JP2657966B2 - マーカー上に金属粒子を析出させるための改良方法 - Google Patents
マーカー上に金属粒子を析出させるための改良方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明の技術的背景 特殊な結合剤及び／又はそれに対応する被結合物質の
定性的及び／又は定量的測定に現在種々の方法が使用さ
れている。これらの方法は感度、操作の容易さ及び含ま
れる化学的及び物理原理において相互に広く相違してい
るが、一般に重要な類似性が認められている。特異的な
結合剤とそれに対応する被結合物質の間の一般的な例
は、抗原−抗体、抗体−抗原、蛋白質−蛋白質、蛋白質
−配位子、受容体−配位子又は核酸−相補性核酸型のも
のである。抗原−抗体又は免疫学的相互作用はこの点に
関して遥に最重要であり、且つ特に診断の目的にはかよ
うな相互作用に基づく検出方法は今日最も広く使用され
ている。
定性的及び／又は定量的測定に現在種々の方法が使用さ
れている。これらの方法は感度、操作の容易さ及び含ま
れる化学的及び物理原理において相互に広く相違してい
るが、一般に重要な類似性が認められている。特異的な
結合剤とそれに対応する被結合物質の間の一般的な例
は、抗原−抗体、抗体−抗原、蛋白質−蛋白質、蛋白質
−配位子、受容体−配位子又は核酸−相補性核酸型のも
のである。抗原−抗体又は免疫学的相互作用はこの点に
関して遥に最重要であり、且つ特に診断の目的にはかよ
うな相互作用に基づく検出方法は今日最も広く使用され
ている。
凝集体を検出し、及び場合によりそれを定量するため
に種々な技術を使用することができる。凝集体とは特異
的な結合剤と含有される被結合物質の間に生じた複合体
を意味する。或場合には複合体化反応は凝集反応及び／
又は凝集体それ自体の沈殿の結果として直接目に見える
信号をもたらすことがある。しかしこれは常時そうであ
るという訳ではなく、一般にはかような結果を生じるの
に必要な結合剤及び被結合物質の濃度は遥に実用的な、
且つ有用な限界を越えていることが多い。この感度の欠
如を回避し、又は他の方法は検出できない凝集体を検出
するために、例えば補体結合法、受動的血球凝集反応
法、放射免疫測定法（RIA）、蛍光抗体法及び酵素結合
免疫吸着剤検査法（ELISA）のような方法が開発されて
いる。後者の三つの方法において、凝集体の検出は特殊
な結合剤に直接結合するか、一次結合剤が被結合物質と
して作用する二次結合剤に結合するか、或いは被結合物
質のいずれかに結合する、容易に検出されるマーカー
（marker）で凝集体を標識付けすることにより改善され
ている。上記の三つの方法において、マーカーは夫々放
射性原子又は基、蛍光物質又は酵素である。かような方
法はオックスフォード（Oxford）及びエジンバラ（Edin
burgh）、ブラックウェル（Blackwell）科学出版（Scie
ntific Publication）発行の、ワイアーズ・ハンドブ
ック・オブ・エクスペリメンタル・インムノロジー（We
ir's Handbook of Experimental Immunology）（196
7）及び米国特許第3,654,090号（ELISA）に記載されて
いる。
に種々な技術を使用することができる。凝集体とは特異
的な結合剤と含有される被結合物質の間に生じた複合体
を意味する。或場合には複合体化反応は凝集反応及び／
又は凝集体それ自体の沈殿の結果として直接目に見える
信号をもたらすことがある。しかしこれは常時そうであ
るという訳ではなく、一般にはかような結果を生じるの
に必要な結合剤及び被結合物質の濃度は遥に実用的な、
且つ有用な限界を越えていることが多い。この感度の欠
如を回避し、又は他の方法は検出できない凝集体を検出
するために、例えば補体結合法、受動的血球凝集反応
法、放射免疫測定法（RIA）、蛍光抗体法及び酵素結合
免疫吸着剤検査法（ELISA）のような方法が開発されて
いる。後者の三つの方法において、凝集体の検出は特殊
な結合剤に直接結合するか、一次結合剤が被結合物質と
して作用する二次結合剤に結合するか、或いは被結合物
質のいずれかに結合する、容易に検出されるマーカー
（marker）で凝集体を標識付けすることにより改善され
ている。上記の三つの方法において、マーカーは夫々放
射性原子又は基、蛍光物質又は酵素である。かような方
法はオックスフォード（Oxford）及びエジンバラ（Edin
burgh）、ブラックウェル（Blackwell）科学出版（Scie
ntific Publication）発行の、ワイアーズ・ハンドブ
ック・オブ・エクスペリメンタル・インムノロジー（We
ir's Handbook of Experimental Immunology）（196
7）及び米国特許第3,654,090号（ELISA）に記載されて
いる。
最近において、特殊な結合剤及び被結合物質の間に生
じた凝集体が、該凝集体を直接又は間接に寸法の小さい
金属粒子、特に金粒子で標識付けすることによって検出
される方法が導入された。情況によって、これらの粒子
は例えば直接目視検査により、顕微鏡又は分光測定的技
術によって検出できる。特殊な応用例である“免疫金染
色（IGS）技術”、“ゾル粒子免疫測定（SPIA）技術”
及びその改良法の記述は、例えば米国特許第4,313,734
号、同4,446,238号及び4,420,558号に、ヨーロッパ特許
明細書第165,634号に対応する米国特許出願第622,923号
に、ヨーロッパ特許明細書第158,746号に対応する米国
特許出願第660,832号に及びニューヨーク、ウィリー（W
iley）社のIBROハンドブック・シリーズの1983年、347
−372頁において見出すことができる。
じた凝集体が、該凝集体を直接又は間接に寸法の小さい
金属粒子、特に金粒子で標識付けすることによって検出
される方法が導入された。情況によって、これらの粒子
は例えば直接目視検査により、顕微鏡又は分光測定的技
術によって検出できる。特殊な応用例である“免疫金染
色（IGS）技術”、“ゾル粒子免疫測定（SPIA）技術”
及びその改良法の記述は、例えば米国特許第4,313,734
号、同4,446,238号及び4,420,558号に、ヨーロッパ特許
明細書第165,634号に対応する米国特許出願第622,923号
に、ヨーロッパ特許明細書第158,746号に対応する米国
特許出願第660,832号に及びニューヨーク、ウィリー（W
iley）社のIBROハンドブック・シリーズの1983年、347
−372頁において見出すことができる。
金属粒子は更に直接固体の支持体上に固定されている
蛋白質及び核酸のような受容体物質の染色に使用されて
きた。かような方法は例えばヨーロッパ特許明細書第16
5,633号に対応する米国特許出願第744,091号に記載され
ている。
蛋白質及び核酸のような受容体物質の染色に使用されて
きた。かような方法は例えばヨーロッパ特許明細書第16
5,633号に対応する米国特許出願第744,091号に記載され
ている。
細胞表面抗原を標識付けするために比較的未知な方法
から出発して、金属粒子は今日各種の検出及び／又は定
量的測定の問題において広く使用されるようになった。
金属粒子の直接目視検査の可能性、及び発生する信号が
永久的であり、迅速に分解しないという長所のために、
それは簡単及び迅速な検査のための興味あるマーカーと
なっている。更に金属マーカー、好適には金マーカーは
放射性同位元素マーカーよりもその作用に関連する健康
に与える危険性が非常に低いので好ましいと思われる。
から出発して、金属粒子は今日各種の検出及び／又は定
量的測定の問題において広く使用されるようになった。
金属粒子の直接目視検査の可能性、及び発生する信号が
永久的であり、迅速に分解しないという長所のために、
それは簡単及び迅速な検査のための興味あるマーカーと
なっている。更に金属マーカー、好適には金マーカーは
放射性同位元素マーカーよりもその作用に関連する健康
に与える危険性が非常に低いので好ましいと思われる。
ヨーロッパ特許明細書第158,746号、10頁、18ないし3
2行に、ブロット（blotting）媒体の表面に結合したコ
ロイド状金粒子をいわゆる物理現像法で処理することに
より、コロイド状金マーカーの信号を著しく改善する方
法が記載されている。
2行に、ブロット（blotting）媒体の表面に結合したコ
ロイド状金粒子をいわゆる物理現像法で処理することに
より、コロイド状金マーカーの信号を著しく改善する方
法が記載されている。
既知技術の物理現像剤は一般に硝酸銀のような可溶性
金属塩、ハイドロキノンのような還元剤及び特定のpH、
好適には４より小さいpHを確保するための適当な緩衝系
を含む溶液から成っている。
金属塩、ハイドロキノンのような還元剤及び特定のpH、
好適には４より小さいpHを確保するための適当な緩衝系
を含む溶液から成っている。
最初に銀イオンの金属銀への還元が金粒子の表面で触
媒され、金粒子の部位に金属銀の特殊な析出を起こす。
次いで、かくして生成した金属銀粒子が還元を触媒し、
自触媒反応を創出する。物理現像の効果は赤い光学的な
金の信号を遥に高い強度を持つ深褐色ないし黒色の銀の
信号に変換することである。これらの既知技術に関連す
る多数の欠点はあるが、この物理現像の使用によって信
号の改善がもたらされる。
媒され、金粒子の部位に金属銀の特殊な析出を起こす。
次いで、かくして生成した金属銀粒子が還元を触媒し、
自触媒反応を創出する。物理現像の効果は赤い光学的な
金の信号を遥に高い強度を持つ深褐色ないし黒色の銀の
信号に変換することである。これらの既知技術に関連す
る多数の欠点はあるが、この物理現像の使用によって信
号の改善がもたらされる。
大きな問題の一つは金属塩の溶解度である。実際銀イ
オンのような金属イオンは多くの対イオンと不溶性塩を
形成することがよく知られている。利用できる銀イオン
の供給源の消耗を別としても、これらの不溶性塩も銀の
還元工程が同様に触媒される核を形成し、ノイズレベル
を大きく増大させる効果を招く。更に銀イオンは臭化銀
及び塩化銀のような感光性の銀塩を形成し、これは光の
影響下で自触媒現象を開始させる金属銀に容易に還元さ
れる。従って極めて清浄な接触表面、例えば容器、分析
級の薬品及び超純水を用いて作業することが必要であ
る。温置（incubation）媒体中に存在する望ましくない
イオンを除去するために、金属で標識された特異的結合
剤との温置とマーカーの物理現像との間に、多数回の洗
浄工程を導入することも通常必要である。これら総ては
在来の物理現像に基づく検査法を一層複雑、高価とし、
且つ誤差を招き易いものとする傾向がある。
オンのような金属イオンは多くの対イオンと不溶性塩を
形成することがよく知られている。利用できる銀イオン
の供給源の消耗を別としても、これらの不溶性塩も銀の
還元工程が同様に触媒される核を形成し、ノイズレベル
を大きく増大させる効果を招く。更に銀イオンは臭化銀
及び塩化銀のような感光性の銀塩を形成し、これは光の
影響下で自触媒現象を開始させる金属銀に容易に還元さ
れる。従って極めて清浄な接触表面、例えば容器、分析
級の薬品及び超純水を用いて作業することが必要であ
る。温置（incubation）媒体中に存在する望ましくない
イオンを除去するために、金属で標識された特異的結合
剤との温置とマーカーの物理現像との間に、多数回の洗
浄工程を導入することも通常必要である。これら総ては
在来の物理現像に基づく検査法を一層複雑、高価とし、
且つ誤差を招き易いものとする傾向がある。
在来の方法の主な欠点は物理現像それ自体の中にあ
る。例えば銀を基剤とした物理現像剤の場合は、還元剤
は総ての銀イオンを或程度まで還元する。適切な感度を
得るためには、増感工程は非マーカー誘導還元（non−m
arker−induced reduction）、いわゆる“自己現像核
化”が現れる前に、金属マーカー含有相から物理現像剤
を除去することにより停止しなければならない。金属に
特有な還元速度と自己現像核化と速度との間の比を増大
できれば、物理現像剤は一層扱い易く且つ強力になるこ
とは明らかである。伝統的に使用されている物理現像剤
の場合、この比を大きくすることはほとんど不可能であ
る。調整できる唯一のパラメーターは工程の全体的な速
度である；自己現像核化は金属マーカー増感の速度を遅
くすることによってのみ遅らせることができる。これを
行う最も明らかな方法の一つは還元剤の濃度、性質又は
環境を変化させることである。しばしば用いられるやり
方は４より低いpHにおけるハイドロキノンの使用であ
る。ハイドロキノンの還元作用は酸性の環境下で強く抑
制される；従って物理現像剤の使用者は自己現像核化が
余り大きくノイズを起こす前に金属マーカーの増感を停
止する充分な時間的余裕がある。しかし酸の添加は多く
の場合標識付けされた特異的結合剤とそれに対応する被
結合物質の間の結合の性質と適合性がない。大部分の単
クローン系の抗体は該pHではその抗原に対して低い又は
平均的な親和性しか有していない。更にマーカーの増感
は自己現像核化が遅くなるのと同程度に遅くなるので、
感度の真の増幅は達成されない。
る。例えば銀を基剤とした物理現像剤の場合は、還元剤
は総ての銀イオンを或程度まで還元する。適切な感度を
得るためには、増感工程は非マーカー誘導還元（non−m
arker−induced reduction）、いわゆる“自己現像核
化”が現れる前に、金属マーカー含有相から物理現像剤
を除去することにより停止しなければならない。金属に
特有な還元速度と自己現像核化と速度との間の比を増大
できれば、物理現像剤は一層扱い易く且つ強力になるこ
とは明らかである。伝統的に使用されている物理現像剤
の場合、この比を大きくすることはほとんど不可能であ
る。調整できる唯一のパラメーターは工程の全体的な速
度である；自己現像核化は金属マーカー増感の速度を遅
くすることによってのみ遅らせることができる。これを
行う最も明らかな方法の一つは還元剤の濃度、性質又は
環境を変化させることである。しばしば用いられるやり
方は４より低いpHにおけるハイドロキノンの使用であ
る。ハイドロキノンの還元作用は酸性の環境下で強く抑
制される；従って物理現像剤の使用者は自己現像核化が
余り大きくノイズを起こす前に金属マーカーの増感を停
止する充分な時間的余裕がある。しかし酸の添加は多く
