JPH0326346B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、蛋白質またはその他の結合性物質に
結合された形態および非結合形態即ち遊離形態の
両方の形態を取つて生物学的液体中に存在し、か
つ遊離形態と結合形態が互いに平衡状態にある有
機物質または被分析体の遊離部分の検査に関す
る。上記蛋白質または他の結合性物質を以下天然
結合剤と称する。 血液のような生物学的液体中において遊離形態
と蛋白質に結合された形態の両方の形態で一緒に
見出されうる大部分の生理学的活性物質について
は、これら物質に関連する生理学的応答を制御で
き、従つて遊離（即ち非結合）および蛋白質に結
合された両方の物質を含む全物質の濃度よりも臨
床的に有意であることができるのは遊離形態の濃
度であると一般に考えられている。 ヨーロツパ特許明細書第26103号はこの種類の
検査方法を記載している。この方法は被分析体と
それのラベル付き誘導体とを、被分析体のための
特異結合剤との反応について競争させることを含
む。次に特異結合剤に結合されてしまつた被分析
体のラベル付き誘導体の量を測定し、生物学的液
体の中の遊離の被分析体の濃度を測定するために
その測定値を用いる。ラベル付きの誘導体および
用いられる特異結合剤の量は前記の平衡に実質的
に影響するには不十分である。また、被分析体の
ラベル付きの誘導体は生物学的液体中の天然結合
剤と実質的に非反応性であるように選ばれる。 前記ヨーロツパ特許明細書第26103号の方法は
ラベル付き種（スペシーズ）が被分析体の一変種
である競争免疫検査に関する。これに対し、本発
明はラベル付きの種が被分析体に対する抗体であ
る検査法に関する。この点につき本発明の検査法
は一部位免疫測定検査法とより密接に関係してい
る。 三種類の検査法は次のように要約することがで
きる： 典型的な競争免疫検査法においては、反応剤
は被分析体（抗原）、ラベル（たとえば放射性
原子）を付けられた被分析体の一変種、および
加えられた特異結合剤（被分析体に対する抗
体）である。用いられる特異結合剤の量はすべ
ての被分析体とそのラベル付き変種と反応する
には不十分である。被分析体とそのラベル付き
変種は特異結合剤との反応に競争して、検査試
料中の被分析体の濃度に依存する割合でそれと
結合する。次いで被分析体のラベル付き変種の
結合された部分は非結合部分から分離される。
この目的のために、特異結合剤は例えば固体粒
子の上または検査管の壁の上の被覆として提供
されてもよい。特異結合剤に結合される被分析
体のラベル付き変種の量は検査試料中の被分析
体の濃度に反比例する。 典型的一部位免疫測定検査法においては、反
応剤は被分析体（抗原）、被分析体のマトリツ
クス結合変種、および被分析体に対する特異結
合剤（抗体）である。用いられる特異結合剤の
量は検査試料中のすべての被分析体と反応する
に少なくとも十分である。）とは異なり、そ
れはラベル（例えば放射性原子）を付けられて
いる特異結合剤である。検査試料の被分析体は
ラベル付きの特異結合剤と反応する。次いで、
マトリツクス結合された被分析体の十分な量
が、過剰のラベル付き変種結合剤と反応するよ
う加えられる。次いで、マトリツクス結合され
た被分析体に結合されたラベル付き特異結合剤
の部分はそのように結合されていない部分から
分離される。マトリツクス結合された被分析体
に結合される特異結合剤の量は検査試料中の被
分析体の濃度に反比例する。免疫測定検査法は
1974年のBritish Medical Bulletin（44〜49ペ
ージ）の論文の主題である。 前記の）と）の中間の免疫検査法が発表
された。Journal of Steroid Biochemistry，
11，1597−1600およびFEBS Letters，96，２
（1978年12月）、298−300を見よ。反応剤は免疫
測定検査法）におけるように、被分析体（抗
原）、被分析体のマトリツクス結合変種および
