JP2022147893A

JP2022147893A - ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液

Info

Publication number: JP2022147893A
Application number: JP2021049347A
Authority: JP
Inventors: 達弥湯本; Tatsuya Yumoto; 陽介寺尾; Yosuke Terao
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2022-10-06

Abstract

【課題】ヒトＦｃγＲＩＩＩａの溶解性を向上させ、沈殿させることなく安定に保存する保存溶液を提供すること。【解決手段】ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液に０．２ｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下のアルギニンおよび／またはその類縁体を含ませることで、前記課題を解決する。【選択図】図２

Description

本発明は、ＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液に関する。特に本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの溶解性を向上させ、かつ沈殿させることなく保存可能な、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液に関する。

Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃレセプターは、さらにいくつかのサブタイプに分類でき、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある。また各レセプターは更に細かく分類されており、Ｆｃγレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。

Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示すＫ_Ｄ値が１０^－７ｍｏｌ／Ｌ以下であることが報告されている（非特許文献２）。また、抗体の糖鎖構造の違いにより、ＦｃγＲＩＩＩａと抗体との結合性が異なることが知られている（非特許文献３）。

天然型のヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中の番号はアミノ酸番号を示しており、その番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａは抗体の糖鎖構造を認識するため、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は、抗体をその糖鎖構造に基づく結合性の違いにより分離できる（特許文献１および２）。抗体の糖鎖構造は、抗体医薬品における薬効や安定性に大きく関与するため、抗体医薬品を製造する際に糖鎖構造を制御することは極めて重要である。このため前記吸着剤は、抗体医薬品製造時の工程分析や分取に有用である。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードする遺伝子を挿入した遺伝子組換え大腸菌を培養し、得られた培養液を陽イオン交換クロマトグラフィに供することで、高純度かつ高効率に製造できる（特許文献３）。しかしながら、特にアミノ酸置換によりアルカリ耐性を向上させたヒトＦｃγＲＩＩＩａにおいて、前記クロマトグラフィの溶出画分に含まれるヒトＦｃγＲＩＩＩａが沈殿してしまう問題があった。

特開２０１５－０８６２１６号公報特開２０１６－１６９１９７号公報特開２０１６－１８３１１３号公報

Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８－３２６，２００５Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８－１９３２，１９９７Ｃ．Ｌ．Ｃｈｅｎ等，ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１２，１３３５－１３４５，２０１７

本発明の課題は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（特にアミノ酸置換によりアルカリ耐性を向上させたヒトＦｃγＲＩＩＩａ）の溶解性を向上させ、かつ沈殿させることなく安定に保存可能な保存溶液を提供することにある。

前記課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む保存溶液に適切な濃度のアルギニンおよび／またはその類縁体を含ませることで、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液への溶解性が向上し、かつ沈殿が生じないことを見出し、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明は以下の［１］から［５］に記載の態様を包含する。

［１］ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液であって、０．２ｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下のアルギニンおよび／またはその類縁体を含む、前記保存溶液。

［２］さらに３（ｗ／ｖ）％以上４５（ｗ／ｖ）％以下のグリセロールを含む、［１］に記載の保存溶液。

［３］ヒトＦｃγＲＩＩＩａと［１］または［２］に記載の保存溶液とを接触させる工程を含む、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの安定化方法。

［４］ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液をクロマトグラフィ用担体充填カラムにアプライし当該担体にヒトＦｃγＲＩＩＩａを吸着させる工程と、溶出緩衝液を前記カラムにアプライし前記担体に吸着したヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出させる工程と、溶出したヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む画分を回収する工程と、回収した画分を保存する工程とを含む、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法であって、前記保存する工程が［１］または［２］に記載の保存溶液で保存する工程である、前記製造方法。

［５］ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドである、［１］または［２］に記載の保存溶液；
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液に終濃度で０．２ｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下のアルギニンおよび／またはその類縁体を含ませることを特徴としており、当該溶液中に存在するヒトＦｃγＲＩＩＩａの溶解性が向上することで沈殿の発生を抑制できる。なおヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液に含ませるアルギニンおよび／またはその類縁体を終濃度０．３ｍｏｌ／Ｌ以上０．８ｍｏｌ／Ｌ以下とすると好ましい。

アルギニンはＬ（＋）－アルギニンが好ましい。またアルギニン類縁体の一態様として、Ｌ（＋）－アルギニン塩酸塩、Ｎα－カルボベンゾキシ－Ｌ（＋）－アルギニン、Ｎα－トシル－Ｌ（＋）－アルギニン、Ｎα－（２，４－ジニトロフェニル）－Ｌ（＋）－アルギニン、Ｎα－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ（＋）－アルギニン塩酸塩、Ｎα－トシル－Ｌ（＋）－アルギニンメチル塩酸塩、Ｌ（＋）－アルギニンメチル二塩酸塩、Ｎα－ベンゾイル－Ｌ（＋）－アルギニンエチル塩酸塩、Ｎα－ベンゾイル－Ｌ（＋）－アルギニンアミド塩酸塩、Ｌ（＋）－アルギニン炭酸塩が挙げられる。

一態様として、未精製、粗精製または精製済のヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液に、前述した濃度のアルギニンおよび／またはその類縁体を添加することでヒトＦｃγＲＩＩＩａを安定化できる。また別の態様として、後述する本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法を実施する場合は、溶出緩衝液に前述した濃度のアルギニンおよび／またはその類縁体を添加することで、溶出したヒトＦｃγＲＩＩＩａを安定化できる。さらに別の態様として、沈殿が生じたヒトＦｃγＲＩＩＩａ溶液に対して前述した濃度のアルギニンおよび／またはその類縁体を加えることで、沈殿を再溶解しての保存もできる。

本発明の保存溶液に、グリセロールを、終濃度３（ｗ／ｖ）％以上４５（ｗ／ｖ）％以下となるよう添加すると、当該溶液中でのヒトＦｃγＲＩＩＩａがさらに安定化するため、好ましい。なお前記溶液に添加するグリセロールを、終濃度５（ｗ／ｖ）％以上１５（ｗ／ｖ）％以下にすると、さらに好ましい。

本明細書において「安定化」とはヒトＦｃγＲＩＩＩａの溶解性が向上し、沈殿が生じにくいことを意味する。

本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法では、クロマトグラフィ用担体充填カラムを用いた精製工程を含む。前記カラムにアプライする、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液の一例として、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドで形質転換した宿主（形質転換体）の培養液より粗精製したヒトＦｃγＲＩＩＩａ溶液があげられる。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現させるための宿主としては、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙ）細胞に代表される動物細胞、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌やパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に代表される細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に代表される酵母、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌）に代表される糸状菌などが利用できる。中でも取扱いの簡便な大腸菌を宿主とすると好ましい。なお宿主が大腸菌の場合は、特開２０１２－０３４５９１号公報および特開２０１３－０８５５３１号公報に開示した方法等により、形質転換体を培養することでヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現させればよい。

前記形質転換体の培養液から、クロマトグラフィ用担体充填カラムにアプライする、粗精製したヒトＦｃγＲＩＩＩａ溶液を得るには、発現の形態によって適宜選択すればよい。例えば、発現したヒトＦｃγＲＩＩＩａが宿主細胞のペリプラズムに発現する場合は、培養液を遠心分離して得られる宿主細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕（物理的破砕、薬剤による破砕など）後、遠心分離により破砕残渣を除去することで、発現したヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む無細胞抽出液を得ればよく、発現したヒトＦｃγＲＩＩＩａが宿主細胞のペリプラズムから培養上清に漏出する場合は、培養液を遠心分離して得られる培養上清から発現したヒトＦｃγＲＩＩＩａを回収すればよい。なお薬剤により宿主細胞を破砕する際は、例えば、特開２０１３－２５２０９９号公報に開示した方法や、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ミリポア社製）等の市販の抽出試薬を用いて破砕するとよい。

本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法で用いる、クロマトグラフィ用担体充填カラムは、当業者が通常タンパク質精製で用いるクロマトグラフィ用担体を充填したカラムであれば特に限定はなく、前記担体として、ゲル濾過クロマトグラフィ用担体、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体、疎水クロマトグラフィ用担体、アフィニティクロマトグラフィ用担体が例示できる。中でも陽イオン交換クロマトグラフィ用担体が、本発明の製造法におけるクロマトグラフィ用担体として好ましい。

陽イオン交換クロマトグラフィ用担体は、カルボキシメチル基、スルホプロピル基、スルホン酸基といった陽イオン交換基を担体に導入したものであれば特に限定はなく、具体例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＣＭ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＳＰ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＧｉｇａＣａｐＳ－６５０（以上、東ソー製）、ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ製）があげられる。なお、前記陽イオン交換クロマトグラフィ用担体を用いて、本発明の精製方法を実施する際は、前記担体へのヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液（アプライ液）の添加量や、前記担体のタンパク吸着性能等によって決定した量の担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。また、前記陽イオン交換クロマトグラフィ用担体は、アプライ液を添加する前に、あらかじめ、適切な緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、グリシン－ＮａＯＨ緩衝液、リン酸塩緩衝液等）で平衡化するとよい。

本発明のヒトＦｃγＲＩＩＩａの精製方法を、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体充填カラムを用いて行なう場合の具体例を以下に示す。
（Ｉ）前述した方法で得られた粗精製ヒトＦｃγＲＩＩＩａ溶液を、あらかじめ平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィ用担体充填カラムにアプライし、前記担体にヒトＦｃγＲＩＩＩａを吸着させる。
（ＩＩ）塩化ナトリウムを含む洗浄液を前記カラムにアプライし、夾雑タンパク質を除去する。
（ＩＩＩ）溶出緩衝液を前記カラムにアプライし、前記担体に吸着したヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出させる。溶出緩衝液としては前記洗浄液よりも高い塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いればよい。また溶出緩衝液に終濃度０．２ｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下のアルギニンおよび／またはその類縁体を含ませてもよい。
（ＩＶ）溶出したヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む画分を回収し、保存する。なお（ＩＩＩ）でアルギニンおよび／またはその類縁体を含まない溶出緩衝液で溶出させた場合は、前記画分に終濃度０．２ｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下のアルギニンおよび／またはその類縁体を含ませてから保存する。

本発明におけるヒトＦｃγＲＩＩＩａの一例として、以下の（ｉ）から（ｖ）のいずれかに記載のポリペプチドがあげられる。
（ｉ）配列番号１に記載の天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列のうち、細胞外領域（図１ではＥＣ領域）の一部である、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド；
（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
（ｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。

前記（ｉｉ）および（ｉｖ）における、「１もしくは数個」とは、例えば、１以上３０個以下、１以上２０個以下、または１以上１０個以下（１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個および１個のいずれか）を意味してよい。

前記（ｉｉ）の一例として、特開２０１５－０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、特開２０１６－１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、特開２０１７－１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、およびＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質があげられる。

中でも前記（ｉｉｉ）から（ｖ）のいずれかに記載のポリペプチドは、溶液中で凝集／沈殿しやすい点で、本発明におけるヒトＦｃγＲＩＩＩａの好ましい態様である。なお前記（ｉｉｉ）から（ｖ）に記載の、配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ（この表記は、配列番号１の２１番目のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ７５Ｉｌｅ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ｔｈｒ８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｔｙｒ１５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ１７６Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１８４Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７ＡｓｐおよびＩｌｅ１９０Ｖａｌのアミノ酸置換を有するアミノ酸残基である。

なお、本発明の保存溶液には終濃度０．５ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは０．６ｍｏｌ／Ｌ以上、１．５ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは１ｍｏｌ／Ｌ以下となるように塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム等）が含まれてよく、ｐＨ７．０以上９．０以下、好ましくはｐＨ７．５以上８．５以下となるよう塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）が含まれてよい。

本発明はヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液として、０．２ｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下のアルギニンおよび／またはその類縁体を含んだ溶液を用いることを特徴としている。本発明により、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの溶解性を向上させ、かつ沈殿させることなく、溶液中でヒトＦｃγＲＩＩＩａを安定に保存できる。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造を示す図。各保存溶液でのヒトＦｃγＲＩＩＩａ飽和濃度測定結果を示した図。ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存安定性評価結果を示した図

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

実施例１保存溶液の組成検討
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換して組換え大腸菌を得た。なおＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが改良ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＮｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであって、ただし６番目のプロリンをセリンにアミノ酸置換したオリゴペプチド）であり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基であり、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ（この表記は、配列番号１の２１番目（配列番号２では２８番目）のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ７５Ｉｌｅ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ｔｈｒ８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｔｙｒ１５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ１７６Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１８４Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７ＡｓｐおよびＩｌｅ１９０Ｖａｌのアミノ酸置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列）であり、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。当該組換え大腸菌を特開２０１３－０８５５３１号公報に記載の方法を参考にして培養し、得られた培養液から遠心分離により大腸菌菌体（湿潤菌体）を得た。

（２）（１）で得られた湿潤菌体を、当該湿潤菌体重量の３倍量の１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁させ、均一になるまで室温（２０℃から２５℃）にて撹拌した。

（３）室温で撹拌後、核酸分解酵素であるＢｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）を終濃度２５００ｕｎｉｔ／Ｌとなるよう添加し、助剤として硫酸マグネシウムを終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう添加後、室温で撹拌した。

（４）室温で撹拌後、糖質分解酵素であるリゾチームを終濃度０．００５（ｗ／ｖ）％となるように添加し、さらに室温で撹拌した。

（５）室温で撹拌後、非イオン界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ－１００（商品名）水溶液を終濃度０．５（ｗ／ｖ）％となるよう添加し、さらに室温で撹拌した。

（６）室温で撹拌後、陰イオン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウムを終濃度０．２（ｗ／ｖ）％となるよう添加し、さらに室温で撹拌した。

（７）一晩抽出操作を行なった後、抽出液を遠心分離し（８０００ｒｐｍ、２０分、２回）、上清（無細胞抽出液）を得た。

（８）（７）で得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ抽出液を、あらかじめ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＣＭ－６５０Ｍ、東ソー製）を充填したカラム（メルクミリポア製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄することで、夾雑不純物を除去した。

（９）０．７ｍｏｌ／ＬＮａＣｌおよび１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、「溶出緩衝液Ａ」とも表記）でＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを溶出した。

（１０）（９）で得られた、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ溶液を、透析により表１の（ａ）から（ｏ）のいずれかに示す２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（濃度はいずれも終濃度）に置換した。

（１１）緩衝液置換したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ溶液を限外ろ過膜（ミリポア社製、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５ｍＬ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０Ｋ）で沈殿が発生するまで濃縮した。この時、局所的に高濃度のところができないよう、こまめに遠心分離機を止めて撹拌した。

（１２）遠心分離により（１１）で得られた溶液の上清を回収し、２８０ｎｍの吸光度から上清中のタンパク質濃度を求めた。前記タンパク質濃度をその溶液に対するＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの飽和濃度とした。

比較例１溶出緩衝液でのヒトＦｃγＲＩＩＩａ飽和濃度評価
（１）実施例１（１０）での透析緩衝液として溶出緩衝液Ａを用いた以外は実施例１と同様の操作を行なった。

実施例１および比較例１の結果をまとめて図１に示す。表１（ｉ）の条件、すなわち０．５ｍｏｌ／ＬのＬ（＋）－アルギニン（Ｌ（＋）－Ａｒｇ）を含む溶液では、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの飽和濃度が顕著に増加した。一方、終濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ以下のＬ（＋）－Ａｒｇ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または硫酸アンモニウム（硫安）を添加しても、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの飽和濃度は、アルギニンを含まない溶出緩衝液Ａ（比較例１）のときと同等または低下した。以上の結果から、０．２ｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下のアルギニンおよび／またはその類縁体を含ませることで、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの溶解性が向上し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを沈殿させることなく保存できることがわかる。

実施例２アルギニン含有溶液におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの保存安定性評価
（１）実施例１（９）で得られたＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ溶液に、アルギニンとしての終濃度が０．５ｍｏｌ／ＬとなるようＬ（＋）－アルギニンおよび／またはＬ（＋）－アルギニン塩酸塩を、終濃度が０．８ｍｏｌ／ＬとなるようＮａＣｌを、それぞれ添加し、ｐＨを８．５に調製後、均一になるよう、転倒混和した。

（２）（１）で得られたアルギニンを含むＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ溶液を冷蔵保存し、冷蔵保存開始直後（０日）ならびに保存１日後、８日後、１２日後、２２日後および３３日後の溶液上清中に含まれるタンパク質濃度を、実施例１（１２）と同様な方法で測定した。

比較例２溶出緩衝液におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの保存安定性評価
実施例１（９）で得られたＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ溶液を冷蔵保存し、冷蔵保存開始直後（０日）ならびに保存１日後、８日後、１２日後、２２日後および３３日後の溶液上清中に含まれるタンパク質濃度を、実施例１（１２）と同様な方法で測定した。

実施例２および比較例２の結果を合わせて表２および図３に示す。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ保存溶液に、アルギニンを終濃度０．５ｍｏｌ／Ｌで添加する（実施例２）ことで、アルギニンを添加しないとき（比較例２）と比較し、大幅に保存安定性が向上していることがわかる。具体的には、３３日間の冷蔵保存で、アルギニンを含まない保存溶液（比較例２）の場合は１０分の１以下までタンパク質濃度が低下したのに対し、０．５ｍｏｌ／Ｌのアルギニンを含む保存溶液（実施例２）の場合はタンパク質濃度の低下がほとんどなかった。

Claims

ヒトＦｃγＲＩＩＩａの保存溶液であって、０．２ｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下のアルギニンおよび／またはその類縁体を含む、前記保存溶液。
さらに３（ｗ／ｖ）％以上４５（ｗ／ｖ）％以下のグリセロールを含む、請求項１に記載の保存溶液。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａと請求項１または２に記載の保存溶液とを接触させる工程を含む、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの安定化方法。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む溶液をクロマトグラフィ用担体充填カラムにアプライし、当該担体にヒトＦｃγＲＩＩＩａを吸着させる工程と、
溶出緩衝液を前記カラムにアプライし、前記担体に吸着したヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出させる工程と、
溶出したヒトＦｃγＲＩＩＩａを含む画分を回収する工程と、
回収した画分を保存する工程とを含む、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの製造方法であって、
前記保存する工程が請求項１または２に記載の保存溶液で保存する工程である、前記製造方法。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドである、請求項１または２に記載の保存溶液；
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１９９番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。