JPH0236355A - 蛋白質測定用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、尿、血清、血漿、髄液等の体液、特に尿中の
蛋白質の簡易測定に用いられる、蛋白質測定用試験片に
関する。

〔発明の背景〕

健康な人でも毎日尿中に２０〜８０Ｉ＋＋９の蛋白質を
排泄するといわれているが、この排泄される蛋白質は通
常粒子が小さく糸球体を通過し易いアルブミンが主体で
ある。一方、溶血がひどく血漿内に赤血球のヘモグロビ
ンが多量に遊出しこれが腎糸球体から漏れたり、あるい
は腎臓や尿路に炎症がある場合などには白血球を尿中に
放出するので、グロブリンを主体とする尿蛋白となる。

尿蛋白は一般に次のような場合に高値となり腎疾患の重
要な指針となる。

（１）急性、および慢性腎炎、ネフローゼ。

（２）心不全による腎の針面、その他。

（５）熱性蛋白尿。

（４）化学薬品中毒、細菌性中毒。

（５）白血病、紫斑病。

（６）狭窄、結石、腫瘍による尿管の閉塞。

（７）脳腫瘍、癲澗、その他中枢神経系疾患、精神感動
。

（８）膿、血液、精液などの混入。

（９）卵など分子量の小さい蛋白質の多量摂取。

（１０）激しい運動、熱い湯又は冷水に長時間つかった
後に現われる一過性のもの。

（１１）体位性および若年性蛋白尿。

現在、一般に行なわれている尿蛋白測定法としては下記
の如き方法がある。

（１）スルホサリチル酸法（鋭敏度０．００２％）透明
尿４〜５　ｒｎｌ＋スルホサリチル酸２０　ｗ／ｖチ溶
液溶液２濶３ 陽性。

（２）煮沸試験法（鋭敏度約０．００５％）透明尿５　
Ｉｌ！ｔを１〜２分間煮沸し、混濁を生じたならば熱時
５％酢酸、又は７０チ硝酸を１〜３滴添加し、混濁が不
変又は増加した場合は蛋白陽性。

（３）　Ｒｏｂｅｒｓ法（鋭敏度０．００３％）試料と
硫酸マグネシウムの硝酸溶液とを等容混合し境界面に日
輪が生ずれば蛋白陽性。

（４）試験紙法（鋭敏度０．０６チ） ブロムフェノールブルーあるいはテトラブロムフェノー
ルブルー等の一指示薬が蛋白質の存在により、アルカリ
側の呈色をする蛋白誤差法を利用。

（５）クツシーブリリアントブルー法 （鋭敏度０００１チ） 色素と蛋白質の結合による高感度測定法で、試料５０Ａ
ｌ　＋ＣＢＢーＧ２５０溶液３ｍ／ー＋５９５ｎｍの吸
光度を測定。

（６）トリクロル酢酸沈殿によるビウレット法検体（原
尿）２ｍｌ＋蒸留水２ｒｒｔｌ＋ト’）クロル酢酸（１
０俤溶液）混和後３．０　０　Ｏ　ｒｐｍで５分以上遠
心後上清を捨てる。沈殿にビウレット試薬（　ＮａＯＨ
４チ、酒石酸カリウムナトリウム結晶４．５チ、ＣｕＳ
Ｏ４・５Ｈ２０　　［１．５％、ヨウ化カリウム０．５
％）２ｍｌ！＋蒸留水２ｍｅ混和後、５７℃、５０分間
加温し５４０ｎｍで比色。

（カビロガロールレッド法 蛋白質によるメタクロマ・ジー現象を利用した高感度測
定法で、検体＋ピロガロールレッドとモリブデン酸の赤
色錯体の酸性溶液→６００　ｎｍの吸光度を測定。