被分析体のためのラベル付き特異結合剤（抗
体）である。この方法は免疫検査）における
ように、検査試料中の被分析体とそのマトリツ
クス結合変種とを、ラベル付き特異結合剤と反
応について競争せしめ、かつ検査試料中の被分
析体全部の濃度に依存する割合でそれに結合さ
れるようにすることである。 特異結合剤がラベルを付けられている検査方
法は、被分析体の一変種がラベルを付けられて
いる検査法とは異なり、かつある環境において
はそれよりも良好であることが認められてい
る。例えば、それはある環境においては抗原よ
りも抗体にラベルを付ける方がより容易であ
る。特異結合剤がラベル付けされる検査法の実
用的開発は、十分な純度のラベル付き抗体を提
供することの困難のために遅延していた。モノ
クローナル抗体の開発と共に、この困難は克服
されつつある、そしてそのような検査法は未来
においてますます重要となることが期待されて
いる。 本発明は被分析体のためのラベル付き特異結合
剤を用いる）類における検査法を提供するもの
であり、この検査法は一つまたはそれ以上の天然
結合剤に結合された被分析体の一部分と平衡して
いる生物学的液体中に存在する被分析体の遊離部
分を測定するよう適合されたものである。 生物学的液体中の被分析体分子の与えられた集
団において、被分析体分子の幾らかが天然結合剤
または存在する他の結合剤に結合されることが判
るであろう。これらの被分析体分子をここでは被
分析体の結合部分と称する。他の被分析体分子は
結合されない、以後これらを被分析体の遊離部分
と称する。 本発明は下記の諸工程により生物学的液体中の
被分析体の遊離部分の濃度の測定方法を提供する
（ただし被分析体は被分析体および被分析体に対
する抗体とよりなる特異結合対の一員であり、被
分析体の上記遊離部分は、被分析体に対する一つ
またはそれ以上の天然結合剤に結合された被分析
体の一部分も含有する生物学的液体中に存在し、
被分析体の結合部分と遊離部分は互いに平衡して
いる）： ａ 生物学的液体の試料と、被分析体に対するラ
ベル付き抗体のある量と、被分析体の誘導体と
で混合物を形成する工程（ただし被分析体に対
する上記ラベル付き抗体の量は上記平衡に実質
的に影響するには不十分であり、かつ被分析体
の上記誘導体は上記天然結合剤と実質的に非反
応性である）、 ｂ 試料中に存在する被分析体の遊離部分の濃度
に依存する割合で被分析体の遊離部分とその誘
導体が被分析体に対するラベル付き抗体に結合
されるようになり得るある時間の間、上記混合
物を保つ工程、 ｃ 被分析体の誘導体に結合された被分析体に対
する上記ラベル付き抗体の量および／または被
分析体の誘導体に結合されていない被分析体に
対する上記ラベル付き抗体の量を測定する工
程、および ｄ 生物学的液体中の遊離の被分析体の濃度を測
定するため上記測定値を用いる工程。 被分析体の性質については、本発明の方法は一
般に適用しうるものである。本発明方法を適用し
得る被分析体の種類の例には、ホルモン、生化学
的伝達体、ステロイド、医薬品、医薬品代謝産
物、ポリペプチド、蛋白質、ビタミン、腫瘍抗
原、毒素、アルカロイドおよび単、二、および多
糖類がある。 被分析体は特異結合対の一員である。 被分析体の遊離部分は生物学的液体中で天然結
合剤に結合している被分析体の部分と平衡してい
る。従つて、もし少量の遊離被分析体が系から除
去されると（たとえばその被分析体に対する抗体
に結合されることにより）、そのとき対応する少
量の被分析体が、平衡を回復するように、生物学
的液体中の天然結合剤によつて遊離せしめられ
る。しかもこの工程は一般に検査に要する時間よ
りも少なくかついかなる場合においても検査に要
する時間よりも実質的に大きくない時間内におい
て生起する。 被分析体に対する抗体（以下特異結合剤とも称
する）のラベル付き変種が利用される。上述のよ
うに、ラベル付き特異結合剤は被分析体に対する
抗体である。免疫検査法または免疫測定検査法に
おいて用いられる任意のラベルでそれはラベル付