の場合標識付けされた特異的結合剤とそれに対応する被
結合物質の間の結合の性質と適合性がない。大部分の単
クローン系の抗体は該pHではその抗原に対して低い又は
平均的な親和性しか有していない。更にマーカーの増感
は自己現像核化が遅くなるのと同程度に遅くなるので、
感度の真の増幅は達成されない。
従って金属を基剤とした検出及び／又は定量的測定技
術の感度及び実用性を改善する強い必要性が存在する。
術の感度及び実用性を改善する強い必要性が存在する。
本発明の詳述 本発明は、使用される物理現像剤が金属イオン、金属
イオンに対してモル比的に過剰な、錯化剤である複素環
式塩基、還元剤及び必要に応じ緩衝系及び一種又は多種
の助剤から成ることにより、直接又は間接に金属イオン
の還元を触媒するマーカー上に物理現像剤から金属粒子
を析出させる方法を提供する。該方法は前記のマーカー
で該凝集体の少なくとも一つの成分を標識付けすること
により、好適には少なくとも一種の特異的な結合剤とそ
の対応する被結合物質との間の凝集体の一種又は多種の
成分を、定性的及び／又は定量的に測定するために好適
に使用される。該好適な方法は、特異的な結合剤又は対
応する被結合物質を直接又は間接的に固体の支持体上に
固定し、支持体を物理現像剤の錯金属イオンの還元を触
媒するマーカーで標識付けされた相対物（counterpar
t）と接触させ、結合した又は遊離の標識付けされた成
分の分離の前又は後に物理現像剤を添加し、それにより
反応の間又は適当な反応時間後に、生成した金属粒子を
試験試料及び／又は誘導された分画中で定量的及び／又
は定性的に測定し、定量すべき成分の定性的及び／又は
定量的な指標を提供することにより適宜に実行すること
ができる。或種の例においては、固定された被結合物質
を含む支持体を該被結合物質に特異的な第一結合剤と接
触させて凝集体を形成させ、且つこうして形成された凝
集体を保持する支持体を引き続き該第一結合蛋白質に特
異的であり、マーカーで標識付けされた第二の結合蛋白
質と接触させる方が好ましいことがある。上記の方法は
ハプテン、抗原及び抗体のような免疫化学的成分の測定
に特に適当している。
イオンに対してモル比的に過剰な、錯化剤である複素環
式塩基、還元剤及び必要に応じ緩衝系及び一種又は多種
の助剤から成ることにより、直接又は間接に金属イオン
の還元を触媒するマーカー上に物理現像剤から金属粒子
を析出させる方法を提供する。該方法は前記のマーカー
で該凝集体の少なくとも一つの成分を標識付けすること
により、好適には少なくとも一種の特異的な結合剤とそ
の対応する被結合物質との間の凝集体の一種又は多種の
成分を、定性的及び／又は定量的に測定するために好適
に使用される。該好適な方法は、特異的な結合剤又は対
応する被結合物質を直接又は間接的に固体の支持体上に
固定し、支持体を物理現像剤の錯金属イオンの還元を触
媒するマーカーで標識付けされた相対物（counterpar
t）と接触させ、結合した又は遊離の標識付けされた成
分の分離の前又は後に物理現像剤を添加し、それにより
反応の間又は適当な反応時間後に、生成した金属粒子を
試験試料及び／又は誘導された分画中で定量的及び／又
は定性的に測定し、定量すべき成分の定性的及び／又は
定量的な指標を提供することにより適宜に実行すること
ができる。或種の例においては、固定された被結合物質
を含む支持体を該被結合物質に特異的な第一結合剤と接
触させて凝集体を形成させ、且つこうして形成された凝
集体を保持する支持体を引き続き該第一結合蛋白質に特
異的であり、マーカーで標識付けされた第二の結合蛋白
質と接触させる方が好ましいことがある。上記の方法は
ハプテン、抗原及び抗体のような免疫化学的成分の測定
に特に適当している。
更に本発明は固体支持体上に直接固定され且つ前述の
マーカーと結合している蛋白質又は核酸のような受容体
物質を、定量的及び／または定性的に測定する祭にも使
用できる。
マーカーと結合している蛋白質又は核酸のような受容体
物質を、定量的及び／または定性的に測定する祭にも使
用できる。
本発明の他の態様は上記の方法を実行するのに適当し
た多目的溶液及び試験用具一式を提供することである。
た多目的溶液及び試験用具一式を提供することである。
本発明は過剰の錯化体（complexant）を現像剤に添加
することにより、在来の現像剤に関連した欠点を改善し
ている。本発明による方法において使用される錯化剤は
物理現像剤の金属イオンと水溶性の錯体を形成すること
ができる任意の薬剤から成る。錯生成定数は、一方では
マーカー上の金属粒子の成長を許容する程度の充分な量
の錯体化しない金属イオンが存在し、他方では錯体化し
ない金属イオンの濃度が前述の望ましくない副次的効果
を避ける程度に充分に低いように選択される。
することにより、在来の現像剤に関連した欠点を改善し
ている。本発明による方法において使用される錯化剤は
物理現像剤の金属イオンと水溶性の錯体を形成すること
ができる任意の薬剤から成る。錯生成定数は、一方では
マーカー上の金属粒子の成長を許容する程度の充分な量
の錯体化しない金属イオンが存在し、他方では錯体化し
ない金属イオンの濃度が前述の望ましくない副次的効果
を避ける程度に充分に低いように選択される。
本発明による方法における有用な錯体剤は、例えばヒ
スチジンのようなアミノ酸及び複素環式塩基のような、
窒素上に利用可能な非共用電子対を有する少なくとも一
つの供与体窒素原子を有する。好適な複素環式塩基はsp
2混成軌道に非共有電子対を持つ、少なくとも一つの窒
素を有する随時置換された単環式又は二環式塩基であっ
て、例えば（ｉ）二個の環状窒素原子を有する五員環を
含む芳香族環式部類、例えばイミダゾール、ベンズイミ
ダゾール、ピラゾール、プリン等で、イミダゾールが最
も好適であり、（ii）一個の環状窒素原子を有する六員
環を含む芳香族環式部類、例えばピリジン、アミノピリ
ジン、ニコチンアミド、キノリン等である。イミダゾー
ル及びピリジン誘導対との銀錯体の錯生成定数に関し
て、ザ・ブチレン・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ
・オブ・ジャパン（the Bulletin of the Chemical
Society of Japan）、42、3598−3600（1969）が参
考となる。
スチジンのようなアミノ酸及び複素環式塩基のような、
窒素上に利用可能な非共用電子対を有する少なくとも一
つの供与体窒素原子を有する。好適な複素環式塩基はsp
2混成軌道に非共有電子対を持つ、少なくとも一つの窒
素を有する随時置換された単環式又は二環式塩基であっ
て、例えば（ｉ）二個の環状窒素原子を有する五員環を
含む芳香族環式部類、例えばイミダゾール、ベンズイミ
ダゾール、ピラゾール、プリン等で、イミダゾールが最
も好適であり、（ii）一個の環状窒素原子を有する六員
環を含む芳香族環式部類、例えばピリジン、アミノピリ
ジン、ニコチンアミド、キノリン等である。イミダゾー
ル及びピリジン誘導対との銀錯体の錯生成定数に関し
て、ザ・ブチレン・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ
・オブ・ジャパン（the Bulletin of the Chemical
Society of Japan）、42、3598−3600（1969）が参
考となる。
本発明により使用されるマーカーは、該マーカーの部
位で対応する金属粒子の析出をもたらす金属イオンの還
元を触媒することができる任意の粒子を含むことを意図
している。往々にしてこうして析出した金属粒子は順次
還元を触媒し、自触媒工程が生起する。
位で対応する金属粒子の析出をもたらす金属イオンの還
元を触媒することができる任意の粒子を含むことを意図
している。往々にしてこうして析出した金属粒子は順次
還元を触媒し、自触媒工程が生起する。
使用されるマーカーは金属、金属化合物又は直接又は
間接にその表面の金属イオンの還元を触媒することがで
きる金属又は金属化合物で随時被覆又は含浸された重合
体から成る。該金属の例として金、銀、タイウム、白
金、パラジウム並びに銅、ニッケル等を挙げることがで
きる、金が最も好適である。金属化合物の例として前記
金属に対応する錯塩及び硫化物を挙げることができる。
金属又は金属化合物で被覆又は含浸された重合体は金属
又は金属化合物として類似の性質を有しているが、寸
法、密度及び金属含量の組み合わせを最適とすることが
できる。好適な方法で使用されるために、マーカーは特
異的な結合剤又はそれと結合できる任意の被結合剤が、
その結合又は被結合の相対物との親和性を損なうことな
くマーカーに付着できるように選択する必要がある。
間接にその表面の金属イオンの還元を触媒することがで
きる金属又は金属化合物で随時被覆又は含浸された重合
体から成る。該金属の例として金、銀、タイウム、白
金、パラジウム並びに銅、ニッケル等を挙げることがで
きる、金が最も好適である。金属化合物の例として前記
金属に対応する錯塩及び硫化物を挙げることができる。
金属又は金属化合物で被覆又は含浸された重合体は金属
又は金属化合物として類似の性質を有しているが、寸
法、密度及び金属含量の組み合わせを最適とすることが
できる。好適な方法で使用されるために、マーカーは特
異的な結合剤又はそれと結合できる任意の被結合剤が、
その結合又は被結合の相対物との親和性を損なうことな
くマーカーに付着できるように選択する必要がある。
本発明による方法において使用するのに特に好適なイ
オンは、（ｉ）金属又は金属硫化物を含むコロイド状金
属粒子、随時ゾル；又は（ii）金属キレート、特にエチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）又はジエチレントリアミン
五酢酸（DTPA）の部類を包含する金属キレート；又は
（iii）随時金属又は金属硫化物を含浸した重合体、例
えばジアミノベンジジン重合体のようにベンジジン誘導
体の集合生成物のいずれかである。
オンは、（ｉ）金属又は金属硫化物を含むコロイド状金
属粒子、随時ゾル；又は（ii）金属キレート、特にエチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）又はジエチレントリアミン
五酢酸（DTPA）の部類を包含する金属キレート；又は
（iii）随時金属又は金属硫化物を含浸した重合体、例
えばジアミノベンジジン重合体のようにベンジジン誘導
体の集合生成物のいずれかである。
本発明による方法において使用される還元剤は、活性
部位の近傍において物理現像剤から金属イオン、特に
銀、金、白金、パラジウム又はタリウムイオンを還元す
る任意の薬剤を含むことを意味する。好適には前記還元
剤は保護された（protected）物理現像剤の一種又は多
数の成分と安定な溶液を形成する。還元剤として特に1,
2−ジヒドロキシベンゼン、1,4−ジヒドロキシベンゼン
（ハイドロキノン）、硫酸−４−メチルアミノフェノー
ル（メトール ）、４−アミノフェノール、1,4−ジア
ミノベンゼン、1,2−ジアミノベンゼン、Ｎ−（４−ヒ
ドロキシフェニル）グリシン、2,4−ジアミノフェノー
ル、１−フェニル−３−ヒドロキシピラゾール（フェニ
ドン ）又はそれらの混合物を挙げることができる。保
護された物理現像剤の他の成分（助剤）として、緩衝
剤、保恒剤、例えば酸化防止剤又は有機性安定剤、現像
抑制剤、殺菌剤等、例えば亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸
ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を挙げることができ
る。
部位の近傍において物理現像剤から金属イオン、特に
銀、金、白金、パラジウム又はタリウムイオンを還元す
る任意の薬剤を含むことを意味する。好適には前記還元
剤は保護された（protected）物理現像剤の一種又は多
数の成分と安定な溶液を形成する。還元剤として特に1,
2−ジヒドロキシベンゼン、1,4−ジヒドロキシベンゼン
（ハイドロキノン）、硫酸−４−メチルアミノフェノー
ル（メトール ）、４−アミノフェノール、1,4−ジア
ミノベンゼン、1,2−ジアミノベンゼン、Ｎ−（４−ヒ
ドロキシフェニル）グリシン、2,4−ジアミノフェノー
ル、１−フェニル−３−ヒドロキシピラゾール（フェニ
ドン ）又はそれらの混合物を挙げることができる。保
護された物理現像剤の他の成分（助剤）として、緩衝
剤、保恒剤、例えば酸化防止剤又は有機性安定剤、現像
抑制剤、殺菌剤等、例えば亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸
ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を挙げることができ
る。
コロイド状マーカー、特にコロイド状金粒子の製造、
特異的結合剤又はそれにより結合性となる任意の試剤に
対するマーカーの付着、及びそれらを所望の被結合物質
と直接又は間接に結合させる種々の方法論は充分周知で
ある。この点に関しては、米国特許第4,313,784号、ヨ
ーロッパ特許明細書第0,158,832号に対応する米国特許
出願第660,832号、ヨーロッパ特許明細書第0,165,633号
に対応する米国特許出願第744,091号、ニューヨーク、
ウィリー（Wiley）社のIBROハンドブック・シラーズ、
クエロ（Cuello）A.C.監修、イムノヒストケミストリー
（Immunohistochemistry）、1983年、347−372頁及びテ
クニックス・イン・イムノシトケミストリー（Immunocy
tochemistry）、第２巻、217−284頁（1983年）を参照
されたい。
特異的結合剤又はそれにより結合性となる任意の試剤に
対するマーカーの付着、及びそれらを所望の被結合物質
と直接又は間接に結合させる種々の方法論は充分周知で
ある。この点に関しては、米国特許第4,313,784号、ヨ
ーロッパ特許明細書第0,158,832号に対応する米国特許
出願第660,832号、ヨーロッパ特許明細書第0,165,633号
に対応する米国特許出願第744,091号、ニューヨーク、
ウィリー（Wiley）社のIBROハンドブック・シラーズ、
クエロ（Cuello）A.C.監修、イムノヒストケミストリー
