JP2001264332A - 臨床診断用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 保存安定性の優れた臨床診断用担体を提供す
る。 【解決手段】 特異的結合物質（ｃ）を固定化した不溶
性担体を、少なくとも一種のアミノ酸（ａ）を含有する
安定化剤（ｂ）で被覆してなることを特徴とする臨床診
断用担体を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臨床診断用担体に
関する。さらに詳しくは、特異的結合物質を固定化した
不溶性担体の保存安定性に優れ、長期にわたって測定対
象物を精度良く測定することができる臨床診断用担体に
関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、特異的結合物質を固定化した不溶
性担体（以下、固定化不溶性担体と略する。）の保存安
定性を向上させる方法として、固定化不溶性担体を、糖
類を含有する溶液中に浸漬したのち乾燥させる方法（例
えば、特公平２−６７３号公報）や、固定化不溶性担体
を、糖類と蛋白質とを含有する溶液中に浸漬したのち乾
燥させる方法（例えば、特開平０９−３１８６２８号公
報、特公平５−４１９４６号公報）などが知られてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来の方法で安定化さ
れた固定化不溶性担体は、冷蔵条件（２〜１０℃）で乾
燥状態を維持することにより、安定保存することができ
る。しかし、乾燥状態を維持するため乾燥剤などの配慮
が必要であり、吸湿した場合に不安定となるため、その
取り扱いに大きな注意を払う必要があるという問題点が
あった。さらに、室温条件（１５〜３０℃）では、乾燥
状態であっても全く安定保存することができないという
問題点があった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記問題点
を解決するため鋭意検討した結果、固定化不溶性担体
を、特定の安定化剤で被覆することにより、固定化不溶
性担体の保存安定性が飛躍的に向上することを見出し、
本発明に到達した。すなわち、本発明の臨床診断用担体
の特徴は、特異的結合物質（ｃ）を固定化した不溶性担
体を、少なくとも一種のアミノ酸（ａ）を含有する安定
化剤（ｂ）で被覆してなる点にある。

【０００５】

【発明実施の形態】本発明において、特異的結合物質
（ｃ）は、物質(ｃ１)に特異的に結合する物質（ｃ２）
であり、従来ヘテロジニアスな免疫測定で用いられる物
が全て使用できる。すなわち、物質（ｃ１）が抗原の場
合、物質（ｃ２）は、抗原に対する抗体である。物質
（ｃ１）が抗体の場合、物質（ｃ２）は、抗体が認識す
る抗原である。物質（ｃ１）が糖鎖の場合、物質（ｃ
２）は、レクチンである。物質（ｃ１）がビオチンの場
合、物質（ｃ２）は、アビジンである。物質（ｃ１）が
遺伝子の場合、物質（ｃ２）は、相補的な遺伝子であ
る。物質（ｃ１）及び物質（ｃ２）は、抗原及び抗体の
場合と同様に、その一方を特異的結合物質（ｃ）として
使用できる。また、物質（ｃ１）に特異的に結合する物
質（ｃ２）と、物質（ｃ２）に特異的に結合する物質
（ｃ３）を組み合わせて特異的結合物質（ｃ）として用
いることも可能である。

【０００６】具体的な抗体としては、例えば、次の抗原
に対する抗体が使用でき、該抗原としては、薬剤、低分
子ホルモン、癌マーカー、ウイルス、高分子ホルモン、
サイトカイン、各種グロスファクター、更に前記ウイル
スの適当なＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。薬剤とし
ては、例えば、テオフィリン、フェニトイン、バルプロ
酸などが挙げられる。低分子ホルモンとしては、例え
ば、サイロキシン、エストロゲン、エストラジオールな
どが挙げられる。癌マーカーとしては、例えば、ＣＥ
Ａ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９などが挙げられる。ウイルス
としては、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどが挙げ
られる。高分子ホルモンとしては、例えば、甲状腺刺激
ホルモン、インシュリンなどが挙げられる。サイトカイ
ンとしては、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６な
どが挙げられる。各種グロスファクターとしては、例え
ば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなどが挙げられる。これらの抗体
は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であ
ってもよく、さらに抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）
２、Ｆａｂ’、Ｆａｂであってもよい。

【０００７】具体的なレクチンとしては、コンカナバリ
ンＡ（コンカナバリンＡは、Ｃ−３,Ｃ−４,Ｃ−６位の
水酸基が未置換のα−Ｄ−Ｍａｎを２残基以上含む糖鎖
に特異的に結合する。）、ドリコスマメレクチン（ドリ
コスマメレクチンは、Ｄ−ＧａｌＮＡｃに特異的に結合
する。）、ダツラレクチン（ダツラレクチンは、キチン
オリゴ糖及びＮ−アセチルラクトサミンに特異的に結合
する。）、デイゴマメレクチン（デイゴマメレクチン
は、Ｎ−アセチルラクトサミン構造を持つアスパラギン
複合型糖鎖に特異的に結合する。）、フコースバインデ
ィングプロテイン（フコースバインディンダプロティン
は、Ｇａｌなどの２位に結合したα−Ｌ−Ｆｕｃに特異
的に結合する。）などが使用できる。