きされておつてもよい。ラベルの最も重要な群は
放射性原子、酵素または酵素系の成分、および化
学発光及び螢光基である。酵素検査法は信号を発
する二つまたはそれ以上の成分、たとえば酵素と
その基質使用を含み、そして特異結合剤はこれら
成分の一つまたはそれ以上によつてラベル付けさ
れたものであつてもよい。最も普通の場合、特異
結合剤は少なくとも一つの放射性原子、好ましく
はガンマ線を発するもの、によつてラベル付けら
れたものである。抗体および他の特異結合剤にラ
ベルを付ける技術は当業者に良く知られているか
らここでは記載しない。 この明細書において用いられる「ラベル付き」
なる言葉はいくらか説明を要する。この言葉は前
述の狭い意味において用いられるばかりでなく、
いくらか広い意味においても用いられる。本発明
の方法のａ）およびｂ）工程を行なう一つの方法
は次の工程によつて行なわれる： 生物学的液体の試料と、被分析体のための特
異結合剤のある量と、被分析体の誘導体との混
合体を形成する工程（ただし上記特異結合剤の
量は上記平衡に実質的に影響するには不十分で
あり、被分析体の上記誘導体は上記天然結合剤
と実質的に非反応性である）、 被分析体の遊離部分とその誘導体が、試料中
に存在する被分析体の遊離部分の濃度に依存す
る割合で特異結合剤に結合するようになり得る
ある時間の間、上記混合物を保つ工程、 形成された被分析体誘導体／特異結合剤の複
合体を反応混合物の残りから分離する工程、 上記特異結合剤のための抗体（または他の特
異結合剤）の過剰と共に前記複合体を培養する
工程（ただし上記抗体は一つのマーカー原子ま
たは基でラベル付けされている）、および 複合体に結合されていない抗体を除くために
複合体を洗う工程。 本発明方法のこの実施態様において、特異結合
剤は、結合目的のためにラベル付けされた抗体に
よつて）工程において認められたその分子部分
により最初から「ラベル付け」されていると見な
される。 ラベル付き特異結合剤の、被分析体に対する、
および被分析体誘導体に対する親和性は本発明に
よる検査法を最適化する上において一つの重要な
因子であることが判つた。親和性は被分析体への
結合に関する解離定数によつて表わすのが好都合
である。この解離定数は被分析体／特異結合剤の
複合体の濃度で割られた遊離特異結合剤濃度を掛
けた遊離の被分析体の濃度として定義される。本
発明の方法において、用いられたラベル付き特異
結合剤の解離定数は、検査試料中の遊離被分析体
濃度よりも約20倍、好ましくは10倍多いか少ない
値以内であることが望ましい。もし親和性が低過
ぎると、検査感度は低下する。もし高過ぎると、
検査は実際において見出される濃度以下の遊離被
分析体濃度において最高感度を有す。被分析体お
よび被分析体誘導体に対するラベル付き特異結合
剤の親和性が非常に異なつているならば、これら
の限定は全く同一の方法では当てはまらない。 検査試料中の遊離の被分析体の濃度が、たとえ
ばチロキシンの場合のように低いときには、ラベ
ル付き特異結合剤の解離定数は対応的に低くある
べきである。このことは、被分析体に対する高い
親和性を持つている特異結合剤の使用を必要とす
る。 抗血清は通常は抗原（被分析体）に対する異な
つた親和性を有する抗体の混合物である。在来の
競争免疫検査（たとえば在来の放射線免疫検査）
においては、優勢であるのは混合物中の高親和性
抗体の効果であり、低親和性抗体の大量の存在は
有害ではない。抗体がラベルを付けられている本
発明の方法においては、低親和性の抗体の大量の
存在は有害であり、平坦なドーズ応答曲線をもた
らす。それ故、本発明の方法においては適当な親
和性を有し、かつ不適当な（一般に低い）親和性
を有する抗体と混合されていない抗体を用いるこ
とが好ましい。モノクローナル抗体が好ましい。 被分析体に対し望ましい親和性を有する特定の
ラベル付き特異結合剤の使用が決定されると、用
いられるべきラベル付き特異結合剤の量は容易に
決定される。もしあまり少なすぎるラベル付き特
