynálezu umísťuje na místě (jako je například nemocnice), kde bude přijímajícímu pacientovi předávána darovaná tkáň, například transplantací nebo transfuzí.

Za použití soupravy podle vynálezu odborníci pro péči o zdraví mohou rychle stanovit, zda darovaná tkáň neobsahuje klinicky závažné množství kontaminujících baktérií. Jakmile sc takové

-25C'Z 300108 B6 stanovení provede a zjistí se. že darovaná tkán neobsahuje klinicky závažné množství kontaminujících baktérií, darovaná tkáň se transplantuje přijímajícímu pacientovi.

Jakékoliv soupravy podle desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu vynálezu se mohou používat současně jako srovnání ABO. srovnání Rh a/nebo srovnání MHC darované tkáně a určeného příjemce. Přednostně se darovaná tkáň vyšetřuje za použití způsobu a souprav podle sedmého, osmého, devátého, desátého, jedenáctého a dvanáctého aspektu vynálezu relativně krátkou dobu před transplantací tkáně. Přednostně se darovaná tkáň transplantuje pacientovi ne později než 42 dnů po začátku testování, více přednostně ne později než 30 dnů po testováni, více io přednostně ne později než 2 týdny po testování, více přednostně ne později než 7 dní po testování, ještě více přednostně ne později než 3 dny po testování a ještě více přednostně ne později než 2 dny po testování, ještě více přednostně ne později než 24 hodin po testování, ještě více přednostně nc později než 12 hodin po testování, ještě více přednostně ne později než 6 hodin po testování a nejvíce přednostně se darovaná tkáň se stanovenou nepřítomnosti klinicky závažného množství baktérií transplantuje příjemci za 3 hodiny od začátku testování.

V následujících příkladech popisuje nevyčerpávajíeí počet možných ímunoanalýz. které při použití v spojitostí s LTA nebo l.PS specifickou vázající látkou mohou vytvářet celou všeobecnou analýzu pro skupinovou mikrobiální detekci. Tedy následující příklady jsou určeny pro další

2o ilustraci jistých obzvláště přednostních provedení vynálezu a nejsou určeny pro omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Způsob detekce baktérií podle vynálezu se může provádět pomocí konvenční imunoanalýzy s využitím částic. V tomto smyslu se vazebné látky, které se specificky vážou na antigenní oblast so na bakteriální buněčné stěně, mohou použít jako imunologické terče a mohou vytvářet základ pro detekci baktérií v krevních produktech. Schéma zařízení použitého v tomto příkladu je znázorněno na obrázcích 3A až 3D. V jednom provedení se vazebné látky, které se specificky vážou na grampozitivní baktérie, gramnegativní baktérie nebo na grampozitivní baktérie i na gramnegativní baktérie, se shromáždí navzájem a potom se rozdělí tak, aby každá z těchto dvou populací vazebných látek obsahovala smčs vazebných látek. Jedna populace se váže na membránu u základny zařízení znázorněného na obrázcích 3A až 3D. Druhá populace se používá na potažení jasně zabarvených latexových částic (tj. latexové častíce potažené vazebnými látkami byly impregnovány barvivém tak. aby byly intenzivně zbarveny.) m V jiném provedení stejná vazebná látka (tj. všechny molekuly vazebné látky specificky rozeznávají stejný antigenní epitop) jsou rozděleny do dvou populací. Jedna populace se zase váže na membránu u základny zařízení znázorněného na obrázcích 3A až 3D a druhá populace se využívá na potažení jasně zabarvených latexových částic. Mohla by se využít stejná vazebná látka (tj. molekuly, které se specificky vážou na stejný epitop), protože na bakteriálním povrchu jsou přítomna vícenásobná rozpoznávací místa.

Perličky potažené vazebnou látkou se umístí do zařízení tak. aby se nevázaly na membránu.

Při použití zařízení znázorněného na obrázcích 3Λ až 3D pro detekci přítomnosti klinicky >0 závažného množství baktérií v krvi nebo v krevním produktu se provádějí následující stupně.

Nejdříve se za sterilních podmínek extrahuje z darované krve nebo z darovaného krevního produktu vzorek. Alternativně se vzorek může extrahovat z tekutiny, ve které se skladuje darovaný orgán nebo tkáň (například ze živné skladovací tekutiny, ve které se skladuje darovaná ledvina).

-26CZ 300108 B6

Dále se vhodný objem vzorku aplikuje na testovací zařízení, jakje znázorněno na obrázcích 3A až 3D, Vzorek se může testovat přímo (tj. nezředčný nebo nezpracovaný) nebo se muže zředit pufrovacimAxtrakěním činidlem nebo se může zpracovat fyzikálními nebo chemickými prostředky. čímž se vystavuje pro zpracování vazebné místo pro vazebnou látku na baktériích (nebo jejích antigenu) přítomných ve vzorku. Například výsledkem zpracování muže být protržení bakteriální buněčné stěny. V jiném příkladu může být výsledkem zpracování antigen odštěpený z buněčné stěny, a tím odhalení vazebného místa na antigenu.

Vzorek prochází předem určenou dráhou v zařízení způsobenou tamponováním absorpční io membrány. Baktérie přítomné ve vzorku se vážou na latexové částice značené vazebnou látkou.

Vzorek se smíchá s latexovými částicemi značenými vazebnou látkou a migruje podél absorpčního tampónu k předem definované oblasti, kde byly imobilizovány antibakteriální protilátky. Imobilizované vazebné látky zachytí komplexy zbarvených latexových perliček potažených baktériemi-antibaktériemi a barevná skvrna indikuje pozitivní výsledek.