これらの内、スルホサリチル酸法、煮沸試験法、Ｒｏｂ
ｅｒｓ法は、比濁法又はそれに準する方法で多量の試料
を必要とし、しかも定量分析に適用するには精度的に限
界がある。一方りマシーブＩＪ　ＩＪアントブルー法は
比色法であるが、検量線が湾曲することや、セル、試験
管等の汚染があることなどから多数検体を連続処理する
にはそぐわないものとされている。

又、トリクロル酢酸沈殿によるビウレット法は、沈殿分
離操作を必要とするので操作が繁雑であり実用的ではな
い。

ピロがロールレッド法は、検体中の微量蛋白質を感度よ
く測定できる方法であり広く利用されてはいるが、比色
法であり且つ測定に時間を要すことから、スクリーニン
グ等の目的で簡便に利用できる方法であるとは言い難い
。

又、蛋白誤差法を利用した試験紙法は非常に簡便であり
、スクリーニングテストなどの目的で広く普及している
が、現在市販されているこれらの試験紙類はいずれも、
例えば、肉眼による呈色見本との比較判定時に、正常と
異常の境界域での判定が困難であったり、測定感度が低
い等の問題点があった。

従って、各種腎疾患の早期発見の良い指標として尿中蛋
白の測定が注目を集めている現在、尿蛋白の簡便で感度
がよ（、且つ精度の高い測定法がますます渇望されてい
る現状にある。

〔発明の目的〕

本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、簡
便で感度がよく、且つ精度の高い試験紙法による蛋白質
測定法を提供することを目的とする。

〔発明の構成〕

本発明は、支持体上に蛋白質測定用の試薬類を含浸、乾
燥させた吸収性担体を存在させてなる蛋白質測定用試験
片に於て、蛋白質測定用の試薬類を含浸、乾燥さぜる吸
収性担体が予めカレンダ処理されたものであることを特
徴とする蛋白質測定用試験片である。

即ち、本発明者らは、簡便で感度がよく、且つ精度の高
い蛋白質測定用試験片を開発すべく鋭意研究の途上、蛋
白質測定用の試薬類を含浸、乾燥させる吸収性担体とし
て予めカレンダ処理したものを用いれば、上記目的を達
成し得ることを見出し本発明を完成するに至った。

本発明の蛋白質測定用試験片は、蛋白質測定用の試薬類
を含浸、乾燥させる吸収性担体を、予めカレンダ処理し
ておく以外は、自体公知の蛋白質測定用試験片の調製方
法に準じてこれを調製すればよい。即ち、予めカレンダ
処理を行った吸収性担体に、常法により、蛋白質測定用
の試薬類を１乃至数回に分けて含浸、乾燥させる。これ
を適当？１大きさに切断後、適当な支持体上に、両面接
着テープ等を用いる常法により固定化すれば、本発明の
蛋白質測定用試験片を得ることができる。

本発明で言うカレンダ処理とは紙又は布などの仕上げ処
理と２して一般に行われている所間１カレンダ（ｃａｌ
ｓｎｄｅｒ）”処理のことを言い、紙や布の表面を平滑
にし、光択を与え、且つ紙類の場合には紙質を緻密にす
る圧延処理のことである。

本発明の蛋白質測定用試験片に於いて予めカレンダ処理
して用いられる吸収性担体としては、紙。

セルロース、化学繊維２合成樹脂製織布及び不織布等通
常の測定用試験片に於いて用いられる吸収浸、乾燥させ
た後の厚さが０．２５　ｍ以下であることが望ましい。

また、例えば吸収性担体として戸紙を用いる場合、カレ
ンダ処理は抄紙工程と連続的に実施することも、また別
の工程として実施することも、いずれも可能であり、カ
レンダ処理に用いる仕上げ法モ、フレート・カレンダ及
ヒスーノξ−・カレンダ等の、通常、製紙工業で行われ
ている方法であればいずれＫでもよく特に限定されるも
のではない。