異結合剤を用いると、検査法は、実際に遭遇する
濃度以下の遊離被分析体濃度のある範囲に渉つて
のみ敏感である。同様に、もしあまり多すぎるラ
ベル付き特異結合剤を用いると、検査法は高い遊
離被分析体濃度においてのみ敏感である。 前に述べたように、用いられるラベル付き特異
結合剤の量は、生物学的液体中の被分析体の遊
離／結合平衡に実質的に影響するに不十分でなけ
ればならぬ。もし被分析体に対して十分高い親和
性を有するラベル付き特異結合剤が選ばれるなら
ば、そのときには遊離／結合被分析体平衡に著し
く影響することなく好適量を検査のために用い得
ることが判る。逆に言うと、被分析体の遊離／結
合平衡に実質的に影響することを避けるように、
少量のラベル付き特異結合剤を使用することの必
要は、被分析体に対し高い親和性を有するラベル
付き特異結合剤の使用を命令する要因の一つであ
る（しかし唯一の要因ではない）。 被分析体の誘導体は、ラベル付き特異結合剤と
の反応に被分析体と競争するために用いる。被分
析体のこの誘導体は、生物学的液体の中で被分析
体のための天然結合剤と実質的に非反応性である
ことが必要である。もしかなりの反応が起こるな
らば、生物学的液体中における被分析体の遊離／
結合平衡は、遊離の被分析体の濃度の真の指示を
検査が与えないような程度まで、乱されるであろ
う。その上、被分析体誘導体のある割合はラベル
付き特異結合剤との反応のため遊離の被分析体と
競争するのに役立たないであろう、そしてこの割
合は検査されている生物学的液体の特定の試料中
の天然結合剤の量と種類によつて決るであろう。 被分析体の誘導体は、被分析体に結合されてし
まつたラベル付き特異結合剤を迅速かつ容易に測
定させ得る性質を持つている（この目的のため
に、被分析体に結合されていないすべてのラベル
付き反応剤は被分析体の誘導体に結合されるよう
になるという仮定をしている）。これに関連して
二種類の検査法がある。 均質検査法。これらにおいては、被分析体の
誘導体に結合されたラベル付き特異結合剤の部
分は、ラベルによつて発せられた信号の測定に
先立つてそのように結合されていないラベル付
き特異結合剤の部分から分離されない。このこ
とは実用的であり、かつ酵素、化学発光および
螢光検査系には有利である。しかし、被分析体
の誘導体に結合されているラベル付き特異結合
剤のラベルによつて発せられた信号が、被分析
体に結合されたラベル付き特異結合剤のラベル
によつて発せられた信号とはある点で異なるこ
とが必要である。それ故、この場合、被分析体
の誘導体はそれに結合されるようになるラベル
付き特異結合剤の部分によつて発せられる信号
を改変するように選ばれなければならない。 不均質検査法。これらにおいては、被分析体
の誘導体に結合されたラベル付き特異結合剤の
部分は、一つまたは他の部分によつて発せられ
た信号の測定に先立ち被分析体に結合されたラ
ベル付き特異結合剤の部分から分離される。放
射線検査系は通常は不均質であり、その他の検
査系もまたそうであろう。この場合、被分析体
の誘導体は一つの分離手段として役立つ。それ
故、被分析体の誘導体は固相においても、ある
いは液体から固相にすでに移つた形態において
も、一般に用いられる。 不均質検査法のため、被分析体の誘導体の要件
は次の如く要約することができる。ａ ラベル付
き特異結合剤との反応後、それは液体の検査媒
質から容易に分離できなければならない。 ｂ それはラベル付き特異結合剤と反応しなけれ
ばならない、そして ｃ それは生物学的液体中において被分析体のた
めの天然結合剤と実質的に非反応性でなければ
ならない。 被分析体の誘導体が、ラベル付き特異結合剤と
反応後液体の検査媒質から容易に分離しうるとい
う性質ａは次のような種々な方法で達成される。 被分析体は、たとえば固形粒子の形で、また
は分析管それ自体の形でのマトリツクスに結合
されていてもよい。その場合、分離は遠心法ま
たは単に傾瀉洗条によつて容易に達成される。 被分析体誘導体は異なるハプテンまたは抗原