【０００８】本発明において用いられる担体としては、
特開平２−２０５７７４号公報に記載の担体、例えば、
ガラスなどの無機物、ポリスチレンなどの有機物の担体
が使用できる。担体の形状は、使用する目的に合わせて
自由に決定でき、例えば、真球状や円盤状のビーズ、板
状や棒状のスティック、試験管、不織布やフィルターの
ストリップなどの形状が使用できる。この中で、ビーズ
が好ましく、真球状のビーズが特に好ましい。担体の大
きさは、使用する目的に合わせて自由に決定でき、例え
ば、免疫測定に用いる場合、直径１０ｍｍ程度の反応容
器に投入できる大きさである（試験管を除く。）。担体
の好ましい形状及び大きさは、直径１〜１０ｍｍのビー
ズ、特に好ましくは直径２〜８ｍｍのビーズである。

【０００９】担体に特異的結合物質（ｃ）を固定化する
方法は、化学的に結合する方法、物理吸着による方法な
ど公知の方法が使用できる。化学的に結合する方法とし
ては、例えば、担体表面に導入されたアミノ基、スルフ
ヒドリル基などの官能基と、特異的結合物質（ｃ）のア
ミノ基、スルフヒドリル基などの官能基をグルタルアル
デヒド、サクシンアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイ
ル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル、ｏ−フェニレ
ンビスマレイミドなどで架橋する方法が使用できる（例
えば、米国特許第４２８０９９２号、米国特許第３６５
２７６１号に記載されている。）。物理吸着による方法
としては、例えば、担体がポリスチレンの場合、特異的
結合物質（ｃ）を０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）含
む炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に担体を適当時間浸漬する
方法が使用できる（例えば、バイオシム・バイオフィズ
・アクタ、２５１巻、４２７頁、１９７１年に記載され
ている。）。

【００１０】本発明のアミノ酸（ａ）としては、タンパ
ク性アミノ酸、非タンパク性アミノ酸が使用できる。タ
ンパク性アミノ酸としては、グリシン、Ｌ−アラニン、
Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メ
チオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニ
ン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−
システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グ
ルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニ
ン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒド
ロキシプロリン、Ｌ−ヒドロキシリシン及びこれらに対
応するＤ型アミノ酸などが挙げられる。非タンパク性ア
ミノ酸としては、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、β
−アラニン、クレアチン及びこれらに対応するＤ型アミ
ノ酸などが挙げられる。アミノ酸（ａ）は、単独で使用
しても、複数のアミノ酸を組み合わせて使用しても良
い。また、種々のアミノ酸を高濃度に含むタンパク質の
加水分解物（カザミノ酸など）を使用することもでき
る。これらのうち、非タンパク性アミノ酸やＤ型アミノ
酸は、一般に高価である一方、タンパク性アミノ酸は、
安価である点で、タンパク性アミノ酸が好ましく、グリ
シン特に好ましい。

【００１１】本品発明においては、アミノ酸（ａ）を含
有する安定化剤（ｂ）中に、多糖類（ｅ）及びポリビニ
ルアルコール（ｆ）から選ばれる少なくとも一種を含有
することが好ましい。多糖類（ｅ）及びポリビニルアル
コール（ｆ）から選ばれる少なくとも一種を含むこと
で、臨床診断用担体がより安定になる。多糖類（ｅ）と
しては、例えば、水溶性デンプン、アミロース、アミロ
ペクチン、グリコーゲン、ヒアルロン酸、ヒドロキシメ
チルセルロース、アルギン酸ソーダ、寒天、グアーガ
ム、ポリβ−シクロデキストリンなどが使用できる。こ
れらのうち好ましいのは、水溶性デンプン、ヒドロキシ
メチルセルロース及びポリβ−シクロデキストリン、特
に好ましくは水溶性デンプンである。ポリビニルアルコ
ール（ｄ）は、通常、ケン化度が７０〜９０％、重合度
が１００〜１０，０００のものが使用でき、重合度が、
３００〜４，０００のものが好ましい。

【００１２】また、本発明において、アミノ酸（ａ）を
含有する安定化剤（ｂ）中に、ニ糖類（ｇ）及び単糖類
（ｈ）から選ばれる少なくとも一種を含むことが好まし
い。さらに、アミノ酸（ａ）を含有する安定化剤（ｂ）
中に、多糖類（ｅ）及びポリビニルアルコール（ｆ）か
ら選ばれる少なくとも一種と共に、ニ糖類（ｇ）及び単
糖類（ｈ）から選ばれる少なくとも一種を含むことが好
ましい。ニ糖類（ｇ）及び単糖類（ｈ）から選ばれる少
なくとも一種を含むことで、臨床診断用担体が、さらに
安定になる。ニ糖類（ｇ）としては、例えば、麦芽糖、
セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ショ
糖、ラクトース、イソサッカロースなどが使用できる。
単糖類（ｈ）としては、例えば、グルコース、フルクト
ース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、キシ
リトースなどが使用できる。これらのうち好ましいの
は、ニ糖類（ｇ）としてはラクトース及びショ糖、単糖
類（ｈ）としてはグルコース及びフルクトースであり、
さらに好ましいのはラクトース及びショ糖であり、最も
好ましいのはショ糖である。

【００１３】本発明において、特異的結合物質（ｃ）を
固定化した不溶性担体を、安定化剤（ｂ）で被覆する方
法としては、例えば、安定化剤（ｂ）を含有する溶液を
該不溶性担体に付着した後、乾燥することにより被覆す
ることができる。安定化剤（ｂ）を含有する溶液を該不
溶性担体に付着させる方法としては、例えば、担体がビ
ーズであれば、安定化剤（ｂ）を含有する溶液中に浸漬
し余分な溶液をアスピレーターなどで除去する方法、安
定化剤（ｂ）を含有する溶液を該不溶性担体に噴霧する
方法などが挙げられる。担体が試験管であれば、試験管
内部に安定化剤（ｂ）を含有する溶液を分注した後、溶
液を除去する方法が挙げられる。乾燥する方法として
は、不溶性担体に固定化された特異的結合物質（ｃ）の
反応性が低下しない条件で行う必要があり、例えば、特
異的結合物質（ｃ）が抗体の場合、室温（１５〜３０
℃）で風乾しても良く、５０℃程度に設定した乾燥器中
で乾燥しても良い。また、加熱に弱い特異的結合物質
（ｃ）の場合は、室温以下の温度で減圧下で乾燥するこ
とが好ましい。

【００１４】本発明においては、特異的結合物質（ｃ）
を固定化した不溶性担体を被覆している安定化剤（ｂ）
中に含まれるアミノ酸（ａ）、多糖類（ｅ）、ポリビニ
ルアルコール（ｆ）、ニ糖類（ｇ）及び単糖類（ｈ）の
被覆量が、該不溶性担体の安定化効果に重要である。
（ａ）〜（ｈ）の被覆量は、不溶性担体の単位表面積当
たりを被覆している（ａ）〜（ｈ）の重量（ｍｇ／ｃｍ
²）で表すことができる。

【００１５】アミノ酸（ａ）の被覆量は、臨床診断用担
体の保存安定性又は診断の再現性の観点から、好ましく
は０．０００６〜０．０６ｍｇの範囲、さらに好ましく
は０．００２〜０．０３ｍｇの範囲、特に好ましくは
０．００６〜０．０３ｍｇの範囲である。

【００１６】多糖類（ｅ）及びポリビニルアルコール
（ｆ）から選ばれる少なくとも一種を使用する場合、こ
れらの被覆量は、臨床診断用担体の保存安定性又は診断
の再現性の観点から、好ましくは０．００２〜０．１６
ｍｇの範囲、さらに好ましくは０．００４〜０．０８ｍ
ｇの範囲、特に好ましくは０．０１６〜０．０８ｍｇの
範囲である。

【００１７】ニ糖類（ｇ）及び単糖類（ｈ）から選ばれ
る少なくとも一種を含有する場合、これらの被覆量は、
臨床診断用担体の保存安定性又は診断の再現性の観点か
ら、好ましくは０．０１〜１ｍｇの範囲、さらに好まし
くは０．０２５〜０．５ｍｇの範囲、特に好ましくは
０．０５〜０．５ｍｇの範囲である。

【００１８】（ａ）〜（ｈ）の被覆量（ｍｇ／ｃｍ²）
は、不溶性担体の表面積を、その形状を計測することで
算出した値と、安定化剤（ｂ）で被覆された不溶性担体
を水と接触させて、水に溶出した物質を定量した値から
算出する。不溶性担体の表面が、例えばサンドブラスト
処理などでスリガラス状になった担体の場合、滑面であ
るとして表面積を算出する。具体的に、（ａ）〜（ｈ）
の定量方法について説明する。安定化剤（ｂ）で被覆さ
れた不溶性担体を該不溶性担体の表面積１ｃｍ²当たり
１ｍＬの水（２５℃）に１時間浸漬し、以下の方法によ
り定量する。アミノ酸（ａ）は、イオン交換カラム又は
逆相カラムを用いたＨＰＬＣで定量する。

【００１９】＜イオン交換カラムを使用する方法＞イオ
ン交換カラム（昭和電工製Ｓｈｏｄｅｘ ＣＸｐａｘ
Ｐ−４２１、又はこれと同等のカラム）を用い、ニンヒ
ドリン試薬を流速０．４ｍＬ／分で添加しながら、流速
０．５ｍＬ／分で、溶離液（１）〜（４）を順次流すこ
とにより、波長５７０ｎｍでアミノ酸のピークを検出
し、あらかじめ用意した検量線から定量する。 溶離液（１）：クエン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｎナ
トリウム／１２％エタノール）ｐＨ３．３２ 溶離液（２）：クエン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｎナ
トリウム）ｐＨ４．２ 、溶離液（３）：クエン酸ナトリウム緩衝液（１．０Ｎ
ナトリウム）ｐＨ６．８９ 溶離液（４）：クエン酸ナトリウム緩衝液（１．８Ｎナ
トリウム）ｐＨ７．５

【００２０】＜逆送カラムを使用する方法＞逆相カラム
（昭和電工製Ｓｈｏｄｅｘ Ｒｓｐａｘ ＮＮ−８１
４、又はこれと同等のカラム）を用い、カラム温度４０
℃、流速１．０ｍＬ／分で溶離液（４０ｍＭリン酸）を
流し、アミノ酸のピークを示差屈折で検出し、あらかじ
め用意した検量線から定量する。

【００２１】多糖類（ｅ）は、ゲルろ過カラムを用いた
ＨＰＬＣを用いて定量する。多糖類（ｅ）が水溶性デン
プンの場合、ゲルろ過カラム（昭和電工製Ｓｈｏｄｅｘ
ＯＨｐａｘ ＳＧＢとＳＢ−８０６Ｍ ＨＱとを連結
したカラム、又はこれと同等のカラム）を用い、カラム
温度３０℃、流速１．０ｍＬ／分で溶離液（０．１Ｍ臭
化リチウム溶液）を流し、水溶性デンプンのピークを示
差屈折で検出し、あらかじめ用意した検量線から定量す
る。多糖類がヒアルロン酸の場合、ゲルろ過カラム（昭
和電工製Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｘ ＳＢ−８０５を２
本連結したカラム、又はこれと同等のカラム）を用い、
カラム温度３０℃、流速１．０ｍＬ／分で溶離液（０．
１Ｍ硝酸ナトリウム溶液）を流し、ヒアルロン酸のピー
クを示差屈折で検出し、あらかじめ用意した検量線から
定量する。多糖類がグリコーゲンの場合、ゲルろ過カラ
ム（昭和電工製Ｓｈｏｄｅｘ Ｉｏｎｐａｘ ＫＳ−８
０６、又はこれと同等のカラム）を用い、カラム温度８
０℃、流速１．０ｍＬ／分で溶離液（０．０５Ｍ硝酸ナ
トリウム溶液）を流し、グリコーゲンのピークを示差屈
折で検出し、あらかじめ用意した検量線から定量する。

【００２２】多糖類がヒドロキシメチルセルロースの場
合、ゲルろ過カラム（昭和電工製Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐ
ａｘ ＳＢ−８０５ ＨＱを２本連結したカラム、又は
これと同等のカラム）を用い、カラム温度３０℃、流速
１．０ｍＬ／分で溶離液（０．１Ｍ硝酸ナトリウム溶
液）を流し、ヒドロキシメチルセルロースのピークを示
差屈折で検出し、あらかじめ用意した検量線から定量す
る。多糖類が、アミロース又はアミロペクチンの場合、
水溶性デンプンと同じ方法で定量できる。多糖類が、寒
天、グアーガム又はポリβ−シクロデキストリンの場
合、ゲルろ過カラム（昭和電工製Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐ
ａｘ ＳＢ−８０５ ＨＱを２本連結したカラム、又は
これと同等のカラム）を用い、カラム温度３０℃、流速
１．０ｍＬ／分で溶離液（０．０２％アジ化ナトリウム
溶液）を流し、測定対象物のピークを示差屈折で検出
し、あらかじめ用意した検量線から定量する。多糖類
が、アルギン酸ソーダの場合、ヒドロキシメチルセルロ
ースと同様の方法で定量できる。

【００２３】ポリビニルアルコール（ｆ）は、ゲルろ過
カラムを用いたＨＰＬＣで定量する。ゲルろ過カラム
（昭和電工製Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｘ ＳＢ−８０６
ＨＱとＳＢ−８０３ ＨＱとを連結したカラム、又は
これと同等のカラム）を用い、カラム温度４０℃、流速
１．０ｍＬ／分で溶離液（０．１Ｍ塩化ナトリウム溶
液）を流し、ポリビニルアルコールのピークを示差屈折
で検出し、あらかじめ用意した検量線から定量する。

【００２４】ニ糖類（ｇ）及び単糖類（ｈ）は、配位子
交換カラムを用いたＨＰＬＣ、呈色反応により定量す
る。 ＜配位子交換カラムを用いる方法＞配位子交換カラム
（昭和電工製Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＳＣ１０１
１、又はこれと同等のカラム）を用い、カラム温度８０
℃、流速１．０ｍＬ／分で溶離液（蒸留水）を流し、ニ
糖類（ｇ）及び単糖類（ｈ）のピークを示差屈折で検出
し、あらかじめ用意した検量線から定量する。 ＜呈色反応により定量する方法＞生化学実験講座４．糖
質の化学（下）［日本生化学会編、東京化学同人（１９
７６）］、３６７〜３８３頁に記載の方法で、糖の性質
に合わせて定量する。例えば、二糖類（ｇ）又は単糖類
（ｈ）が、還元糖（麦芽糖、セロビオース、ゲンチビオ
ース、メリビオース、ラクトース、イソサッカロースな
どのニ糖類、グルコース、フルクトース、マンノース、
アラビノースなどの単糖類）の場合、Ｐａｒｋ−Ｊｏｈ
ｎｓｏｎ法又は３，６−ジニトロフタル酸反応で定量す
る。

【００２５】ニ糖類又は単糖が、非還元糖（ショ糖な
ど）の場合、Ｍｏｌｉｓｃｈ反応、フェノール−硫酸反
応、クモトロープ酸−硫酸反応又はアントロン−硫酸反
応で定量する。なお、これらの方法は、還元糖にも適用
できる。単糖が、ヘキソース（六単糖であるグルコー
ス、フルクトース、ガラクトース、マンノースなど）の
場合、フェノール−硫酸反応、アントロン−硫酸反応、
５−ヒドロキシテトラロン−硫酸反応、クモトロープ酸
−硫酸反応などで定量する。なお、還元糖で例示した単
糖（重複例示している単糖）は、これれの方法または還
元糖の場合の方法のどちらの方法で定量してもよい。単
糖がケトース（ケトン基を持つ単糖で、フルクトース、
キシルロースなど）の場合、レソシノール−鉄（ＩＩ
Ｉ）塩−塩酸反応で、ペント−スの場合、オルシノール
−塩化鉄（ＩＩＩ）−塩産反応で定量できる。なお、還
元糖またはヘキソースで例示した単糖（重複例示してい
る単糖）は、これれの方法、ヘキソースの場合の方法、
還元糖の場合の方法のいずれの方法で定量してもよい。
ニ糖類がショ糖の場合、クモトロープ酸−硫酸反応での
定量方法を例示すると、クモトロープ酸１ｍｇを含む硫
酸（１５モル／Ｌ）０．５ｍＬにショ糖を含むサンプル
０．１ｍＬを加え、沸騰水中で３０分過熱後、９モル／
Ｌ硫酸０．４ｍＬを加え、５７０ｎｍの波長で吸光度を
測定し、あらかじめ用意した検量線から定量する。いず
れの定量方法においても、濃度の異なる標準物質を同時
に測定し、その測定値（検量線）と比較して、水に溶出
した物質の被覆量を決定する。

【００２６】（ａ）〜（ｈ）の被覆量は、（ｂ）を含有
する溶液中の（ａ）〜（ｈ）の濃度を調整することによ
り制御することができる。また、例えば、安定化剤
（ｂ）を含有する溶液中の（ｂ）の濃度を変えることで
（ｂ）の被覆量を調整することにより、制御することも
できる。また、例えば、多糖類（ｅ）及びポリビニルア
ルコール（ｆ）の使用量を調整することで（ｂ）を含有
する溶液の粘度を調整し、（ｂ）の被覆量を調整するこ
とにより、制御することができる。さらに、錠剤のコー
テイングに使用されているコーテイングパンなどを用い
て、溶液を噴霧しながら乾燥すれば、噴霧量と噴霧時間
を調整することで（ｂ）の被覆量を制御することができ
る。

【００２７】本発明の臨床診断用担体は、緩衝液などと
接触すると、安定化剤（ｂ）はただちに溶解し、特異的
結合物質（ｃ）を固定化した不溶性担体が復元する。す
なわち、本発明の臨床診断用担体に、直接測定対象物を
含む検体、標識された特異的結合物質などを反応さて、
診断対象物を検出することが可能である。従って、本発
明による臨床診断用担体は、そのまま従来公知の免疫測
定試薬に用いる事ができ、例えば、遺伝子を固定化した
遺伝子チップ（遺伝子固定化チップ）やアフィニティク
ロマト用試薬などに応用できる。また、遺伝子固定化チ
ップは、例えば、ウィルス若しくは細菌の検出による感
染症の診断、ガン遺伝子の診断、インシュリン関連遺伝
子などの生活習慣病の起因遺伝子の診断に使用できる。
また、アフィニティクロマト用試薬は、例えば、生体中
の微量物質（例えば、各種ホルモンのレセプタータンパ
クなど）の分離・精製に使用できる。

【００２８】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。なお、以
下、％は、特記のない限り重量％を示し、リン酸緩衝液
は、０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を使用し
た。 試験例Ａ 本試験例Ａは、本発明の臨床診断用担体の保存安定性が
優れていることを示すものである。 １）抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ビーズの調製 抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ダコジャパン株式会社よ
り購入）をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍ
Ｌの濃度で溶解した。この溶液５０ｍＬに直径３．２ｍ
ｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカル株式会社より
購入）２０００個を加え、４８時間静置させて、ポリス
チレンビーズに抗ＡＦＰポリクロナール抗体を物理吸着
させた。その後、溶液をアスピレーターで吸引除去し、
５０ｍＬの０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液
でビーズを２回洗浄し、抗ＡＦＰポリクローナル抗体結
合ビーズを調製した。この抗ＡＦＰポリクローナル抗体
結合ビーズを再度５０ｍＬの０．１％牛血清アルブミン
含有リン酸緩衝液に浸漬し、浸漬状態で冷蔵（２〜１０
℃）保存した。

【００２９】２）ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰポリク
ローナル抗体の調製 抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ダコジャパン株式会社よ
り購入）、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡
製）を用い、文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、
イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏ
ｌ．９２（１９８２）１４１３−１４２４］に記載の方
法でペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰポリクローナル抗体
を調製し、冷凍（−３０℃）保存した。 ３）ルミノール溶液の調製 ルミノール（東京化成製）０．１８ｇ及び４−（シアノ
メチルチオ）フェノール０．１ｇを０．１Ｍ（モル／
Ｌ）、ｐＨ８．５のトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン／塩酸緩衝液１リットルに溶解し、ルミノール溶
液を調製し、遮光下で、冷蔵（４〜１０℃）保存した。

【００３０】４）過酸化水素水の調製 ２００μｌの３５％過酸化水素水を脱イオン水１リット
ルに溶解し、過酸化水素水を調製し、冷蔵（４〜１０
℃）保存した。 ５）コーティングビーズの作成（実施例１〜５及び比較
例１〜３） １）で調製した抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ビーズ
を含む溶液から０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩
衝液をアスピレーターで除き、抗ＡＦＰポリクローナル
抗体結合ビーズを下記の実施例１〜５又は比較例１〜３
の溶液５０ｍＬそれぞれに再度浸漬した。３０分室温で
放置した後、余分な溶液をアスピレーターで除き、ビー
ズをろ紙上に並べて５０℃、３０分乾燥し、コーティン
グビーズを調製した。 実施例１ １％グリシン含有リン酸緩衝液 実施例２ １％グリシン、２．５％ポリビニルアルコー
ル（ケン化度８０％、重合度約５００）含有リン酸緩衝
液 実施例Ａ３ １％グリシン、１％可溶性デンプン（アミ
ロ−ス成分として分子量約４０，０００〜６０，００
０）含有リン酸緩衝液 実施例４ １％グリシン、５％ショ糖含有リン酸緩衝液 実施例５ １％グリシン、２．５％ポリビニルアルコー
ル（ケン化度８０％、重合度約５００）、５％ショ糖含
有リン酸緩衝液 比較例１ １％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液 比較例２ ５％ショ糖含有リン酸緩衝液 比較例３ １％ウシ血清アルブミン、５％ショ糖含有リ
ン酸緩衝液

【００３１】６）免疫反応操作 試験管中で、標準ＡＦＰ溶液２０μＬ[和光純薬工業
（株）が販売する臨床検査薬「スフィアライトＡＦＰコ
ントロールセット」を使用]と、１％牛血清アルブミン
含有リン酸緩衝液３００μＬと、５）で作成したコーテ
イングビーズ（実施例１）１個とを３７℃で、１時間反
応させた。反応液をアスピレータで除去した後、生理食
塩水を加てビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで
除去した。次に、２）で作成したペルオキシダーゼ標識
抗ＡＦＰポリクローナル抗体を１％牛血清アルブミン含
有リン酸緩衝液で抗体濃度として１μｇ／ｍＬの濃度に
希釈し、標識抗体液を調製した。この標識抗体液３００
μＬを、洗浄後のビーズに加え３７℃、１時間反応させ
た。反応液をアスピレーターで除去し、生理食塩水を加
えビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去し
た。洗浄後のビーズについて、以下の７）の方法で酵素
活性の測定を行った。

【００３２】７）酵素活性測定操作 ６）の洗浄後のビーズが入った試験管（１２×７５ｍ
ｍ）をアロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０
１型のサンプルホルダーにセットし、３）で作成したル
ミノール溶液２００μＬ及び５）で作成した過酸化水素
水２００μＬを加え発光反応を開始した。発光反応開始
４０秒後から１０秒間の発光量を計測し、酵素活性を示
す発光量とした。ビーズ１０個について発光量を測定
し、その平均値を表１に示した。実施例２〜５及び比較
例１〜３についても、同様にして免疫反応操作を行い、
その結果を表１に示した。

【００３３】８）保存安定性試験 ５）で作成した実施例１〜５及び比較例１〜３のコーテ
イングビーズを開口容器中に入れ、２５℃（湿度６５
％）の恒温恒湿器中で保存した。保存４週間後に上記
６）及び７）の方法で標準ＡＦＰ溶液（濃度２００ｎｇ
／ｍＬ）を各１０個のコーティングビーズについて発光
量を測定し、その平均値を表１に示す。また、保存前後
の発光量の比（光量比）を算出し併記した。表１の光量
比から明らかなように、実施例１〜５は、比較例１〜３
に比べて、極めて保存安定性に優れている。

【００３４】

【表１】

【００３５】試験例Ｂ 本試験例Ｂは、安定化剤（ｂ）中のアミノ酸などの量と
保存安定性の関係を示すものである。 １）コーティングビーズの作成 １−１）実施例６〜９ 上記試験例Ａの１）で作成した抗ＡＦＰポリクローナル
抗体結合ビーズを浸漬した溶液から０．１％牛血清アル
ブミン含有リン酸緩衝液をアスピレーターで除き、ビー
ズをろ紙上に並べて風乾した。風乾したビーズを１％グ
リシン含有リン酸緩衝液を噴霧しながらコーテイングパ
ン上で再度乾燥した。噴霧液量をビーズ１０００個当た
り、０．２ｍＬ（実施例６）、０．４ｍＬ（実施例
７）、１．０ｍＬ（実施例８）、２．０ｍＬ（実施例
９）として、コーティングビーズを作成した。

【００３６】１−２）実施例１０〜１３ １％グリシン含有リン酸緩衝液を、１％グリシン、１５
％ショ糖、２．５％ポリビニルアルコール（ケン化度８
０％、重合度約５００）含有リン酸緩衝液とした以外は
実施例６〜９と同様の方法で、噴霧液量をビーズ１００
０個当たり、０．２ｍＬ（実施例１０）、０．４ｍＬ
（実施例１１）、１．０ｍＬ（実施例１２）、２．０ｍ
Ｌ（実施例１３）として、コーティングビーズを作成し
た。 １−３）実施例１４〜１６ グリシン含有リン酸緩衝液中のグリシンの濃度を０．１
５％とした以外は実施例６と同様にして、コーティング
ビーズを作成した（実施例１４）。グリシン含有リン酸
緩衝液中のグリシンの濃度を０．３％とした以外は実施
例６と同様にして、コーティングビーズを作成した（実
施例１５）。グリシン含有リン酸緩衝液中のグリシンの
濃度を２％とした以外は実施例９と同様にして、コーテ
ィングビーズを作成した（実施例１６）。

【００３７】１−４）実施例１７〜１９ １％グリシン含有リン酸緩衝液を、０．３％グリシン、
１．５％ショ糖及び０．２５％ポリビニルアルコール含
有リン酸緩衝液とした以外は実施例６と同様にして、コ
ーティングビーズを作成した（実施例１７）。１％グリ
シン含有リン酸緩衝液を、０．３％グリシン、３％ショ
糖及び０．５％ポリビニルアルコール含有リン酸緩衝液
とした以外は実施例６と同様にして、コーティングビー
ズを作成した（実施例１８）。１％グリシン含有リン酸
緩衝液を、２％グリシン、３０％ショ糖及び５％ポリビ
ニルアルコール含有リン酸緩衝液とした以外は実施例９
と同様にして、コーティングビーズを作成した（実施例
１９）。 １−５）比較例４〜７ １％グリシン含有リン酸緩衝液を、１５％ショ糖、２．
５％ポリビニルアルコール（ケン化度８０％、重合度約
５００）含有リン酸緩衝液とした以外は実施例６〜９と
同様の方法で、噴霧液量をビーズ１０００個当たり、
０．２ｍＬ（比較例４）、０．４ｍＬ（比較例５）、
１．０ｍＬ（比較例６）、２．０ｍＬ（比較例７）とし
て、コーティングビーズを作成した。

【００３８】２）被覆する安定化剤中のアミノ酸などの
定量 上記作成した実施例６〜１９及び比較例４〜７の各ビー
ズ１０個をそれぞれ蒸留水３ｍＬに浸漬後、蒸留水中に
溶出したグリシン、ショ糖、ポリビニルアルコールの量
を測定した。グリシンは、逆相カラム（昭和電工製Ｓｈ
ｏｄｅｘ Ｒｓｐａｘ ＮＮ−８１４）を用い、カラム
温度４０℃、流速１．０ｍＬ／分で溶離液（４０ｍＭリ
ン酸）を流し、ピークを示差屈折で検出し、既知濃度の
グリシン溶液を同様に測定して作成した検量線から、蒸
留水中に溶出したグリシンの濃度を決定した。ポリビニ
ルアルコールは、ゲルろ過カラム（昭和電工製Ｓｈｏｄ
ｅｘ ＯＨｐａｘ ＳＢ−８０６ ＨＱとＳＢ−８０３
ＨＱとを連結したカラム）を用い、カラム温度４０
℃、流速１．０ｍＬ／分で溶離液（０．１Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液）を流し、ピークを示差屈折で検出し、既知濃
度のポリビニルアルコール溶液を同様に測定して作成し
た検量線から、蒸留水中に溶出したポリビニルアルコー
ルの濃度を決定した。ショ糖は、呈色反応で定量した。
すなわち、クモトロープ酸１ｍｇを含む硫酸（１５モル
／Ｌ）０．５ｍＬに抽出した蒸留水０．１ｍＬを加え、
沸騰水中で３０分過熱後、９モル／Ｌ硫酸０．４ｍＬを
加え、５７０ｎｍの波長で吸光度を測定し、既知濃度の
ショ糖溶液を同様に測定して作成した検量線から蒸留水
中に溶出したショ糖濃度を決定した。蒸留水中に溶出し
た量とビーズ１０個の表面積から、ビーズの単位表面積
当たりを被覆する各成分の量を算出し、表２に示した。

【００３９】３）保存安定性の比較結果 実施例Ａの８）記載の条件で、保存安定性試験を行い、
各ビーズ１０個について測定発光量の平均値を表２に示
した。また、保存後のビーズの測定発光量の変動係数も
併せて示した。ただし、保存期間は３ヶ月とした。表２
の光量比から明らかなように、実施例６〜１９は、比較
例４〜７に比較して、極めて保存安定性に優れている。
また、グリシン、ショ糖、ポリビニルアルコールの濃度
が高くなるとさらに安定性が良好となり、保存後の変動
係数も良好である。なお、実施例１９のようにグリシ
ン、ショ糖、ポリビニルアルコールの被覆量が多くなる
と、保存安定性は高いのに対し、実施例１０〜１３に比
較して変動係数が大きくなる。

【００４０】

【表２】

【００４１】

【発明の効果】本発明の臨床診断用担体は、室温（１５
〜３０℃）で、乾燥状態を保つ必要なく、長期間にわた
って極めて優れた保存安定性を有する。従って、本発明
の臨床診断用担体を適用した測定試薬を用いることによ
り、長期間に渡って、極めて信頼性の高い診断を行うこ
とができる。さらに、担体の吸湿を防止する配慮が不要
であるなど、測定時の試薬の取り扱いが極めて簡便とな
るというメリットがある。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 特異的結合物質（ｃ）を固定化した不溶
   性担体を、少なくとも一種のアミノ酸（ａ）を含有する
   安定化剤（ｂ）で被覆してなることを特徴とする臨床診
   断用担体。
2. 【請求項２】 安定化剤（ｂ）中に、アミノ酸（ａ）を
   不溶性担体の単位表面積当たり０．０００６〜０．０６
   ｍｇ／ｃｍ²の範囲で含む請求項１記載の担体。
3. 【請求項３】 安定化剤（ｂ）が、多糖類（ｅ）及びポ
   リビニルアルコール（ｆ）から選ばれる少なくとも一種
   を含有してなる請求項１又は２記載の担体。
4. 【請求項４】 安定化剤（ｂ）が、多糖類（ｅ）及びポ
   リビニルアルコール（ｆ）から選ばれる少なくとも一種
   を不溶性担体の単位表面積当たり０．００２〜０．１６
   ｍｇ／ｃｍ²の範囲で含む請求項３記載の担体。
5. 【請求項５】 安定化剤（ｂ）が、ニ糖類（ｇ）及び単
   糖類（ｈ）から選ばれる少なくとも一種を含有してなる
   請求項１〜４いずれか記載の担体。
6. 【請求項６】 安定化剤（ｂ）が、ニ糖類（ｇ）及び単
   糖類（ｈ）から選ばれる少なくとも一種を不溶性担体の
   単位表面積当たりり０．０１〜１ｍｇ／ｃｍ ²の範囲で
   含む請求項５記載の担体。