更に吸収性担体として戸紙を用いる場合には、製紙工程
で行われる工程のうちの叩解処理に於いて、通常のクロ
マト用ｐ紙に行う場合よりも叩解度を高めておく方が好
ましい。なお叩解処理は通常製紙工業で行われているも
のであれば特に限定されない。

本発明で用いられる蛋白質測定用の試薬類は、特に本発
明の為に選択されたものである必要はなく既存の蛋白質
測定用試験片に於て用いられている蛋白質検出用色素、
緩衝剤等が何ら支障なく使用することができる。即ち、
蛋白質検出用の色素としては、蛋白質によりメタクロマ
ジーを起こす色素であれば特に限定されることな（用い
ることができるが、例えば、テトラブロムフェノールブ
ルー、テトラブロムフェノールフタレインエチルエステ
ル、コンゴーレッド、ブロムクレゾールグリーン、メチ
ルオレンジ、ヒロがロールレッＰとモリブデンの錯体、
ピロカテコールバイオレットとモリブデンの錯体等が通
常好ましく用いられる。

これらを単独で用いる、或いは２種以上組合せて用いる
等は任意である。また、これら色素の使用量としては、
含浸液濃度として、通常０．００１〜１チの範囲が好ま
しく挙げられる。また、含浸液を吸収性担体に含浸、乾
燥させる操作は、常法により行えばよく、含浸・乾燥の
操作を１回だけ行う、或いは数回繰り返し行う等は任意
である。

また、緩衝剤としては、通常、酸性側で使用できる緩衝
剤、例えばクエン酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液等が
代表的なものとして挙げられるが、これら緩衝剤の種類
や含浸液中の濃度については、使用する色素により、自
ら好ましいものが異なるから、使用する色素に応じて、
使用する緩衝剤及びその濃度を適宜選択して用いるべき
ことは言うまでもない。

これら蛋白質測定用の試薬類を、水、適当な有機溶剤或
はこれらの混合溶剤に溶解したものを含浸液とし、本発
明に係る吸収性担体をこれに浸漬することＫよりこれら
試薬類を吸収性担体に含浸させる。

本発明に係る吸収性担体を保持させる支持体としては、
既存の蛋白質測定用試験片に於いて通常支持体として用
いられているものであれば全て例外なく使用でき、例え
ば、ガラス繊維、ポリ塩化ビニル、テフロン９．＋５リ
スチレン、ポリビニルアセタール、アセチルセルロース
、ニトロセルロース。

ポリ塩化ビニリデン及びポリゾロぎレン等の合成高分子
化合物のシート或はこ・れらをコーティングした厚紙等
が挙げられるが、なかでもそれ自身が光を反射しやすい
性質を有するもの、或は光を反射しやすいように加工し
たもの、例えば光沢のある白色ポリマーフィルム又は光
沢のあるアルミ箔を貼り付けたポリマーフィルム等がよ
り好ましく選択される。また、このような性質の支持体
を用いる代わりに、吸収性担体と支持体の間に光を反射
しやすい性質を有するもの、例えば光沢のあるアルミ箔
等を設けても全く同様の効果が得られるので、このよう
な処理を行った場合には、支持体は更にその選択の範囲
が広がる。

これら吸収性担体及び支持体の大きさ、寸法等について
は特に制約はなく、通常用いられている測定用試験片に
於ける吸収性担体及び支持体の大きさ、寸法に準じたも
のを用いることで足りる。

また、吸収性担体の支持体への接着方法に関しても、接
着剤を使用する方法、接着テープを使用する方法等蛋白
質測定用試験片作製に際し、通常行なわれているいずれ
の方法で行なってもよく特別な方法は必要としないが、
接着剤もしくは、接着テープ自体が透明なものあるいは
、接着剤もしくは接着テープ自体が光を反射しやすいも
のであることがより好ましい。