を含有してもよい。被分析体のための天然結合
剤に対して非反応性であるこの異なる抗原に対
する抗体は所望の分離を達成するためマトリツ
クスに結合された形またはその他の形で用いる
ことができる。 被分析体誘導体はキレート剤を含有していて
もよく、あるいは溶液から容易に沈澱されるか
またはイオン交換樹脂のような吸着剤に結合さ
れているかまたは有機溶剤で抽出される他の化
学的に反応性ある種を含有していてもよい。 被分析体誘導体はビオチンを含有してもよ
い。この場合、分離はたとえばマトリツクスに
結合された形でアビジンまたはストレプトアビ
ジンを用いて達成される。 被分析体は被分析体の誘導体を形成するためあ
る点で改変されることは明らかである。この改変
は化学的改変であつてもよい、あるいは被分析体
をマトリツクスに結合る量よりも多くない量であ
つてもよい。しかし、改変は被分析体のその特異
結合剤に対する天然の親和性を破壊してはならな
い、そしてこのことは生物学的液体中に天然の結
合剤が存在する場合においてもそうでなければな
らない。このことを考えに入れて、特殊薬剤によ
る結合の目的のため認識されない被分析体分子の
ある部分において、被分析体の改変または結合は
通常実施すべきである。被分析体は固体マトリツ
クスに結合される際その特異結合剤に対する親和
性を失なうという可能性もある。この問題は被分
析体とマトリツクスとの間に長い架橋を作ること
によつて避けることができる。 被分析体の誘導体が被分析体のための天然結合
剤と実質的に非反応性であるという性質ｃ）もま
た種々な方法で達成される： マトリツクスへの被分析体の結合は、天然結
合剤による結合のため認識される被分析体分子
のある部分を介して行なわれてもよい。 被分析体の改変は天然結合剤による結合のた
め認識される被分析体分子のある部分で行なわ
れてもよい。 被分析体またはその誘導体を担持するマトリ
ツクスの表面は天然結合剤の作用を退けるかさ
もなくば妨げる基の付着によつて改変されても
よい。 蛋白質結合部位の性質によつて、被分析体と
マトリツクスとの間の架橋は、被分析体がマト
リツクスへの接近によつて保護されるほど短か
いように整えられてもよい（しかし、架橋は被
分析体がラベル付き特異結合剤と反応できるに
十分な長さである）。 この特長の組み合せを有する被分析体誘導体の
選択は被分析体の性質によつて異なる。被分析体
がチロイドホルモンまたはステロイドであるとき
の選択に影響する要因は以下に論議する。 用いられる被分析体誘導体の量はラベル付き特
異結合剤の量に関係する。もしラベル付き特異結
合剤の濃度に対する被分析体誘導体の濃度のモル
比が非常に大きいときには、被分析体誘導体に結
合されたラベルの割合は常に100％に近い。従つ
て、もし比率が非常に小さいときには、割合は常
に０％に近い。モル比は約１から50までの範囲
内、好ましくは約10であることが望ましい。 培養の時間と温度、および検査媒質のPHを含
む。本発明方法実施のための好適な条件は被分析
体のための従来の検査法の知識から容易に決定で
きる。反応剤は種々な方法で混合することができ
る。即ち ラベル付き特異結合剤と被分析体誘導体は検
査試料へ同時にまたは順次に加えられる。それ
により遊離の被分析体と被分析体誘導体はラベ
ル付き特異結合剤との反応のために競争する。 ラベル付き特異結合剤は被分析体誘導体に結
合された形で検査試料へ加える。ラベル付き特
異結合剤のうちのいくらかは複合体より遊離し
て遊離の被分析体に結合するようになる。 上に述べたように、ラベル付き特異結合剤は被
分析体に対する抗体である。抗体は二価であるこ
とが知られている。ここで一つの問題が起こるの
でないかと考えられよう、何故なら抗体の分子は
被分析体の分子および被分析体誘導体の分子の両
方と反応するかも知れないからである。もしこれ
が大きい程度に起こるとすれば、これは検査の感
度を低下するであろう。しかし、すべての一部位
免疫測定検査法に理論的に共通であるこの問題は