（Immunohistochemistry）、1983年、347−372頁及びテ
クニックス・イン・イムノシトケミストリー（Immunocy
tochemistry）、第２巻、217−284頁（1983年）を参照
されたい。
一般に、所望の結合剤、例えば抗体が溶解している適
当なpHの水性媒体と粒子を接触させることにより付着は
容易に行なわれる。粒子を試験試料の非特定の蛋白質と
の非選択的相互作用から保護するために、例えば免疫学
的に不活性な極性の高分子、例えは牛血清アルブミン
（BSA）、ポリビニルピロリドン（PVP）及びポリエチレ
ングリコール（PEG）のような消正（quenching）又は安
定剤を添加することが適当である。適当な時間を置いた
後に、不安定な粒子及び遊離した又は緩く結合した結合
剤は繰り返し遠心及び洗浄することにより除去される。
必要に応じ、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー
（J.Cell Biol.）90、533−536に記載された方法に従
って粒子をサイジング（size）することもできる。
当なpHの水性媒体と粒子を接触させることにより付着は
容易に行なわれる。粒子を試験試料の非特定の蛋白質と
の非選択的相互作用から保護するために、例えば免疫学
的に不活性な極性の高分子、例えは牛血清アルブミン
（BSA）、ポリビニルピロリドン（PVP）及びポリエチレ
ングリコール（PEG）のような消正（quenching）又は安
定剤を添加することが適当である。適当な時間を置いた
後に、不安定な粒子及び遊離した又は緩く結合した結合
剤は繰り返し遠心及び洗浄することにより除去される。
必要に応じ、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー
（J.Cell Biol.）90、533−536に記載された方法に従
って粒子をサイジング（size）することもできる。
又一方、米国特許第3,857,931号に記載された方法に
従い、水溶性のカップリング剤を用いて蛋白質をマーカ
ーに共有結合させることもできる。抗体のような結合剤
に対する金属キレートの付着は、例えばアナリチカル・
バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、14
2、68−79（1984年）及びカンサー・リサーチ（Cancer
Resaerch）、45、5694−5699（1985年）に記載された
方法に従って容易に実施することができる。一般に、ジ
エチレントリアミン五酢酸（DTPA）、エチレンジアミン
四酢酸（EDTA）等のようなキレート剤を蛋白質にカップ
リングする反応は、ジアゾニウムカップリング及び活性
カルボキシル基を用いるアシル化を含んでいる。こうし
て得られたキレート剤複合蛋白質はその免疫反応性を保
持しており、そして所望の金属元素を容易に架載するこ
とができる。
従い、水溶性のカップリング剤を用いて蛋白質をマーカ
ーに共有結合させることもできる。抗体のような結合剤
に対する金属キレートの付着は、例えばアナリチカル・
バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、14
2、68−79（1984年）及びカンサー・リサーチ（Cancer
Resaerch）、45、5694−5699（1985年）に記載された
方法に従って容易に実施することができる。一般に、ジ
エチレントリアミン五酢酸（DTPA）、エチレンジアミン
四酢酸（EDTA）等のようなキレート剤を蛋白質にカップ
リングする反応は、ジアゾニウムカップリング及び活性
カルボキシル基を用いるアシル化を含んでいる。こうし
て得られたキレート剤複合蛋白質はその免疫反応性を保
持しており、そして所望の金属元素を容易に架載するこ
とができる。
本発明の方法において使用されるマーカーとして用い
ることができる重合体として、随時金属又は金属化合物
が架載されているベンジジン誘導体の重合体生成物を挙
げることができる。ジアミノベンジジン重合体の用途及
び製造法は例えばジャーナル・オブ・ヒストケミストリ
ー・アンド・シトケミストリー（J.Histochem.Cytoche
m.）30、183−184（1982年）及びニューロサイエンス
（Neuroscience）13、513−525（1984年）に記載されて
いる。
ることができる重合体として、随時金属又は金属化合物
が架載されているベンジジン誘導体の重合体生成物を挙
げることができる。ジアミノベンジジン重合体の用途及
び製造法は例えばジャーナル・オブ・ヒストケミストリ
ー・アンド・シトケミストリー（J.Histochem.Cytoche
m.）30、183−184（1982年）及びニューロサイエンス
（Neuroscience）13、513−525（1984年）に記載されて
いる。
本発明の好適な方法によって為される測定法は均質的
又は異質的に実施することができる。均質的な測定は実
施することが特に簡単であるが、標識付けされた試薬中
に存在するマーカー、又は標識付けされた試薬と定量さ
れるべき粒子との間に生じた標識付けされた凝集体中に
存在するマーカーのどちらからか発生する認識された信
号の測定可能な変化を必要とする。かような区別が不可
能である場合には、異質的測定が実施されるべきであろ
う。
又は異質的に実施することができる。均質的な測定は実
施することが特に簡単であるが、標識付けされた試薬中
に存在するマーカー、又は標識付けされた試薬と定量さ
れるべき粒子との間に生じた標識付けされた凝集体中に
存在するマーカーのどちらからか発生する認識された信
号の測定可能な変化を必要とする。かような区別が不可
能である場合には、異質的測定が実施されるべきであろ
う。
均質的測定は結合又は未結合の標識付けされた物質種
を物理的に分離することが不必要であり、従って検査を
実施するのに必要な工程の数を減らせるという点で有利
である。標識付けされた成分と対応する結合相対物との
間の反応により、均質測定を実施するのに必要な、標識
の共有関係の測定可能な変化又は信号発生成分の変調が
生起する。結合及び未結合物質種の間のマーカーの分布
は、該マーカーが結合物質種中に存在する時に、現像後
マーカーから発する信号に影響を及ぼす能力が無くなる
か又は変更されることによって差異を生じることができ
る。
を物理的に分離することが不必要であり、従って検査を
実施するのに必要な工程の数を減らせるという点で有利
である。標識付けされた成分と対応する結合相対物との
間の反応により、均質測定を実施するのに必要な、標識
の共有関係の測定可能な変化又は信号発生成分の変調が
生起する。結合及び未結合物質種の間のマーカーの分布
は、該マーカーが結合物質種中に存在する時に、現像後
マーカーから発する信号に影響を及ぼす能力が無くなる
か又は変更されることによって差異を生じることができ
る。
均質測定法は例えば競合結合（competitive bindin
g）技術のような既知技術の方法によって適宜実施する
ことができる。分析物を含む試料は、分析物の結合相対
物、分析物にカップルされるマーカーを含む標識付けさ
れた試薬、又は特異的な結合性類似物、及びマーカーそ
れ自体を信号発生成分に変換するのに必要な物理現像剤
と混和される。又一方、試料と分析物の結合相対物を最
初に組み合わせ、その後で検出用試薬を添加することに
よる逐次的測定法を実施することができる。
g）技術のような既知技術の方法によって適宜実施する
ことができる。分析物を含む試料は、分析物の結合相対
物、分析物にカップルされるマーカーを含む標識付けさ
れた試薬、又は特異的な結合性類似物、及びマーカーそ
れ自体を信号発生成分に変換するのに必要な物理現像剤
と混和される。又一方、試料と分析物の結合相対物を最
初に組み合わせ、その後で検出用試薬を添加することに
よる逐次的測定法を実施することができる。
多くの場合、均質的測定法を実施することが不可能で
ある。このような場合は異質的定量法は特に魅力的な別
法である。一般に、異質的測定系は少なくとも二つの基
本的成分及び同時に又は逐次的に混和される物理現像
剤、即ち検出されるべき分析物、マーカーで標識付けさ
れた結合の相対物及びマーカーを信号発生成分自体に変
換するのに必要な物理現像剤から成る。必要に応じ適当
な温置期間を置いた後、標識付けされた試薬は対応する
検出されるべき被結合物質に結合するが、その際結合物
質種の非結合物質種に対する比率は、存在する分析物の
量の関数である。結合及び非結合物質種は物理的に分離
され、その一方に存在する標識の量が測定される。
ある。このような場合は異質的定量法は特に魅力的な別
法である。一般に、異質的測定系は少なくとも二つの基
本的成分及び同時に又は逐次的に混和される物理現像
剤、即ち検出されるべき分析物、マーカーで標識付けさ
れた結合の相対物及びマーカーを信号発生成分自体に変
換するのに必要な物理現像剤から成る。必要に応じ適当
な温置期間を置いた後、標識付けされた試薬は対応する
検出されるべき被結合物質に結合するが、その際結合物
質種の非結合物質種に対する比率は、存在する分析物の
量の関数である。結合及び非結合物質種は物理的に分離
され、その一方に存在する標識の量が測定される。
分離工程及び結合反応を実施する種々の手段は当該分
野で既知である。前記の分離は例えば固体相抗体又は抗
原、二次抗体、又は固体相二次抗体の使用による；又は
免疫複合体沈殿剤、吸着剤等によるような通常の方法を
含んでいる。前記結合反応は例えばいわゆる競合結合技
術、逐次飽和技術、サンドウィッチ技術等を含んでい
る。
野で既知である。前記の分離は例えば固体相抗体又は抗
原、二次抗体、又は固体相二次抗体の使用による；又は
免疫複合体沈殿剤、吸着剤等によるような通常の方法を
含んでいる。前記結合反応は例えばいわゆる競合結合技
術、逐次飽和技術、サンドウィッチ技術等を含んでい
る。
本発明の方法により為される好適な測定法は、特異的
な結合蛋白質と被結合物質との間に形成された標識付け
された凝集体は、或時点において、未反応の粒子が洗い
落とされ、それにより固定された粒子が“その場で”又
は必要に応じ、それから誘導された任意の他の相に解放
された後、検出されるような方式で固定されるという原
理に基づいた異質的測定法である。
な結合蛋白質と被結合物質との間に形成された標識付け
された凝集体は、或時点において、未反応の粒子が洗い
落とされ、それにより固定された粒子が“その場で”又
は必要に応じ、それから誘導された任意の他の相に解放
された後、検出されるような方式で固定されるという原
理に基づいた異質的測定法である。
特に好適な具体化においては、生の試験検体中に、又
はそれから誘導された精製、又は部分的に精製された分
画中に含まれている検出すべき被結合物質が、該被結合
物質に特異的な標識付けされた結合剤と複合体をつくる
前に、適当な固体性の支持体上に固定される。
はそれから誘導された精製、又は部分的に精製された分
画中に含まれている検出すべき被結合物質が、該被結合
物質に特異的な標識付けされた結合剤と複合体をつくる
前に、適当な固体性の支持体上に固定される。
被結合物質の固定は通常の技術に従い、例えば固定用
支持体上に試験検体の一部液をスポットするか又は試験
検体中に支持体を浸漬し、引き続き乾燥し、且つ随時固
定されなかった物質を洗い落とすことによって実行する
ことができる。これはいわゆる直接法である。この技術
用の固定化支持体としての各種の材料、一般に測定に便
利な任意の、例えばシート、ビート（beat）、窪みのあ
る板、浸漬棒等の形状を取ることができる重合体材料、
例えばニトロセルロース、ジアゾベンジルオキシメチル
（DBH）−及びジアゾフェニルチオエーテル（DPT）改質
セルロース紙、紙、臭化シアンで活性化された紙又は酢
酸セルロース、アガロース、ナイロン、プラスチック等
を使用することができる。
支持体上に試験検体の一部液をスポットするか又は試験
検体中に支持体を浸漬し、引き続き乾燥し、且つ随時固
定されなかった物質を洗い落とすことによって実行する
ことができる。これはいわゆる直接法である。この技術
用の固定化支持体としての各種の材料、一般に測定に便
利な任意の、例えばシート、ビート（beat）、窪みのあ
る板、浸漬棒等の形状を取ることができる重合体材料、
例えばニトロセルロース、ジアゾベンジルオキシメチル
（DBH）−及びジアゾフェニルチオエーテル（DPT）改質
セルロース紙、紙、臭化シアンで活性化された紙又は酢
酸セルロース、アガロース、ナイロン、プラスチック等
を使用することができる。
次いで結合剤と対応する被結合物質との間に凝集体が
形成される条件下で、支持体を標識付けされた結合剤と
接触させる。その結果、被結合物質が固定されている座
位（site）で、順次固定された被結合物質の濃度に比例
する量でマーカーが固定される。
形成される条件下で、支持体を標識付けされた結合剤と
接触させる。その結果、被結合物質が固定されている座
位（site）で、順次固定された被結合物質の濃度に比例
する量でマーカーが固定される。
この方法の変法においては、固定された被結合物質は
まず特異的である第一結合剤と反応し、引き続きこうし
て固定された相を前記第一結合剤に特異的である第二結
合剤に付着したマーカーと接触される。上記のように固
定方法の選択性及び特異性の欠如のために、直接法は比
較的純粋な又は精製された試験試料又は分画について通
常使用される。一層複雑な試料の場合は、大過剰の非所
望物質の非特異的固定により、測定の感度及び特異性が
阻害されるので、直接法は往々にして有用性に乏しい。
まず特異的である第一結合剤と反応し、引き続きこうし
て固定された相を前記第一結合剤に特異的である第二結
合剤に付着したマーカーと接触される。上記のように固
定方法の選択性及び特異性の欠如のために、直接法は比
較的純粋な又は精製された試験試料又は分画について通
常使用される。一層複雑な試料の場合は、大過剰の非所
望物質の非特異的固定により、測定の感度及び特異性が
阻害されるので、直接法は往々にして有用性に乏しい。
日常分析に関して重要であるこの問題を避けるため
に、間接又はいわゆるサンドウィッチ法を利用すること
ができる。この技術においては、精製された又は濃縮さ
れた一次特異的結合剤が固体支持体に固定される。対応
する被結合物質の複合体化を可能とする条件下で、支持
体を試験試料と接触させ、その結果それ自体が固定化さ