Příklad II

2i) V jiném provedení způsobu popsaného v příkladu 1 jsou vazebnými látkami navázanými na latexu vazebné látky, které specificky rozpoznávají gramnegativní baktérie nebo grampozitivní baktérie nebo oba druhy baktérií. Avšak každá z těchto antibakteriálních vazebných látek má epitop, který je společný pro všechny vazebné látky. V tomto příkladu jsou všechny antibakteriální vazebné látky myšími protilátkami. Vazebné látky navázané na membráně se nevážou specificky na baktérie, spíše specificky vážou na myší determinanty na konstantních oblastech myších antibakteriálních protilátek. Tyto antimyší vazebné látky se nazývají sekundární vazebné látky, protože se nevážou specificky na baktérie, ale spíše sc specificky vážou na vazebnou látku, která je specificky navázána na baktériích.

Příklad lil

Dalším způsobem detekce klinicky závažného množství baktérií v krvi, krevním produktu nebo v tekutině z darované tkáně je aglutinaění zkouška. V tomto příkladu aglutinaění zkoušky se využívají latexové částice potažené vazebnými látkami, které sc specificky vážou na bakteriální druhy. Tyto latexové částice aglutinují v přítomnosti klinicky závažného množství bakteriálních druhů. Pozitivní reakce se ukazuje vývojem aglutinovaného obrazce. Při negativní reakci se latex neaglutinuje a mléčný vzhled zůstává v podstatě nezměněn.

4o V tomto způsobu se využívá zařízení, které je znázorněno na obrázcích 4Aaž4D. Vzorek extrahovaný za sterilních podmínek z darované krve nebo krevního produktu se aplikuje na testovací zařízení. Alternativně se vzorek může extrahovat z tekutiny, ve které se skladuje darovaný orgán nebo tkáň. Vzorek se muže testovat přímo (tj. nezředčný nebo nezpracovaný), zředěný pufrovacím/extrakěnim činidlem nebo zpracovaný tak, aby se tímto zpracováním odhalilo vazebné místo pro vazebnou látkou na kterýchkoliv baktériích (nebo jejich antigenu) přítomných ve vzorku. Dále se k biologickému vzorku v testovacím zařízení přidají latexové perličky potažené vazebnými látkami, které se specificky vážou na baktérie. Obsah se míchá kvůli dosažení homogenity složek.

5(i Baktérie v biologickém vzorku se budou specificky vázat na antibakteriální protilátky na latexových perličkách. Následkem vícenásobných antigenu ích míst na bakteriálním povrchu vytvářejí latexové částice potažené protilátkami můstek mezi sousedními bakteriálními buňkami. V přítomnosti klinicky závažného množství bakteriálních buněk v biologickém vzorku se vytváří zesílená matrice. Vedle předem definovaného klinicky závažného množství baktérií ve vzorku (který je definován výše) roste matrice až do zviditelněni jako „aglutinaění obrazec ve zkušební

-27CZ 300108 Bó jamce. Po předem určené době pro umožnění rustu takové matrice se výsledky vizuálně odčítají, přítomnost bakteriálního antigenu ukazuje vytvoření charakteristického obrazce znázorněného na obrázku 4D.

Příklad IV

Ještě dalším způsobem detekce přítomnosti klinicky závažného množství bakterií v krvi nebo v krevním produktu využívá standardní formu enzymových imunoadsorbcntových analýz m (ELISA) (enzyme Iinked immunosorbant assays). Mikrotitrační (tj. 96-jamková) plotna pro

EI4SA využívá četné oddělené reakční jamky, přičemž každá představuje jedinečné testovací prostředí. Mikrotitrační plotny poskytují vyšší přechodnou testovací kapacitu, aplikaci automatického ovládání vzorku, přidávání činidla, detekce reakce a kvantitativní vyhodnocení výsledků. Vývoj ELISA s mikrotitračními plotnami je dohře znám a využíván. Pro detekci iš rozsáhlých druhu s velkou molekulovou hmotností a s vícenásobnými vazebnými místy jako bakteriálními povrchovými antigeny je přednostní sendvičová imunoanalýza. Sendvičové imunoanalýzy spočívají na pasivním nebo kovalentním umístění vazebné látky, která se specificky váže na gramnegativní nebo grampozitivní baktérie (nebo na oba druhy baktérií) na polystyrénovém povrchu (nebo na jiném materiálu) jamky mikrotitrační plotny tak. žc se vazebná látka zachytí na povrchu jamky mikrotitrační plotny. Imunologická detekce se provádí následujícím způsobem.

Nejdříve se vzorek extrahuje za sterilních podmínek z darované krve nebo darovaného krevního produktu nebo z tekutiny, ve které je skladován darovaný orgán nebo tkáň. Vzorek se může zředit nebo se nemusí zředit nebo se může zpracovat tak, aby toto zpracování odhalilo vazebné místo pro vazebnou látku na jakýchkoliv baktériích (nebo jejich antigenu) nacházejících se ve vzorku.

Do testovací jamky se aplikuje vhodný objem vzorku. Baktérie přítomné v biologickém vzorku budou vytvářet specifický komplex s povrchové vázanými antibakteriálními vazebnými látkami na povrchu jamky mikrotitrační plotny. Dále se z jamky odstraňuje (nebo vysypává) nevázaný vzorek v jamce. Do jamky se přidá specificky připravený promývací roztok pro vymytí so nespecificky vázaných baktérií (a jiných složek vzorku) z povrchu jamky mikrotitrační ploty.

Dále se do reakční jamky přidá roztok obsahující vazebnou látku detekovatelně značenou reportérovou molekulou. Detekovatelně značená vazebná látka v tomto roztoku se specificky váže na antigen, který definuje typ baktérií přítomných v biologickém vzorku, a může být odlišná nebo stejná jako povrchově vázaná vazebná látka. Detekovatelně značená vazebná látka se chemicky váže s reportérovou molekulou (s reportérovou molekulou s enzymatickou aktivitou, v specifickém případě z ELISA), která se používá pro důkaz nepřítomnosti nebo přítomnosti baktérii ve vzorku. Je potřebné poznamenat, že reportérova molekula může být tvořena rozličnými typy a je zvolena pro minimalizaci interference s reakcí navázání protilátky. Enzymy jo se využívají především v enzymových imunoadsorbentových analýzách (ELISA), ale mohou se použít rovněž jinc reportérové molekuly; bez omezení například chromofory, fluorofory. radioizotopy, ehemi luminiscenční sloučeniny; elektrochemicky aktivní sloučeniny, kovy; částice, magnetické systémy a sekundární značení, jako jc například biotin/avidin nebo jiné podobné typy; Detekovatelně značená vazebná látka, která je výsledkem chemické vazby specifické vazebné látky s reportérovou molekulou, se nechá vytvořit komplex s komplexem antibakteriální vazebná látka/baktéric za vytvoření „sendviče“ antibakteriální vazebná látka/baktérie/antibakteriálηí detekovatelně značená vazebná látka.

Po vhodné době se roztok detekovatelně značené vazebné látky odstraní z jamky. Jamka se su potom může vymýt specificky připraveným promývaeím roztokem pro oddělení navázaného konjugátu od nenavázaného konjugátu v jamce mikrotitrační plotny:

Specificky vázaná detekovatelně značená vazebná látka v jamce mikrotitrační ploty se může detektovat vhodnými prostředky. Tyto zahrnují přímé měření v případě fluoroforií, chromoforů.

chemiluminiscenčních sloučenin, elektroaklivních látek a nepřímé měření v případě značení, jako

-28CZ 300108 Bó jsou například enzymy. Počet specificky vázaných detekovatelné značených vazebných látek je přímo úměrný množství baktérií přítomných v biologickém vzorku, lato přímá úměrnost jc základem metodologie pro stanovení množství, která se muže použít pro specifické stanovení množství baktérií přítomných ve vzorku. Standardní reakění křivka se muže stanovit měřením reakce specificky navázané detekovatelné značené vazebné látky jako funkce známého množství baktérií přítomných v kalibrovaných vzorcích. Interpolace výsledků ze standardní reakční křivky popisuje koncentraci baktérií v neznámém biologickém vzorku.

io Příklad V

Přídavným způsobem vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství bakterií v krvi, krevním produktu nebo v tekutině, ve které sc darovaná tkán skladuje, využívá kompetitivní imunoanalýzu. Pro detekcí druhů s malou molekulovou hmotností s jednoduchými vazebnými místy, is jako jsou například sekretované lipopolysacharidové struktury z gramnegalivních baktérií je samozřejmě přednostní kompetitivní imunoanalýza. Kompetitivní imunoanalýzy jsou založeny na pasivním nebo kovalentním umístění vazebné látky, která se specificky váže na sekretovanou

LPS strukturu (jako je například navázání na část lipidu A LPS struktury ) na polystyrénovém povrchu (nebo na jiném materiálu) jamky mikrotitrační plotny tak, že sc vazebná látka zachytí na

i) pov rc h u j am ky m i krot itrač η ί p 1 otnv,

V jednom příkladu kompetitivní imunoanalýzy pro detekci přítomnosti klinicky závažného množství gramnegat i vn ích baktérií se imunologická detekce se provádí následujícím způsobem. Nejdříve se vzorek extrahuje za sterilních podmínek z darované krve nebo darovaného krevního produktu nebo z tekutiny, ve které je skladován darovaný orgán nebo tkáň. Vzorek se může zředit nebo se nemusí zředit nebo se může zpracovat tak, aby toto zpracování odhalilo vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegat i vn ích baktériích, (nebo jejich antigenu), jako je například vazebné místo na složce lipidu A struktury' LPS. Do testovací jamky, která obsahuje vazebnou látku, která se specificky váže na LPS, se aplikuje vhodný objem vzorku. Do testovací jamky se současně nebo postupně přidá vhodný objem roztoku obsahujícího detekovatelné značenou molekulu LPS. Detekovatelné značená molekula LPS v tomto roztoku se specificky váže na vazebnou látku v testovací jamce. Detekovatelné značená molekula LPS se chemicky váže s reportérovou molekulou (jako je například oznamující molekula s enzymatickou aktivitou, v specifickém případě z ELISA), která se používá pro důkaz nepřítomnosti nebo přítomnosti baktérií ve vzorku. Je potřebné poznamenat, že reportérova molekula může být tvořena rozličnými typy a je zvolena pro minimalizaci interference s reakcí navázání protilátky. Enzymy se využívají především v enzymových imunoadsorbcntových analýzách (ELISA), ale mohou se použít rovněž jiné reportérové molekuly, bez omezení například chroinofory. fluorofory. radioizotopy, chemiluniinisccncní sloučeniny, elektrochemicky aktivní sloučeniny, kovy, částice, magnetické složky a sekundární značení, jako je například biotin/avidin nebo jíně podobné typy. Detekovatelné značená molekula EPS se nechá vytvořit komplex s imobilizovanou vazebnou látkou v přítomnosti EPS pocházejícího z buněčné stěny za ustálení vazebné rovnováhy. Přednostně je testovací jamkou jamka mikrotitrační plotny.

Po vhodné době se roztok detekovatelné značené molekuly LPS/LPS pocházejícího z kontaminující bakteriální buňky odstraní z testovací jamky. Jamka se potom může vymýt specificky připraveným promývacím roztokem pro oddělení navázaného konjugátu od nenavázaného konjugátu v jamce mikrotitrační plotny. Vazebná rovnováha ustálená v testovací jamce je funkcí koncentrace LPS pocházejícího z buňky. V nepřítomnosti jakéhokoliv kontaminujícího klinicky

5o závažného množství gramnegalivních baktérií vc vzorku, a tedy žádného LPS pocházejícího / bakteriální buňky se detekovatelné značená molekula LPS komplexně váže na povrchově vázanou vazebnou látku. Při zvýšených hladinách baktérií, a tedy při zvýšených hladinách LPS pocházejícího z kontaminujících bakteriálních buněk se vazba s povrchově vázanou vazebnou látkou rozdělí mezi tyto dva druhy LPS podle koncentrace. Při nízkých hladinách LPS poehá55 zejícího z kontaminujících bakteriálních buněk se větší část vazebných míst vazebné látky

-29CZ 300108 B6 komplexně váže s detekovatelně značenou molekulou LPS a pozoruje se zvýšená hladina oznamujícího signálu. Při vysokých hladinách LPS pocházejícího z bakteriálních buněk se větší část vazebných míst vazebné látky komplexně váže s LPS pocházejícím / bakteriálních buněk a pozoruje se snížená hladina oznamujícího signálu. Tedy počet specificky vázaných detekovatelně značených molekul LPS je nepřímo úměrný k množství kontaminujících gramnegativních baktérii přítomných v biologickém vzorku. Standardní reakční křivka se může stanovit měřením reakce detekovatelně značené molekuly LPS jako funkce známého množství baktérií přítomných v kalibrovaných vzorcích. Interpolace výsledků ze standardní reakční křivky popisuje koncentraci gramnegativních baktérií v neznámém biologickém vzorku.

Příklad VI

Ještě další způsob detekce přítomnosti klinicky závažného množství baktérií v krvi nebo v krev15 nim produktu využívá homogenní imunoanalýzu. Homogenní imunoanalýzy jsou charakterizovány schopností současného měření vázaných a volných složek komplexotvorné reakce vazebné složky s ligandem. Vlastnosti značení se modifikují na základě vázání komplementárního reaktantu. takže separace vázaných složek od nevázaných není potřebná,

Nejdříve se extrahuje vzorek za sterilních podmínek z darované krve nebo darovaného krevního produktu nebo z tekutiny, ve které je skladován darovaný orgán nebo tkáň. Vhodný objem testovacího vzorku se smíchá s předběžné zpracovaným činidlem tak, aby se vytvořily malé fragmenty struktury buněčné stěny. Takové činidlo může zahrnovat (ale bez omezení) povrchové aktivní látky, chclatonv a enzymy pro degradaci přirozené antigenní struktury na složky s nižší molekulovou hmotností. Přídavně se může využít mechanická fragmentace (jako je například sonikace) nebo kinetická energie (jako je například var) pro rozbití buněčné stěny na její nižší složky. V tomto případě zpracování odhalí vazebné místo pro vazebnou látku na gramnegativních baktériích nebo jejich antigenu za odstranění a degradace lipopolysacharidové struktury v gramnegativních baktériích na jejich lipidové A jednotky nebo jádrové jednotky.

Vzorek fragmentů degradovaných buněčných stěn se smíchá s činidlem obsahujícím lipidový A (nebo jádrový) antigen, který sc chemicky vázal s fluorescenční značkou. K reakční směsi se přidá známé množství anti lipidové A (nebo anti jádrové) vazebné látky. Antigeny, které se vážou s vazebnou látkou, budou ukazovat sníženou hladinu molekulární rotace, zatímco neváza35 né budou ukazovat poměrně zvýšenou hladinu rotace. V poli polarizovaného světla bude polarizované světlo přednostně excitovat ty molekuly, které jsou paralelní s rovinou dopadajícího světla. Orientace emisních druhů bude determinovat stupeň polarizace emitovaného světla. Jestliže molekulární pozice emisních druhu je poměrně stabilní, fluorescence bude částečně polarizována. Jestliže molekuly jsou ve stavu rychlé oscilace místo toho, aby byly fixovány, moleku40 lámí pohyb bude snižovat stupeň polarizace. Fluorescenční světlo emitované z reaktantové směsi lipidového A (nebo jádrového) antigenu z fragmentů buněčné stěny z jakýchkoliv kontaminujících gramnegativních baktérií přítomných ve vzorku, fluorescenčně značeného lipidu A (nebo jádra) a vazebné látky bude projevovat vysoký stupeň polarizace světla při nízkých hladinách lipidu A (nebo jádra) z fragmentů buněčné stěny (tj. při nízkých hladinách kontaminace bakté45 riemi vc vzorku) a nízký stupeň polarizace světla při vysokých hladinách lipidu A (nebo jádra) z fragmentů buněčné stěny (tj. při vysokých hladinách kontaminace gramnegativními baktériemi vc vzorku) ve srovnání s vazebnou látkou plus fluorescenčně značeným lipidem A (nebo jádrem) bez jakéhokoliv vzorku. Reakce odlišných hladin polarizace světla jako funkce lipidu A (nebo jádra) z fragmentů buněčné stěny se může využít jako základ vazebné zkoušky pro stanovení neznámých koncentrací lipidu A (nebo jádra) a konečně pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti gramnegativních baktérii ve vzorku.

Výše uvedená detekční technika s využitím protilátky jako vazebné látky, je v oboru známa jako fluorescenční polarizační imunoanalýza, příbuzné techniky zahrnují fluorescenční zhášecí imuno55 analýzu, fluoroimunoanalýzu s časovým rozlišením, imunoanalýzu s potencovanou fluorescenci,

-30CZ 300108 Bó fluorescenční imunoanalýzu s excitačním přenosem a imunoanalýzu s uvolněním fluoroforu. Pro detekci menších fragmentů složek bakteriální buněčné stěny (a tedy pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti bakteriální kontaminace) se může jako alternativní huniogenní imunoanalýza alternativně použít modulace enzymatické aktivity jako funkce komplexotvomé reakce vazebné látky. Každá z těchto metod je dobře dokumentována a dobře známa u odborníků v tomto oboru.

Příklad Vil io Modifikace způsobu popsaného v příkladu VI bude sloužit k vyšetření přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních baktérií ve vzorku z darované krve, darovaného krevního produktu a/nebo tekutiny; ve které se darovaná tkán skladuje. V tomto příkladu se vzorek extrahuje za sterilních podmínek z darované krve. darovaného krevního produktu a/nebo tekutiny; ve které se darovaná tkáň skladuje. Vhodný objem testovaného vzorku se smíchá s předem is zpracovaným činidlem tak, aby se vytvořily malé fragmenty struktury buněčné stěny; Tímto zpracováním, jehož výsledkem je odhalení vazebného místa pro vazebnou látku na grampozitivních baktériích (nebo na jejich antigenů), muže být zpracování chemikálií, jako je například povrchové aktivní látka, chelaton a/ncbo enzym pro degradaci přirozené antigenní struktury na složky s nižší molekulovou hmotností. Zpracování se může provést rovněž mechanickými pro20 středky za použití mechanické fragmentace (jako je například sonikace) nebo kinetické energie Jako je například var) pro rozbití buněčné stěny na její nižší složky; a tím pro odhalení vazebného místa pro vazebnou látku na antigenní složce struktury LTA. Specifickým příkladem může být izolace poly(glycerofosforečnanového) řetězce ze struktur lipotechoové kyseliny; Odborníci v tomto oboru mohou snadno předpokládat jiné struktury stěny grampozitivní buňky.

Dále se vzorek fragmentů degradovaných buněčných stěn smíchá s činidlem obsahujícím poly(glycerofosforeěnanový) antigen, který se chemicky vázal s enzymovým značením za účelem vytvoření enzymového konjugátu. Konjugace s enzymem se provede tak. aby se pří vytváření komplexu s vazebnou látkou modulovala enzymatická aktivita konjugátu. Prostřednictvím maskování aktivního místa nebo modifikacemi konformacc na enzymu se snižuje enzymatická aktivita, když vazebná látka vytváří komplex s enzymovým konjugátem, a enzymatická aktivita se obnovuje, když vazebná látka nevytváří komplex s enzymovým konjugátem. Tato modulace enzymatické aktivity je základem běžně používané homogenní analýzy.

?>5 Dále se přidá známé množství anti-poly(glycerofosforečnanové) vazebné látky k reakční směsi, která obsahuje stálé množství vazebné látky a enzymového konjugátu. Potom sc přidá známý objem krve (nebo krevního produktu nebo tekutiny z tkáně) zpracované za účelem degradace složek bakteriální buněčné stěny. Pokud nejsou v krvi, krevním produktu nebo v tekutině ze vzorku darované tkáně přítomné žádné baktérie, potom dostupná vazebná místa na vazebné látce mohou vytvářet komplexy s enzymovým konjugátem. Enzymový konjugál bude ukazovat sníženou úroveň enzymatické aktivity ve vázaném stavu a konverze substrátu bude minimální. Při vysokých hladinách antigenů pocházejícího z buněčné stěny z vysoké hladiny kontaminujících grampozitivních baktérií přítomných ve vzorku bude většina vazebných míst na vazebné látce obsazena přirozeným antigenem buněčné stěny (jakoje například poly(glycerofosforeěnan)), a tím se umožní, aby enzymový konjugál existoval ve stavu bez vytvoření komplexu. V tomto stavu bez vytvoření komplexu se enzymatická aktivita obnovuje a pozorují se zvýšené hladiny konverze substrátu,

Mírná modifikace postupu zahrnuje použití enzymových fragmentů, přičemž jeden z nich je zna5o cen antigenním fragmentem. V přítomnosti vazebné látky je enzymový fragment nedostupný pro vytváření komplexu s potřebným přídavným fragmentem pro vytvoření úplného funkčního enzymu. Když vazebná látka vytváří komplex s antigenem pocházejícím z buněčné stěny kontaminujících grampozitivních baktérií přítomných ve vzorku, je nedosažitelné vytváření komplexu s enzymovými fragmenty; a tím umožnění, aby se slučovaly a vytvářely aktivní enzym.

-31 C'7. 300108 B6

Modifikace těchto postupů jsou dobře známy pro odborníky v tomto oboru jako vazebné analýzy s enzvmovou modulací.

s Příklad Vlil

Modifikace analýz popsaných v příkladech IV, V. VI a VII zahrnují využití automatického analytického zařízení pro provádění analýz a výpočet výsledků. Automatizace umožňuje aplikaci technologie více reprodukovalelným způsobenu a tím umožnění zlepšené provádění analýz a id detekci snížené úrovně bakteriální kontaminace. Komerčně dostupných je mnoho komplexních systémů pro imunoanalýzu a používají se pro rutinní Ímunodiagnostické testování v nemocničních ústředních laboratořích. Může se snadno předpokládat, žc aplikace výše uvedené technologie sc může začlenit do kteréhokoliv z těchto automatických systémů. V rámci tohoto vynálezu se může rovněž předpokládat použití alternativních separaěních technologií (tuhá fáze. kapalná fáze, magnetické částice, rozdělení na základě elektrického náboje atd.). Podobně se mohou předpokládat alternativní detekční metodologie (například chromogenní, fluorogenní, elektrochemické, ehemiluminiseenční nebo radiometrické) předpokládanými modifikacemi detekční metody na bázi systémů s detekovatelně značenými vazebnými látkami a rovněž odpovídající změny detekčního systému automatického zařízení pro imunoanalýzu.

2()

Příklad IX

Obecná druhová specifita dvou reprezentativních, neomezujících vazebných látek podle vynálezu byla vyhodnocena sondováním povrchové antigenní struktury grampozitivních a gram negativních baktérií. Vazebnou látkou, která se specificky váže na grampozitivní bakteriální antigen, a to na li potec hoovou kyselinu, byl klon monoklonální protilátky 96 110 ((IgG 1) popsaný v Fisher et al.. PCT publikace č. WO 98/57994). Vazebnou látkou, která se specificky váže na gramnegativní bakteriální antigen. a to na lipid A, byl klon monoklonální protilátky 26 5 (IgG2b) so (komerčně dostupný od firmy Biodcsign International, Saeo, Maine. katalogové číslo C61212M).

Pro vazebnou charakterizaci bylo vybráno čtrnáct baktérií: sedm grampozitivních baktérií a sedm gramnegativníeh baktérií (viz obrázky 5 a 6). Tyto bakterie byly vybrány, protože reprezentují bakteriální druhy, které byly identifikovány během tří velkých národních studií transfůzníeh reakcí (včetně studie BaCon ve Spojených státech, Hemovigilancc study vc Francii a SHOT vc Velké Britanii).

Pro charakterizování vazby grampozitivních a grampozitivních baktérií s anti-lipotechoová ky seli na-rnonok tonální protilátkou a ant i—lipid A-monoklonální protilátkou se bakteriální druhy z kli-io nic kých izo lát ů naočkovaly na plotny s agareni obsahujícím 5 % ovčí krve (BBL) a kultivovaly se přes noc při 37 °C. Výsledné kolonie sc naočkovaly do tryptózového sójového bujónu (30 mg/ml, Sigma) v PBS a třepaly se přes noc při 37 °C. Počet baktérií sc kvantifikoval turbidimetrickým měřením při 620 nm. Celé buňky baktérií se peletizovaly 15 minut při 5000 ot./min. Peletizované baktérie se resuspendovaly v PBS na jednotky (CFU)/nil tvořící přibližně 10^s kolonií ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). 100 μΐ suspenze baktérií se přidalo do každé jamky jednoho řádku 96-jamkových mikrotitračních ploten. Postup se opakoval pro každou ze sedmi grampozitivních baktérií a každou ze sedmi gramnegativníeh bakterií. Plotny se inkubovaly jednu hodinu při 37 °C a potom skladovaly přes noc při 4 °C. Plotny se potom pro myly pětkrát pomocí 200 μ 1/jam ku 0,05% Tween-20 a skladovaly za sucha při -20 °C do so dalšího použití.

Pro minimalizaci nespecifické vazby sc plotny pokryté baktériemi blokovaly 300 μΙ/jamku 5% sušeného mléka/0.05% Tween-20 v PBS. Plotny se blokovaly přes noc při teplotě místnosti a potom se třikrát promyly PRS/Tween. Vazebné látky (tj. anti-lipotechoová kyselína-mono55 klonální protilátka a anti—lipid A-monoklonální protilátka) se zředily na 5 pg/ml v PBS

- r CZ. 300108 B6 obsahujícím 4 % BSA a 0,05 % Tween-20. Roztoky se smíchaly a filtrovaly přes 0.22 pm filtry;

i 00 pl roztoku sc přidalo do každé jamky a vazebné látky se nechaly reagovat jednu hodinu při °C. Plotny se potom promyly pětkrát 0.05% Iween-20. Komerčně dostupná sekundární protilátka, konjugát kozího antimyšího IgG (těžké a lehkc řetězce) a HRP sc zředil 1:5000 v PBS/1,5% BSA a 0.005 Tween 20. 200 pl roztoku sekundární protilátky se přidal do každé jamky a sekundární protilátka se nechala vázat jednu hodinu při 37 °C. Plotny se potom jednou promyly PBS/0,05% Tween-20 a ještě třikrát PBS samotným. Pro kvantifikaci vazeb baktérií se do každé jamky přidalo 200 pl substrátu peroxidázv TMB (Sigma). V kinetické úpravě ve čtecím zařízení mi krotit rač ní plotny Dynax se odečetla absorbanee (OD 370 nm).

in

Jak znázorňuje obrázek 5 a 6 každá ze sedmi grarnpozitivních a sedmi gramnegativních bakterií byla specificky rozpoznána anti-lipotechoová kyselina monoklonální protilátkou (gram požít i vní; obrázek 5) a anti—lipid A-monoklonální protilátkou (gramnegativní; obrázek 6). (Průměrné výsledky z trojnásobného měření se znázornily jako funkce každé z rozpoznávaných baktérií).

Jak znázorňují obrázky 5 a 6, rozsah rozpoznávání se mění mezi bakteriálními druhy, ale ve všech případech baktérií je alespoň dvojnásobné než pozadí. Tyto údaje jasně ukazují možnost použití běžné vazebně látky pro rozpoznávání všech druhů gramnegativních i gram pozitivu ích baktérií. Tyto baktérie jsou specificky důležité, protože představují exaktní druhy baktérií identifikovaných jako příčinné látky při transfuzníeh reakcích.

Claims (44)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob vyšetřování přítomnosti klinicky závažného množství grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkáni od savčího dárce pro převod do organismu savčího příjemce, přičemž darovaná tkáň je uchovávána v so tekutině, vyznačující se tím, že se vzorek darované krve nebo krevního produktu nebo tekutiny uvede do kontaktu se sadou vazebných látek, přičemž sada vazebných látek obsahuje vazebné látky; které se specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií a/nebo vazebné látky; které se specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií, a stanoví se navázání sady vazebných látek kc vzorku, přičemž navázání ukazuje přítomnost klinicky závaž35 něho množství grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi nebo krevním produktu nebo v darované tkáni a nenavázáni ukazuje nepřítomnost klinicky závažného množství grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi, krevním produktu nebo v darované tkáni od savčího dárce: kde pro převod do organismu savčího příjemce se hodí krev nebo krevní produkt nebo darovaná tkáň. v nichž bylo zjištěno méně než I \ 10⁶ jednotek

   4o vytvářejících kolonie (CFU) grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v 1 ml.
2. 2. Způsob podle nároku {.vyznačující se t í m . že vazebné látky, které se specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních bakterií, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou

   45 na antigen gramnegativních bakterií, nebo zahrnují molekulu zvolenou ze souboru sestávajícího z I.imulus anti-lipopolysaeharidového faktoru (LALF). proteinu vázajícího lipopolysacharidy (LBP). bakterie idního, permeabilitu zvyšujícího proteinu (BP1) a antibiotika.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že vazebné látky, které se so specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek.

   které se specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií.
4. 4. Způsob podle nároku R vyznačující se t í m , že vazebné látky, které se specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií sc specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny

   55 grampozitivních bakterií, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií, nebo zahrnují antibiotikum mimo vankomyeinu a gentamycinu.
5. 5. Způsob podle nároku 1 nebo 4. vyznačující se tím, že vazebné látky, které se 5 specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek.

   které se specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií.
6. 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím. že vzorek se před uvedením nebo při uvádění do kontaktu se sadou vazebných látek zpracovává, io
7. 7. Způsob podle nároku 6. vyznačující se tím. že zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebné látky na antigenu gramnegativních bakterií nebo antigenu grampozitivních bakterií.

   i?
8. 8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující sc tím, že savčí dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu,
9. 9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5. vyznačující se tím. že darovaná krev nebo krevní produkt se zvolí ze souboru sestávajícího z plné krve. leukocytů, he máto poet ických kmenových buněk, krevních destiček, červených krvinek, plazmy a séra.
10. 10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků I až 5, v y z n a č u j í c í se t í m , že darovaná tkáň se zvolí ze souboru sestávajícího z plic, srdce, jater, kůže, ledviny, pankreatu, sleziny a kostní dřeně.
11. 11. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že antibiotikem je polymixin nebo bacitracín.
12. 12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5. vyznačující se tím, že vazebné 30 látky, které se specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií, jsou detekovatelně značeny první reportérovou molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií, jsou detekovatelně značeny druhou reportérovou molekulou.
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že první reportérova molekula a 55 druhá reportérova molekula jsou stejné nebo nejsou stejné.
14. 14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím. že alespoň jedna z první a druhé reportérové molekuly jc zvolena ze souboru sestávajícího z molekuly s enzymatickou aktivitou, molekuly značené radioaktivním izotopem, fúzní molekuly, fluorogenní molekuly, sólu kovu.

    40 částice, chromatické molekuly a molekuly, která je specificky vázána sekundární vazebnou látkou.
15. 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž 5, vyznačující sc tím. že sada vazebných látek je imobilizována na pevném nosiči.
16. 16. Způsob podle nároku 15. vyznačující se tím. že pevným nosičem je mikrotitrační plotna.
17. 17. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5. v y z n a č u j í c í se t í m . že alespoň jeden 4(i ze savčího dárce a savčího pří jemce je člověk nebo domestikovaný savec.

    -3418. Způsob podle kteréhokoliv z nároků I až 5. vyznačující se tím. že klinicky závažné množství bakterií v darované krvi, krevním produktu nebo v darované tkáni je vyšší než

    1 x 1 (f jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakterií v 1 ml. přičemž pro převod do organismu savčího příjemce se hodí krev nebo krevní produkt nebo darovaná tkáň, v nichž bylo zjištěno méně než 1 x 10'jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakterií v 1 ml.
18. 19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím. že klinicky > závažné množství bakterií v darované krvi, krevním produktu nebo v darované tkáni je vyšší než 1 x 10^J jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakterií v 1 nik přičemž pro převod do organismu savčího příjemce se hodí krev nebo krevní produkt nebo darovaná tkáň. v nichž bylo zjištěno méně než 1 x 10^J jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakterií v 1 ml.

    to
19. 20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků l až 5, vyznačující se tím. že klinicky závažné množství bakterií v darované krvi. krevním produktu nebo v darované tkáni je vyšší než 1 x 10'jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakterií v 1 ml, přičemž pro převod do organismu savčího příjemce se hodí krev nebo krevní produkt nebo darovaná tkáň, v nichž bylo zjištěno méně než 1 x 10'jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakterií v 1 ml.
20. 21. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím. že molekula s enzymatickou aktivitou se zvolí z křenové peroxidázy. alkalické fosfatázy a β-galaktosidázy.
21. 22. Způsob podle kteréhokoliv z nároku 12 až 14. v v z n a č u j í e í se tím, že první nebo

    2o druhá reporterová molekula se váže k vazebným činidlům intermolekulární asociací.
22. 23. Souprava k provádění způsobu podle nároku 1, vyznačující se tím. že zahrnuje sadu vazebných látek, přičemž tato sada vazebných látek zahrnuje vazebné látky, které sc specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií a/nebo vazebné látky, které se specificky vážou

    25 na antigen grampozitivních bakterií, a prostředky pro detekci navázání sady vazebných látek ke vzorku darované krve nebo krevního produktu nebo tekutiny, přičemž navázání ukazuje přítomnost klinicky závažného množství grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi nebo krevním produktu nebo darované tkáni a nenavázání ukazuje nepřítomnost klinicky závažného množství grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v darované krvi nebo krev30 ním produktu nebo darované tkáni od savčího dárce, přičemž pro převod do organismu savčího příjemce se hodí krev nebo krevní produkt nebo tkáň, v nichž bylo zjištěno méně než 1 x I0⁶ jednotek vytvářejících kolonie (CFU) grampozitivních a/nebo gramnegativních bakterií v 1 ml.
23. 24. Souprava podle nároku 23, vyznačující sc tím. že vazebné látky, kterc se species fícky vážou na antigen gramnegativních bakterií se specificky vážou na lipopolysacharidovou strukturu gramnegativních bakterií, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií nebo zahrnují molekulu zvolenou ze souboru sestávajícího z Limulus antilipopolysacharidového faktoru (LALF), proteinu vázajícího Iipopolysacharidy (LBP). baktericidního. permeabilitu zvyšujícího proteinu (BPI) a antibiotika.
24. 25. Souprava podle nároku 23 nebo 24. vyznačující se tím, že vazebné látky, které sc specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, které se specificky vážou na antigen gramnegativních bakterií.

    45
25. 26. Souprava podle nároku 23, vyznačující se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií, se specificky vážou na strukturu lipotechoové kyseliny grampozitivních bakterií, zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek, kterc sc specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií nebo zahrnují antibiotikum mimo vankomycinu a gentamycinu.
26. 27. Souprava podle nároku 23 nebo 26, vyznačující sv tím. že vazebné látky, které se specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií zahrnují protilátky nebo deriváty protilátek. které se specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií.

    - 35 CZ 300108 B6
27. 28. Souprava podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27, vyznačující se tím. že dále zahrnuje prostředky pro zpravování vzorku, přičemž zpracování odhaluje vazebné místo pro vazebnou látku na antigenů gramnegativitích bakterii nebo antigenů grampozitivních bakterií,

    5
28. 29, Souprava podle kteréhokoliv z nároků 23 až27, vyznačující se tím. že se darovaná krev nebo krevní produkt nebo darovaná tkáň se stanovenou nepřítomností klinicky závažného množství bakterií od savčího dárce převede savčímu příjemci.
29. 30. Souprava podle kteréhokoliv 7 nároků 23 až27, vyznačující sc t í m . žc savčí m dárce a savčí příjemce jsou stejného druhu.
30. 31. Souprava podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27. v y z n a č u j í e í se tím, že darovaná krev nebo krevní produkt se zvolí ze souboru sestávajícího z plné krve, leukocytů. hematopoctiekých kmenových buněk, krevních destiček, červených krvinek, plazmy, a séra.
31. 32. Souprava podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27. vyznačující se tím. že darovaná tkáň se zvolí ze souboru sestávajícího z plic. srdce, jater, kůže, ledviny, pankreatu, sleziny a kostní dřeně.

    2o
32. 33. Souprava podle nároku 24, vyznačující se tím. že antibiotikem je polymixin nebo bacitracin.
33. 34. Souprava podle kteréhokoliv z nároku 23 až 27. vyznačující se tím, že vazebné látky, které se specificky vážou na antigen gramnegati vních bakterií, jsou detekovatelnč značeny

    25 první reportérovou molekulou, a vazebné látky, které se specificky vážou na antigen grampozitivních bakterií, jsou detekovatelnč značeny druhou reportérovou molekulou,
34. 35. Souprava podle nároku 34, vyznačující se tím, že první reportérova molekula a druhá reporterová molekula jsou stejné nebo nejsou stejné,
35. 36. Souprava podle nároku 34. vyznačující se tím. že alespoň jedna z první a druhé reportérové molekuly je zvolena ze souboru sestávajícího z molekuly s enzymatickou aktivitou, molekuly značené radioaktivním izotopem, íuzní molekuly, fluorogenní molekuly, sólu kovu. částice, chromatické molekuly a molekuly, která je specificky vázána sekundární vazebnou

    55 látkou.
36. 37. Souprava podle kteréhokoliv z nároků 23 až27, vyznačující se tím, že sada vazebných látek je iniobilizována na pevném nosiči, který m je podložka nebo perla.

    4(i
37. 38. Souprava podle nároku 37. vyznačující se tím, že pevným nosičem je jasně zabarvená perla.
38. 39. Souprava podle nároku 37. vyznačující se tím, že pevným nosičem je mikrotitraění plotna.
39. 40. Souprava podle nároku 21. vyznačující se tím, že alespoň jeden ze savčího dárce a savčího příjemce je člověk nebo domestikovaný savec.
40. 41. Souprava podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27, vyznačující se tím. žc klinicky

    5o významné množství bakterií je vyšší než I x I (fi jednotek vytvářejících kolonie (Cl U) bakterií v darované krvi nebo krevním produktu nebo darované tkáni na l ml, přičemž pro převod či přenos savčímu příjemci se hodí krev nebo krevní produkt nebo tkáň, v nichž bylo zjištěno méně než l x 10' jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakterií na 1 mi.

    - 36 CZ 300108 Bó
41. 42. Souprava podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27. vyznačující se tím, že klinicky významné množství bakterií je vyšší než 1 x 10⁴ jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakterií v darované krvi nebo krevním produktu nebo darované tkáni na 1 ml, přičemž pro převod ěi přenos savčímu příjemci se hodí krev nebo krevní produkt nebo tkán, v nichž bylo zjištěno méně

    5 než 1 x 10'jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakterií na 1 ml.
42. 43. Souprava podle kteréhokoliv z nároku 23 až 27. vyznačující sc tím, že klinicky významné množství bakterií je vyšší než l x 10'jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakteri v darované krvi nebo krevním produktu nebo darované tkáni na 1 ml. přičemž pro převod č ía přenos savčímu příjemci se hodí krev nebo krevní produkt nebo tkáň. v nichž bylo zjištěno méně než 1 x 10'jednotek vytvářejících kolonie (CFU) bakterií na 1 ml.
43. 44. Souprava podle nároku 36. vyznačující se tím, že molekula s enzymatickou aktivitou se zvolí z křenové peroxidázy, alkalické fosfatázy a β-galaktosídázy.
44. 45. Souprava podle kteréhokoliv z nároku 34 až 36. vyznačující sc tím, že první nebo druhá reportérové molekula se váže k vazebným činidlům intennolekulární asociací.