従来の蛋白質測定用試験片に於いては、他の測定項目の
試験片に比べて厚みのある吸収性担体を材料として用い
、吸収性担体に含浸させる検体量を増すことにより、測
定感度の向上を図っていた。

それ故に、本発明の如く、カレンダ処理を行って従来の
ものよりも薄くした吸収性担体を用いて、測定感度の向
上が図れるということは意外なことであった。

この理由については、未だ明確ではないが、カレンダ処
理を行った吸収性担体を材料として用いたことにより、
出来上った試験片の表面が平滑化され、乱反射による反
射率の低下が防止できたこと、或は、出来上った試験片
に検体を含浸させた場合、従来の試験片を使用した場合
に比較して試験片自体の透明度が増し、試験片を通過し
た光が支持体により反射され“て試験片表面にまで戻っ
て（る可能性が高くなって、試験片の色調自体が明るく
なり、色調の変化がより判定し易くなったこと等が考え
られる。

以下に実施例を示すが本発明はこれら実施例により何ら
限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例　１゜ （１）検体量 市販の蛋白質測定用試験片により蛋白陰性と判定された
人プール尿に、ヒトアルブミン（シグマ社製）を５．１
０，１５，２０，３０，１００，３００及び１０００Ｗ
９７ｄｔとなるように添加したものを検体とした。

（２）含浸液の調製 （Ａ液） クエン酸　　　　　　　　　　８．１７クエン酸ナトリ
ウム　　　　　３．５？これらを蒸留水４０ｄに溶解し
て、１．５Ｍのクエン酸溶液で−３，１とし、全量を５
０ｍ／とじた。

（Ｂ液） テトラブロムフェノールブルー　６０■これをメタノー
ルに溶解し５０ｍ／とじた。

次いで、上記Ａ液及びＢ液を混合し、含浸液とした。

（３）試験片の作製 カレンダ処理したクロマトグラフ用ｐ紙（厚さ０．１８
ｍ）に、常法により上記含浸液を含浸させ、乾燥した。

このようにして作製した試験紙を５ｆｉ角の正方形に切
断し、両面テープを用いてポリ塩化ビニルシート（５ｍ
Ｘ　８ｃｙｎ）に貼り付は試験片とした。

（４）測定方法及び測定結果 各検体量に試験片を瞬時浸漬しこれを含浸させた後、約
３０秒後の呈色度合を測定した。呈色度合は、尿検査自
動処理機ＫＩＤ−３０１型（富士通ゼネラル社製）を用
い、測定波長６３０　ｎｍ　Ｋ於ける反射率として測定
した。結果を表１に示す。

比較例　１゜ 実施例１に於けるカレンダ処理したクロマトグラフ用ν
紙の代わりに、厚さ０．２８閣の未カレンダ処理のクロ
マトグラフ用戸紙を用い実施例１と同じ含浸液を用いて
、実施例１と同様の方法により試験片を作製し実施例１
と同様にして、実施例１と同じ検体床につき測定を行っ
た。結果を表１に併せて示す。

表１より明らかな如く、従来の試験片に比較して、本発
明の試験片に於いては、正常域と異常域の境界付近（ヒ
ト血清アルブミン濃度　１０〜３０η’ｄｔ　）での反
射率差が大きくなっていることがわかる。即ち、従来の
試験片では判別が難しかった正常域と異常域の境界付近
での呈色変化が明瞭となったことがわかる。

実施例　２゜ （１）検体床 実施例１と同じ検体床を使用した。

（２）含浸液の調製 実施例１と同じ含浸液を使用した。

（３）試験片の作製 実施例１と同様にして試験片を作製した。

（４）測定方法及び測定結果 検体床に夫々試験片を瞬時浸漬してこれを含浸させた後
、約１０秒後の試験片の呈色を観察した。

検体のアルブミン濃度に応じて試験紙部分は黄〜青色に
呈色した。検出限界は、５１９７ｄｔであった。

比較例　２゜ 実施例２に於けるカレンダ処理したクロマトグラフ用ｐ
紙の代りに、厚さ０．４　ｍの未カレンダ処理のクロマ
トグラフ用戸紙を用い、実施例２と同じ含浸液を用いて
実施例２と同様の方法により試験片を作製し、実施例２
と同様にして、実施例２と同じ検体床につき測定を行っ
た。