実際には著しく程度に起るようには見えない。こ
の問題は、もし必要ならば、たとえば抗体を二つ
の小さい一価の分子（例えばFab断片）に分断し
て抗体を一価にすることによつて避けることがで
きる。 本発明の方法は主として検査への一つの平衡到
達法として意図されている。しかし、ある種の反
応は平衡に達するのにかなり遅い、特に被分析体
が大きい分子である場合、および／または被分析
体誘導体が不溶性マトリツクスに結合されている
場合にはそうである。そのような場合、この方法
は一つの動力学的または非平衡到達法に適応させ
ることができる。 不均質検査法においては、被分析体誘導体に結
合されたラベル付き特異結合剤の部分の、被分析
体に結合された部分からの分離は、液相からの固
体の分離を通常包含している、そしてこれは従来
の手段、例えば遠心分離によつて行うことができ
る。結合された部分および／または結合されてい
ない部分によつて発せられる信号の測定もまた在
来手段で行なうことができる。 平衡状態においてラベル付き特異結合剤とその
他の場所との間における被分析体誘導体の分布
は、存在する天然結合剤とラベル付き特異結合剤
の量により、被分析体とその誘導体に対するそれ
らの親和性定数により、そして存在する被分析体
とその誘導体の量により決定される。ラベル付き
特異結合剤に結合された被分析体誘導体の量に関
する知識およびその他の関連性のあるデータから
遊離した形の被分析体の量を計算することは理論
的には可能であろうが、これは実施可能な方法で
はない、そして標準的検査法、即ち「ドーズ応答
曲線」または「標準曲線」の使用に頼らねばなら
ない。この方法においては、この方法の所要の適
用範囲を測る、知られた遊離の被分析体の含有量
（たとえば平衡透析によつて測定された）の、多
数の標準血清がこの方法において測定される。結
果をグラフ上にプロツトし、未知の試料はこの曲
線から読み取る。試料、ラベル付き特異結合剤お
よび被分析体誘導体の実際の量は、検査法の所望
の適用範囲に渉る適切な傾斜の（従つて適切な検
査感度の）ドーズ応答曲線を与えるように最適化
する。検査を最適化する方法は、放射線免疫検査
および関連の方法を実施する人々にはよく知られ
た方法であり、以下に記載するような反復コンピ
ユーター法を用いて行なうことができる。 生物学的液体中で遊離形と結合形の両方におい
て見出される多くの被分析体では、与えられた被
分析体のための天然結合剤の数は二つまたはそれ
以上である。蛋白質の二つまたはそれ以上の結合
が可逆的である場合、遊離の被分析体、結合され
てない天然結合剤および天然結合剤のそれぞれに
結合された被分析体の間の化学的平衡は、複雑で
ありかつ相互に影響し合う。質量作用の法則はこ
の全体の平衡の成分部分を記載する便利な方法を
提供する。これらはまた完全な複雑平衡の完全な
説明を確立するに用いることができる。 各天然結合剤（全濃度〔Pj〕）においては、遊
離の被分析体〔F1〕、結合された被分析体〔B1j〕
および結合されていない蛋白質（〔Pj〕−〔B1j〕）
の間に、次のように表わし得る一つの平衡定数
K1jを有する一つの平衡が成立する： K1j＝〔B1j〕／〔F1〕（〔Pj〕−〔B1j〕） 遊離の被分析体が、ｎ個の天然結合剤の各々に
結合している被分析体と共存する一般の場合、遊
離形および結合形は次のように全被分析体〔T1〕
と関係している： 〔T1〕＝〔F1〕＋j=o 〓j=1 〔B1j〕 上の二つの式を用いると、遊離の被分析体と被
分析体の種々な結合形との間の完全な平衡は各天
然結合剤の全濃度、被分析体と各天然結合剤との
平衡定数および被分析体の全濃度によつて表わす
ことができる： 全被分析体〔T1〕＝〔F1〕＋j=o 〓j=1 〔K1j〔Pj〕〔F1〕／１＋K1j〔F1〕〕 加算列における各ｊ番目の項はｊ番目の蛋白質
に結合している被分析体の濃度を表わす。 本発明においてはこれら技術は平衡状態におけ
る天然結合剤とラベル付き特異結合剤に対する被
分析体と被分析誘導体の両者の結合を表わすよう
拡大することができる。 ラベル付き特異結合剤が被分析体と被分析体誘
導体の両方に対する特異の抗体であることは（そ
の濃度は〔P(o+1)〕である）望ましいが必ずしも
必要ではない。ラベル付き特異結合剤についての
被分析体誘導体の平衡定数K2(o+1)は特異結合剤に
ついての被分析体の平衡定数K1(o+1)）と同じであ
つてもよいが、これがそうであることは必ずしも
常に必要ではない。もし遊離の被分析体誘導体を
〔F2〕で表わすとすれば、天然結合剤とラベル付
き特異結合剤の間の被分析体の分布は次式によつ
て与えられる： 〔T1〕＝〔F1〕＋j=o 〓 〓j=1 〔K1j〔Pj〕〔F1〕／１＋K1j〔F1〕〕＋〔K1(o+1)〔
P(o+1)〕〔F1〕／１＋K1(o+1)〔F1〕＋K2(o+1)〔F2〕〕
(1) 被分析体誘導体（全濃度〔T2〕が天然結合剤
に対して残余の結合力を持たない場合、ラベル付
き特異結合剤の遊離形と結合形の間の被分析体の
分布は次のようである： 〔T2〕＝〔F2〕＋〔K2(o+1)〔P(o+1)〔F2〕／１＋K1(
o+1)〔F1〕＋K2(o+1)〔F2〕〕(2) もし天然結合剤とラベル付き特異結合剤の平衡
定数が被分析体誘導体、天然結合剤およびラベル
付き特異結合剤の全濃度と共に知られているなら
ば、概算〔F1〕と〔F2〕を得るべく同時に式(1)
と(2)を解くことにより、検査中平衡状態において
被分析体誘導体に結合しているラベル付き特異結
合剤の量を概算することが可能であり、〔F1〕と
〔F2〕はそのように結合しているラベル付き特異
結合剤の直接概算を得べく式(2)の中で用いられ
る。これらの計算は数値解析を行なう人々にはよ
く知られた反復コンピユーター法を用いて都合よ
く行なうことができる。 検査中の被分析体誘導体は天然結合剤に非結合
性であることが望ましいが必ずしもそうでなくて
もよい。被分析体誘導体の弱い残留結合体が天然
結合剤のいずれかに対して生じた場合（平衡定数
K2j）、検査中平衡にある遊離形と種々な結合形
の間における被分析体誘導体の分布は次のとおり
である： 〔T2〕＝〔F2〕＋〔K2(o+1)〔P(o+1)〕〔F2〕／１＋K1(
o+1)〔F1〕＋K2(o+2)〔F2〕〕＋j=o 〓j=1 〔Kj〔Pj〕〔F2〕〕 (3) 加算における各ｊ番目の項はｊ番目の蛋白質に
対する被分析体誘導体の弱い残留結合を表わす。 式(3)は被分析体誘導体に結合されたラベル付き
特異結合剤の量を概算するに用いるときすべての
点において式(2)に入れ換わる。 これら計算は本発明の利用する検査を最適化す
るに特に有用であり、特に、要求される被分析体
誘導体とラベル付き特異結合剤の両者の品質と量
を決定する上において有用である。 上に述べたコンピユーター計算法を用いること
により、ラベル付き特異結合剤の平衡定数の概算
値と被分析体誘導体とラベル付き特異結合剤の両
者の濃度を変えることにより、被分析体の遊離／
結合平衡のわずかな変化；適当な傾斜のドーズ応
答曲線（従つて適当な検査感度）；および天然結
合剤に対する被分析体誘導体の弱い残留結合より
起こる測定された遊離の被分析体の概算の無視し
得るひずみ；と両立し得るこれらすべての最適範
囲を決定することが可能である。三つの特異被分
析体についてのコンピユーター計算の結果は実施
例２，３および４に示す。 この項においては、チロイドホルモン類につい
て本発明によつて放射線検査を計画する上におい
て、特にマトリツクスに結合された被分析体誘導
体の構造を含む、要因のいくつかを論ずる。これ
らは次の式を有す： Ｘはチロキシン（Ｔ４）においてはＩである。 Ｘはトリ−ヨードチロニン（Ｔ３）においては
Ｈである。 Ｔ４は三つの天然に存在するＴ４を結合する蛋
白質、即ちチロキシンを結合するグロブリン
（TBG）、チロキシンを結合するプレアルブミン
（TBPA）およびアルブミン（Ａ１ｂ）に大量に
（99.98％）結合されて人間の血液中で運ばれてい
る。これら各々に結合されているