PL215864B1 - Sposób i zestaw do immunologicznego wykrywania in vitro bakterii w krwi i tkankach - Google Patents

Description

Zgłoszenie czerpie korzyści ze zgłoszenia na patent tymczasowy w Stanach Zjednoczonych Ameryki nr 60/144442, z 16 czerwca 1999 r., którego całą zawartość wprowadza się jako źródło literaturowe.

Tło wynalazku

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy wykrywania in vitro, w krwi lub preparacie z krwi (włącznie z pełną krwią, krwiotwórczymi komórkami macierzystymi, leukocytami, osoczem, surowicą, czerwonymi ciałkami krwi i płytkami) lub w tkance dawcy, obecności znaczącej klinicznie ilości bakterii. W szczególności wynalazek dotyczy wykrywania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości skażających bakterii w krwi lub w preparatach z krwi lub w tkance dawcy, które mają zostać zastosowane do transfuzji lub transplantacji.

Streszczenie stanu techniki

Transfuzja krwi i preparatów z krwi jest terapeutycznie istotnym aspektem w opiece nad pacjentami. Transplantacja tkanek i organów dawcy jest także istotna terapeutycznie. Brak znaczącego klinicznie poziomu bakterii w krwi dawcy, preparatów z krwi dawcy, tkanki lub organu dawcy jest wymagany dla bezpiecznego, terapeutycznego zastosowania tych płynów i tkanek do transfuzji i transplantacji. Tak też, np., bakteriemia (obecność bakterii w krwi) może być przejściowa, stała lub może występować z przerwami. Wagner i inni, (Clin. Microbiol Rev. 7: 290-302 (1994)) i Goldman i inni, (Trans. Med. Revs. 5: 73-83 (1991)) zidentyfikowali dużą liczbę różnych gatunków bakterii w skażonej krwi przetoczonej pacjentom u których, po transfuzji, rozwinęła się posocznica. Tadler i inni, (J. Clin. Laboratory Analysis 2: 21-25 (1989)) stwierdzili, że o ile przejściowa bakteriemia ma ogólnie niewielkie konsekwencje, o tyle stała lub występująca z przerwami bakteriemia może stworzyć sytuacje groźne dla życia w kilku populacjach pacjentów, w szczególności u pacjentów z obniżoną odpornością, noworodków i pacjentów w wieku starszym. Zatem, gdy skażona krew ze znaczącą klinicznie ilością bakterii zostanie przetoczona dawcy, u dawcy mogą rozwinąć się powikłania, w szczególności ze względu na to, że transfuzje krwi i/lub preparatów z krwi przeprowadza się gdy pacjent przechodzi dużą operację chirurgiczną lub jest w inny sposób wrażliwy na uraz.

Podobnie tkanki i organy dawcy korzystnie są wolne od bakterii w celu opóźniania oraz, korzystnie, zapobiegania odrzuceniu przez biorcę.

Pomimo potrzeby dostarczania bezpiecznej, wolnej od bakterii krwi i preparatów z krwi, nie istnieje szybki, wydajny sposób wykrywania in vitro obecności zakażenia bakteryjnego w krwi lub preparacie z krwi. Pomimo, że istnieją sposoby określania czy krew jest, czy nie jest zakażona bakteriami, większość obecnie dostępnych testów bakteryjnych wykonuje się u pacjentów, u których podejrzewa się zakażoną krew z głównym zamiarem zidentyfikowania konkretnego mikroorganizmu wywołującego zakażenie, tak by można było rozpocząć odpowiednie leczenie antybiotykami. W tych sposobach, w celu zidentyfikowania zakażających bakterii, próbkę krwi pacjenta hoduje się w pożywce hodowlanej, która sprzyja wzrostowi bakterii, przez względnie długi okres czasu. Ostatecznie liczba obecnych organizmów wzrasta do punktu, w którym istnieje ich dostateczna liczba, by mogły być wykryte.

Pomimo, że te oparte na hodowli techniki badawcze znajdują zastosowanie do określania konkretnego typu bakterii, które zakażają krew pacjenta, czas potrzebny do przeprowadzenia tych testów sprawia, że są one niepraktyczne w zastosowaniach do badań krwi dawcy lub preparatów z krwi lub organów dawcy. Wynika to z faktu, że pobrana krew dawcy, preparaty z krwi i organy, są często potrzebne do transfuzji lub transplantacji wykonywanych w krótkim terminie po pobraniu. Zatem może nie być czasu, aby zbadać pobraną krew (lub preparat z krwi) lub organ przy pomocy technik opartych na hodowli przed tym, aż pobrana krew lub organ będą potrzebne do zastosowania.

Ponadto, organy i krew lub preparaty z krwi mają stosunkowo krótki termin ważności, nie tylko ze względu na utratę działania pobranego materiału, ale także ze względu na wzrost ilości jakichkolwiek skażających bakterii. Ponieważ bakterie mają szybkie tempo rozmnażania, nawet niewielka ilość skażających bakterii obecnych w pobranej krwi lub preparacie z krwi szybko wzrasta z czasem. Dla przykładu, podczas gdy pobrane płytki są funkcjonalnie żywe tylko 7 dni po pobraniu, rzadko stosuje się je później niż 5 dni po pobraniu ze względu na niebezpieczeństwo skażenia bakteryjnego, które przy pobraniu mogło nie być znaczące, ale z czasem mogło wzrosnąć do poziomu znaczącego klinicznie. Ponadto, te techniki badania krwi w oparciu o hodowlę, zabierają zbyt dużo czasu, aby do

PL 215 864 B1 zastosowania w transfuzjach rutynowo badać płytki, które mają krótki termin ważności (około 5 dni po pobraniu).

Brecher i inni, (Transfusion 34(9); 750-755 (1994)) opisał inną technikę wykrywania konkretnych skażających bakterii w krwi przy pomocy znakowanych sond kwasów nukleinowych, które hybrydyzują z materiałem genetycznym potencjalnych zakażeń. Jednakże sondy zastosowane w tych badaniach znacznie ograniczają liczbę mikroorganizmów, które można wykryć oraz, niestety, nie opracowano z tej techniki żadnego testu dostępnego w handlu. Biorąc pod uwagę złożoność tych technik, wymagają one zbyt dużo pracy laboratoryjnej i trwają zbyt długo by mogły być rutynowo stosowane w wykrywaniu w krwi lub preparatach z krwi skażenia bakteryjnego.

Zatem potrzebna jest technika szybkiego wykrywania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości jakichkolwiek skażających bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi lub w innej tkance dawcy. Szybko i skutecznie można tutaj zastosować techniki wiązania antygenu. Niestety Wagner, S. J. (Int. J. Med. Microbiol. Virol. Parasitol Infect. Dis. 283(3):253-257 (1996)) stwierdził, że brak jest wspólnego źródła antygenowego do szerokiego wykrywania bakterii. Zatem, potrzebne są techniki wykrywania in vitro znaczących klinicznie ilości jakichkolwiek skażających bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi lub w innej tkance dawcy oparte na wiązaniu antygenu.

Streszczenie wynalazku

Wynalazek dostarcza szybkich metod, opartych na wiązaniu antygenu, do wykrywania in vitro znaczących klinicznie ilości skażających bakterii w krwi lub preparatach z krwi lub w tkance dawcy, w szczególności krwi dawcy lub w preparatach z krwi lub tkankach dawcy, które mają być przeniesione z jednego pacjenta do drugiego.

Zgodnie z tym, w pierwszym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposobu poszukiwania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi dawcy, przenoszonych od ssaka dawcy do ssaka biorcy, obejmującego poddanie próbki krwi lub preparatu z krwi działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących obejmuje środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie wskazuje obecność znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi, a brak wiązania wskazuje brak znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi.

W pewnych postaciach pierwszego rozwiązania według wynalazku, próbkę, przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu środków wiążących, poddaje się obróbce. Korzystnie obróbka ta pozwala wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub antygenie bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach pierwszego rozwiązania według wynalazku, krew dawcy lub preparat z krwi, w których oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii, podaje się ssakowi biorcy. Korzystnie ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciwlipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają antybiotyk, gdzie antybiotyk nie jest wankomycyną ani gentamycyną. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

W różnych postaciach pierwszego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie pierwszą cząsteczką reporterową i środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, znakuje się wykrywalnie drugą cząsteczką reporterową. W pewnych postaciach, pierwsza i druga cząsteczka reporterowa są takie same. W innej postaci pierwsza i druga cząsteczka reporterowa nie są takie same. Korzystnie, pierwszą lub zarówno pierwszą i drugą cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol

PL 215 864 B1 metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W drugim rozwiązaniu wynalazek dostarcza sposobu stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w krwi dawcy lub preparacie z krwi, od ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, obejmującego poddanie próbki krwi dawcy lub preparatu z krwi działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich cząsteczka reporterowa dawcy lub preparacie z krwi, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w krwi dawcy lub preparacie z krwi.

W pewnych postaciach drugiego rozwiązania według wynalazku, próbkę, przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu zestawu środków wiążących, poddaje się obróbce. Korzystnie obróbka ta pozwala wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach rozwiązania według wynalazku, krew dawcy lub preparat z krwi, w których oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich, podaje się ssakowi biorcy. Korzystnie ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują antybiotyk, gdzie antybiotykiem nie jest wankomycyna ani gentamycyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

W różnych postaciach drugiego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową. Korzystnie, cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W trzecim rozwiązaniu wynalazek dostarcza sposobu stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w krwi dawcy lub preparacie z krwi od ssaka dawcy, przed przeniesieniem do ssaka biorcy, obejmującego poddanie próbki krwi lub preparatu z krwi działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gramujemnych w krwi dawcy lub preparacie z krwi i brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w krwi dawcy lub preparacie z krwi.

W pewnych postaciach trzeciego rozwiązania według wynalazku próbkę, przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu zestawu środków wiążących, poddaje się obróbce. Korzystnie obróbka ta pozwala wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych. W pewnych postaciach, krew dawcy lub preparat z krwi, w których oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, podaje się ssakowi biorcy. Korzystnie, ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych.

W różnych postaciach trzeciego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową. Korzystnie, cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W czwartym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi od ssaka dawcy, przed przeniesieniem do ssaka biorcy, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiąPL 215 864 B1 żące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką krwi dawcy lub preparatu z krwi, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi i brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi.

W pewnych postaciach czwartego rozwiązania według wynalazku, zestaw dalej zawiera środki do poddania próbki obróbce, pozwalającej wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub na antygenie bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach czwartego rozwiązania według wynalazku, krew dawcy lub preparat z krwi, w których oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii, podaje się ssakowi biorcy. Korzystnie ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają antybiotyk, gdzie antybiotyk nie jest wankomycyną ani gentamycyną. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

W różnych postaciach czwartego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie pierwszą cząsteczką reporterową i środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, znakuje się wykrywalnie drugą cząsteczką reporterową. W pewnych postaciach, pierwsza i druga cząsteczka reporterowa są takie same. W innej postaci pierwsza i druga cząsteczka reporterowa nie są takie same. Korzystnie, pierwszą lub zarówno pierwszą i drugą cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W piątym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich, w krwi dawcy lub preparacie z krwi od ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, zawierającego zestaw środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką krwi lub preparatu z krwi, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w krwi dawcy lub preparacie z krwi, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w krwi dawcy lub preparacie z krwi.

W pewnych postaciach piątego rozwiązania według wynalazku, zestaw dalej zawiera środki do poddania próbki obróbce pozwalającej wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach rozwiązania według wynalazku, krew dawcy lub preparat z krwi, w których oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich, podaje się ssakowi biorcy. Korzystnie ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują antybiotyk, gdzie antybiotykiem nie jest wankomycyna ani gentamycyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

W różnych postaciach piątego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową. Korzystnie, cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana

PL 215 864 B1 radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W szóstym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, w krwi dawcy lub preparacie z krwi od ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, zawierającego zestaw środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką krwi lub preparatu z krwi, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w krwi dawcy lub preparacie z krwi, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w krwi dawcy lub preparacie z krwi.

W pewnych postaciach szóstego rozwiązania według wynalazku, zestaw dalej zawiera środki do poddania próbki obróbce, pozwalającej wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych. W pewnych postaciach, krew dawcy lub preparat z krwi, w których oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, podaje się ssakowi biorcy. Korzystnie ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych.

W różnych postaciach szóstego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową. Korzystnie, cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W różnych postaciach pierwszego, drugiego, trzeciego, czwartego, piątego i szóstego rozwiązania według wynalazku, krew lub preparat z krwi jest korzystnie pełną krwią, leukocytami, krwiotwórczymi komórkami macierzystymi, płytkami, czerwonymi ciałkami krwi, osoczem lub surowicą.

W siódmym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposobu poszukiwania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w tkance ssaka, gdzie tkankę przechowuje się w płynie, obejmującego poddanie próbki płynu działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących obejmuje środki wiążące, specyficznie wiąże antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie wskazuje obecność znaczących klinicznie ilości bakterii w tkance dawcy, a brak wiązania wskazuje na brak znaczących klinicznie ilości bakterii w tkance dawcy.

W pewnych postaciach siódmego rozwiązania według wynalazku, próbkę, przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu środków wiążących, poddaje się obróbce. Korzystnie, obróbka ta pozwala wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub antygenie bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach siódmego rozwiązania według wynalazku, tkankę dawcy w której oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii przenosi się do ssaka biorcy. Korzystnie ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące Iipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają antybiotyk, gdzie antybiotyk nie jest wankomycyną ani gentamycyną. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

PL 215 864 B1

W różnych postaciach siódmego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie pierwszą cząsteczką reporterową i środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, znakuje się wykrywalnie drugą cząsteczką reporterową. W pewnych postaciach, pierwsza i druga cząsteczka reporterowa są takie same. W innej postaci pierwsza i druga cząsteczka reporterowa nie są takie same. Korzystnie, pierwszą lub zarówno pierwszą i drugą cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W ósmym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposobu stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w tkance ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, gdzie tkankę dawcy przechowuje się w płynie, obejmującego poddanie próbki płynu działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w tkance dawcy, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w tkance dawcy.

W pewnych postaciach ósmego rozwiązania według wynalazku, próbkę, przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu zestawu środków wiążących, poddaje się obróbce. Korzystnie, obróbka ta pozwala wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach rozwiązania według wynalazku tkankę dawcy, w której oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich, podaje się ssakowi biorcy. Korzystnie, ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują antybiotyk, gdzie antybiotykiem nie jest wankomycyna ani gentamycyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

W różnych postaciach ósmego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową. Korzystnie, cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka Darwina lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W dziewiątym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposobu stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w tkance ssaka dawcy, przed przeniesieniem do ssaka biorcy, gdzie tkankę dawcy przechowuje się w płynie, obejmującego poddanie próbki płynu działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gramdodatnich w tkance dawcy i brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gramujemnych w tkance dawcy.

W pewnych postaciach dziewiątego rozwiązania według wynalazku, próbkę, przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu zestawu środków wiążących, poddaje się obróbce. Korzystnie, obróbka ta pozwala wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych. W pewnych postaciach, tkankę dawcy, w której oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, podaje się ssakowi biorcy. Korzystnie, ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych.

PL 215 864 B1

W różnych postaciach dziewiątego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową. Korzystnie, cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W dziesiątym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w tkance ssaka dawcy, przed przeniesieniem do ssaka biorcy, gdzie tkankę dawcy przechowuje się w płynie, zawierającego zestaw środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką płynu, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii w tkance dawcy i brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii w tkance dawcy.

W pewnych postaciach dziesiątego rozwiązania według wynalazku, zestaw dalej zawiera środki do poddania próbki obróbce, pozwalającej wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub na antygenie bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach dziesiątego rozwiązania według wynalazku, tkankę dawcy, w której oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii przenosi się do ssaka biorcy. Korzystnie, ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają antybiotyk, gdzie antybiotyk nie jest wankomycyną ani gentamycyną. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

W różnych postaciach dziesiątego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie pierwszą cząsteczką reporterową i środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, znakuje się wykrywalnie drugą cząsteczką reporterową. W pewnych postaciach, pierwsza i druga cząsteczka reporterowa są takie same. W innej postaci pierwsza i druga cząsteczka reporterowa nie są takie same. Korzystnie, pierwszą lub zarówno pierwszą i drugą cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W jedenastym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich, w tkance ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, gdzie tkankę dawcy przechowuje się w płynie, zawierającego zestaw środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką płynu, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w tkance dawcy, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w tkance dawcy.

W pewnych postaciach jedenastego rozwiązania według wynalazku, zestaw dalej zawiera środki do poddania próbki obróbce, pozwalającej wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach rozwiązania według wynalazku, tkankę dawcy, w której oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich, przenosi się do ssaka biorcy. Korzystnie, ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują antybiotyk, gdzie antybiotykiem nie jest wankomycyna ani gentamycyna. Korzystnie, środki wiążące, specyPL 215 864 B1 ficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

W różnych postaciach jedenastego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową. Korzystnie, cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W dwunastym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, w tkance ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, gdzie tkankę dawcy przechowuje się w płynie, zawierającego zestaw środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką płynu, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w tkance dawcy, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w tkance dawcy.

W pewnych postaciach dwunastego rozwiązania według wynalazku, zestaw dalej zawiera środki do poddania próbki obróbce, pozwalającej wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych. W pewnych postaciach, tkankę dawcy, w której oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, przenosi się do ssaka biorcy. Korzystnie, ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych.

W różnych postaciach dwunastego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową. Korzystnie, cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W różnych postaciach siódmego, ósmego, dziewiątego, dziesiątego jedenastego i dwunastego rozwiązania według wynalazku, tkanką dawcy jest korzystnie płuco, serce, wątroba, skóra, nerka, trzustka, śledziona lub szpik kostny.

W pewnych korzystnych postaciach wszystkich powyższych rozwiązań według wynalazku, zestaw środków wiążących jest unieruchomiony na złożu w fazie stałej (np. na płytce do mikromianowania). W korzystnych postaciach pierwszego, drugiego, trzeciego, czwartego, piątego, szóstego, siódmego, ósmego, dziewiątego, dziesiątego, jedenastego i dwunastego rozwiązania według wynalazku, ssakiem dawcą i/lub biorcą jest człowiek lub zwierzę domowe.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia schemat typowej błony i ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich.

Fig. 2 przedstawia schemat struktury lipopolisacharydu (LPS) znajdowanego w ścianie komórkowej bakterii Gram-ujemnych.

Fig. 3A-3D przedstawiają schemat urządzenia ujawnionego w opisie wynalazku. Fig. 3A przedstawia urządzenie bez dodanej próbki krwi lub preparatu z krwi (lub bez dodania płynu, w którym przechowuje się tkankę dawcy). Fig. 3B przedstawia urządzenie w momencie dodawania próbki krwi lub preparatu z krwi. Fig. 3C przedstawia kontakt próbki płynów ciała z urządzeniem. Fig. 3D przedstawia dodatni wynik przy pomocy urządzenia ujawnionego w opisie wynalazku co wskazuje, że badana próbka krwi lub preparatu z krwi była skażona mikroorganizmem.

Fig. 4A-4D przedstawiają schemat sposobu według wynalazku. Fig. 4A przedstawia dodanie próbki krwi, preparatu z krwi lub płynu, w którym przechowuje się tkankę dawcy, do urządzenia testowego. Fig. 4B przedstawia dodanie cząstek lateksowych opłaszczonych przeciwciałami specyficznie wiążącymi, z urządzeniem testowym, zarówno bakterie Gram-ujemne, jak i Gram-dodatnie. Fig. 4C przedstawia mieszanie próbki z cząstkami lateksowymi, powleczonymi przeciwciałami, w urządzeniu

PL 215 864 B1 testowym. Fig. 4D przedstawia widoczny wynik negatywnego wiązania (tj. brak bakterii w próbce; po lewej) i wiązania (tj. obecność bakterii w próbce; po prawej).

Fig. 5 przedstawia wykres liczby różnych (przedstawionych) bakterii Gram-dodatnich, specyficznie związanych przez nieograniczający środek wiążący według wynalazku, przeciwciało przeciw kwasowi lipotejchowemu.

Fig. 6 przedstawia wykres liczby różnych (przedstawionych) bakterii Gram-ujemnych, specyficznie związanych przez nieograniczający środek wiążący według wynalazku, przeciwciało przeciw lipopolisacharydowi.

Szczegółowy opis korzystnych postaci

Wynalazek dotyczy wykrywania in vitro znaczących klinicznie ilości bakterii skażających w krwi lub preparacie z krwi lub tkance dawcy, w szczególności krwi lub preparacie z krwi lub tkance przenoszonej od pacjenta dawcy do pacjenta biorcy. Wynalazek dostarcza szybkich sposobów opartych na wiązaniu antygenu i zestawów do wykrywania in vitro znaczących klinicznie ilości mikroorganizmów w krwi, preparacie z krwi lub w płynie, w którym przechowuje się tkankę dawcy. Wynalazek opracowano, gdyż stwierdzono, że dokładna identyfikacja skażających bakterii w krwi dawcy, preparacie z krwi lub tkance dawcy, które mają być zastosowane do transfuzji lub transplantacji, jest zbyteczna. Zgodnie z tym, wynalazek dostarcza sposobów, wykorzystujących in vitro środki wiążące, specyficznie wiążące zarówno bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne, do wykrywania i wiązania z próbką krwi, preparatem z krwi lub próbką płynu, w którym przechowuje się tkankę dawcy. Zatem, gdy wykryje się jakiekolwiek wiązanie oznacza to, że krew, preparat z krwi lub tkanka dawcy jest skażona i korzystnie nie należy jej stosować do przenoszenia do innego pacjenta.

Publikacje patentowe i literatura naukowa zacytowane tutaj, opisują wiedzę dostępną specjalistom w dziedzinie wynalazku. Zatem opublikowane patenty, zgłoszenia i pozycje literaturowe tutaj zacytowane, wprowadza się tutaj jako literaturę w takim samym stopniu, jak gdyby każde z nich specyficznie i niezależnie miało być tutaj wprowadzone jako pozycja literaturowa. Jakakolwiek niezgodność pomiędzy tymi publikacjami i niniejszym ujawnieniem powinna być rozwiązana na korzyść niniejszego ujawnienia.

W pierwszym rozwiązaniu wynalazek dostarcza sposobu poszukiwania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi dawcy, przenoszonych od ssaka dawcy do ssaka biorcy. Sposób obejmuje poddanie próbki krwi lub preparatu z krwi działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących obejmuje środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie wskazuje obecność znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi, a brak wiązania wskazuje brak znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi. W korzystnych postaciach dawcą i/lub biorcą jest człowiek lub zwierze domowe (np. kot, pies, koń, świnia).

Zastosowany tutaj termin „krew lub preparat z krwi” obejmuje jakąkolwiek komórkę znajdowaną w krwi lub szpiku kostnym, włącznie z, ale nie tylko, pełną krwią, czerwonymi ciałkami krwi, płytkami, surowicą, osoczem, krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i leukocytami (włącznie z limfocytami). Specjalista biolog łatwo stwierdzi, że bez dodania środków przeciwskrzepliwych, takich jak EDTA lub heparyna, pełna krew będzie tworzyć skrzep, co uczyni większość komórek krwi niezdatnymi do transfuzji. Zgodnie z tym termin „krew lub preparat z krwi” oznacza krew poddana działaniu jakiemukolwiek środkowi przeciwskrzepliwemu. Ponadto podczas izolacji konkretnego preparatu z krwi (np. płytek przy zastosowaniu płytko-forezy), do krwi mogą być dodane jakiekolwiek składniki nie wchodzące w skład krwi, takie jak sól fizjologiczna. Zgodnie z tym termin „krew lub preparat z krwi” obejmuje także krew do której dodano jakąkolwiek biologicznie obojętną substancję, taką jak sól fizjologiczna, woda lub roztwór odżywczy do przechowywania.

Użyty tutaj termin „znaczące klinicznie ilości” oznacza ilość skażenia bakteriami w krwi lub preparacie z krwi, równa lub wyższa niż ilość, która, gdy jest obecna w krwi lub preparacie z krwi przetoczonej typowemu biorcy transfuzji, wywołuje, nie ograniczająco, jakikolwiek z następujących objawów u biorcy transfuzji: gorączkę, dreszcze, podciśnienie, mdłości/wymioty, ból głowy, duszności, skąpomocz, biegunkę, ból w miejscu wlewu, pokrzywkę, pocenie się, ból klatki piersiowej, wybroczyny i krwawe wylewy podskórne, rozsiane krzepnięcie wewnątrznaczyniowe, wstrząs septyczny, niewydolność organów i śmierć (patrz, np., Morduchowicz, G. i inni, Reviews of Infectious Diseases 13: 307 (1991)). Ze względu na krótki czas podziału bakterii, ilość bakterii w krwi powinno wyznaczyć się tak blisko momentu transfuzji, jak to tylko jest możliwe. Zazwyczaj w momencie transfuzji znacząca kliPL 215 864 B1 nicznie ilość oznacza więcej niż 1 x 10⁷ jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml krwi lub preparatu z krwi. Korzystnie, w momencie transfuzji znacząca klinicznie ilość oznacza więcej niż 1 x 10⁶ CFU/ml. ₅

Jeszcze korzystniej, w momencie transfuzji znacząca klinicznie ilość, oznacza więcej niż 1 x 10⁵

CFU/ml. Jeszcze korzystniej, w momencie transfuzji znacząca klinicznie ilość oznacza więcej niż x 10⁴ CFU/ml. Jeszcze korzystniej, w momencie transfuzji znacząca klinicznie ilość oznacza więcej ₃ niż 1 x 10³ CFU/ml. Najkorzystniej, w momencie transfuzji, znacząca klinicznie ilość oznacza więcej ₂ niż 1 x 10² CFU/ml. Oczywiście, specjalista w dziedzinie przemysłu związanego z medycyną transfuzji, łatwo stwierdzi jednakże, że niektórzy pacjenci, tacy jak mający poważnie obniżoną odporność lub noworodki, posiadają układ immunologiczny niezdolny do oczyszczenia z ilości bakterii, która jest niższa niż znacząca klinicznie ilość. Jednakże, specjalista wykorzystujący wynalazek, łatwo stwierdzi, że sposoby według wynalazku będą wystarczające do badania krwi i preparatów z krwi, które mają być zastosowane do transfuzji u ogromnej większości pacjentów.

Zastosowany tutaj termin „specyficznie wiąże” oznacza, że środek wiążący (np. przeciwciało) rozpoznaje i wiąże się z konkretnym ligandem (np. polipeptydem, węglowodanem, lipidem lub glikoproteiną), ale zasadniczo nie rozpoznaje i nie wiąże się z jakimikolwiek innymi cząsteczkami w próbce, np. próbce biologicznej, która naturalnie zawiera wiele różnych białek. Podobnie, o ligandzie wiązanym przez środek wiążący, który specyficznie wiąże ten ligand, mówi się, że jest “specyficznie związany” przez środek wiążący. Połączenie wytworzone pomiędzy środkiem wiążącym i jego ligandem może być kowalencyjny, a korzystnie jest niekowalencyjny. Korzystnie, środek wiążący specyficznie wiążący ligand, tworzy związek z tym ligandem z powinowactwem przynajmniej 10⁶ M^-1, korzystniej, 7 1 ft 1 Q 1 przynajmniej 10⁷ M^-1, jeszcze korzystniej, przynajmniej 10⁸ M^-1, a najkorzystniej, przynajmniej 10⁹ M^-1 w wodzie, w warunkach fizjologicznych lub W warunkach bliskich warunkom fizjologicznym w odniesieniu do siły jonowej, np. 140 mM NaCl, 5 mM MgCl2.

Zastosowany tutaj termin „antygen” (np. antygen bakterii Gram-ujemnych lub antygen bakterii Gram-dodatnich), oznacza jakąkolwiek cząsteczkę, z wyjątkiem cząsteczek kwasu nukleinowego i peptydoglikanów, w jakiejkolwiek konformacji strukturalnej, która może być specyficznie związana przez środek wiążący. Tak też, np. antygen bakterii Gram-ujemnych jest antygenem, który jest wydzielany przez, znajduje się wewnątrz lub jest obecny na powierzchni (lub przechodzący przez) błony komórkowej, ściany komórkowej lub przestrzeni periplazmatycznej bakterii Gram-ujemnej. Miejsce na antygenie wiązane przez środek wiążący nazywa się “miejscem wiązania”. Antygenem może być, ale nie tylko, białko, glikoproteina, węglowodór lub lipid. Specyficznie wykluczone z definicji antygenu w odniesieniu do niniejszego wynalazku są peptydoglikany i cząsteczki kwasu nukleinowego, takie jak DNA lub RNA.

Zastosowany tutaj termin „bakterie Gram-dodatnie” oznacza szczep, typ, gatunek lub rodzaj bakterii, które, gdy podda się je barwieniu Grama, zatrzymuje barwnik i tak wybarwia się na niebiesko-purpurowo.

Zastosowany tutaj termin „bakterie Gram-ujemne” oznacza szczep, typ, gatunek lub rodzaj bakterii, który gdy podda się go barwieniu Grama, nie zatrzymuje barwnika i tak nie wybarwia się na niebiesko-purpurowo. Specjalista łatwo stwierdzi, oczywiście, że zależnie od stężenia barwnika oraz czasu trwania ekspozycji, bakterie Gram-ujemne mogą pochłonąć niewielką ilość barwnika Grama i wybarwić się na jasno niebiesko-purpurowo. Jednakże, w porównaniu z bakteriami Gram-dodatnimi, wybarwionymi takim samym preparatem barwnika Grama i przez taki sam okres czasu, bakterie Gram-ujemne będą znacznie słabiej niebiesko-purpurowe niż bakterie Gram-dodatnie.

Bakteryjna ściana komórkowa jest złożoną, półsztywną strukturą określającą kształt organizmu oraz otaczającą leżącą pod nią kruchą błonę cytoplazmatyczną i chroniącą komórkę bakteryjną przed środowiskiem zewnętrznym. Bakteryjna ściana komórkowa składa się z wielkocząsteczkowej sieci nazywanej peptydoglikanem, która zawiera węglowodory i polipeptydy tworzące szkielet wokół komórki bakteryjnej. Bakteryjna ściana komórkowa zapewnia komórce bakteryjnej mechaniczną stabilność i zapobiega lizie osmotycznej. Najbardziej odpowiedni, w odniesieniu do niniejszego wynalazku, jest preparat chemiczny ściany komórkowej, który stosuje się do rozróżniania głównych gatunków bakterii.

Ściany komórkowe różnych gatunków bakterii mogą znacznie różnić się grubością, strukturą i składem. Jednakże istnieją dwa dominujące typy bakteryjnej ściany komórkowej i ogólnie można stwierdzić, czy dany gatunek bakterii ma taki czy inny typ ściany komórkowej, na drodze reakcji komórki z pewnymi barwnikami. Prawdopodobnie najczęściej stosowanym barwnikiem do wybarwiania bakterii jest barwnik Grama. Przy barwieniu tym fioletem albo krystalicznym fioletem i barwnikiem

PL 215 864 B1 jodowym, bakterie zatrzymujące barwnik nazywa się Gram-dodatnimi, a te które nie zatrzymują, nazywa się Gram-ujemnymi.

Ściana bakterii Gram-dodatnich zawiera względnie gruby płaszcz peptydoglikanu. Struktura ta jest zorganizowana jako powtórzenia jednostek węglowodanowych N-acetyloglukozaminy (NAG), i kwasu N-acetylomuraminowego (NAM), połączonych przez wiązania β-1,4 glikozydowe. Reszty kwasu N-acetylomuraminowego są połączone krzyżowo z sąsiadującymi łańcuchami (NAM-NAG)x (gdzie x=jakakolwiek liczba) przez tetrapetydy, gdzie peptydy 2 i 3 mogą wykazywać pewną zmienność w naturze peptydu. Niektóre z połączeń krzyżowych wychodzą powyżej i poniżej powierzchni tworząc liczne warstwy peptydoglikanu. Polimery te otaczają powierzchnię komórki, co wyznacza kształt organizmu.

W ścianie bakterii Gram-dodatnich znajduje się lipopolimer zawierający kwasy lipotejchowe (LTA), które tworzą znaczną masę ścian komórkowych niektórych gatunków. Polimery te składają się głównie z fosforanu glicerolu (lub rybitolu). Fig. 1 przedstawia schemat typowej ściany komórkowej i błony komórkowej bakterii Gram-dodatnich. Ze względu na dużą polarność i całkowity ładunek dodatni uważa się, że struktury kwasu lipotejchowego regulują przepływ jonów i składników odżywczych do i z komórki bakteryjnej. Struktury LTA są silnie antygenowe i mogą stanowić podstawę specyficzności cząsteczkowej wymaganej do umożliwienia szerokiego wykrywania tej klasy bakterii. Ze względu na to, że kwasy lipotejchowe są powszechne w bakteriach Gram-dodatnich, procedury testowe rozpoznające tą strukturę będą wyraźnie wskazywać skażenie bakteriami Gram-dodatnimi. Ze względu na to, że struktura chemiczna polimerów kwasu lipotejchowego jest znacznie konserwowana w różnych szczepach bakterii Gram-dodatnich, podawanie sondy pozwalającej stwierdzić obecność tej struktury ściany komórkowej pozwala wykryć wiele bakterii Gram-dodatnich.

Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych jest inaczej uwarstwiona i znacznie cieńsza niż ściana bakterii Gram-ujemnych. Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych jest podobna do ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich tym, że jest zbudowana na zawierającej białka dwuwarstwie lipidowej; jednakże lipidami wewnętrznymi są fosfolipidy, a lipidami zewnętrznymi są makrocząsteczki nazywane lipopolisacharydami (LPS). Struktura LPS wytwarza silny ładunek ujemny na zewnętrznej powierzchni komórki, który jest używany do rozpoznawania i przeżycia komórki. Ta struktura LPS wytwarza także działanie toksyczne zakażenia bakteriami Gram-ujemnymi i z tego powodu jest nazywana “endotoksyną”.

Strukturę składnika LPS opisano w wielu badaniach i przedstawiono na fig. 2. Ogólnie, strukturę antygenu LPS można opisać jako zawierającą trzy odrębne regiony. Najbardziej zewnętrzny region, nazywany regionem O-specyficznym, składa się z liniowych lub rozgałęzionych łańcuchów węglowodorów, jest wysoce zmienny i zazwyczaj odrębny u poszczególnych gatunków. Testy serologiczne wykorzystują te różnice umożliwiając identyfikację poszczególnych typów bakterii Gram-ujemnych. Obecność łańcuchów O, tworzy powierzchnię gładką w wyglądzie, w obrazie mikroskopowym. W odróżnieniu od tego, te szczepy lub mutanty, które nie posiadają O-specyficznych łańcuchów bocznych, wydają się chropowate. Zatem większość szczepów typu dzikiego nazywa się szczepami „gładkimi”, natomiast mutanty pozbawione tej struktury nazywa się szczepami „chropowatymi”.

Wewnętrznie, w stosunku do regionu O-specyficznego w strukturze LPS, leży rdzeniowy region polisacharydowy, wykazujący wysoki stopień homologii pomiędzy rodzajami. Region rdzeniowy może być dalej podzielony na dwa regiony: „wewnętrzny rdzeń” i „zewnętrzny rdzeń”. Zewnętrzny rdzeń regionu rdzeniowego wykazuje pewną zmienność, ale posiada kilka elementów powszechnie występujących i ogólnie zawiera glukozę, galaktozę, N-acetyloglukozaminę i inne węglowodory. Wewnętrzny rdzeń regionu rdzeniowego wszystkich bakterii Gram-ujemnych posiadających LPS, zawiera struktury identyczne chemicznie. Rdzeń wewnętrzny składa się z reszt heptozy i 2-keto-3-deoksyoktonianu (KDO).

Najbardziej wewnętrzny składnik struktury LPS stanowi struktura lipidu A, która stanowi najbardziej jednorodną chemicznie część LPS. Lipid A składa się z disacharydu e-gIukozaminylo-(1 »6)-a-glukozaminy fosforylowanego na każdym ze swoich dystalnych końców węglowodorowych. Szkielet węglowodorowy jest acylowany w każdym z centr 2,3 i podstawiony pochodnymi kwasu mirystynowego. Zależnie od gatunku łańcuchy boczne kwasu tłuszczowego wykazują pewien niewielki stopień modyfikacji, ale te kwasy tłuszczowe wchodzą do błony komórkowej i nie są dostępne do rozpoznawania immunologicznego. Prawdopodobnie wytwarzanie przeciwciał jest spowodowane przez eksponowaną na powierzchni strukturę szkieletu disacharydu bisfosforyloglukozaminy, który jest silnie konserwowany.

PL 215 864 B1

Strukturalna zmienność struktury LPS zmniejsza się od eksponowanego na powierzchni regionu O-specyficznego do wewnętrznych i zewnętrznych regionów rdzeniowych do pochodnych disacharydowych i pogrążonego w błonie składnika lipidu A. Za przyczynę tego gradientu zmienności uważa się presję ewolucyjną wywieraną na bakterie Gram-ujemne. Możliwe jest, że bakterie zmieniały strukturę eksponowaną na swojej powierzchni w odpowiedzi na tą presję.

Tak jak w przypadku struktur kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich, struktury lipopolisacharydowe konserwowane pomiędzy rodzajami bakterii Gram-ujemnych mogą być stosowane w metodach szerokiego wykrywania in vitro tych bakterii. Te unikalne związki docelowe (kwasy lipotejchowe w bakteriach Gram-dodatnich i regiony lipidu A lub rdzeniowe struktury LPS bakterii Gram-ujemnych) stanowią podstawę metod wykrywania klas mikroorganizmów.

Zastosowany tutaj termin „środek wiążący” oznacza cząsteczkę lub ligand, z takim wyjątkiem, że środek wiążący nie jest naturalnie występującym środkiem obecnym w organizmie skrzypłocze (e.g., Limulus polyphemus) wiążącym endotoksynę. Korzystnie, środek wiążący według wynalazku nie jest zrekombinowanym środkiem wyprowadzonym ze środka obecnego w organizmie skrzypłocza (e.g., Limulus polyphemus) wiążącego endotoksynę. Środkiem wiążącym może być, ale nie tylko, przeciwciało, antybiotyk, białko, białko fuzyjne (tj. białko zawierające części dwóch lub więcej białek) lub chemiczny związek chelatujący. W pewnych korzystnych postaciach, środek wiążący według wynalazku oznacza peptyd lub peptydomimetyk. Dla celów wynalazku „peptyd” oznacza cząsteczkę złożoną z reszt aminokwasów ułożonych liniowo, połączonych ze sobą przez wiązania peptydowe. Takie peptydy według wynalazku, mogą zawierać od około trzech do około 500 aminokwasów i mogą dalej zawierać drugorzędowe, trzeciorzędowe i czwartorzędowe struktury, a także wewnątrzcząsteczkowe połączenia z innymi peptydami lub innymi cząsteczkami niepeptydowymi. Takie połączenia wewnątrzcząsteczkowe mogą być przez, ale nie tylko, wiązania kowalencyjne (np. przez mostki dwusiarczkowe) lub przez chelatowanie, oddziaływania elektrostatyczne, oddziaływania hydrofobowe, wiązania wodorowe, oddziaływania jon-dipol, oddziaływania dipol-dipol lub kombinacje powyższych.

W pewnych korzystnych postaciach, taki środek wiążący zawiera region determinujący dopasowanie (CDR) przeciwciała, które wiąże się w warunkach fizjologicznych z antygenem, zawierającym epitop struktury lipopolisacharydu (LPS) bakterii Gram-ujemnych lub struktury kwasu lipotejchowego (LTA) bakterii Gram-dodatnich lub peptydomimetyk takiego regionu determinującego dopasowanie. Dla celów wynalazku “region determinujący dopasowanie przeciwciała” oznacza część przeciwciała, która wiąże się w warunkach fizjologicznych z epitopem, włącznie z jakimikolwiek regionami zrębowymi, potrzebnymi do takiego wiązania i która korzystnie zawiera podzbiór reszt aminokwasowych kodowanych przez ludzkie geny regionów V, D i J łańcucha ciężkiego oraz V i J łańcucha lekkiego i/lub ich kombinacje. Przykłady takich korzystnych postaci obejmują przeciwciało lub pochodną przeciwciała, które korzystniej mogą być przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem ludzkim, przeciwciałem humanizowanym, przeciwciałem jednołańcuchowym, przeciwciałem chimerycznym lub fragmentem przeciwciała wiążącym antygen.

Specjaliści potrafią przygotowywać jakiekolwiek takie pochodne przeciwciał przy pomocy standardowych metod znanych w dziedzinie wynalazku. Na przykład Jones i inni. (Nature 321: 522-525 (1986)) ujawnia zastąpienie CDR ludzkiego przeciwciała tymi regionami z mysiego przeciwciała. Marx (Science 229:455-456 (1985)) ujawnia chimeryczne przeciwciała, posiadające mysie regiony zmienne i ludzkie regiony stałe. Rodwell (Nature 342: 99-100 (1989)) ujawnia elementy rozpoznające o niższej masie cząsteczkowej wyprowadzone z informacji CDR przeciwciała. Clackson (Br. J. Rheumatol. 3052: 36-39 (1991)) ujawnia przeciwciała monoklonalne stworzone na drodze inżynierii genetycznej, obejmujące pochodne fragmentu Fv, przeciwciała jednołańcuchowe, chimeryczne przeciwciała utworzone na drodze fuzji białkowych i humanizowane przeciwciała gryzoni. Reichman i inni, (Nature 332: 323-327 (1988)) ujawnia ludzkie przeciwciało na które przeniesiono szczurze regiony hiperzmienne. Verhoeyen i inni, (Science 239: 1534-1536 (1988)) opisuje przeniesienie mysiego miejsca wiążącego antygen na ludzkie przeciwciało.

Ponadto specjaliści potrafią zaprojektować i wytwarzać peptydomimetyki o charakterystyce wiązania podobnej lub nadrzędnej w stosunku do regionu determinującego dopasowanie (patrz np. Horwell i inni, Bioorg. Med Chem. 4: 1573 (1996); Liskamp i inni. Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1:113 (1994); Gante i inni, Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 33: 1699 (1994); Seebach i inni, Helv. Chim. Acta 79: 913 (1996)). Zgodnie z tym, wszystkie takie pochodne przeciwciał i peptydomimetyki przeciwciał, uważa się za objęte zakresem wynalazku. Środki według wynalazku mogą dalej zawierać dopuszczalne fizjologicznie rozcieńczalniki, środki stabilizujące, środki umiejscawiające lub bufory.

PL 215 864 B1

Dodatkowe korzystne środki wiążące według wynalazku obejmują małe cząsteczki, które można zidentyfikować stosując podejście przeszukiwania lub racjonalnego projektowania, co opisano tutaj poniżej.

Najkorzystniej środki wiążące według wynalazku są przeciwciałami, takimi jak przeciwciała poliklonalne lub przeciwciała monoklonalne i/lub pochodnymi przeciwciał. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych znane jest specjalistom w dziedzinie biologii (patrz, np. Ausubel i inni, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994). Wiele procedur znajduje zastosowanie w wytwarzaniu przeciwciał przeciw wymaganym unikalnym antygenom docelowym. Tradycyjne techniki immunizacji i zbierania, powodują wytworzenie przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciw wspólnym determinantom docelowych gatunków bakterii (LTA lub LPS). Ponadto, techniki hybrydyzacji komórkowej można zastosować do wytworzenia nieśmiertelnych linii komórek hybrydoma, które wytwarzają specyficzne przeciwciała monoklonalne przeciw docelowym gatunkom.

Przeciwciała o potencjalnym zastosowaniu w szerokim wykrywaniu bakterii Gram-dodatnich obejmują opisane w Fisher i inni, publikacja PCT nr WO 98/57994; Jackson, D.E. i inni., Infection and Immunity 43; 800 (1984); Hamada, S. i inni, Microbiol Immunol. 28: 1009 (1984); Aasjord, P. i inni, Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C, 93: 245 (1985); McDaniel L.S. i inni, Microbial Pathogenesis 3: 249 (1987); Tadler, M.B. i inni, Journal of Clinical Laboratory Analysis 3:21 (1989) oraz Stuertz, Κ. i inni, Journal of Clinical Microbiology 36: 2346 (1998).

Przeciwciała o potencjalnym zastosowaniu w szerokim wykrywaniu bakterii Gram-ujemnych obejmują opisane w Nelles, M.J. i inni. Infect. Immun. 46: 677 (1984); Teng, N.N.H. i inni, Proc. Natl Acad. Sci. USA 82: 1790 (1985); Dunn, D.L. i inni. Surgery 98: 283 (1985); De Jongh-Leuvenink, J. i inni, Eur. J. Clin. Microbiol 5: 148 (1986); Bogard, W.C. i inni, Infect. Immun. 55: 899 (1987); Pollack, M. i inni, Bacterial Endotoxins: Pathophysiological Effects, Clinical Significance, and Pharmacological Control str. 327 - 338 Alan R. Liss, Inc. (1988); Priest, B.P. i inni. Surgery 106: 147 (1989); Tyler, J.W. i inni, Journal of Immunological Methods 129: 221 (1990); Siegel, S.A. i inni. Infect. Immun. 61: 512 (1993); Shelburne, C.E. i inni, J Periodont. Res. 28: 1 (1993); Di Pardova, F.E. i inni. Infect. Immun. 61: 3863 (1993) oraz De Kievit, T.R. i Lam, J.S. J. Bacteriol 176: 7129 (1994).

Wyboru które przeciwciało(a) należy wybrać, można dokonać klasycznymi technikami. Specyficzność przeciwciała, stopień wiązania oraz kinetykę można scharakteryzować przez empiryczne badania każdego przeciwciała w empirycznym formacie. Formaty przeszukiwania przy pomocy mikromianowania są dobrze opisane w literaturze jako służące charakteryzacji specyficzności odpowiedzi przeciwciała w jakimkolwiek danym formacie testu immunologicznego. Podobnie, aktywność znakowanych wykrywalnie przeciwciał, można scharakteryzować przeprowadzając różne reakcje chemicznego sprzęgania i badając powstały produkt pod względem optymalnych prezentowanych parametrów. Przeciwciało wychwytujące i przeciwciało znakowane wykrywalnie można badać względem klinicznych izolatów bakterii z przetrzymywanych próbek płytek lub czerwonych ciałek krwi tak by naśladować przeprowadzenie ostatecznego testu tak podobnie do postaci ostatecznego produktu jak to tylko możliwe. Doświadczenie prowadzi do wybrania i optymalizacji odczynników przeciwciała do zastosowań w różnych formatach testowych opisanych poniżej. Gdy zostaną zidentyfikowane środki wiążące, empirycznie wykazujące lepsze niż opisane lub wytworzone przeciwciała, mogą one być ocenione w tym samym empirycznym formacie opisanym dla przeciwciał.

Przeciwciała monoklonalne, o specyficzności względem unikalnych pomiędzyrodzajowych celów na powierzchni komórki bakteryjnej, stosuje się do wytworzenia formatu testu wykrywającego klasy. Gdy pojedyncze klony przeciwciał nie wytwarzają wymaganego limitu czułości wykrywania dla każdego gatunku (tak jak może być w przypadku podstawień w strukturze LTA) można stosować mieszaniny przeciwciał monoklonalnych. Powiększenie czułości dla LPS możne obejmować wytworzenie poliklonalnej surowicy o szerokiej specyficzności względem różnych gatunków bakterii Gram-ujemnych. W każdym z opisanych poniżej formatów testowych przeciwciała poliklonalne mogą także być podstawione.

Jeszcze innym typem środków wiążących według wynalazku, są receptory wiążące inne niż immunoglobuliny.

Pewne korzystne sposoby wykorzystują kompleksowanie bakterii Gram-ujemnych z takimi cząsteczkami jak, ale nie tylko, czynnik przeciwpolisacharydowy Limulus (LALF), polimiksyny, kationowe białko przeciwbakteryjne (CAP18), surowiczy myloid P, magaininy, baktenecyny, Toll-podobny receptor 4 (TLR-4), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP) i białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI), a także antybiotyki, takie jak bacytracyna i inne antybiotyki. Pewne korzystne sposoby

PL 215 864 B1 wykorzystują kompleksowanie bakterii Gram-dodatnich z cząsteczkami takimi jak, ale nie tylko, białko wiążące mannozę, Toll-podobny receptor 2 (TLR-2), histatyny i antybiotyki, przy czym antybiotykiem nie jest wankomycyna ani gentamycyna. Pewne korzystne sposoby wykorzystują kompleksowanie zarówno bakterii Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich z takimi cząsteczkami jak, ale nie tylko, CD14, kationowe peptydy α-helikalne, laktoferrycyna B, płytkowe białka bakteryjne i peptydy neutrofilowe (Defenzyny). Każdy z tych środków wiążących posiada zdolność wiązania bakterii wielu rodzajów i może być wykorzystywany razem z lub niezależnie od immunologicznych odczynników kompleksujących.

Przeciwciała i środki wiążące, wskazane powyżej, można zastosować jak opisano lub zmodyfikować tak, jak jest to konieczne, z wytworzeniem użytecznego odczynnika immunologicznego.

Zgodnie z pierwszym rozwiązaniem według wynalazku, obecność lub brak wiązania można wyznaczyć standardowymi technikami, włącznie z zastosowaniem testów wiązania według wynalazku, co opisano poniżej. Ogólnie, wyznaczenie „wiązania” (tj. obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi lub preparacie z krwi) stwierdza się, gdy próbka od dawcy wiąże przynajmniej 0,5 x silniej od wiązania tła, gdzie tło stanowi próbkę krwi lub preparatu z krwi, wolnych od jakiegokolwiek skażenia bakteryjnego. Tak też, np. próbkę płytek dawcy porównuje się z tłem, zawierającym próbkę płytek, wolną od jakiegokolwiek skażenia bakteriami. Zatem gdy tło wynosi 0,1 jednostek (np. wyznaczonych przez czytnik płytek do mikromianowania), „wiązanie” stwierdza się, gdy próbka krwi dawcy lub preparatu z krwi wynosi przynajmniej 0,15 jednostek. Korzystniej, wyznaczenie „wiązania” stwierdza się, gdy próbka od dawcy wiąże przynajmniej 0,75 x silniej niż tło wiązania. Jeszcze korzystniej, wyznaczenie „wiązania” stwierdza się, gdy próbka od dawcy wiąże się przynajmniej 1,0 x silniej niż tło. Jeszcze korzystniej, wyznaczenie „wiązania” stwierdza się, gdy próbka od dawcy wiąże się przynajmniej 1,25 x silniej niż tło. Najkorzystniej, wyznaczenie „wiązania” stwierdza się, gdy próbka od dawcy wiąże się przynajmniej 1,5 x silniej niż tło.

W pewnych postaciach pierwszego rozwiązania według wynalazku, próbkę, przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu środków wiążących, poddaje się obróbce. Korzystnie, obróbka ta pozwala wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego, na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub antygenie bakterii Gram-dodatnich. Miejsce wiązania na antygenie bakteryjnym może być wyeksponowane przez, np. odcięcie antygenu ze ściany lub błony komórkowej bakterii, co wyeksponuje miejsce wiązania; zaindukowanie u bakterii wydzielania antygenu, co wyeksponuje miejsce wiązania; zlizowanie bakterii, co uwolni wewnątrzkomórkowe antygeny bakteryjne i tak wyeksponuje miejsce wiązania na antygenie lub przez zaindukowanie zmiany konformacyjnej antygenu bakteryjnego, co wyeksponuje miejsce wiązania. Takie poddanie obróbce, obejmuje mechaniczne rozerwanie komórek bakteryjnych w próbce metodami fizycznymi, włącznie z, ale nie tylko, rozbijaniem dźwiękiem, gotowaniem lub homogenizacją, przy pomocy, np. homogenizatora Dounce. Obróbka może także obejmować działanie na próbkę środkami chemicznymi przy pomocy związku lub kompozycji, takich jak detergent, roztwór zasadowy (do lizy alkalicznej), roztwór kwaśny (do lizy kwaśnej), EDTA, EGTA, jon metalu, anion, kation, środek powierzchniowo czynny, chelator i/lub enzym, przy czym obróbka eksponuje miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub na antygenie bakterii Gram-dodatnich.

W pierwszej postaci pierwszego rozwiązania według wynalazku, krew dawcy lub preparat z krwi, w których oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii, przenosi się do ssaczego biorcy. Przez “przenoszenie” rozumie się podawanie, transfuzję, transplantację lub przenoszenie krwi, produktu z krwi i/lub tkanki od ssaka dawcy do ssaka biorcy. Korzystnie ssak dawca, od którego uzyskuje się krew lub produkt krwi, oraz ssak biorca są tego samego gatunku. Zgodnie z sposobami według wynalazku, krew dawcy lub preparat z krwi dawcy można szybko zbadać na obecność jakichkolwiek skażających bakterii, bez względu na szczep lub typ skażających bakterii. Należy rozumieć, że ze względu na krótki okres rozmnażania bakterii w krwi lub preparacie z krwi, korzystne jest przetoczenie zamierzonemu biorcy krwi dawcy lub preparatu z krwi, nie zawierających znaczących klinicznie ilości bakterii, co można wyznaczyć przy pomocy wynalazku, w krótkim czasie po wykonaniu testu. Korzystnie, krew dawcy lub preparat z krwi nie zawierające znaczących klinicznie ilości bakterii, podaje się, przetaczając pacjentowi, nie później niż 42 dni po wstępnych testach, korzystniej, nie później niż 30 dni po testach, korzystniej, nie później niż 2 tygodnie po testach, korzystniej, nie później niż 7 dni po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 3 dni po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 2 dni po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 24 godziny po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 12 godzin po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 6 godzin po testach i naj16

PL 215 864 B1 korzystniej krew dawcy lub preparat z krwi w których stwierdzono brak znaczących klinicznie ilości bakterii przetacza się biorcy w czasie 3 godzin od rozpoczęcia testu. Najkorzystniej krew lub preparat z krwi oznacza pełną krew, krwiotwórcze komórki macierzyste, leukocyty, płytki, czerwone ciałka krwi, osocze lub surowicę.

W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych.

W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają antybiotyk, gdzie antybiotyk nie jest wankomycyną ani gentamycyną. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

Specjalista biolog łatwo stwierdzi, że w wynalazku można zastosować połączenia jednego lub większej liczby różnych środków wiążących. Zatem antybiotyki, specyficznie wiążące podzestaw bakterii Gram-dodatnich można połączyć z przeciwciałem, specyficznie wiążącym pozostałe bakterie Gram-dodatnie i drugim przeciwciałem specyficznie wiążącym wszystkie bakterie Gram-ujemne.

W różnych postaciach pierwszego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie pierwszą cząsteczką reporterową i środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, znakuje się wykrywalnie drugą cząsteczką reporterową. W pierwszej postaci pierwsza cząsteczka reporterowa i druga cząsteczka reporterowa są takie same. W innej postaci pierwsza cząsteczka reporterowa i druga cząsteczka reporterowa nie są takie same. Korzystnie, pierwszą lub zarówno pierwszą cząsteczką reporterowa i drugą cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu (np. zol złota lub zol srebra), cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący. “Drugorzędowy środek wiążący” oznacza środek wiążący, który specyficznie wiąże środek wiążący, specyficznie wiążący bakterie Gram-ujemne, bakterie Gram-dodatnie oraz zarówno jedne jak i drugie. Tak też, np. gdy środki wiążące, specyficznie wiążące bakterie Gram-ujemne oraz bakterie Gram-dodatnie, są monoklonalnymi przeciwciałami mysimi, drugorzędowym środkiem wiążącym może być przeciwciało przeciw-mysie.

Dla przykładu próbkę można zbadać przy pomocy analizy FACScan, ze środkami wiążącymi, specyficznie wiążącymi antygen bakterii Gram-dodatnich, wykrywalnie znakowanymi FITC oraz że, środkami wiążącymi, specyficznie wiążącymi antygen bakterii Gram-ujemnych, wykrywalnie znakowanymi rodaminą. Przeszukując pod względem wybarwienia FITC i/lub rodaminą w próbce można oznaczyć brak skażenia bakteriami Gram-dodatnimi, ale równocześnie można stwierdzić znaczący klinicznie poziom skażenia bakteriami Gram-ujemnymi. Korzystnie, gdy ta próbka krwi dawcy lub preparatu z krwi pochodzi z opakowania, opakowanie to nie powinno być zastosowane do przetoczenia.

Kowalencyjne sprzęganie cząsteczki reporterowej ze środkiem wiążącym (takim jak przeciwciało lub antybiotyk) powoduje, że środek wiążący jest wykrywalnie oznakowany. Najczęściej stosowaną cząsteczką reporterową w większości formatów testów immunologicznych dzisiaj używaną jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej. Środki wiążące zazwyczaj sprzęga się z enzymami. Na skutek tego powstaje kompleks, który zachowuje zdolność wiązania immunologicznego, ale równocześnie posiada podwyższony limit wykrywania przez wykorzystanie wzmocnienia możliwości pary enzym/substrat. W literaturze opisano dobrze ponad 20 różnych enzymów do wytwarzania koniugatów enzymatycznych. Jak dotychczas najczęściej stosowanymi są peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna i β-galaktozydaza. Wymagana charakterystyka znacznika enzymatycznego obejmuje wysoką specyficzność aktywności, niewielki rozmiar, łatwość mierzenia produktów reakcji oraz stabilność kompleksu. Peroksydazę chrzanową stosowano z substratem nadtlenkiem wodoru i następującymi barwnikami: o-fenylenodiaminą (OPD), tetrametylobenzydyną (TMB) i diaminobenzydyną (DAB). AlkaPL 215 864 B1 liczną fosfatazę stosowano z fosforanem p-nitrofenylu (PNPP) i metyloumbeliferonem. β-galaktozydaza wykorzystuje jako substrat O-nitrofenylo β-D-galaktopiranozyd (ONPG).

Tam, gdzie cząsteczką reporterową jest enzym, aktywność enzymatyczna zależy od zdolności do specyficznego wiązania docelowego ligandu (np. LPA lub LTA) przez enzymatycznie aktywny, znakowany wykrywalnie środek wiążący. Połączenie enzymu z przeciwciałem nie powinno znacząco wpływać na zdolność środka wiążącego do specyficznego wiązania cząsteczki docelowej i nie powinno znacząco wpływać na aktywność katalityczn ą enzymu. Typowe reakcje łączenia krzyżowego, wykorzystują pewien typ hetero- lub homo-bifunkcyjnych odczynników do chemicznego wiązania tych dwóch cząsteczek razem. W handlu dostępne są systemy, gotowe do zastosowania przez niespecjalistę.

Alternatywami znaczników enzymatycznych jako cząsteczek reporterowych są znaczniki cząstkowe. Mogą one obejmować cząstki lateksu; impregnowane barwnikiem cząstki lateksu oraz cząstki metalu, takiego jak złoto lub srebro. Koniugaty z cząstkami są stosowne do wizualizacji w momencie zakończenia testu. W handlu dostępne są cząstki o rozmiarach od nanometrów do mikrometrów. Rozmiar cząstek jest istotny gdyż wpływa na detekcję w momencie zakończenia testu. Cząstki lateksowe, a także cząstki metalu są dostępne z różnymi reaktywnymi chemicznie resztami umieszczonymi na powierzchni. Producenci przygotowują je tak, by można było zastosować alternatywne procedury sprzęgania.

Zatem, środek wiążący według wynalazku można wykrywalnie znakować cząsteczką reporterową przez wytworzenie połączenia międzycząsteczkowego lub wykrywalnie znakować przez cząsteczki pośrednie dla cząsteczki reporterowej przez połączenie międzycząsteczkowe. Takie połączenia międzycząsteczkowe można wytworzyć przez, ale nie tylko, wiązanie kowalencyjne (np. mostek dwusiarczkowy) lub chelatowanie, oddziaływania elektrostatyczne, oddziaływania hydrofobowe, wiązania wodorowe, oddziaływania jon-dipol, oddziaływania dipol-dipol lub kombinacje powyższych. Korzystne cząsteczki reporterowe obejmują ale nie tylko, radioizotopy, metale ciężkie, znaczniki fluorescencyjne, znaczniki barwne, znaczniki chemoluminescencyjne, enzymy i substraty enzymów. Korzystne próbki biologiczne obejmują krew, surowicę, osocze, czerwone ciałka krwi, płytki i białe ciałka krwi. W pewnych postaciach sposoby według tego rozwiązania według wynalazku przybierają postać standardowych testów immunologicznych, takich jak ELISA lub RIA. W innych korzystnych postaciach, w sposobie stosuje się bezpośrednio lub pośrednio immunofluorescencję.

W korzystnych postaciach pierwszego rozwiązania według wynalazku zestaw środków wiążących jest unieruchomiony na złożu z fazą stałą (np. na płytce do mikromianowania).

W drugim rozwiązaniu wynalazek dostarcza sposobu stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w krwi dawcy lub preparacie z krwi, od ssaka dawcy przed przeniesieniem ssakowi biorcy. Sposób ten obejmuje poddanie próbki krwi dawcy lub preparatu z krwi, działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich cząsteczka reporterowa dawcy lub preparacie z krwi, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w krwi dawcy lub preparacie z krwi. Korzystnie ssak dawca i/lub biorca jest człowiekiem lub zwierzęciem domowym.

W trzecim rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposobu stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w krwi dawcy lub preparacie z krwi od ssaka dawcy, przed przeniesieniem do ssaka biorcy. Sposób według tego rozwiązania obejmuje poddanie próbki krwi lub preparatu z krwi, działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w krwi dawcy lub preparacie z krwi, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w krwi dawcy lub preparacie z krwi. Korzystnie ssak dawca i/lub biorca jest człowiekiem lub zwierzęciem domowym.

Zgodnie z drugim i trzecim rozwiązaniem według wynalazku terminy „wiązanie”, „antygen”, „krew lub preparat z krwi”, „bakterie Gram-dodatnie”, „bakterie Gram-ujemne”, „znacząca klinicznie ilość”, „specyficznie wiąże” oraz „środek wiążący” oznaczają jak zdefiniowano powyżej. Należy podkreślić, że w sposoby według pierwszego, drugiego i trzeciego rozwiązania według wynalazku, można wykorzystywać równocześnie z testami zgodności próby AB0, próby Rh i/lub próby MHC pomiędzy ssakiem dawcą i biorcą.

PL 215 864 B1

W pewnych postaciach drugiego i trzeciego rozwiązania według wynalazku, próbkę, przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu środków wiążących, poddaje się obróbce. Korzystnie, obróbka ta pozwala wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-dodatnich lub antygenie bakterii Gram-ujemnych. Sposoby poddawania próbki obróbce eksponującej miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-dodatnich lub antygenie bakterii Gram-ujemnych są takie jak opisano w pierwszym rozwiązaniu według wynalazku.

W pewnych postaciach, krew dawcy lub preparat z krwi, w których oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich, podaje się, zgodnie ze sposobami według drugiego rozwiązania według wynalazku, ssakowi biorcy. W pewnych postaciach, krew dawcy lub preparat z krwi, w których oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, podaje się, zgodnie ze sposobami według drugiego rozwiązania według wynalazku, ssakowi biorcy. Korzystnie ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku.

W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają antybiotyk, gdzie antybiotyk ten nie jest wankomycyną ani gentamycyną. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych.

W czwartym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi od ssaka dawcy, przed przeniesieniem do ssaka biorcy, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką krwi dawcy lub preparatu z krwi, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi i brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi dawcy lub preparacie z krwi. W korzystnej postaci ssak dawca i ssak biorca są tego samego gatunku.

Zgodnie z czwartym rozwiązaniem według wynalazku terminy „wiązanie, „antygen”, „krew lub preparat z krwi”, „bakterie Gram-ujemne”, „bakterie Gram-dodatnie”, „znacząca klinicznie ilość”, „specyficznie wiąże” oraz „środek wiążący” oznaczają jak zdefiniowano powyżej.

Użyty tutaj termin „środki do wykrywania wiązania” oznacza jakąkolwiek metodę znaną w dziedzinie wynalazku, stosowaną do wykrywania wiązania środka wiążącego z docelowym ligandem (tj. strukturami antygenów LPS lub LTA). Korzystne środki do wykrywania wiązania obejmują testy immunologiczne opisane poniżej. Różne „środki do wykrywania wiązania” są znane specjaliście biologowi i obejmują, ale nie tylko, analizę przepływu bocznego, ELISA, RIA, analizę FACScan, analizę Western blott, immunoprecypitację, testy aglutynacji, testy oparte na cząstkach oraz testy rozdzielające i testy nierozdzielające. Testy rozdzielające („heterogenne”) są to testy, w których rozdzielane są związane i wolne składniki znakowane. Testy nierozdzielające („homogenne”) są to testy w których wiązanie znakowanych cząstek z dodatkowym środkiem wiążącym, zmienia właściwości znacznika, w związku z tym związane i wolne składniki można rozróżnić bez etapu rozdziału. Testy rozdzielające można podzielić na dwa podstawowe formaty, testy współzawodnictwa, w których analit i znakowany analit współzawodniczą o ograniczoną liczbę miejsc wiązania i testy kanapkowe („ekstrakcyjne”), w których odczynnik w nadmiarze ekstrahuje analit z próbki. Odczynniki i próbki można mieszać równocześnie lub kolejno, zależnie od wykonywanego protokołu. W celu zwiększenia czułości testu, jeden ze składników może być oznakowany substancją mogącą wzmocnić sygnał, w celu wykrycia niewielkiej liczby zdarzeń wiązania, może to obejmować izotopy radioaktywne, barwniki fluorescencyjne, enzymy, związki chemiluminescencyjne, atomy metalu, zole lub związki metali, stabilne wolne rodniki, wirusy lub bakteriofagi, kofaktory, lateksowe substancje cząstkowe, czerwone ciałka krwi, przeciwciaPL 215 864 B1 ła, inhibitory, apoenzymy, substancje elektroaktywne, czynniki zmatowiające, uczulacze widmowe, kolorowe barwniki, barwniki fosforescencyjne, liposomy i elektrofory.

Należy rozumieć, że w którymkolwiek z tych środków do wykrywania in vitro można zastosować automatyzację w celu wykonania i/lub zanalizowania wyników testu.

W pewnych postaciach czwartego rozwiązania według wynalazku, zestaw dalej zawiera środki do poddania próbki obróbce, pozwalającej wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub na antygenie bakterii Gram-dodatnich.

Termin „środki do poddania obróbce”, oznacza jakikolwiek sposób lub obróbkę, które eksponują miejsce wiązania środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub na antygenie bakterii Gram-dodatnich. Takie środki obejmują, ale nie tylko, działanie fizyczne, włącznie z homogenizacją (przy pomocy, np. homogenizatura Dounce), sonikacją i gotowaniem. Inne „środki do poddania obróbce” obejmują działanie na próbkę chemicznymi roztworami lub związkami, włącznie z, ale nie tylko, detergentami (np. SDS lub triton-X), roztworami do lizy alkalicznej (np. roztworem zasadowym), roztworami do lizy kwaśnej (np. roztworem kwaśnym), EDTA, EGTA, środkami powierzchniowo czynnymi, jonami metalu, kationami, anionami, związkami chelatującymi i enzymami.

W jednej postaci czwartego rozwiązania według wynalazku, krew dawcy lub preparat z krwi, w których oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii podaje się ssakowi biorcy, gdzie ssak dawca od którego pobrano próbkę krwi lub preparatu z krwi i ssak biorca są tego samego gatunku. Korzystnie zestaw według wynalazku przechowuje się w miejscu (np. w szpitalu) gdzie pacjentowi biorcy zostanie przetoczona krew dawcy lub preparat z krwi. Stosując zestaw według wynalazku, leczący specjalista opieki zdrowotnej może szybko stwierdzić, czy krew dawcy jest wolna od znaczącej klinicznie ilości skażających bakterii. Gdy taka analiza zostanie przeprowadzona, stwierdza się, że krew lub preparat z krwi są wolne od znaczących klinicznie ilości skażających bakterii i krew lub preparat z krwi mogą być przetoczone pacjentowi biorcy.

W korzystnych postaciach czwartego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych. W pewnej korzystnej postaci środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają antybiotyk, gdzie antybiotyk nie jest wankomycyną ani gentamycyną. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

W różnych postaciach czwartego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie pierwszą cząsteczką reporterową a środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, znakuje się wykrywalnie drugą cząsteczką reporterową. W jednej postaci, pierwsza cząsteczka reporterowa i druga cząsteczka reporterowa są takie same. W innej postaci, pierwsza cząsteczka reporterowa i druga cząsteczka reporterowa nie są takie same. Korzystnie, pierwszą lub zarówno pierwszą i drugą cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząstka (np. cząstka zolu złota lub cząstka lateksu), cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący. Takie znakowane wykrywalnie środki wiążące z zestawu według wynalazku opisano powyżej. Należy rozumieć, że gdy środki wiążące są wyznakowane wykrywalnie cząsteczkami reporterowymi będącymi cząsteczkami o aktywności enzymatycznej, zestaw według wynalazku zawiera także substrat dla enzymu.

W korzystnej postaci czwartego rozwiązania według wynalazku zestaw środków wiążących unieruchamia się na złożu w fazie stałej (np. płytce do mikromianowania).

W piątym rozwiązaniu wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich, w krwi dawcy lub preparacie z krwi od ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, zawierającego zestaw środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz

PL 215 864 B1 środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką krwi lub preparatu z krwi, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w krwi dawcy lub preparacie z krwi, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w krwi dawcy lub preparacie z krwi. W korzystnej postaci ssak dawca i/lub ssak biorca jest człowiekiem lub zwierzęciem domowym.

W szóstym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, w krwi dawcy lub preparacie z krwi od ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, zawierającego zestaw środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką krwi lub preparatu z krwi, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w krwi dawcy lub preparacie z krwi, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w krwi dawcy lub preparacie z krwi. W korzystnej postaci ssak dawca i/lub ssak biorca jest człowiekiem lub zwierzęciem domowym.

Zgodnie z piątym i szóstym rozwiązaniem według wynalazku, terminy „środki do wiązania”, „wiązanie”, „antygen”, „krew lub preparat z krwi”, „bakterie Gram-ujemne”, „bakterie Gram-dodatnie”, „znacząca klinicznie ilość”, „specyficznie wiąże” oraz „środek wiążący” oznaczają jak zdefiniowano powyżej.

W korzystnych postaciach piątego i szóstego rozwiązania według wynalazku, zestaw dalej zawiera środki do poddania próbki obróbce, gdzie obróbka ta eksponuje miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub antygenie bakterii Gram-dodatnich. Termin “środki do poddania obróbce” zdefiniowano w czwartym rozwiązaniu według wynalazku.

Którykolwiek z zestawów według czwartego, piątego i szóstego rozwiązania według wynalazku, można wykorzystywać równocześnie z testami zgodności próby AB0, próby Rh i/lub próby MHC pomiędzy krwią lub preparatem z krwi dawcy i biorcą. Korzystnie krew dawcy lub preparat krwi wolne od znaczących klinicznie ilości bakterii, podaje się w postaci transfuzji pacjentowi nie później niż 42 dni po wstępnych testach, korzystniej, nie później niż 30 dni po testach, korzystniej, nie później niż 2 tygodnie po testach, korzystniej, nie później niż 7 dni po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 3 dni po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 2 dni po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 24 godziny po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 12 godzin po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 6 godzin po testach i najkorzystniej krew dawcy lub preparat z krwi w których stwierdzono brak znaczących klinicznie ilości bakterii przetacza się biorcy w czasie 3 godzin od rozpoczęcia testu. Najkorzystniej, krew lub preparat z krwi oznacza pełną krew, krwiotwórcze komórki macierzyste, leukocyty, płytki, czerwone ciałka krwi, osocze lub surowicę.

Wynalazek dostarcza także sposoby i zestawy do badania pod względem obecności jakiegokolwiek skażenia bakteriami w tkance lub organie dawcy przez transplantacją tkanki lub organu dawcy ssakowi biorcy, który korzystnie jest tego samego gatunku co dawca. Tkanki i organy dawcy standardowo przechowuje się, jakkolwiek krótko, w płynie, takim jak roztwór soli fizjologicznej lub odżywczy bufor do przechowywania. Obecność bakterii w płynie do przechowywania wskazuje na obecność bakterii skażających w tkance. Takie skażające bakterie mogą przyspieszyć odrzucenie przeszczepionej tkanki lub organu przez ssaka biorcę. Zgodnie z tym, w siódmym rozwiązaniu wynalazek dostarcza sposobu poszukiwania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w tkance ssaka, gdzie tkankę przechowuje się w płynie, obejmującego poddanie próbki płynu działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących obejmuje środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie wskazuje obecność znaczących klinicznie ilości bakterii w tkance dawcy, a brak wiązania wskazuje brak znaczących klinicznie ilości bakterii tkance dawcy. W korzystnej postaci ssak dawca i/lub ssak biorca jest człowiekiem lub zwierzęciem domowym.

Zgodnie z siódmym rozwiązaniem według wynalazku, terminy „wiązanie”, „antygen”, „bakterie Gram-ujemne”, „bakterie Gram-dodatnie”, „znacząca klinicznie ilość”, „specyficznie wiąże” oraz „środek wiążący” oznaczają jak zdefiniowano powyżej.

Termin „tkanka” oznacza każdą tkankę lub organ organizmu. Przykłady tkanek według wynalazku obejmują, ale nie tylko, nerkę, wątrobę, serce, skórę, szpik kostny, śledzionę, grasicę, trzustkę, jelita i tkankę nerwową.

PL 215 864 B1

W pewnych korzystnych postaciach siódmego rozwiązania według wynalazku, próbkę, przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu środków wiążących, poddaje się obróbce. W pewnych postaciach obróbka ta pozwala wyeksponować miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub antygenie bakterii Gram-dodatnich. Sposoby obróbki pozwalającej wyeksponować miejsce wiązania na środku wiążącym antygenu bakterii Gram-ujemnych i antygenu bakterii Gram-dodatnich opisano dla pierwszego rozwiązania według wynalazku. W pewnych postaciach siódmego rozwiązania według wynalazku, tkankę dawcy, w której oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii przenosi się do ssaka biorcy. Korzystnie ssak dawca, od którego uzyskano tkankę i ssak biorca, są tego samego gatunku. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, obejmują przeciwciała lub pochodne przeciwciał, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, zawierają cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej czynnik przeciw-lipopolisacharydowy Limulus (LALF), białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI) oraz antybiotyk, taki jak polimiksyna lub bakitracyna. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, specyficznie wiążą się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych. W pewnych korzystnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają przeciwciała lub pochodne przeciwciał specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich. W pewnych postaciach, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, zawierają antybiotyk, gdzie antybiotyk nie jest wankomycyną ani gentamycyną. Korzystnie, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, specyficznie wiążą strukturę kwasu lipotejchowego bakterii Gram-dodatnich.

W różnych postaciach siódmego rozwiązania według wynalazku, środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, znakuje się wykrywalnie pierwszą cząsteczką reporterową i środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, znakuje się wykrywalnie drugą cząsteczką reporterową. W pewnych postaciach pierwsza cząsteczka reporterowa i druga cząsteczka reporterowa są takie same. W innej postaci pierwsza cząsteczka reporterowa i druga cząsteczka reporterowa nie są takie same. Korzystnie, pierwszą lub zarówno pierwszą cząsteczką reporterową i drugą cząsteczką reporterową jest cząsteczka o aktywności enzymatycznej, cząsteczka znakowana radioaktywnie, cząsteczka fuzyjna, cząsteczka fluorogenna, zol metalu, cząstka, cząsteczka barwna lub cząsteczka specyficznie wiązana przez drugorzędowy środek wiążący.

W korzystnej postaci siódmego rozwiązania według wynalazku, zestaw środków wiążących unieruchamia się na złożu w fazie stałej (np. płytce do mikromianowania).

W ósmym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposobu stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w tkance ssaka dawcy przed przeniesieniem ssakowi biorcy, gdzie tkankę przechowuje się w płynie, obejmującego poddanie próbki płynu działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w tkance dawcy, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w tkance dawcy. Korzystnie ssak dawca i/lub biorca jest człowiekiem lub zwierzęciem domowym.

W dziewiątym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposobu stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w tkance ssaka dawcy przed przeniesieniem ssakowi biorcy, gdzie tkankę przechowuje się w płynie, obejmującego poddanie próbki płynu działaniu zestawu środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz wyznaczenie wiązania zestawu środków wiążących z próbką, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w tkance dawcy i brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w tkance dawcy. Korzystnie ssak dawca i/lub biorca jest człowiekiem lub zwierzęciem domowym.

Zgodnie z ósmym i dziewiątym rozwiązaniem według wynalazku, terminy „wiązanie”, „antygen”, „tkanka”, „bakterie Gram-ujemne”, „bakterie Gram-dodatnie”, „znacząca klinicznie ilość”, „specyficznie wiąże” oraz „środek wiążący” oznaczają jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie, sposoby według siódmego, ósmego i dziewiątego rozwiązania według wynalazku można wykorzystywać równocześnie z testami zgodności próby AB0, próby Rh i/lub próby MHC pomiędzy ssakiem dawcą i biorcą.

W pewnych postaciach ósmego i dziewiątego rozwiązania według wynalazku, próbkę, przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu środków wiążących, poddaje się obróbce. Sposoby ob22

PL 215 864 B1 róbki próbki w celu wyeksponowania miejsca wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-dodatnich lub antygenie bakterii Gram-ujemnych opisano dla pierwszego rozwiązania według wynalazku.

W pewnych postaciach ósmego i dziewiątego rozwiązania według wynalazku, tkankę dawcy w której oznaczono brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych lub brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich, przenosi się do ssaka biorcy. Korzystnie ssak dawca od którego uzyskano tkankę i ssak biorca są tego samego gatunku.

W dziesiątym rozwiązaniu wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w tkance ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, gdzie tkankę przechowuje się w płynie, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką płynu, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii w tkance dawcy, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii w tkance dawcy. W korzystnej postaci ssak dawca i/lub ssak biorca jest człowiekiem lub zwierzęciem domowym.

W jedenastym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich, w tkance ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, gdzie tkankę przechowuje się w płynie, zawierającego zestaw środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-dodatnich, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką płynu, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w tkance dawcy, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w tkance dawcy. W korzystnej postaci ssak dawca i/lub ssak biorca jest człowiekiem lub zwierzęciem domowym.

W dwunastym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza zestaw do stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, w tkance ssaka dawcy, przed przeniesieniem ssakowi biorcy, gdzie tkankę przechowuje się w płynie, zawierającego zestaw środków wiążących, gdzie zestaw środków wiążących zawiera środki wiążące, specyficznie wiążące antygen bakterii Gram-ujemnych, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących z próbką płynu, gdzie wiązanie oznacza obecność znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w tkance, a brak wiązania oznacza brak znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych w tkance dawcy. W korzystnej postaci ssak dawca i/lub ssak biorca jest człowiekiem lub zwierzęciem domowym.

Zgodnie z dziesiątym, jedenastym i dwunastym rozwiązaniem według wynalazku terminy „środki do wiązania”, „wiązanie”, „antygen”, „tkanka”, „bakterie Gram-ujemne”, „bakterie Gram-dodatnie”, „znacząca klinicznie ilość”, „specyficznie wiąże” oraz „środek wiążący” oznaczają jak zdefiniowano powyżej. W korzystnych postaciach jedenastego i dwunastego rozwiązania według wynalazku, zestaw dalej zawiera środki do poddania próbki obróbce, gdzie obróbka ta eksponuje miejsce wiązania dla środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub antygenie bakterii Gram-dodatnich.

W pewnych postaciach dziesiątego, jedenastego i dwunastego rozwiązania według wynalazku, zestaw dalej zawiera środki do poddania próbki obróbce, gdzie obróbka ta pozwoli wyeksponować miejsce wiązania środka wiążącego na antygenie bakterii Gram-ujemnych lub na antygenie bakterii Gram-dodatnich. Środki do obróbki próbki opisano dla czwartego rozwiązania według wynalazku. W różnych postaciach, tkankę w której stwierdzono brak znaczących klinicznie ilości bakterii przenosi się do ssaka biorcy. Korzystnie, ssak dawca, od którego uzyskano tkankę, i ssak biorca są tych samych gatunków.

Korzystnie, zestaw według wynalazku przechowuje się w miejscu (np. w szpitalu) gdzie pacjentowi biorcy zostanie podana tkanka dawcy, przez, np. przeszczepienie lub przetoczenie. Stosując zestaw według wynalazku leczący specjalista opieki zdrowotnej może szybko stwierdzić, czy tkanka dawcy jest wolna od znaczącej klinicznie ilości skażających bakterii. Gdy taka analiza zostanie przeprowadzona i stwierdzi się, że tkanka dawcy jest wolna od znaczących klinicznie ilości skażających bakterii tkanka dawcy może być przeszczepiona biorcy.

Którykolwiek z zestawów według dziesiątego, jedenastego i dwunastego rozwiązania według wynalazku można wykorzystywać równocześnie z testami zgodności próby AB0, próby Rh i/lub próby MHC pomiędzy tkanką dawcy i biorcą. Korzystnie, tkankę dawcy bada się sposobami i zestawami według siódmego, ósmego, dziewiątego, dziesiątego, jedenastego i dwunastego rozwiązania według wynalazku, względnie krótko przed przeszczepieniem tkanki. Korzystnie, tkankę dawcy przeszczepia się pacjentowi nie później niż 42 dni po wstępnych testach, korzystniej, nie później niż 30 dni po tePL 215 864 B1 stach, korzystniej, nie później niż 2 tygodnie po testach, korzystniej, nie później niż 7 dni po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 3 dni po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 2 dni po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 24 godziny po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 12 godzin po testach, jeszcze korzystniej, nie później niż 6 godzin po testach i najkorzystniej tkankę dawcy, w której stwierdzono brak znaczących klinicznie ilości bakterii, przeszczepia się biorcy w czasie 3 godzin od rozpoczęcia testu.

Jakkolwiek niewyczerpująco, wiele potencjalnych formatów testów immunologicznych opisano w poniższych przykładach, które, gdy stosuje się je razem ze środkiem specyficznie wiążącym LTA lub LPS mogą stworzyć pan-rodzajowy test do wykrywania klas bakterii. Zatem poniższe przykłady dalej ilustrują pewne szczególnie korzystne postaci wynalazku i nie ograniczają one zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d I

Sposób wykrywania in vitro bakterii według wynalazku, można przeprowadzić w formacie standardowego testu immunologicznego. W tym podejściu, środki wiążące, specyficznie wiążące region antygenowy ściany bakteryjnej, można zastosować jako cele w testach immunologicznych i mogą one stanowić podstawę wykrywania in vitro bakterii w preparatach z krwi. Schemat urządzenia stosowanego w tym przykładzie przedstawiono na fig. 3A-3D. W jednej postaci środki wiążące, specyficznie wiążące bakterie Gram-dodatnie, bakterie Gram-ujemne lub obydwa typy bakterii, łączono razem i następnie dzielono w przybliżeniu na dwie części, tak by dwie populacje środków wiążących były mieszaniną środków wiążących. Jedną populację wiązano z błoną na podstawie urządzenia przedstawionego na fig. 3A-3D. Drugą populację stosowano do powlekania zabarwionych jasno cząstek lateksu (tj. cząstki lateksu powleczone środkiem wiążącym impregnowano barwnikiem jak by były one intensywnie kolorowe).

W innej postaci, ten sam środek wiążący (tj. wszystkie cząsteczki środka wiążącego, specyficznie rozpoznające ten sam epitop antygenu) dzielono na dwie populacje. Ponownie jedną populację wiązano z błoną na dnie urządzenia z fig. 3A-3D, podczas gdy drugą populację stosowano do powleczenia zabarwionych jasno cząstek lateksu. Można było zastosować ten sam środek wiążący (tj. cząsteczki specyficznie wiążące ten sam epitop), gdyż na powierzchni bakterii obecnych jest wiele miejsc rozpoznawanych.

Kulki, powleczone środkiem wiążącym, umieszczano w urządzeniu, tak, że nie wiązały się one z błoną.

Stosując urządzenie przedstawione na fig. 3A-3D, do wykrycia in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi lub preparacie z krwi, wykonano następujące czynności. Najpierw próbkę ekstrahowano w jałowych warunkach z krwi dawcy lub preparatu z krwi dawcy. Próbka może zostać także wyekstrahowana z płynu, w którym przechowywany był organ lub tkanka dawcy (np. z odżywczego płynu do przechowywania, w którym przechowywano nerkę).

Następnie odpowiednią objętość próbki naniesiono na urządzenie testowe, jak przedstawiono na fig. 3A-3D. Próbka mogła być badana bezpośrednio (tj. nie rozcieńczona lub nie poddana obróbce) lub mogła być rozcieńczona odczynnikiem buforującym/ekstrahującym lub mogła być poddana obróbce fizycznej lub chemicznej, przy czym obróbka ta eksponowała miejsce wiązania dla środka wiążącego na bakteriach (lub ich antygenach) obecnych w próbce. Tak też, np. obróbka taka mogła powodować rozbicie ściany komórkowej. W innym przykładzie obróbka mogła spowodować odcięcie antygenu ze ściany komórkowej i tak wyeksponować miejsce wiązania na antygenie.

Próbka przebywała zamierzoną drogę w urządzeniu ze względu na nasiąkanie błony absorpcyjnej. Bakterie obecne w próbce wiązały się z cząstkami lateksowymi znakowanymi środkiem wiążącym.

Próbka mieszała się z cząstkami lateksowymi znakowanymi środkiem wiążącym i przemieszczała się po błonie absorpcyjnej do określonego wcześniej regionu, gdzie zostały unieruchomione przeciwciała przeciwbakteryjne. Te unieruchomione środki wiążące, wychwytywały kompleksy bakterii i kolorowych lateksowych cząstek powleczonych środkami przeciwbakteryjnymi i na skutek tego powstawały kolorowe plamy, co wskazywało na pozytywny wynik testu.

P r z y k ł a d II

W innej postaci sposobu opisanego w przykładzie I, środkami wiążącymi związanymi z cząstkami lateksowymi, były środki wiążące, specyficznie rozpoznające bakterie Gram-ujemne lub bakterie Gram-dodatnie lub obydwa typy. Jednakże, każdy z tych przeciwbakteryjnych środków wiążących posiadał epitop wspólny dla wszystkich środków wiążących. W tym przykładzie wszystkie przeciwbakteryjne

PL 215 864 B1 środki wiążące były mysimi przeciwciałami. Związane z błoną środki wiążące, nie wiązały specyficznie bakterii, a raczej wiązały one specyficznie determinanty mysie na stałym regionie mysich przeciwciał przeciwbakteryjnych. Te przeciwmysie środki wiążące, nazywa się drugorzędowymi środkami wiążącymi, gdyż nie wiążą one specyficznie bakterii, ale raczej specyficznie wiążą środek wiążący specyficznie związany z bakterią.

P r z y k ł a d III

Jeszcze jednym sposobem wykrycia in vitro znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi, preparacie z krwi lub płynie z tkanki dawcy jest test aglutynacji. W tym przykładzie testu aglutynacji stosowano lateksowe cząstki, powlekane środkami wiążącymi, specyficznie wiążącymi bakterie. Lateksowe cząstki aglutynowały w obecności znaczących klinicznie ilości bakterii. Pozytywną reakcję obserwowano jako powstawanie wzoru aglutynacji. W negatywnej reakcji lateks nie aglutynował i mleczna barwa pozostawała zasadniczo niezmieniona.

W tym sposobie stosowano urządzenie testowe przedstawione na fig. 4A-4D. Próbkę ekstrahowaną w jałowych warunkach z krwi dawcy lub preparatu z krwi dawcy i nanoszono na urządzenie. Inaczej na urządzenie nanoszono próbkę, ekstrahowaną z płynu w którym przechowywany był organ lub tkanka dawcy. Próbka mogła być badana bezpośrednio (tj. nie rozcieńczona lub nie poddana obróbce), mogła być rozcieńczona odczynnikiem buforującym/ekstrahującym lub mogła być poddana obróbce fizycznej lub chemicznej, przy czym obróbka ta eksponowała miejsce wiązania dla środka wiążącego na bakteriach (lub ich antygenach) obecnych w próbce. Następnie do próbki biologicznej w urządzeniu testowym dodawano cząstki lateksowe powleczone środkami wiążącymi, specyficznie wiążącymi bakterie. Zawartość mieszano, aby uzyskać homogenność składników.

Bakterie w próbkach biologicznych specyficznie wiązały przeciwciała przeciwbakteryjne na cząstkach lateksowych. Ze względu na obecność wielu miejsc antygenowych na powierzchni bakterii, cząstki lateksowe, powleczone przeciwciałami, tworzyły mostki pomiędzy przyległymi komórkami bakteryjnymi. W obecności znaczących klinicznie ilości komórek bakteryjnych, w próbce biologicznej, powstawała usieciowana struktura. Powyżej znaczących klinicznie ilości bakterii w próbce (co zdefiniowano powyżej), struktura rozrastała się do momentu gdy stawała się widoczna w naczyniu testowym jako wzór „aglutynacji”. Po wyznaczonym wcześniej okresie czasu, pozwalającym na wzrost takiej struktury, odczytywano wyniki i obecność antygenów bakteryjnych wywoływała tworzenie charakterystycznego wzoru przedstawionego na fig. 4D.

P r z y k ł a d IV

W jeszcze innym sposobie wykrywania in vitro znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi lub preparacie z krwi, stosowano format standardowego enzymatycznego testu immunoadsorbcyjnego (ELISA). W formacie testu ELISA na płytkach do mikromianowania (np. 96 - studzienkowych) wykorzystywano wiele oddzielnych studzienek reakcyjnych, z których każda zawierała unikalne środowisko testowe. Format płytek do mikromianowania pozwalał uzyskać wyższą sprawność testu, stosowanie automatyzacji przy rozdzielaniu prób, dodawaniu odczynników, wykrywaniu reakcji i ilościowej oceny wyników. Opracowanie testu ELISA na płytkach do mikromianowania jest dobrze znane i stosowane. Do wykrywania cząsteczek o dużej masie cząsteczkowej o wielu miejscach wiązania, tak jak jest w przypadku bakteryjnych antygenów powierzchniowych, korzystnym formatem jest kanapkowy test immunologiczny. Testy kanapkowe konstruowano umieszczając biernie lub kowalencyjnie środek wiążący, specyficznie wiążący bakterie Gram-ujemne lub Gram-dodatnie (lub oba typy) na polistyrenowej (lub wytworzonej z innego materiału) powierzchni płytki do mikromianowania, tak, że środek wiążący ulegał adhezji na powierzchni studzienki płytki do mikromianowania. Detekcję immunologiczną przeprowadzano w następujący sposób.

Najpierw próbkę ekstrahowano w jałowych warunkach z krwi dawcy lub preparatu z krwi dawcy, lub płynu, w którym przechowywany był organ lub tkanka dawcy. Próbka mogła być rozcieńczona lub nie rozcieńczona lub mogła być poddana obróbce, tak że obróbka ta eksponowała miejsce wiązania dla środka wiążącego na bakteriach (lub ich antygenach) obecnych w próbce. Odpowiednią objętość próbki nakładano do studzienki testowej. Bakterie obecne w próbce biologicznej tworzyły specyficzny kompleks z przeciwbakteryjnymi środkami wiążącymi, związanymi na powierzchni płytki do mikromianowania. Następnie studzienkę odsysano (lub zlewano z niej płyn), aby usunąć niezwiązaną próbkę ze studzienki. Następnie do studzienki dodawano specjalnie przygotowany roztwór do przemywania, aby wymyć bakterie nie związane specyficznie (oraz inne składniki próbki) z powierzchni studzienki płytki do mikromianowania.

PL 215 864 B1

Następnie, do studzienki reakcyjnej dodawano roztwór zawierający środek wiążący, wykrywalnie oznakowany cząsteczką reporterową. Wykrywalnie oznakowany środek wiążący w roztworze specyficznie wiązał antygen wyznaczając typ bakterii obecnych w próbce biologicznej i mógł on być inny lub taki sam jak środek wiążący związany na powierzchni. Wykrywalnie oznakowany środek wiążący był chemicznie sprzężony z cząsteczką reporterową (cząsteczką reporterową o aktywności enzymatycznej, specyficznie w przypadku testu ELISA) która była wykorzystywana do uwidocznienia braku lub obecności bakterii w próbce. Należy zwrócić uwagę, że cząsteczka reporterowa mogła być wybrana z wielu różnych cząsteczek i wybrano ją tak by minimalizowała oddziaływania z reakcją wiązania przeciwciała. W enzymatycznych testach immunoadsorbcyjnych (ELISA) zazwyczaj stosuje się enzymy, ale można tu także stosować inne cząsteczki reporterowe, włącznie z, ale nie tylko, chromoforami, fluoroforami, radioizotopami, związkami chemiluminescencyjnymi, związkami czynnymi elektrochemicznie, metalami, cząstkami, cząstkami magnetycznymi i drugorzędowymi znacznikami, takimi jak biotyna/awidyna lub inne podobne cząsteczki. Wykrywalnie znakowany środek wiążący, powstały w wyniku chemicznego sprzężenia specyficznego środka wiążącego z cząsteczką reporterową, pozostawiano do skompleksowania z antybakteryjnym środkiem wiążącym / kompleksem bakterii z wytworzeniem przeciwbakteryjnego środka wiążącego/bakterii/ oznakowanego przeciwbakteryjnego środka wiążącego “kanapki”.

Po określonym okresie czasu roztwór wykrywalnie oznakowanego środka wiążącego usuwano ze studzienki. Następnie studzienkę płukano, specjalnie przygotowanym roztworem płuczącym, w celu oddzielenia związanego koniugatu od niezwiązanego koniugatu w studzience płytki do mikromianowania.

Specyficznie związany, wykrywalnie oznakowany środek wiążący, można wykryć odpowiednimi sposobami. Obejmują one bezpośredni pomiar w przypadku fluoroforów, chromoforów, związków chemiluminescencyjnych i związków elektroczynnych i pomiar pośredni, w przypadku znaczników takich jak enzymy. Liczba specyficznie związanych, wykrywalnie oznakowanych środków wiążących była bezpośrednio proporcjonalna do ilości bakterii obecnych w próbce biologicznej. Proporcjonalność ta stanowiła podstawę metod ilościowych, które zastosowano do specyficznego wyznaczenia ilości bakterii obecnych w próbce. Można było wyznaczyć standardową krzywą odpowiedzi przez pomiar odpowiedzi specyficznie związanego, wykrywalnie oznakowanego środka wiążącego w funkcji znanych ilości bakterii obecnych w próbkach kalibracyjnych. Interpolacja wyników ze standardowej krzywej odpowiedzi opisywała stężenie bakterii w nieznanej próbce biologicznej.

P r z y k ł a d V

W dodatkowym sposobie stwierdzania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi, preparacie z krwi lub płynie w którym przechowywana jest tkanka dawcy, stosuje się immunologiczny test współzawodnictwa. W rzeczywistości, format immunologicznego testu współzawodniczego jest korzystny w przypadku wykrywania cząsteczek o małej masie cząsteczkowej z pojedynczym miejscem wiązania, takich jak struktury lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych. Immunologiczne testy współzawodnictwa konstruowano przez bierne lub kowalencyjne umieszczenie środka wiążącego, specyficznie wiążącego strukturę wydzielanego LPS (takiego jak środek wiążący część lipidu A struktury LPS) na powierzchni polistyrenowej (lub z innego materiału) studzienki płytki do mikromianowania, tak, że środek wiążący ulegał adhezji na powierzchni studzienki płytki do mikromianowania.

W jednym z przykładów, tego immunologicznego testu współzawodnictwa do wykrywania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, wykrywanie immunologiczne przeprowadzano w następujący sposób. Najpierw próbkę ekstrahowano w jałowych warunkach z krwi dawcy lub preparatu z krwi dawcy lub płynu w którym przechowywany był organ lub tkanka dawcy. Próbka mogła być rozcieńczona lub nie rozcieńczona lub mogła być poddana obróbce, tak że obróbka ta eksponowała miejsce wiązania dla środka wiążącego na bakteriach Gram-ujemnych (lub ich antygenach), takich jak miejsce wiązania lipidu A będącego składnikiem LPS. Odpowiednią objętość próbki nakładano do studzienki testowej zawierającej środek wiążący specyficznie wiążący LPS. Równocześnie lub później, do studzienki testowej nakładano odpowiednią objętość roztworu zawierającego wykrywalnie wyznakowane cząsteczki LPS. Wyznakowane wykrywalnie cząsteczki LPS w tym roztworze specyficznie wiązały się ze środkiem wiążącym w studzience testowej. Wykrywalnie wyznakowana cząsteczka była chemicznie sprzężona z cząsteczką reporterową (cząsteczką reporterową o aktywności enzymatycznej, specyficznie w przypadku testu ELISA), która była wykorzystywana do uwidocznienia braku lub obecności bakterii w próbce. Należy zwrócić uwagę, że cząsteczką reporterową mogła być cząsteczka wybrana z grupy różnych cząsteczek i wybrano ją tak by minimalizowała oddziały26

PL 215 864 B1 wania z reakcją wiązania przeciwciała. W enzymatycznych testach immunoadsorbcyjnych (ELISA) zazwyczaj stosuje się enzymy, ale można tu także stosować inne cząsteczki reporterowe, włącznie z, ale nie tylko, chromoforami, fluoroforami, radioizotopami, związkami chemiluminescencyjnymi, związkami czynnymi elektrochemicznie, metalami, cząstkami, cząstkami magnetycznymi i drugorzędowymi znacznikami, takimi jak biotyna/awidyna lub inne podobne cząsteczki. Wykrywalnie znakowaną cząsteczkę LPS pozostawiano do skompleksowania z unieruchomionym środkiem wiążącym, w obecności LPS, pochodzącego ze ściany komórkowej, do ustalenia równowagi wiązania. Korzystnie studzienką testową była studzienka płytki do mikromianowania.

Po określonym okresie czasu, roztwór wykrywalnie wyznakowanych cząsteczek LPS/LPS pochodzącego z komórek skażających bakterii usuwano ze studzienki. Następnie studzienkę płukano specjalnie przygotowanym roztworem płuczącym, w celu oddzielenia związanego koniugatu od niezwiązanego koniugatu w studzience płytki do mikromianowania. Równowaga wiązania ustalona w studzience testowej, była funkcją stężenia LPS pochodzącego z komórek. Przy braku w próbce jakichkolwiek skażających znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-ujemnych, a zatem braku LPS pochodzącego z komórek, wykrywalnie wyznakowane cząsteczki LPS były skompleksowane ze środkiem wiążącym związanym na powierzchni. Przy podwyższonych poziomach bakterii, a zatem podwyższonych poziomach LPS pochodzącego z komórek bakterii skażających, wiązanie ze środkiem wiążącym, związanym na powierzchni, było podzielone pomiędzy dwoma rodzajami cząsteczek LPS zależnie od stężenia. Przy niskich stężeniach LPS pochodzącego z komórek skażających bakterii, większość miejsc wiązania środka wiążącego była skompleksowana z wykrywalnie wyznakowanymi cząsteczkami LPS i obserwowano podwyższony poziom sygnału reporterowego. Przy wysokich stężeniach LPS pochodzącego z komórek skażających bakterii, większość miejsc wiązania środka wiążącego była skompleksowana z LPS pochodzącym z komórek skażających bakterii i obserwowano obniżony poziom sygnału reporterowego. Zatem liczba specyficznie związanych wykrywalnie wyznakowanych cząsteczek LPS była odwrotnie proporcjonalna do ilości skażających bakterii Gram-ujemnych obecnych w próbce biologicznej. W oparciu o pomiar odpowiedzi wykrywalnie wyznakowanych cząsteczek LPS w funkcji znanych ilości bakterii obecnych w próbkach kalibracyjnych można było wyznaczyć standardową krzywą odpowiedzi na dawkę. Interpolacja wyników ze standardowej krzywej odpowiedzi opisywała stężenie bakterii Gram-ujemnych w nieznanej próbce biologicznej.

P r z y k ł a d Vl

W jeszcze innym sposobie wykrywania in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii w krwi lub preparacie z krwi, stosuje się format homogennego testu immunologicznego. Homogenny test immunologiczny charakteryzuje się zdolnością równoczesnego mierzenia związanych i wolnych składników reakcji kompleksacji czynnik wiążący-ligand. Właściwości znacznika modyfikuje się po związaniu komplementarnego odczynnika, tak że rozdział związanych i niezwiązanych odczynników nie jest konieczny.

Najpierw próbkę ekstrahowano w jałowych warunkach z krwi dawcy lub preparatu z krwi dawcy lub płynu w którym przechowywany był organ lub tkanka dawcy. Odpowiednią objętość badanej próbki zmieszano z odczynnikiem poddającym obróbce, tak żeby mogły być wytworzone małe fragmenty struktury ściany komórkowej. Taki odczynnik może zawierać (ale nie tylko) środki powierzchniowo czynne, środki chelatujące i enzymy degradujące natywną strukturę antygenową na subskładniki o mniejszych masach cząsteczkowych. Ponadto, aby rozbić ścianę komórkową na subskładniki, można zastosować mechaniczną fragmentację (taką jak sonikacja) lub energię kinetyczną (taką jak gotowanie). W tym przykładzie, obróbka eksponuje miejsce wiązania środka wiążącego na bakteriach Gram-ujemnych lub ich antygen przez wywołanie usunięcia i degradacji struktury lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych z odsłonięciem jego struktury lipidu A lub jednostek rdzenia.

Próbkę fragmentów zdegradowanych ścian komórkowych mieszano z odczynnikiem zawierającym antygen lipid A (lub rdzeń) chemicznie sprzężony ze znacznikiem fluorescencyjnym. Do mieszaniny reakcyjnej dodano znaną ilość środka wiążącego przeciw lipidowi A (lub przeciw rdzeniowi). Antygeny związane ze środkiem wiążącym wykazywały obniżony poziom rotacji cząsteczek, podczas gdy niezwiązane wykazywały względnie podwyższony poziom rotacji cząsteczek. W polu spolaryzowanego światła, spolaryzowane światło preferencyjnie wzbudzało te cząsteczki, które znajdowały się równolegle do powierzchni padającego światła. Orientacja rodzajów emisji określała stopień polaryzacji emitowanego światła. Gdy pozycja cząsteczkowa emitujących cząsteczek była względnie stabilna, fluorescencja była częściowo spolaryzowana. Gdy zamiast będąc utrwalonymi cząsteczki znajdywały się w stanie gwałtownej oscylacji ruch cząsteczek obniżał stopień polaryzacji. Światło fluorescencyjne

PL 215 864 B1 emitowane przez mieszaninę reagentów: fragmentów ściany komórkowej - antygenu lipidu A (lub rdzenia) z jakichkolwiek skażających bakterii Gram-ujemnych obecnych w próbce, znakowanego fluorescencyjnie lipidu A (lub rdzenia) oraz środka wiążącego, pokazywało wysoki stopień polaryzacji światła przy niskim poziomie fragmentów ściany komórkowej - lipidu A (lub rdzenia) (tj. niskim poziomie skażenia próbki bakteriami), a niski stopień polaryzacji światła przy wysokim poziomie fragmentów ściany komórkowej lipidu A (lub rdzenia) (tj. wysokim poziomie skażenia próbki bakteriami Gram-ujemnymi), w porównaniu ze środkiem wiążącym plus znakowanym fluorescencyjnie lipidem A (lub rdzeniem) bez dodania próbki. Tą odpowiedź różnych poziomów polaryzacji światła w funkcji fragmentów ściany komórkowej - lipidu A (lub rdzenia) można zastosować jako podstawę testu wiązania do wyznaczenia nieznanych stężeń lipidu A (lub rdzenia) i ostatecznie wyznaczenia obecności lub braku bakterii Gram-ujemnych w próbce.

Przy stosowaniu przeciwciał jako środka wiążącego powyższa technologia wykrywania jest dobrze znana w dziedzinie wynalazku jako test immunologiczny polaryzacji fluorescencji, pokrewne techniki obejmują test immunologiczny wyciszania fluorescencji, wykonywany w czasie test fluoroimmunologiczny (time resolved fluoroimmunoassay), test immunologiczny wzmacniania fluorescencji, test immunologiczny przeniesienia wzbudzenia fluorescencji oraz test immunologiczny uwalniania fluoroforu. Ponadto, jako alternatywny format homogennego testu immunologicznego, do wykrywania mniejszych fragmentów składników bakteryjnej ściany komórkowej (a co za tym idzie wyznaczenia obecności lub braku skażenia bakteriami) można zastosować modulację aktywności enzymatycznej w funkcji kompleksacji środka wiążącego. Każde z tych rozwiązań jest dobrze udokumentowane i znane specjalistom w dziedzinie wynalazku.

P r z y k ł a d VII

Modyfikacją sposobu opisanego w przykładzie VI jest stwierdzanie in vitro obecności znaczących klinicznie ilości bakterii Gram-dodatnich w próbce zebranej z krwi dawcy, preparatu z krwi dawcy i/lub płynu w którym jest przechowywana tkanka dawcy. W tym przykładzie próbkę ekstrahowano w jałowych warunkach z krwi dawcy lub preparatu z krwi dawcy lub płynu w którym przechowywany był organ lub tkanka dawcy. Odpowiednią objętość badanej próbki zmieszano z odczynnikiem poddającym wstępnej obróbce, tak żeby mogły być wytworzone małe fragmenty struktury ściany komórkowej. Obróbka ta, eksponująca miejsce wiązania środka wiążącego na bakteriach Gram-dodatnich (lub ich antygen), może być podziałanie odczynnikami, takimi jak środki powierzchniowo czynne, środki chelatujące i enzymy degradujące natywną strukturę antygenową na sub-składniki o mniejszych masach cząsteczkowych. Obróbkę tą można wykonać także, przy pomocy mechanicznej fragmentacji (takiej jak sonikacja) lub energii kinetycznej (takiej jak gotowanie) w celu rozbicia ściany komórkowej na sub-składniki, co pozwoli wyeksponować miejsce wiązania środka wiążącego na antygenicznym składniku struktury LTA. Jednym specyficznym przykładem może być izolacja łańcucha poli(glicerolofosforanu) z struktur kwasu lipotejchowego. Specjaliści w dziedzinie wynalazku mogą łatwo przewidzieć struktury ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich.

Następnie próbkę fragmentów zdegradowanej ściany komórkowej mieszano z odczynnikiem zawierającym antygen poli(glicerolofosforanu), który sprzężono chemicznie ze znacznikiem enzymatycznym z wytworzeniem koniugatu enzymatycznego. Koniugację z enzymem wykonano w taki sposób, że po skompleksowaniu ze środkiem wiążącym aktywność enzymatyczna koniugatu jest modulowana. Przez maskowanie miejsca czynnego lub zmiany konformacyjne enzymu aktywność enzymu była zmniejszona, gdy środek wiążący był skompleksowany z koniugatem enzymu, natomiast aktywność enzymu była odtworzona, gdy środek wiążący nie był skompleksowany z koniugatem. Ta modulacja aktywności enzymatycznej stanowi podstawę często stosowanego formatu testu tiomogennego.

Następnie znaną ilość środka wiążącego przeciwpoli (glicerolofosforanowi) dodawano do mieszaniny reakcyjnej zawierającej stałą ilość środka wiążącego i koniugatu enzymu. Ponadto dodano znaną objętość krwi (lub preparatu z krwi lub płynu z tkanki) poddanych obróbce w celu rozłożenia składników bakteryjnej ściany komórkowej. Gdy w krwi, preparacie z krwi lub próbce płynu tkanki dawcy nie było obecnych bakterii, dostępne miejsca wiązania na środku wiążącym były skompleksowane z koniugatem enzymu. Koniugat enzymu wykazywał obniżony poziom aktywności enzymatycznej w stanie związanym, i przekształcanie substratu było minimalne. Przy wysokim poziomie antygenu, pochodzącego ze ściany komórkowej przy wysokim poziomie skażających bakterii Gram-dodatnich obecnych w próbce, większość miejsc wiązania na środki wiążące było zajętych przez natywny antygen ściany komórkowej (np. poli(glicerolofosforan), co pozwalało koniugatowi enzyma28

PL 215 864 B1 tycznemu istnieć w stanie nieskompleksowanym. W tym nieskompleksowanym stanie aktywność enzymatyczna była odtworzona i obserwowano podwyższony poziom obrotu substratu.

W niewielkiej odmianie tej procedury, stosuje się fragmenty enzymu z których jeden jest znakowany fragmentem antygenu. W obecności środka wiążącego, fragment enzymu był niedostępny do stworzenia kompleksu z dodatkowym fragmentem wymaganym do stworzenia całego funkcjonalnego enzymu. Gdy środek wiążący został skompleksowany z antygenem pochodzącym ze ściany komórkowej skażających bakterii Gram-dodatnich obecnych w próbce, był on dostępny do stworzenia kompleksu z fragmentami enzymu, co pozwalało im połączyć się i stworzyć działający enzym. Odmiany tych rozwiązań są dobrze znane i rozumiane przez specjalistów jako formaty testów enzymatycznych modulacji wiązania.

P r z y k ł a d VIII

Modyfikacje testów opisanych w przykładach IV, V, VI i VII, obejmują zastosowanie automatycznego sprzętu analitycznego do przeprowadzenia testu i obliczenia wyników. Automatyzacja pozwala zastosować technologię w formacie bardziej powtarzalnym, co prowadzi do polepszenia sprawności testu, a także obniżenia poziomu detekcji skażenia bakteriami. Wiele kompleksowych systemów immunologicznych jest dostępnych w handlu i są one rutynowo stosowane do immunodiagnostycznych badań w centralnych laboratoriach szpitalnych. Łatwo można dostosować zastosowanie opisanej powyżej technologii do któregokolwiek z tych zautomatyzowanych systemów. Zastosowanie metod rozdziału różnych faz (fazy stałej, fazy ciekłej, cząstek magnetycznych, dzielenia na podstawie ładunku elektrycznego itd.) można także umieścić w tym ujawnieniu. Analogicznie, inne sposoby detekcji (takie jak tworzenie barwników, fluorogenne, elektrochemiczne, chemiluminescencyjne lub radiometryczne) mogą być podobnie uważane za możliwe modyfikacje metod detekcji układów, znakowanych wykrywalnie środków wiążących, a także odpowiadających im zmian układów detekcji w zautomatyzowanym układzie testowym.

P r z y k ł a d IX

Pan-rodzajową specyficzność dwóch reprezentatywnych, nieograniczających środków wiążących według wynalazku, oceniono badając struktury antygenów powierzchniowych zarówno bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych. Środkiem wiążącym, specyficznie wiążącym antygen bakterii Gram-dodatnich, dokładnie kwas lipotejchowy, było przeciwciało monoklonalne klon 96-110 ((IgGl) (opisane w Fisher i inni, publikacja PCT nr WO 98/57994). Środkiem wiążącym, specyficznie wiążącym antygen bakterii Gram-ujemnych, dokładnie lipid A, było przeciwciało monoklonalne klon 26-5 (IgG2b) (dostępne w handlu z Biodesign International, Saco, Maine, nr katalogowy C61212M).

Czternaście bakterii wybrano do scharakteryzowania: 7 gatunków bakterii Gram-dodatnich i 7 gatunków bakterii Gram-ujemnych (patrz odpowiednio fig. 5 i 6). Bakterie te wybrano ponieważ reprezentują one gatunki bakterii, które zidentyfikowano podczas trzech głównych narodowych badań transfuzji (włącznie z badaniem BaCon w Stanach Zjednoczonych Ameryki, badaniem Hemovigilance we Francji i badaniem SHOT w Wielkiej Brytanii).

W celu scharakteryzowania wiązania bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych z, odpowiednio, przeciwciałem monoklonalnym przeciw kwasowi lipotejchowemu i przeciwciałem monoklonalnym przeciw lipidowi A, szczepy bakterii z izolacji klinicznych wysiano smugą na płytkach agarowych z 5% krwią owczą (BBL) i hodowano przez noc w 37°C. Powstałe kolonie zaszczepiono do pożywki Tryptic Soy Broth (30 mg/ml, Sigma) w PBS i hodowano z wytrząsaniem przez noc w 37°C. Bakterie policzono przez pomiar zmętnienia przy 620 nm. Całe komórki bakterii odwirowano do osadu przy 5000 rpm przez 15 minut. Osady bakterii zawieszono w PBS do około 10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml w soli buforowanej fosforanem (PBS). Po 100 μΐ zawiesiny bakterii dodano każdej studzienki pojedynczego rzędu 96-studzienkowej płytki do mikromianowania. Czynności te powtórzono dla każdego z siedmiu gatunków bakterii Gram-dodatnich i każdego z siedmiu gatunków bakterii Gram-ujemnych. Płytki inkubowano przez godzinę 37°C i przechowywano przez noc w 4°C. Następnie płytki przemyto pięciokrotnie 200 μl/studzienkę 0,05% Tween-20 i przechowywano wysuszone w -20°C do czasu wykorzystania.

Aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie, płytki powleczone bakteriami blokowano 300 μ^studzienkę roztworu 5% mleka w proszku/0,05% Tween-20 w PBS. Płytki blokowano przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie przemyto 3X roztworem PBS/Tween. Środki wiążące (przeciwciało monoklonalne przeciw kwasowi lipotejchowemu i przeciwciało monoklonalne przeciw lipidowi A) rozcieńczono do stężenia 5 μ^ w PBS zawierającym 4% BSA i 0,05% Tween-20. Roztwory zmieszano i przefiltrowano przez 0,22 μm filtry. Do każdej studzienki dodano po 100 μΐ roztworu i środki

PL 215 864 B1 wiążące pozostawiono do związania przez 1 godzinę w 37°C. Następnie płytki przemyto 5 razy 0,05% Tween-20. Dostępne w handlu drugorzędowe przeciwciało, koniugat koziego przeciwciała przeciwmysiej IgG (ciężkim i lekkim łańcuchom) z HRP rozcieńczono 1:5000 w PBS/1,5% BSA i 0,05% Tween-20. Do każdej studzienki dodano po 200 μΐ drugorzędowego przeciwciała i drugorzędowe przeciwciało pozostawiono do związania na 1 godzinę w 37°C. Następnie płytki przemyto raz PBS/0,05% Tween i trzy razy samą PBS. W celu ilościowej oceny wiązania bakterii do każdej studzienki dodano po 200 μl substratu peroksydazy TMB (Sigma). Absorbcję (OD 370 nm) odczytano w formacie kinetycznym w czytniku do płytek do mikromianowania Dynax.

Jak przedstawiono odpowiednio na fig. 5 i 6, każdy gatunek z siedmiu bakterii Gram-dodatnich i siedmiu bakterii Gram-ujemnych był specyficznie rozpoznany przez przeciwciało monoklonalne przeciw kwasowi lipotejchowemu (Gram-dodatnie; fig. 5) i przeciwciało monoklonalne przeciw lipidowi A (Gram-ujemne; fig. 6) (średnie wartości z trzecich powtórzeń doświadczeń wykreślono w funkcji każdej z rozpoznawanych bakterii). Fig. 5 i 6 pokazują, że stopień rozpoznania różnił się pomiędzy gatunkami bakterii, ale we wszystkich przypadkach bakterii, odczyt przekraczał poziom podstawowy przynajmniej dwukrotnie. Dane te jasno pokazują przydatność stosowania wspólnych środków wiążących do pan-rodzajowego rozpoznawania zarówno bakterii Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich. Bakterie te są szczególnie interesujące, gdyż stanowią one dokładnie szczepy, zidentyfikowane jako środki wywołujące reakcje po transfuzji.

Claims (32)

1. Sposób wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę krwi dawcy, preparat krwi dawcy lub płyn z zestawem środków wiążących obejmującym przeciwciało specyficznie wiążące się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych i wykazujące pangeneryczną swoistość względem bakterii Gram-ujemnych, i/lub przeciwciało specyficznie wiążące się ze strukturą kwasu lipotejchojowego bakterii Gram-dodatnich oraz wykazujące pangeneryczną swoistość względem bakterii Gram-dodatnich, następnie wykrywa się wiązania zestawu środków wiążących z próbką oraz oznacza się ilość bakterii obecną we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub płynie, przy czym klinicznie znacząca ilość wynosi ponad 1 x 10⁶ jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii na ml krwi dawcy, preparatu krwi dawcy lub płynu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę poddaje się obróbce przed lub równocześnie z poddaniem próbki działaniu zestawu środków wiążących lub przeciwciała.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że obróbka pozwala wyeksponować miejsce wiązania środka wiążącego na strukturze lipopolisacharydu lub na strukturze kwasu lipotejchojowego.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że krew lub preparat krwi dawcy, wybiera się z grupy obejmującej pełną krew, leukocyty, krwiotwórcze komórki macierzyste, płytki, czerwone ciałka krwi, osocze i surowicę.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała specyficznie wiążące się ze strukturą lipopolisacharydu, znakuje się wykrywalnie pierwszą cząsteczką reporterową, a przeciwciała, specyficznie wiążące się ze strukturą kwasu lipotejchojowego, znakuje się wykrywalnie drugą cząsteczką reporterową.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że pierwsza cząsteczka reporterowa i druga cząsteczka reporterowa są takie same lub nie są takie same.

7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że przynajmniej jedna spośród pierwszej cząsteczki reporterowej i drugiej cząsteczki reporterowej jest wybrana z grupy obejmującej cząsteczkę o aktywności enzymatycznej, cząsteczkę znakowaną radioaktywnie, cząsteczkę fuzyjną, cząsteczkę fluorogenną, zol metalu, znacznik cząstkowy, cząsteczkę barwną lub cząsteczkę specyficznie wiązaną przez drugorzędowy środek wiążący.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała specyficznie wiążące się ze strukturą kwasu lipotejchojowego, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że cząsteczka reporterowa jest wybrana z grupy obejmującej cząsteczkę o aktywności enzymatycznej, cząsteczkę znakowaną radioaktywnie, czą30

PL 215 864 B1 steczkę fuzyjną, cząsteczkę fluorogenną, zol metalu, cząstkę, cząsteczkę barwną lub cząsteczkę specyficznie wiązaną przez drugorzędowy środek wiążący.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała specyficznie wiążące się ze strukturą lipopolisacharydu, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że cząsteczka reporterowa jest wybrana z grupy obejmującej cząsteczkę o aktywności enzymatycznej, cząsteczkę znakowaną radioaktywnie, cząsteczkę fuzyjną, cząsteczkę fluorogenną, zol metalu, cząstkę, cząsteczkę barwną lub cząsteczkę specyficznie wiązaną przez drugorzędowy środek wiążący.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zestaw środków wiążących lub przeciwciało jest unieruchomione na fazie stałej.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że fazę stałą stanowi płytka do mikromianowania.

14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przynajmniej jednym spośród ssaka dawcy i ssaka biorcy jest człowiek lub zwierzę udomowione.

₅

15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że klinicznie znacząca ilość wynosi ponad 1 x 10⁵ jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii na ml krwi dawcy, preparatu krwi dawcy lub płynu.

16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że klinicznie znacząca ilość wynosi ponad 1 x 10⁴ jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii na ml krwi dawcy, preparatu krwi dawcy lub płynu.

₃

17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że klinicznie znacząca ilość wynosi ponad 1 x 10³ jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii na ml krwi dawcy, preparatu krwi dawcy lub płynu.

18. Zastosowanie zestawu do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, przy czym zestaw ten zawiera zestaw środków wiążących obejmujący przeciwciało specyficznie wiążące się ze strukturą lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych i wykazujące pangeneryczną swoistość względem bakterii Gram-ujemnych, i/lub przeciwciało specyficznie wiążące się ze strukturą kwasu lipotejchojowego bakterii Gram-dodatnich oraz wykazujące pangeneryczną swoistość względem bakterii Gram-dodatnich, oraz środki do wykrywania wiązania zestawu środków wiążących do próbki krwi dawcy, preparatu krwi dawcy lub płynu, przy czym, że przeciwciało specyficznie wiążące strukturę lipopolisacharydu jest wykrywalnie oznaczone pierwszą cząsteczką reporterową, a przeciwciało specyficznie wiążące strukturę kwasu lipotejchojowego jest wykrywalnie oznaczone drugą cząsteczką reporterową.

19. Zastosowanie zestawu według zastrz. 18, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że zestaw zawiera reagent do obróbki próbki krwi dawcy, preparatu krwi dawcy lub płynu, przy czym obróbka eksponuje miejsce wiązania środka wiążącego na strukturze lipopolisacharydu lub na strukturze kwasu lipotejchojowego.

20. Zastosowanie zestawu według zastrz. 18, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że krew lub preparat krwi dawcy są wybrane z grupy obejmującej pełną krew, leukocyty, krwiotwórcze komórki macierzyste, płytki, czerwone ciałka krwi, osocze i surowicę.

21. Zastosowanie zestawu według zastrz. 18, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że przeciwciała specyficznie wiążące strukturę lipopolisacharydu znakuje się wykrywalnie pierwszą cząsteczką reporterową oraz przeciwciała specyficznie wiążące kwas lipotejchojowy znakuje wykrywalnie się drugą cząsteczką reporterową.

22. Zastosowanie zestawu według zastrz. 21, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że pierwsza cząsteczka reporterowa i druga cząsteczka reporterowa są takie same lub nie są takie same.

23. Zastosowanie zestawu według zastrz. 21, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje

PL 215 864 B1 się w płynie, znamienne tym, że przynajmniej jedna spośród pierwszej cząsteczki reporterowej i drugiej cząsteczki reporterowej jest wybrana z grupy obejmującej cząsteczkę o aktywności enzymatycznej, cząsteczkę znakowaną radioaktywnie, cząsteczkę fuzyjną, cząsteczkę fluorogenną, zol metalu, znacznik cząstkowy, cząsteczkę barwną i cząsteczkę specyficznie wiązaną przez drugorzędowy środek wiążący.

24. Zastosowanie zestawu według zastrz. 18, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że przeciwciała specyficznie wiążące się ze strukturą kwasu lipotejchojowego, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową.

25. Zastosowanie zestawu według zastrz. 24, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że cząsteczka reporterowa jest wybrana z grupy obejmującej cząsteczkę o aktywności enzymatycznej, cząsteczkę znakowaną radioaktywnie, cząsteczkę fuzyjną, cząsteczkę fluorogenną, zol metalu, cząstkę, cząsteczkę barwną lub cząsteczkę specyficznie wiązaną przez drugorzędowy środek wiążący.

26. Zastosowanie zestawu według zastrz. 18, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że przeciwciała specyficznie wiążące się ze strukturą lipopolisacharydu, znakuje się wykrywalnie cząsteczką reporterową.

27. Zastosowanie zestawu według zastrz. 26, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że cząsteczka reporterowa jest wybrana z grupy obejmującej cząsteczkę o aktywności enzymatycznej, cząsteczkę znakowaną radioaktywnie, cząsteczkę fuzyjną, cząsteczkę fluorogenną, zol metalu, cząstkę, cząsteczkę barwną lub cząsteczkę specyficznie wiązaną przez drugorzędowy środek wiążący.

28. Zastosowanie zestawu według zastrz. 18, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że przeciwciało jest unieruchomione na fazie stałej.

29. Zastosowanie zestawu według zastrz. 28, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że fazę stałą stanowi płytka do mikromianowania.

30. Zastosowanie zestawu według zastrz. 18, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje ₅ się w płynie, znamienne tym, że klinicznie znacząca ilość wynosi ponad 1 x 10⁵ jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii na ml krwi dawcy, preparatu krwi dawcy lub płynu.

31. Zastosowanie zestawu według zastrz. 18, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje się w płynie, znamienne tym, że klinicznie znacząca ilość wynosi ponad 1 x 10⁴ jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii na ml krwi dawcy, preparatu krwi dawcy lub płynu.

32. Zastosowanie zestawu według zastrz. 18, do wykrywania in vitro obecności klinicznie znaczącej ilości bakterii we krwi dawcy, preparacie krwi dawcy lub tkance dawcy od ssaka dawcy, w celu przekazania do ssaka odbiorcy przez transfuzję lub transplantację, którą to tkankę dawcy przechowuje ₃ się w płynie, znamienne tym, że klinicznie znacząca ilość wynosi ponad 1 x 10³ jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii na ml krwi dawcy, preparatu krwi dawcy lub płynu.