試験片の試験紙部分は、各検体のアルブミン濃度に応じ
て黄〜緑青色に呈色した。目視による検出限界は約１０
　Ｗ／ｄｌでありた。

実施例　３゜ （１）検体床 実施例１と同じ検体床を使用した。

（２）含浸液の調製 （Ａ液） クエン酸　　　　　　　　　８．１ｆ クエン酸ナトリウム　　　　　３．５２これらを蒸留水
５０＋＋ｔｌに溶解して、１．５Ｍのクエン酸溶液でｐ
Ｈ３，０とし、全量を５０ｍ／とした。

（Ｂ液） テトラブロムフェノール フタレインエチルエステル　　　５０ｍ？これをメタノ
ールに溶解し５０ｒｎｌとした。

次いで、上記Ａ液及びＢ液を混合し、含浸液とした。

（２）試験片の作製 実施例２と同様にして試験片を作製した。

（３）測定方法及び測定結果 実施例２と同様にして測定を行なった。検体のアルブミ
ン濃度に応じて試験紙部分は、黄〜青色に呈色した。目
視による検出限界は、５　ｗ／ｒｉｐ、であった。

実施例２，３及び比較例２の試験片の呈色の変化を比較
したところ、実施例２及び３のそれは、比較例２のそれ
よりも全体的に色調が明るく、特に正常域と異常域での
境界付近での呈色の変化はより見易く感じられた。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明は、簡便で感度よく且つ精度の
高い、試験紙法による蛋白質測定方法を提供するもので
あり、従来の蛋白質測定用試験片では判別の難しかった
、正常域と異常域の境界付近での判別が明瞭となった点
に顕著な効果を奏する発明であり、斯業に貢献するとこ
ろ極めて大なる発明である。

特許出願人　　和光純薬工業株式会社 手続補正書 １、事件の表示 昭和６３年　特許願第１８７Ｌ２６号 ２、発明の名称 蛋白質測定用試験片 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 〒　５４１ 住所　大阪府大阪市中央区道修町三丁目１番２号「平成
元年２年１３日住居表示変更」 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄、１ ６、補正の内容 （１）明細書１５頁１行目から２行目にかけて記載の「
尿検査自動処理機ＫＩＤ−３０１型（富士通ゼネラル社
製）」を「尿検査機器」と補正する。

（２）明細書１５頁２行目に記載のｒ　６３０ｎｍ　Ｊ
をｒ　６３５ｎｍＪと補正する。

以　　ヒ 連絡先　特許課（東京）置０３−２７０−８５７１４、
補正命令の日付 自　　　発

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）支持体上に蛋白質測定用の試薬類を含浸、乾燥さ
   せた吸収性担体を存在させてなる蛋白質測定用試験片に
   於て、蛋白質測定用の試薬類を含浸、乾燥させる吸収性
   担体が予めカレンダ処理されたものであることを特徴と
   する蛋白質測定用試験片。
2. （２）蛋白質測定用の試薬類を含浸、乾燥させた吸収性
   担体が、厚さ０．２５ｍｍ以下である請求項１に記載の
   試験片。
3. （３）支持体が、光を反射しやすい材質または反射しや
   すいように加工してある請求項１又は２に記載の試験片
   。
4. （４）蛋白質測定用の試薬類を含浸、乾燥させた吸収性
   担体と支持体との間に、光を反射しやすい性質を有する
   ものを存在させる請求項１又は２に記載の試験片。
5. （５）蛋白質が尿蛋白である請求項１〜４のいずれかに
   記載の試験片。