れる。試験試料の除去及び支持体の洗浄後、固定された
被結合物質の被複合座位に結合することができる二次的
特異結合剤で被覆されたマーカーの懸濁物と支持体を接
触させる。
に、間接又はいわゆるサンドウィッチ法を利用すること
ができる。この技術においては、精製された又は濃縮さ
れた一次特異的結合剤が固体支持体に固定される。対応
する被結合物質の複合体化を可能とする条件下で、支持
体を試験試料と接触させ、その結果それ自体が固定化さ
れる。試験試料の除去及び支持体の洗浄後、固定された
被結合物質の被複合座位に結合することができる二次的
特異結合剤で被覆されたマーカーの懸濁物と支持体を接
触させる。
本発明が応用される最も直接的な具体化剤は、直接又
は間接的に固体相に固定されている被結合物質、及び固
体相に対して移動性の液体相から成る流動環境である。
固体相に対する液体相の流れの方向によって、この固体
相は流体透過性又は非透過性であることができる。例え
ば透過性膜は膜を透過する液体相の垂直な流れが可能で
ある固体相として使用することができる。他方、不透過
性の固体相を横方向の液体の流れと組み合わせて使用す
ることができる。
は間接的に固体相に固定されている被結合物質、及び固
体相に対して移動性の液体相から成る流動環境である。
固体相に対する液体相の流れの方向によって、この固体
相は流体透過性又は非透過性であることができる。例え
ば透過性膜は膜を透過する液体相の垂直な流れが可能で
ある固体相として使用することができる。他方、不透過
性の固体相を横方向の液体の流れと組み合わせて使用す
ることができる。
具体化の第一段階の間に、標識付けされた特異な結合
剤を含む液体相は固体相上に固定された被結合物質と接
触する。固体相に対するこの液体相の移動は連続的又は
非連続的であることができ、両相の接触時間は固定され
た被結合物質と標識付けされた特異的結合剤の間の結合
が起こり得るようにものでなくてはならない。しかし、
この結合過程は必ずしもその飽和点に達する必要はな
い。液体の流れを起こさせる、出発点及び到着点の間の
液体相の圧力降下はいくつかの方法でつくることができ
る。固体相として透過性膜を使用する場合は、この膜の
一方の側を液体吸着材料と接触させ、他の側に液体相を
加えることにより垂直の流れを起こすことができる。非
透過性固体相の場合は、ポンプにより液体相の横方向の
流れを起こすことができる。
剤を含む液体相は固体相上に固定された被結合物質と接
触する。固体相に対するこの液体相の移動は連続的又は
非連続的であることができ、両相の接触時間は固定され
た被結合物質と標識付けされた特異的結合剤の間の結合
が起こり得るようにものでなくてはならない。しかし、
この結合過程は必ずしもその飽和点に達する必要はな
い。液体の流れを起こさせる、出発点及び到着点の間の
液体相の圧力降下はいくつかの方法でつくることができ
る。固体相として透過性膜を使用する場合は、この膜の
一方の側を液体吸着材料と接触させ、他の側に液体相を
加えることにより垂直の流れを起こすことができる。非
透過性固体相の場合は、ポンプにより液体相の横方向の
流れを起こすことができる。
第二段階として本発明による保護された物理現像剤は
液体相として用いられる。該保護された物理現像剤は錯
体化した金属イオン並びに還元剤から成る。マーカーに
特異的な還元速度と自己造核の速度の間の比率を最大と
するために、両成分は直接使用する前まで離して置いて
おく。しかし、従来技術と比較して、二種の安定な且つ
液状の成分を混合することにより、比較的安定な物理現
像剤の配合物をつくることができることが強調されるべ
きである。或場合には、両者共液状成分を用い、即ち一
つは金属イオン、金属イオンに関してモル比的に過剰な
錯化剤から成り、且つ他方は還元剤から成り、後で保護
された物理現像剤を“その場”で形成することが好適で
あることがある。又或場合には、安定且つ液状の成分
を、適当量の水を添加することによりそれらに対応する
乾燥成分から製造することもできる。上記の問題を考慮
すれば、物理現像剤は使用されるマーカー、必要な感度
及び固体相と液状物理現像剤の間の接触時間に対して容
易に最適化することができる。
液体相として用いられる。該保護された物理現像剤は錯
体化した金属イオン並びに還元剤から成る。マーカーに
特異的な還元速度と自己造核の速度の間の比率を最大と
するために、両成分は直接使用する前まで離して置いて
おく。しかし、従来技術と比較して、二種の安定な且つ
液状の成分を混合することにより、比較的安定な物理現
像剤の配合物をつくることができることが強調されるべ
きである。或場合には、両者共液状成分を用い、即ち一
つは金属イオン、金属イオンに関してモル比的に過剰な
錯化剤から成り、且つ他方は還元剤から成り、後で保護
された物理現像剤を“その場”で形成することが好適で
あることがある。又或場合には、安定且つ液状の成分
を、適当量の水を添加することによりそれらに対応する
乾燥成分から製造することもできる。上記の問題を考慮
すれば、物理現像剤は使用されるマーカー、必要な感度
及び固体相と液状物理現像剤の間の接触時間に対して容
易に最適化することができる。
好適な還流法の具体化においては、二種の安定な液状
成分の混合、及び得られる保護された物理現像剤の使用
は単一の処置として組み合わされなければならない。流
動する保護された物理現像剤の使用は二重の効果を有し
ている。最初に、液は第一段階の間結合しなかった又は
緩く結合した標識付けされた結合剤の残存物の総てを固
体相から洗い去る。マーカーの物理現像は徐々に進行す
る工程であるから、この物質は何等かの信号が現れる前
に固体相から洗い落とされる。残留する結合した標識付
けされた特異的結合剤は更に保護された物理現像剤とを
接触する間に目に見える信号を発生するに至る。固体相
に適用される現像剤の流れ及び容積は、固定された標識
化合物の最適な検出に必要な程度に長く、且つ自己造核
により起こされる固体相の非特異的還元を回避するに必
要な程度に短い接触時間を確保するように選択される。
一般にこれらの時間は数秒ないし数分に調整することが
できる。多くの保護された物理現像剤の場合、この信号
を永久的に保つための追加処理又は定着工程の必要はな
い。
成分の混合、及び得られる保護された物理現像剤の使用
は単一の処置として組み合わされなければならない。流
動する保護された物理現像剤の使用は二重の効果を有し
ている。最初に、液は第一段階の間結合しなかった又は
緩く結合した標識付けされた結合剤の残存物の総てを固
体相から洗い去る。マーカーの物理現像は徐々に進行す
る工程であるから、この物質は何等かの信号が現れる前
に固体相から洗い落とされる。残留する結合した標識付
けされた特異的結合剤は更に保護された物理現像剤とを
接触する間に目に見える信号を発生するに至る。固体相
に適用される現像剤の流れ及び容積は、固定された標識
化合物の最適な検出に必要な程度に長く、且つ自己造核
により起こされる固体相の非特異的還元を回避するに必
要な程度に短い接触時間を確保するように選択される。
一般にこれらの時間は数秒ないし数分に調整することが
できる。多くの保護された物理現像剤の場合、この信号
を永久的に保つための追加処理又は定着工程の必要はな
い。
この新規具体化の利点は、先に述べた物理現像された
コロイド状金属マーカー系の総ての利点を備えるが、旧
来の物理現像に固有の前記欠点を持たないことから明ら
かである。
コロイド状金属マーカー系の総ての利点を備えるが、旧
来の物理現像に固有の前記欠点を持たないことから明ら
かである。
本発明は現像剤に関してモル比的に過剰な、好適には
数倍過剰な、例えば２ないし20倍過剰な錯化剤である複
素環式塩基を添加することにより、旧来の現像剤に随伴
した欠点を改善する。極めて清潔な接触表面、例えば容
器、分析級化学薬品、超純粋及び多段予備洗浄段階の必
要性がなくなること以外に、マーカーに特異的な還元速
度及び自己造核の速度の比率を数倍増大させることも可
能である。平衡関係は錯体形の方向に強く移行している
ので、物理現像に必要な遊離の金属イオンを易動化する
ために一段と強い還元環境が許容される。これらの環境
下で、マーカーの触媒的効果は一段と増幅され、その結
果自己造核の速度に影響することなくマーカーに特異的
な還元速度の促進がもたらされる。マーカーに特異的な
還元速度及び自己造核の速度の比率の増大は、いくつか
の方法で実現することができる。従来法と対照的に、マ
ーカーをより長く物理現像剤と接触させることにより感
度を増加させることができ、又はマーカーの最適現像の
時機の自己造核が開始してバックグラウンドが増大する
時機との間の安全時間帯により提供される融通性を損な
うことなく、マーカーの特異的な現象速度を増加させる
ことができる。或場合には全体的速度と速度の増大の両
者を並行して達成することが可能である。前記の全体的
速度は還元剤の濃度、性質又は環境を変えることにより
容易に調整することができる。最高の速度は非常に小さ
いマーカー、好適には5nm以下、例えば１ないし4nmの粒
子を用いて得ることができる。金粒子が本発明により現
像される場合は、この系の速度は非常に速く（10−20
秒）から遅く（30分又はそれ以上）まで好適に調整する
ことができる。明らかに、従来法のいずれの方法もこの
ような可能性に到達することはできなかった。普通の現
像系は平均（６−10分）系ないし低速（15−30分）系の
みが可能である。更に小さいマーカーはマーカーの特異
的還元速度を促進するだけでなく標識付けされた試薬の
拡散速度を促進し、そして適当な結合剤へとマーカーの
より効率的な付着を可能とし、懸濁物中の標識付けされ
た試薬の安定性の増大をもたらすことに注意すべきであ
る。従来技術との比較に際して強調されるべき他の点
は、現像の間結合対の間の結合物の安定性の増加につな
がる、中性的環境（pH7）で作業する可能性に関する 反応混合物の或相において生成した金属粒子の検出は
それ自体周知である多数の方法を用いて行うことができ
る。該方法は生成した金属粒子の量及び／又は物理的性
質に、好適には金属粒子の散乱及び吸収に基づいてい
る。これらの技術の例として、定量的測定が必要な時に
好適である濃度測定法（densitometry）のような分光測
定的技術を採用することができる。しかし得られる高感
度からして、粒子は目視的に、随時顕微鏡を用いて容易
に観察される。
数倍過剰な、例えば２ないし20倍過剰な錯化剤である複
素環式塩基を添加することにより、旧来の現像剤に随伴
した欠点を改善する。極めて清潔な接触表面、例えば容
器、分析級化学薬品、超純粋及び多段予備洗浄段階の必
要性がなくなること以外に、マーカーに特異的な還元速
度及び自己造核の速度の比率を数倍増大させることも可
能である。平衡関係は錯体形の方向に強く移行している
ので、物理現像に必要な遊離の金属イオンを易動化する
ために一段と強い還元環境が許容される。これらの環境
下で、マーカーの触媒的効果は一段と増幅され、その結
果自己造核の速度に影響することなくマーカーに特異的
な還元速度の促進がもたらされる。マーカーに特異的な
還元速度及び自己造核の速度の比率の増大は、いくつか
の方法で実現することができる。従来法と対照的に、マ
ーカーをより長く物理現像剤と接触させることにより感
度を増加させることができ、又はマーカーの最適現像の
時機の自己造核が開始してバックグラウンドが増大する
時機との間の安全時間帯により提供される融通性を損な
うことなく、マーカーの特異的な現象速度を増加させる
ことができる。或場合には全体的速度と速度の増大の両
者を並行して達成することが可能である。前記の全体的
速度は還元剤の濃度、性質又は環境を変えることにより
容易に調整することができる。最高の速度は非常に小さ
いマーカー、好適には5nm以下、例えば１ないし4nmの粒
子を用いて得ることができる。金粒子が本発明により現
像される場合は、この系の速度は非常に速く（10−20
秒）から遅く（30分又はそれ以上）まで好適に調整する
ことができる。明らかに、従来法のいずれの方法もこの
ような可能性に到達することはできなかった。普通の現
像系は平均（６−10分）系ないし低速（15−30分）系の
みが可能である。更に小さいマーカーはマーカーの特異
的還元速度を促進するだけでなく標識付けされた試薬の
拡散速度を促進し、そして適当な結合剤へとマーカーの
より効率的な付着を可能とし、懸濁物中の標識付けされ
た試薬の安定性の増大をもたらすことに注意すべきであ
る。従来技術との比較に際して強調されるべき他の点
は、現像の間結合対の間の結合物の安定性の増加につな
がる、中性的環境（pH7）で作業する可能性に関する 反応混合物の或相において生成した金属粒子の検出は
それ自体周知である多数の方法を用いて行うことができ
る。該方法は生成した金属粒子の量及び／又は物理的性
質に、好適には金属粒子の散乱及び吸収に基づいてい
る。これらの技術の例として、定量的測定が必要な時に
好適である濃度測定法（densitometry）のような分光測
定的技術を採用することができる。しかし得られる高感
度からして、粒子は目視的に、随時顕微鏡を用いて容易
に観察される。
本発明による好適な方法において使用できる特異的な
結合剤は種々の性質のものであることができるが、多く
の例においては特定の抗原又はハプテンに対する抗体で
ある。抗体以外の特異的な結合物質の例として随時分子
的又は細胞物質に結合するように化学的又は遺伝学的に
適応させたファージ、特異的に糖蛋白に結合するレクチ
ン、各種の動物の免疫グロブリンに特異的に結合するス
タフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureu
s）蛋白質Ａ及び遺伝的同定用のDNA又はRNA消息子（pro
be）を挙げることができる。一般に充分な特異性及び親
和性のある任意の他の分子間相互作用を使用することが
できる。抗体はポリクローン性又は単一クローン性であ
ることができる。
結合剤は種々の性質のものであることができるが、多く
の例においては特定の抗原又はハプテンに対する抗体で
ある。抗体以外の特異的な結合物質の例として随時分子
的又は細胞物質に結合するように化学的又は遺伝学的に
適応させたファージ、特異的に糖蛋白に結合するレクチ
ン、各種の動物の免疫グロブリンに特異的に結合するス
タフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureu
s）蛋白質Ａ及び遺伝的同定用のDNA又はRNA消息子（pro
be）を挙げることができる。一般に充分な特異性及び親
和性のある任意の他の分子間相互作用を使用することが
できる。抗体はポリクローン性又は単一クローン性であ
ることができる。
特異的結合剤及び被結合物質の結合反応はほとんどす
べての場合温和な条件下で進行することができる。反応
混合物は一般に任意の望ましい有機性補助溶剤が少量存
在している水性媒体である。反応温度は温置期間を通じ
て正常の環境下で一定の水準に保たれる。温度は一般に
０ないし50℃、より通常的には20なしい40℃の間であ
る。好適には反応は室温で進められる。反応混合物のpH
は５ないし10の間、より通常的に、６ないし９の間で変
えられる。各種の試薬の濃度は試薬媒体中に予想される
分析物の濃度に依存し、通常は10-3ないし10-12Mの間の
濃度とされる。パラメーターの選択は、主として究極的
に日常的な基盤で分析を実施する技術者の選択と必要性
とに対し勘考された、経験的に導かれた最適化に基づい
ている。それ故いずれのパラメーターも本発明に対し重
大な性質のものではなく、それらは総て従来法で使用さ
れた普通の範囲内にある。
べての場合温和な条件下で進行することができる。反応
混合物は一般に任意の望ましい有機性補助溶剤が少量存
在している水性媒体である。反応温度は温置期間を通じ
て正常の環境下で一定の水準に保たれる。温度は一般に
０ないし50℃、より通常的には20なしい40℃の間であ
る。好適には反応は室温で進められる。反応混合物のpH
は５ないし10の間、より通常的に、６ないし９の間で変
えられる。各種の試薬の濃度は試薬媒体中に予想される
分析物の濃度に依存し、通常は10-3ないし10-12Mの間の
濃度とされる。パラメーターの選択は、主として究極的
に日常的な基盤で分析を実施する技術者の選択と必要性
とに対し勘考された、経験的に導かれた最適化に基づい
ている。それ故いずれのパラメーターも本発明に対し重
大な性質のものではなく、それらは総て従来法で使用さ
れた普通の範囲内にある。
その一般的性質の点から見て、本発明による方法は極
めて広い応用分野を有している。原理的に該方法は前述
のマーカーで標識付けできる任意の物質の定性的及び／
又は定量的測定に利用することができる。例えば該物質
は細胞表面及び組織の抗原、生体により分泌され又はそ
れから誘導された生物学的物質、特にだ液、りんぱ液、
血液のような生物学的液中に存在する生物学的物質及び
その誘導された分画、例えば血しょう及び血清、尿、脳
脊髄液、半膜液等を含むが、これらに限定されるもので
はない。検出できる物質は蛋白質、ポリペプチド、ペプ
チド、酵素様物質、ホルモン、構造蛋白質、核酸、ビタ
ミン、多糖類、毒素、アルカロイド、糖蛋白質、ハプテ
ン、代謝産物、薬剤、殺虫剤、汚染物、ステロイド、及
び生体系中に特異的結合の相対物が存在するか又は合成
できる任意の他の分子を含む。
めて広い応用分野を有している。原理的に該方法は前述
のマーカーで標識付けできる任意の物質の定性的及び／
又は定量的測定に利用することができる。例えば該物質
は細胞表面及び組織の抗原、生体により分泌され又はそ
れから誘導された生物学的物質、特にだ液、りんぱ液、
血液のような生物学的液中に存在する生物学的物質及び
その誘導された分画、例えば血しょう及び血清、尿、脳
脊髄液、半膜液等を含むが、これらに限定されるもので
はない。検出できる物質は蛋白質、ポリペプチド、ペプ
チド、酵素様物質、ホルモン、構造蛋白質、核酸、ビタ
ミン、多糖類、毒素、アルカロイド、糖蛋白質、ハプテ
ン、代謝産物、薬剤、殺虫剤、汚染物、ステロイド、及
び生体系中に特異的結合の相対物が存在するか又は合成
できる任意の他の分子を含む。
代表的な蛋白分析物はプロタミン、ムコ蛋白、糖蛋
白、グロブリン、アルブミン、硬蛋白、燐蛋白、ヒスト
ン、リポ蛋白、色素蛋白、及び核蛋白の部類も含む。特
異的蛋白の例はプレアルブミン、α１−リポ蛋白、ヒト
血清アルブミン、α１−酸糖蛋白、α１−抗トリプシ
ン、α１−糖蛋白、トランスコルチン、チロキシン結合
グロブリン、ハプトグロブリン、ヘモグロビン、ミオグ
ロビン、セルロプラスミン、α２−リポ蛋白、α２−マ
クログロブリン、β−リポ蛋白、エリスロ蛋白、トラン
スフェリン、ヘモペキシン、フィプリノーゲン、IgGが
最も好適であるが、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEのよ
うな免疫グロブリン、及びそれらのフラグメント、例え
ばFc、Fab及びＦ（ab）２補体因子、プロラクチン、フ
ィプリノーゲン、トロンビン等のような血液凝固因子、
インシュリン、メラノトロピン、ソマトトロピン、チロ
トロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ゴナ
ドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、胎盤性ラクトゲン、
内因性因子（intrinsic factor）、トランスコバラミ
ン、血清酵素、例えばアルカリ性フォスファターゼ、乳
酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、フォスフ
ァターゼ、コリンエステラーゼ、グルタミン酸−オキザ
ロ酢酸−トランスアミナーゼ、グルタミン酸−ピルビン
酸−トランスアミナーゼ、及びウロペプシン、エンドル
フィン、エンケファリン、プロタミン、組織抗原、最近
抗原、及び肝炎関連の抗原（例えばHBsAg、HBcAg及びHB
eAg）のようなウイルス抗原である。
白、グロブリン、アルブミン、硬蛋白、燐蛋白、ヒスト
ン、リポ蛋白、色素蛋白、及び核蛋白の部類も含む。特
異的蛋白の例はプレアルブミン、α１−リポ蛋白、ヒト
血清アルブミン、α１−酸糖蛋白、α１−抗トリプシ
ン、α１−糖蛋白、トランスコルチン、チロキシン結合
グロブリン、ハプトグロブリン、ヘモグロビン、ミオグ
ロビン、セルロプラスミン、α２−リポ蛋白、α２−マ
クログロブリン、β−リポ蛋白、エリスロ蛋白、トラン
スフェリン、ヘモペキシン、フィプリノーゲン、IgGが
最も好適であるが、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEのよ
うな免疫グロブリン、及びそれらのフラグメント、例え
ばFc、Fab及びＦ（ab）２補体因子、プロラクチン、フ
ィプリノーゲン、トロンビン等のような血液凝固因子、
インシュリン、メラノトロピン、ソマトトロピン、チロ
トロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ゴナ
ドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、胎盤性ラクトゲン、
内因性因子（intrinsic factor）、トランスコバラミ
ン、血清酵素、例えばアルカリ性フォスファターゼ、乳
酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、フォスフ
ァターゼ、コリンエステラーゼ、グルタミン酸−オキザ
ロ酢酸−トランスアミナーゼ、グルタミン酸−ピルビン
酸−トランスアミナーゼ、及びウロペプシン、エンドル
フィン、エンケファリン、プロタミン、組織抗原、最近
抗原、及び肝炎関連の抗原（例えばHBsAg、HBcAg及びHB
eAg）のようなウイルス抗原である。
代表的なハプテン分析物は医薬品、代謝産物、ホルモ
ン、殺虫剤、汚染物、ビタミン、及び類似の有機化合物
の一般的部類を含んでいる。ハプテンホルモンはチロキ
シン及びトリヨードチロニンを含む。ビタミンはビタミ
ンＡ、Ｂ、例えばB12、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＫ、葉酸及びチ
アミンを含む。医薬品はアミノ配糖体、例えばゲンタマ
イシン、トブラマイシン、アミダシン、シソマイシン、
カナマイシン、及びネチルマイシン、ペニシリン、テト
ラサイクリン、テラマイシン、クロロマイセチン、及び
アクチノマイセチン；ヌクレオシド及びヌクレオチド、
例えばアデノシン二燐酸塩（ADP）、アデノシン三燐酸
塩（ATP）、フラヴィンモノヌクレオチド（FMN）、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）、及びその
燐酸塩誘導体（NADP）、チミジン、グアノシン、及びア
デノシン；プロスタグラジンス；卵胞ホルモンのような
ステロイド、例えばエストリオール及びエストラジオー
ル、ステロイド；及び他の、例えばフェノバルビター
ル、フェニトイン、ピリミドン、エトスクシミド、カル
バマゼピン、ヴァルプロエート、テオフィリン、カフェ
イン、プロプラノロール、プロカインアミド、キニジ
ン、アミトリプチリン、コルチゾール、デシプラミン、
ジソピラミド、ドクセピン、ドクソルビシン、ノルトリ
プチリン、メトトレクセート、イミプラミン、リドカイ
ン、Ｎ−アセチル−プロカインアミド、アンフェタミ
ン、カテコールアミン、及び抗ヒスタミン剤を含む。更
に強心性配糖体、及びベンゾジアゼピン、ベンズイミダ
ゾール、ピペリジン、ピペラジン、イミダゾーール、ト
リアゾール、ピリダジン、1,2,4−トリアジンジオン又
は2,3,5,6−テトラヒドロ−イミダゾ［2,1−ｂ］チアゾ
ール、又はアミド類の誘導体、ヒドラトロピン酸（hydr
atropic acid）誘導体又はトリアルキルアミンが含ま
れる。
ン、殺虫剤、汚染物、ビタミン、及び類似の有機化合物
の一般的部類を含んでいる。ハプテンホルモンはチロキ
シン及びトリヨードチロニンを含む。ビタミンはビタミ
ンＡ、Ｂ、例えばB12、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＫ、葉酸及びチ
アミンを含む。医薬品はアミノ配糖体、例えばゲンタマ
イシン、トブラマイシン、アミダシン、シソマイシン、
カナマイシン、及びネチルマイシン、ペニシリン、テト
ラサイクリン、テラマイシン、クロロマイセチン、及び
アクチノマイセチン；ヌクレオシド及びヌクレオチド、
例えばアデノシン二燐酸塩（ADP）、アデノシン三燐酸
塩（ATP）、フラヴィンモノヌクレオチド（FMN）、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）、及びその
燐酸塩誘導体（NADP）、チミジン、グアノシン、及びア
デノシン；プロスタグラジンス；卵胞ホルモンのような
ステロイド、例えばエストリオール及びエストラジオー
ル、ステロイド；及び他の、例えばフェノバルビター
ル、フェニトイン、ピリミドン、エトスクシミド、カル
バマゼピン、ヴァルプロエート、テオフィリン、カフェ
イン、プロプラノロール、プロカインアミド、キニジ
ン、アミトリプチリン、コルチゾール、デシプラミン、
ジソピラミド、ドクセピン、ドクソルビシン、ノルトリ
プチリン、メトトレクセート、イミプラミン、リドカイ
ン、Ｎ−アセチル−プロカインアミド、アンフェタミ
ン、カテコールアミン、及び抗ヒスタミン剤を含む。更
に強心性配糖体、及びベンゾジアゼピン、ベンズイミダ
ゾール、ピペリジン、ピペラジン、イミダゾーール、ト
リアゾール、ピリダジン、1,2,4−トリアジンジオン又
は2,3,5,6−テトラヒドロ−イミダゾ［2,1−ｂ］チアゾ
ール、又はアミド類の誘導体、ヒドラトロピン酸（hydr
atropic acid）誘導体又はトリアルキルアミンが含ま
れる。
ベンズイミダゾールハプテンはチアベンダゾール、フ
ベリダゾール、シクロベンダゾール、オキシベンダゾー
ル、パルベンダゾール、カムベンダゾール、メベンダゾ
ール、フェンベンダゾール、フルベンダゾール、アルベ
ンダゾール、オクスフェンダゾール、ノコダゾール及び
アステミゾールから成る。
ベリダゾール、シクロベンダゾール、オキシベンダゾー
ル、パルベンダゾール、カムベンダゾール、メベンダゾ
ール、フェンベンダゾール、フルベンダゾール、アルベ
ンダゾール、オクスフェンダゾール、ノコダゾール及び
アステミゾールから成る。
ピペリジンハプテンはジフェノキシレート、フェノペ
リジン、ハロペリドール、ハロペリドールデカノエー
ト、ブロムペリドールデカノエート、ブロムペリドー
ル、モペロン、トリフルペリドール、ピパムペロン、ピ
リトラミド、フェンタニル、ベンペリドール、ドロペリ
ドール、ベンジトラミド、ドモペリドン、スフェンタニ
ル、カルフェンタニル、アルフェンタニル、デクセチミ
ド、ミレンペロン、ジフェノキシン、フルスピレン、ペ
ンフルリドール、ピモジド、ロルカイニド、ロペラミ
ド、アステミゾール、カンタセリン、レヴォカバスチ
ン、シサプリド、アルタンセリン、リタンセリン、３−
［２−［４−（４−フルオロベンゾイル）−１−ピペリ
ジニル］エチル］−2,7−ジメチル−４Ｈ−ピリド−
［1,2−ａ］−ピリミジン−４−オン、３−［２−［４
−ビス（４−フルオロフェニル）メチレン］−１−ピペ
リジニル］−エチル］−２−メチル−４Ｈ−ピリド１
［1,2−ａ］ピリミジン−４−オン及び３−［２−［４
−［［３−（２−フラニルメチル）−３Ｈイミダゾ［4,
5−ｂ］ピリジン−２−イル］アミノ］−１−ピペリジ
ニル］エチル］−２−メチル−４Ｈ−ピリド［1,2−
ａ］ピリミジン−４−オンから成る。ピペラジンハプテ
ンはアザペロン、フルアニソン、リドフラジン、フルナ
リジン、ミアンセリン、オクサトミド、ミオフラジン、
クロシニジン及びシンナリジンを含む。
リジン、ハロペリドール、ハロペリドールデカノエー
ト、ブロムペリドールデカノエート、ブロムペリドー
ル、モペロン、トリフルペリドール、ピパムペロン、ピ
リトラミド、フェンタニル、ベンペリドール、ドロペリ
ドール、ベンジトラミド、ドモペリドン、スフェンタニ
ル、カルフェンタニル、アルフェンタニル、デクセチミ
ド、ミレンペロン、ジフェノキシン、フルスピレン、ペ
ンフルリドール、ピモジド、ロルカイニド、ロペラミ
ド、アステミゾール、カンタセリン、レヴォカバスチ
ン、シサプリド、アルタンセリン、リタンセリン、３−
［２−［４−（４−フルオロベンゾイル）−１−ピペリ
ジニル］エチル］−2,7−ジメチル−４Ｈ−ピリド−
［1,2−ａ］−ピリミジン−４−オン、３−［２−［４
−ビス（４−フルオロフェニル）メチレン］−１−ピペ
リジニル］−エチル］−２−メチル−４Ｈ−ピリド１
［1,2−ａ］ピリミジン−４−オン及び３−［２−［４
−［［３−（２−フラニルメチル）−３Ｈイミダゾ［4,
5−ｂ］ピリジン−２−イル］アミノ］−１−ピペリジ
ニル］エチル］−２−メチル−４Ｈ−ピリド［1,2−
ａ］ピリミジン−４−オンから成る。ピペラジンハプテ
ンはアザペロン、フルアニソン、リドフラジン、フルナ
リジン、ミアンセリン、オクサトミド、ミオフラジン、
クロシニジン及びシンナリジンを含む。
イミダゾールハプテンの例はメトロニダゾール、オル
ニダゾール、イプロニダゾール、チニダゾール、イソコ
ナゾール、ニモラゾール、ミコナゾール、ブリマミド、
メチアミド、メトミデート、エニルコナゾール又はイマ
ザリル、エトミデート、エコナゾール、クロトリマゾー
ル、カルニダゾール、ジメチジン、ドコナゾール、スル
コナゾール、パルコナゾール、オルコナゾール、ブトコ
ナゾール、トリアジミノール、チオコナゾール、ヴァル
コナゾール、フルオトリマゾール、ケトコナゾール、オ
キシコナゾール、ロンバゾール、ビフォナゾール、オク
スメチジン、フェンチコナゾール、ツブラゾール及び
（Ｚ）−１−［２−クロロ−２−（2,4−ジクロロフェ
ニル）エテニル］−１Ｈ−イミダゾールである。
ニダゾール、イプロニダゾール、チニダゾール、イソコ
ナゾール、ニモラゾール、ミコナゾール、ブリマミド、
メチアミド、メトミデート、エニルコナゾール又はイマ
ザリル、エトミデート、エコナゾール、クロトリマゾー
ル、カルニダゾール、ジメチジン、ドコナゾール、スル
コナゾール、パルコナゾール、オルコナゾール、ブトコ
ナゾール、トリアジミノール、チオコナゾール、ヴァル
コナゾール、フルオトリマゾール、ケトコナゾール、オ
キシコナゾール、ロンバゾール、ビフォナゾール、オク
スメチジン、フェンチコナゾール、ツブラゾール及び
（Ｚ）−１−［２−クロロ−２−（2,4−ジクロロフェ
ニル）エテニル］−１Ｈ−イミダゾールである。
トリアゾールハプテンはヴィラゾール、アザコナゾー
ル、エタコナゾール、プロピコナゾール、ペンコナゾー
ル、イトラコナゾール及びテルコナゾールから成る。
ル、エタコナゾール、プロピコナゾール、ペンコナゾー
ル、イトラコナゾール及びテルコナゾールから成る。
ピリダジンハプテンは例えば３−クロロ−６−［3,6
−ジヒドロ−４−（３−メチルフェニル）−１（２Ｈ）
−ピリジニル］ピリダジン、３−メトキシ−６−［４−
（３−メチルフェニル）−１−ピペラジニル］ピペラジ
ン、及びヨーロッパ特許公開公報第0,156,433号の化合
物から成る。
−ジヒドロ−４−（３−メチルフェニル）−１（２Ｈ）
−ピリジニル］ピリダジン、３−メトキシ−６−［４−
（３−メチルフェニル）−１−ピペラジニル］ピペラジ
ン、及びヨーロッパ特許公開公報第0,156,433号の化合
物から成る。
1,2,4−トリアジンジオンは例えば２−クロロ−α−
（４−クロロフェニル）−４−（4,5−ジヒドロ−3,5−
ジオキソ−1,2,4−トリアジン−２（３Ｈ）−イル）ベ
ンゼンアセトニトリル、2,6−ジクロロ−α−（４−ク
ロロフェニル）−４−（4,5−ジヒドロ−3,5−ジオキソ
−1,2,4−トリアジン−２（３Ｈ）−イル）ベンゼンア
セトニトリル及びヨーロッパ特許公開公報第0,170,316
号の化合物から成る。
（４−クロロフェニル）−４−（4,5−ジヒドロ−3,5−
ジオキソ−1,2,4−トリアジン−２（３Ｈ）−イル）ベ
ンゼンアセトニトリル、2,6−ジクロロ−α−（４−ク
ロロフェニル）−４−（4,5−ジヒドロ−3,5−ジオキソ
−1,2,4−トリアジン−２（３Ｈ）−イル）ベンゼンア
セトニトリル及びヨーロッパ特許公開公報第0,170,316
号の化合物から成る。
トリアルキルアミンは例えばジイソプロミン、プロザ
ピンである。
ピンである。
2,3,5,6−テトラヒドロ−イミダゾ［2,1−ｂ］チアゾ
ールは例えばテトラミソール又はレヴァミソールから成
る。
ールは例えばテトラミソール又はレヴァミソールから成
る。
アミド類は例えばクロサンテル、アンブセトアミド、
イソプロパド、ウゼピドメチオダイド、デキストロモラ
ミドから成る。ヒドロトロピン酸ハプテンは例えばスプ
ロフェンである。
イソプロパド、ウゼピドメチオダイド、デキストロモラ
ミドから成る。ヒドロトロピン酸ハプテンは例えばスプ
ロフェンである。
測定の目的は多様であることができる。或使用例では
特定の物質を可視化するための単なる科学的手段とし
て、例えば組織学的クーペ（coupe）に、クロマトグラ
ムに、電気泳動図、ブロット（blot）法等に使用され
る。例えば、クロマトグラム、電気泳動図、蛋白質ブロ
ット法等で種々の特異的蛋白質又は他の被結合物質に異
なった標識付けをする時に、他の蛋白質又は他の物質を
限局するために有利に使用できる基準図形が得られる。
その科学的有用性以外に、本発明の方法は例えば下記の
ような広範囲の診断試験:T−リンパ球の細区分（subpop
ulation）の検出及び特性決定；尿中における或種のホ
ルモン（卵膜性ゴナドトロピン）の存在に基づく妊娠試
験、カビ、細菌及び特にウイルスを病原とする例えばＢ
型肝炎、自己免疫病、例えばエリテマトーデス、及び免
疫欠損病、例えば、エイズ、りん病、ポリオ等のような
種々の感染病の診断試験；代謝、内分泌性、及び半膜液
中の特定蛋白質の存在に基づく胎芽の先天的な機能不全
の検出のための診断を含む各種の内因性の病気の診断等
で有用性を発揮するであろう。
特定の物質を可視化するための単なる科学的手段とし
て、例えば組織学的クーペ（coupe）に、クロマトグラ
ムに、電気泳動図、ブロット（blot）法等に使用され
る。例えば、クロマトグラム、電気泳動図、蛋白質ブロ
ット法等で種々の特異的蛋白質又は他の被結合物質に異
なった標識付けをする時に、他の蛋白質又は他の物質を
限局するために有利に使用できる基準図形が得られる。
その科学的有用性以外に、本発明の方法は例えば下記の
ような広範囲の診断試験:T−リンパ球の細区分（subpop
ulation）の検出及び特性決定；尿中における或種のホ
ルモン（卵膜性ゴナドトロピン）の存在に基づく妊娠試
験、カビ、細菌及び特にウイルスを病原とする例えばＢ
型肝炎、自己免疫病、例えばエリテマトーデス、及び免
疫欠損病、例えば、エイズ、りん病、ポリオ等のような
種々の感染病の診断試験；代謝、内分泌性、及び半膜液
中の特定蛋白質の存在に基づく胎芽の先天的な機能不全
の検出のための診断を含む各種の内因性の病気の診断等
で有用性を発揮するであろう。
従って本発明の方法は現在免疫学的技術が考えられる
事実上総ての情況下で使用することができる。更に本発
明は蛋白質及び核酸のような直接支持体内は上に固定さ
れ、ヨーロッパ特許公開公報第0,165,633号及びアナリ
ティカル・バイオケミストリー145、315−321（1985）
に記載されている方法によるコロイド状マーカーと結合
する受容体物質の定量及び／又は検出にも使用できる。
上記文献を参照し参考とされたい。前記方法は蛋白質又
は核酸支持体を一定の時間、好適には蛋白質又は核酸の
結合を妨害しない、例えば0.1％の非イオン性活性剤ツ
ィーン（Tween）20のような活性剤を含み、且つ適当なp
Hに調整された媒体中に懸濁された充分な量のコロイド
状マーカーと接触させ、そして物理現像剤を添加し、そ
れにより反応の間又は適当な反応時間後に生じた基粒子
を定量的又は定性的に測定する次の段階から成る。本発
明による物理現像剤は旧来の現像剤に付き物の欠点をも
たらすことなく本法の感度を改善する。
事実上総ての情況下で使用することができる。更に本発
明は蛋白質及び核酸のような直接支持体内は上に固定さ
れ、ヨーロッパ特許公開公報第0,165,633号及びアナリ
ティカル・バイオケミストリー145、315−321（1985）
に記載されている方法によるコロイド状マーカーと結合
する受容体物質の定量及び／又は検出にも使用できる。
上記文献を参照し参考とされたい。前記方法は蛋白質又
は核酸支持体を一定の時間、好適には蛋白質又は核酸の
結合を妨害しない、例えば0.1％の非イオン性活性剤ツ
ィーン（Tween）20のような活性剤を含み、且つ適当なp
Hに調整された媒体中に懸濁された充分な量のコロイド
状マーカーと接触させ、そして物理現像剤を添加し、そ
れにより反応の間又は適当な反応時間後に生じた基粒子
を定量的又は定性的に測定する次の段階から成る。本発
明による物理現像剤は旧来の現像剤に付き物の欠点をも
たらすことなく本法の感度を改善する。
本発明による方法は広範囲の日常的多び実験的応用に
使用できる枠組みを提供する。その性質及び取り扱いの
容易さによって、本方法は特に簡単且つ迅速な定性的又
は半定量的分析に適合している。本方法は経験のある実
験技術者並びに技術的な訓練の無い医学従事者又は未経
験者による使用に適応させることができる。本方法は又
多数の同一な測定を行う必要がある時、例えば血液銀行
及び専門的に診療検査室において重要な因子である自動
化が容易に可能である。
使用できる枠組みを提供する。その性質及び取り扱いの
容易さによって、本方法は特に簡単且つ迅速な定性的又
は半定量的分析に適合している。本方法は経験のある実
験技術者並びに技術的な訓練の無い医学従事者又は未経
験者による使用に適応させることができる。本方法は又
多数の同一な測定を行う必要がある時、例えば血液銀行
及び専門的に診療検査室において重要な因子である自動
化が容易に可能である。
本発明は更に本発明が包含する所望の検査方法を実行
するのに必要である必須な総ての化学的要素から成る試
薬系を構成する。試薬系は試薬の相溶性によって可能な
場合は組成物又は混合物として、試験装置一式中で、又
は試験用キット、即ち必要な試薬を保有する一個又は多
数個の包装された組み合わせ物として、市販の包装形態
で提供することができる。試薬系中には標識付けされた
試薬及び信号発生反応を生じるに必要な保護された物理
現像剤を作成する溶液を必須とする、所望の結合反応系
に適当した試薬が包含される。かような結合反応試薬は
標識付けされた試薬以外に、分析物に対する結合相対等
を含むことができる。勿論、試薬系としては本分野で既
知な他の試薬、及び市販上又は使用者の観点から見て望
ましい緩衝剤、希釈剤、標準試薬等を含むことができ
る。より好適には本発明は、他の試薬の他に、好適には
使用の直前に二種の等容積物を混合することによって調
合される、保護された物理現像剤から成る、マーカー上
の金属粒子の還元を触媒してマーカー上に金属粒子を析
出させる試験用キットから成る。
するのに必要である必須な総ての化学的要素から成る試
薬系を構成する。試薬系は試薬の相溶性によって可能な
場合は組成物又は混合物として、試験装置一式中で、又
は試験用キット、即ち必要な試薬を保有する一個又は多
数個の包装された組み合わせ物として、市販の包装形態
で提供することができる。試薬系中には標識付けされた
試薬及び信号発生反応を生じるに必要な保護された物理
現像剤を作成する溶液を必須とする、所望の結合反応系
に適当した試薬が包含される。かような結合反応試薬は
標識付けされた試薬以外に、分析物に対する結合相対等
を含むことができる。勿論、試薬系としては本分野で既
知な他の試薬、及び市販上又は使用者の観点から見て望
ましい緩衝剤、希釈剤、標準試薬等を含むことができ
る。より好適には本発明は、他の試薬の他に、好適には
使用の直前に二種の等容積物を混合することによって調
合される、保護された物理現像剤から成る、マーカー上
の金属粒子の還元を触媒してマーカー上に金属粒子を析
出させる試験用キットから成る。
実施例 １ 1.1 コロイド状の金で標識付けされた抗ヒト免疫グロ
ブリン（Ig）抗体の製造 平均直径20nmのコロイド状金ゾルオーロゾル（AuroSo
l）G20 をベルギーのベールス（Beerse）Ｂ−2340のジ
ャンセン・ライフ・サイエンス・・プロダクツ（Jansse
n Life Science Products）から購入した。親和性精
製（affinity−purified）したヤギ−抗−ヒトIg抗体
を、pH9.8の5mM炭酸塩緩衝液に対して４℃で一夜透析し
た。金ゾルの酸性度を水酸化カリウムでpH9.0とした。
この金ゾル100mlを室温でビーカー中で撹拌した。1mgの
透析した抗体を添加した。２分後に１μＭの水酸化カリ
ウム10mlに予め溶解した牛血清アルブミン（BSA）1gを
添加した。更に２分後に、金−抗体−BSA混合物を４℃
で１時間15000xgで遠心した。上澄み除去した後、ペレ
ットを１％（w/v）BSA及び150mMの塩化ナトリウムを含
むpH8.2の20mMトリス−塩酸緩衝液100ml中に再分散し
た。この懸濁液を再度遠心し、ペレットを520nmの光学
密度が約5.0となる容積まで同じ緩衝液中に再分散し
た。
ブリン（Ig）抗体の製造 平均直径20nmのコロイド状金ゾルオーロゾル（AuroSo
l）G20 をベルギーのベールス（Beerse）Ｂ−2340のジ
ャンセン・ライフ・サイエンス・・プロダクツ（Jansse
n Life Science Products）から購入した。親和性精
製（affinity−purified）したヤギ−抗−ヒトIg抗体
を、pH9.8の5mM炭酸塩緩衝液に対して４℃で一夜透析し
た。金ゾルの酸性度を水酸化カリウムでpH9.0とした。
この金ゾル100mlを室温でビーカー中で撹拌した。1mgの
透析した抗体を添加した。２分後に１μＭの水酸化カリ
ウム10mlに予め溶解した牛血清アルブミン（BSA）1gを
添加した。更に２分後に、金−抗体−BSA混合物を４℃
で１時間15000xgで遠心した。上澄み除去した後、ペレ
ットを１％（w/v）BSA及び150mMの塩化ナトリウムを含
むpH8.2の20mMトリス−塩酸緩衝液100ml中に再分散し
た。この懸濁液を再度遠心し、ペレットを520nmの光学
密度が約5.0となる容積まで同じ緩衝液中に再分散し
た。
1.2 保護された物理現像剤の製造 本現像剤の二種の液体成分を別個に製造した。溶液Ａ
は12gのヒスチジン、0.4gの硝酸銀及び4gのクエン酸を1
00mlの蒸留水中に溶解することにより調製された。溶液
Ｂは2.88gのクエン酸ナトリウム、2gの亜硫酸ナトリウ
ム、6gのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、0.
5gの硫酸ｐ−メチルアミノフェノール及び0.2gの塩酸ｐ
−アミノフェールを100mlの蒸留水中に溶解することに
より調製された。
は12gのヒスチジン、0.4gの硝酸銀及び4gのクエン酸を1
00mlの蒸留水中に溶解することにより調製された。溶液
Ｂは2.88gのクエン酸ナトリウム、2gの亜硫酸ナトリウ
ム、6gのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、0.
5gの硫酸ｐ−メチルアミノフェノール及び0.2gの塩酸ｐ
−アミノフェールを100mlの蒸留水中に溶解することに
より調製された。
1.3 吸着性固体相の製造 正方形の白いニトロセルロース紙（12×12mm）を紙
の堆積物（40×60mm、高さ10mm）の頂部に、それと近接
させて取り付けた。この量の紙は数mlの水を吸収する
ことができた。各ニトロセルロース／紙堆積部をニト
ロセルロース膜の側に穴（直径10mm）を有する密な段ボ
ール箱中に入れた。この穴をプラスチックの円筒（直径
10mm、高さ7mm）で内張りした。この円筒中に液を注ぐ
とニトロセルロースの膜を通して吸収性の紙中に液の
流れが起こるような設計とした。
の堆積物（40×60mm、高さ10mm）の頂部に、それと近接
させて取り付けた。この量の紙は数mlの水を吸収する
ことができた。各ニトロセルロース／紙堆積部をニト
ロセルロース膜の側に穴（直径10mm）を有する密な段ボ
ール箱中に入れた。この穴をプラスチックの円筒（直径
10mm、高さ7mm）で内張りした。この円筒中に液を注ぐ
とニトロセルロースの膜を通して吸収性の紙中に液の
流れが起こるような設計とした。
1.4 緩衝液中におけるヒトIg検出の実行 0.005％のBSAを含むpH8.2の50mMトリス−塩酸緩衝液
中に、種々な濃度（10ないし200μg/ml）のヒトIg試料
を調製した。該ヒトIg溶液５μをニトロセルロース膜
の中心に塗布し、直径約5mmの湿潤スポットを残し、そ
れは数秒以内に乾燥した（抗原固定工程）。0.5％BSA及
び0.5％ツイーン 20を含むpH7.5の50mM燐酸塩緩衝液10
0μを膜に添加した（遊離の蛋白質結合座位の飽和工
程）。この量の液は円筒を通して通体し得るニトロセル
ロース膜全体を非壁し、膜を通って流れるのに約15秒か
かった。100μのコロイド上の金で標識付けされた坑
−ヒトIg抗体を添加した。この容量分を膜を通して吸い
取った（更に15秒）。100μの保護された物理現像剤
溶液Ａを100μの溶液Ｂと小さい試験管中で混合し
た。その直後、この活性現像剤を膜に添加した。30秒後
に現像剤は膜を通して全部吸い取られ、実験は終了し
た。
中に、種々な濃度（10ないし200μg/ml）のヒトIg試料
を調製した。該ヒトIg溶液５μをニトロセルロース膜
の中心に塗布し、直径約5mmの湿潤スポットを残し、そ
れは数秒以内に乾燥した（抗原固定工程）。0.5％BSA及
び0.5％ツイーン 20を含むpH7.5の50mM燐酸塩緩衝液10
0μを膜に添加した（遊離の蛋白質結合座位の飽和工
程）。この量の液は円筒を通して通体し得るニトロセル
ロース膜全体を非壁し、膜を通って流れるのに約15秒か
かった。100μのコロイド上の金で標識付けされた坑
−ヒトIg抗体を添加した。この容量分を膜を通して吸い
取った（更に15秒）。100μの保護された物理現像剤
溶液Ａを100μの溶液Ｂと小さい試験管中で混合し
た。その直後、この活性現像剤を膜に添加した。30秒後
に現像剤は膜を通して全部吸い取られ、実験は終了し
た。
1.5 結果 膜表面上にヒトIgが存在することによって、試料を塗
布した側に黒い点（還元された銀）が生じた。この点の
周囲では膜は白いままであり、バックグラウンドの染色
は非常に低い水準であることを示している。50μg/mlの
ヒトIg5μ（2450ng）を添加した時、現像された信号
はなお明瞭に目視できた。総てのIgがこうして吸着され
るわけではないから、これは12ng/mm2よりも感度が良好
であることに対応する。飽和した膜上に抗原を固定する
点から出発して、分析に要した時間は１分以内であっ
た。
布した側に黒い点（還元された銀）が生じた。この点の
周囲では膜は白いままであり、バックグラウンドの染色
は非常に低い水準であることを示している。50μg/mlの
ヒトIg5μ（2450ng）を添加した時、現像された信号
はなお明瞭に目視できた。総てのIgがこうして吸着され
るわけではないから、これは12ng/mm2よりも感度が良好
であることに対応する。飽和した膜上に抗原を固定する
点から出発して、分析に要した時間は１分以内であっ
た。
実施例 ２ 2.1 DTPAをカップリングしたヒト免疫グロブリン（huI
g）の調製 120mgのDTPAを2mlのアセトニトリル及び170μのト
リエチルアミンの混合物中で、撹拌条件下に90分間50℃
で加熱した。室温に冷却後、17.65mgのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド及び24μのジイソプロピルカルボジイ
ミドを添加し、全体を更に90分間室温で撹拌した。得ら
れるDTPA複合体を、次ぎに、5mg/mlのhuIg及び0.2mMのE
DTAを含むpH7.0の0.1M炭酸水素ナトリウム溶液と混合す
る。この溶液を20分間毎に短時間振盪して室温に60分間
保つ。この温置後、試料を迅速に数分間−20℃に冷却
し、次いで４℃に保つ。その後、huIg及びDTPA−huIg分
子を未反応のDTPA−複合体からアセファデックス（Seph
adex） G100カラム上でpH5.0の0.1M酢酸ナトリウム溶
液でゲル過することにより分離した。
g）の調製 120mgのDTPAを2mlのアセトニトリル及び170μのト
リエチルアミンの混合物中で、撹拌条件下に90分間50℃
で加熱した。室温に冷却後、17.65mgのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド及び24μのジイソプロピルカルボジイ
ミドを添加し、全体を更に90分間室温で撹拌した。得ら
れるDTPA複合体を、次ぎに、5mg/mlのhuIg及び0.2mMのE
DTAを含むpH7.0の0.1M炭酸水素ナトリウム溶液と混合す
る。この溶液を20分間毎に短時間振盪して室温に60分間
保つ。この温置後、試料を迅速に数分間−20℃に冷却
し、次いで４℃に保つ。その後、huIg及びDTPA−huIg分
子を未反応のDTPA−複合体からアセファデックス（Seph
adex） G100カラム上でpH5.0の0.1M酢酸ナトリウム溶
液でゲル過することにより分離した。
2.2 銀で標識付けしたDTPA−huIgの調製 1mlのDTPA−huIg（280nmの光学密度＝1.0）を10mMの
水酸化カリウムでpH10.7とし、0.1Mの硝酸銀溶液を最初
の沈殿の兆候が明らかになるまで数滴添加した。銀イオ
ンがDTPAと結合するのに好都合ではないことが知られて
いる条件であるpH5.4で硝酸銀をDTPA−huIgに添加する
ことにより、対象試料を調製した。セファデックス G2
5カラム上で燐酸塩緩衝食塩水（生理的濃度の塩化ナト
リウムを含むpH7.5の50mM燐酸塩緩衝液）でゲル過す
ることによりAg−DTPA−huIg及びDTPA−huIg分子を遊離
の銀イオンから分離する前に、これらの混合物を室温で
24時間温置した。
水酸化カリウムでpH10.7とし、0.1Mの硝酸銀溶液を最初
の沈殿の兆候が明らかになるまで数滴添加した。銀イオ
ンがDTPAと結合するのに好都合ではないことが知られて
いる条件であるpH5.4で硝酸銀をDTPA−huIgに添加する
ことにより、対象試料を調製した。セファデックス G2
5カラム上で燐酸塩緩衝食塩水（生理的濃度の塩化ナト
リウムを含むpH7.5の50mM燐酸塩緩衝液）でゲル過す
ることによりAg−DTPA−huIg及びDTPA−huIg分子を遊離
の銀イオンから分離する前に、これらの混合物を室温で
24時間温置した。
2.3 保護された物理現像剤の製造 本現像剤の二種の液体成分を別個に製造した。溶液Ａ
は8gのイミダゾール、0.18gの硝酸銀、1.4gのクエン酸
ナトリウム（・2H2O）及び3.6gのクエン酸（H2O）を100
mlの蒸留水中に溶解することにより調製された。溶液Ｂ
は3.3gのクエン酸ナトリウム（・2H2O）、3.6gのクエン
酸（H2O）、1.6gのハイドロキノン及び0.75gの亜硫酸ナ
トリウムを100mlの蒸留水中に溶解することにより調製
された。
は8gのイミダゾール、0.18gの硝酸銀、1.4gのクエン酸
ナトリウム（・2H2O）及び3.6gのクエン酸（H2O）を100
mlの蒸留水中に溶解することにより調製された。溶液Ｂ
は3.3gのクエン酸ナトリウム（・2H2O）、3.6gのクエン
酸（H2O）、1.6gのハイドロキノン及び0.75gの亜硫酸ナ
トリウムを100mlの蒸留水中に溶解することにより調製
された。
2.4 Ag−DTPA−huIgの可視化 白いニトロセルロース紙（５×30mm）の切片を固定マ
トリックスとして使用した。Ag−DTPA−huIg溶液（280n
mの光学密度＝1.0）の１μ二滴及びDPTA−huIg対照溶
液（2.2参照）１μ二滴を、四つの異なったスポット
として各ニトリセルロース紙の切片に塗布した。0.5％B
SA（牛血清アルブミン）及び0.1％ツイーン 20を含むp
H7.5の50mMの燐酸塩緩衝液中に５ないし10分間切片を温
置することにより、これらの切片の未飽和の蛋白質結合
座位を封鎖した。1mlの現像剤溶液Ａと1mlの現像剤溶液
Ｂを10mlの試験管中で混合し、スポットし、飽和した切
片をその中に温置することにより実際の現像を実施し
た。
トリックスとして使用した。Ag−DTPA−huIg溶液（280n
mの光学密度＝1.0）の１μ二滴及びDPTA−huIg対照溶
液（2.2参照）１μ二滴を、四つの異なったスポット
として各ニトリセルロース紙の切片に塗布した。0.5％B
SA（牛血清アルブミン）及び0.1％ツイーン 20を含むp
H7.5の50mMの燐酸塩緩衝液中に５ないし10分間切片を温
置することにより、これらの切片の未飽和の蛋白質結合
座位を封鎖した。1mlの現像剤溶液Ａと1mlの現像剤溶液
Ｂを10mlの試験管中で混合し、スポットし、飽和した切
片をその中に温置することにより実際の現像を実施し
た。
現像は室温で30分間並びに24時間行なわれた。現像
後、切片を短時間蒸留水で濯ぎ、風乾した。
後、切片を短時間蒸留水で濯ぎ、風乾した。
2.5 結果 30分間現像後、Ag−DTPA−huIgスポットは灰色に着色
したが、DPTA−huIg対照スポット及びバックグラウンド
は全く着色しなかった。24時間現像後、対照スポット又
はバッググラウンドは何も着色せず、Ag−DTPA−huIgス
ポットは一段と濃く着色した。この実施例は物理現像剤
でこのマーカーを可視化する特異性を示している。同様
な実験はAg−DTPA−huIg分子はhuIg分子自身と同じ免疫
結合的挙動を有することを示した。
したが、DPTA−huIg対照スポット及びバックグラウンド
は全く着色しなかった。24時間現像後、対照スポット又
はバッググラウンドは何も着色せず、Ag−DTPA−huIgス
ポットは一段と濃く着色した。この実施例は物理現像剤
でこのマーカーを可視化する特異性を示している。同様
な実験はAg−DTPA−huIg分子はhuIg分子自身と同じ免疫
結合的挙動を有することを示した。
3.0 ジアミノベンジジン重合体の可視化 ニトロセルロースの切片にネズミのIgG（１μスポ
ット、250μgIg/μで開始）をスポットした。
ット、250μgIg/μで開始）をスポットした。
37℃において30分間５％BSAで閉鎖した後、ヤギ−坑
ネズミIgGペルオキシダーゼ標識物と共に切片を60分間
温置した。5g/のBSAと0.5ml/のツイーンを含むpH7.
5の0.05M燐酸ナトリウム緩衝液で各３分間３回洗浄した
後、切片を水で３回洗浄した。
ネズミIgGペルオキシダーゼ標識物と共に切片を60分間
温置した。5g/のBSAと0.5ml/のツイーンを含むpH7.
5の0.05M燐酸ナトリウム緩衝液で各３分間３回洗浄した
後、切片を水で３回洗浄した。
100mgのジアミノベンジジンを4mlの燐酸塩緩衝液（5.
75g Na2PHO4＋1.48g NaH2PO4−2H2O/水）4mlに溶かす
ことにより基質溶液を調製した。この溶液0.5mlを使用
前に同じ燐酸塩緩衝液25ml及び３％H2O275μと混合し
た。切片を９分間現像した。洗浄後、切片を0.03％HAuC
l4で６分間処理した、各３分間３回洗浄後、切片をNa2S
の0.142％溶液中にに浸漬した。水中で各３分間３回洗
浄後、“2.3"に記載したように0.5mlの溶液Ａ及び0.5ml
の溶液Ｂをトリション（Trition）X100溶液（水中0.25
％）と共に混合することにより銀の増感をを行った。
75g Na2PHO4＋1.48g NaH2PO4−2H2O/水）4mlに溶かす
ことにより基質溶液を調製した。この溶液0.5mlを使用
前に同じ燐酸塩緩衝液25ml及び３％H2O275μと混合し
た。切片を９分間現像した。洗浄後、切片を0.03％HAuC
l4で６分間処理した、各３分間３回洗浄後、切片をNa2S
の0.142％溶液中にに浸漬した。水中で各３分間３回洗
浄後、“2.3"に記載したように0.5mlの溶液Ａ及び0.5ml
の溶液Ｂをトリション（Trition）X100溶液（水中0.25
％）と共に混合することにより銀の増感をを行った。
3.1 結果 ８分間の増感後、強い暗色（黒色）の信号が得られ
た。この実施例は本発明による保護された物理現像剤が
旧来の現像剤よりも使用が非常に簡単であることを明ら
かに示している。旧来の現像剤で類似の結果を得るため
には、数回の追加工程を必要とし、旧来の現像剤の使用
について知られている注意事項、即ち極めて純粋な水、
ガラス器具類等に対し著しく用心しなければならない。
た。この実施例は本発明による保護された物理現像剤が
旧来の現像剤よりも使用が非常に簡単であることを明ら
かに示している。旧来の現像剤で類似の結果を得るため
には、数回の追加工程を必要とし、旧来の現像剤の使用
について知られている注意事項、即ち極めて純粋な水、
ガラス器具類等に対し著しく用心しなければならない。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−501822（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−116258（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−116259（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−66964（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−15100（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−47761（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−45457（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−45458（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−185160（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−17958（ＪＰ，Ａ) 特公 昭49−46420（ＪＰ，Ｂ２) 特表 昭62−500119（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ ｓ，74（２），Ｐ．353−60，（1984)
Claims (28)
- 【請求項１】使用される物理現像剤が金属イオン、金属
イオンに対してモル過剰な錯化剤である複素環式塩基及
び還元剤の溶液を含有して成ることを特徴とする金属イ
オンの還元を触媒するマーカー上に物理現像剤から金属
粒子を析出させる方法。 - 【請求項２】使用されるマーカーが金属、金属化合物或
いは金属又は金属化合物で随時被覆又は含浸されていて
もよい重合体である特許請求の範囲１項記載の方法。 - 【請求項３】使用されるマーカーがコロイド状の金、
銀、タリウム、白金又はパラジウム粒子；キレート状の
金、銀、タリウム、白金又はパラジウムイオン；又は随
時金属又は金属化合物で含浸されていてもよいベンジジ
ン誘導体の重合生成物のいずれかである特許請求の範囲
２項記載の方法。 - 【請求項４】該錯化剤が二個の環状窒素原子を有する５
員環又は一個の環状窒素原子を有する６員環のいずれか
を含む芳香族塩基である特許請求の範囲１項記載の方
法。 - 【請求項５】該錯化剤がヒスチジン、イミダゾール、ベ
ンズイミダゾール、ピラゾール、ピリジン、アミノピリ
ジン、ニコチンアミド、キノリン又はプリンである特許
請求の範囲４項記載の方法。 - 【請求項６】該物理現像剤の金属イオンが金、銀、白
金、パラジウム又はタリウムイオンである特許請求の範
囲１項記載の方法。 - 【請求項７】該物理現像剤の還元剤が1,2−ジヒドロキ
シベンゼン、1,4−ジヒドロキシベンゼン、硫酸−４−
メチルアミノフェノール、４−アミノフェノール、1,4
−ジアミノベンゼン、1,2−ジアミノベンゼン、Ｎ−
（４−ヒドロキシフェニル）グリシン、2,4−ジアミノ
フェノール、１−フェニル−３−ヒドロキシピラゾール
又はそれらの混合物である特許請求の範囲１項記載の方
法。 - 【請求項８】該物理現像剤が ａ）還元剤及び必要に応じ緩衝系及び一種又は多種の助
剤を含有して成る溶液；及び ｂ）金属イオン、金属イオンに対し過剰の錯化剤である
複素環式塩基及び必要に応じ緩衝系及び一種又は多種の
助剤を含有して成る溶液 を混合することにより得られる特許請求の範囲１項記載
の方法。 - 【請求項９】該マーカーが少なくとも一つの特異的結合
剤及びその対応する被結合物質との間に形成された凝集
体の少なくとも一つの成分に結合される特許請求の範囲
１項記載の方法。 - 【請求項１０】該マーカーが固体状支持体の内又は上に
直接固定されている受容体物質に結合される特許請求の
範囲１項記載の方法。 - 【請求項１１】少なくとも一種の特異的結合剤及びその
対応する被結合物質との間に形成した凝集体の少なくと
も一つの成分をマーカーで標識付けし、該凝集体を物理
現像剤と接触させ、それによってマーカーの影響下に定
性的又は定量的に測定できる金属粒子が生成することか
ら成る該凝集体の一種又は多種の成分を定性的及び／又
は定量的に測定する方法であつて、使用される物理現像
剤が金属イオン、金属イオンに対してモル過剰な錯化剤
である複素環式塩基及び還元剤の溶液から成ることを特
徴とする方法。 - 【請求項１２】特異的結合剤及び対応する被結合物質の
間の反応の成分が抗体、ハプテン又は抗原である特許請
求の範囲11項記載の方法。 - 【請求項１３】下記の： ａ）特異的結合剤又は対応する被結合物質を固体支持体
上に直接又は間接的に固定し； ｂ）支持体を物理現像剤から錯体化した金属イオンの還
元を触媒するマーカーで標識付けされた特異的結合剤又
は対応する被結合物質夫々の相対物と接触させ； ｃ）結合した及び遊離の標識付けされた成分を随時分離
した後に物理現像剤を添加し、それにより反応の間又は
適当な反応時間の後生成した金属粒子を試験試料及び／
又は誘導された分画中で定量的及び／又は定性的に測定
し、測定すべき成分又は多種成分の定性的及び／又は定
量的指標を提供する； 工程を含有する特許請求の範囲11項記載の方法。 - 【請求項１４】固体支持体上に固定されている特異的結
合剤により被結合物質を結合させることによって被結合
物質が固体支持体上に固定されることを特徴とする特許
請求の範囲第13項記載の方法。 - 【請求項１５】マーカーで標識付けされた相対物及び物
理現像剤が固体相に対し移動性である液相の一部である
ことを特徴とする特許請求の範囲13項記載の方法。 - 【請求項１６】下記の： ａ）特異的結合剤又は対応する被結合物質を固体支持体
上に直接又は間接的に固定し； ｂ）固定された被結合物質を含む支持体を該被結合物質
に対し特異的である第一の結合剤と接触させて両者で凝
集体を形成させ； ｃ）こうして形成された凝集体を保持する支持体を、物
理現像剤から錯体化された金属イオンの還元を触媒する
マーカーで標識付けされた前記第一の結合蛋白質に特異
的である第二の結合蛋白質と接触させ；且つ ｄ）結合した及び遊離の標識付けされた成分を随時分離
した後に物理現像剤を添加し、それにより反応の間又は
適当な反応時間の後生成した金属粒子を試験試料及び／
又は誘導された分画中で定量的及び／又は定性的に測定
し、測定すべき成分又は多種成分の定性的及び／又は定
量的指標を提供する； 工程を含有する特許請求の範囲11項記載の方法。 - 【請求項１７】第一の結合剤、マーカーで標識付けされ
た第二の結合蛋白質及び物理現像剤が該固体相に対し移
動性である液相の一部である特許請求の範囲16項記載の
方法。 - 【請求項１８】受容体物質をマーカーと結合させ、且つ
該マーカーを物理現像剤と接触させ、それによってマー
カーの影響下に定性的又は定量的に測定できる金属粒子
が生成することから成る、固体支持体の上又は内に直接
固定されている受容体物質を定性的及び／又は定量的に
測定する方法であつて、使用される物理現像剤が金属イ
オン、金属イオンに対してモル過剰な錯化剤である複素
環式塩基及び還元剤の溶液から成ることを特徴とする方
法。 - 【請求項１９】下記の： ａ）受容体物質を固体支持体上に固定し； ｂ）該支持体をコロイド状マーカー、及び受容体物質に
対するマーカーの結合を促進する少なくとも一種の物質
の溶液から成る懸濁物と接触させ； ｃ）物理現像剤を添加し、それにより反応の間又は適当
な反応時間後生成した粒子を定量的及び／又は定性的に
測定する； 工程を含有する特許請求の範囲18項記載の方法。 - 【請求項２０】物理現像剤が金属イオン、金属イオンに
対してモル過剰な錯化剤である複素環式塩基及び還元剤
の溶液から成ることを特徴とする物理現像剤から金属イ
オンの還元を触媒するマーカー上に金属粒子を析出させ
る試験用キット。 - 【請求項２１】特許請求の範囲８記載の方法において使
用するための特許請求の範囲20項記載の試験用キット。 - 【請求項２２】特許請求の範囲15記載の方法において使
用するための特許請求の範囲20項記載の試験用キット。 - 【請求項２３】特許請求の範囲17記載の方法において使
用するための特許請求の範囲20項記載の試験用キット。 - 【請求項２４】特許請求の範囲19記載の方法において使
用するための特許請求の範囲20項記載の試験用キット。 - 【請求項２５】金属イオン、金属イオンに対してモル比
的に過剰な錯化剤である複素環式塩基及び還元剤から成
ることを特徴とするマーカー上に金属粒子を析出させる
ための溶液。 - 【請求項２６】特許請求の範囲４記載の方法において使
用するための特許請求の範囲25項記載の溶液。 - 【請求項２７】特許請求の範囲６記載の方法において使
用するための特許請求の範囲25項記載の溶液。 - 【請求項２８】特許請求の範囲７記載の方法において使
用するための特許請求の範囲25項記載の溶液。
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Family Cites Families (14)
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|---|---|---|---|---|
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| JPS5745458A (en) * | 1980-09-02 | 1982-03-15 | Fuji Photo Film Co Ltd | Immunologic method for trace analysis |
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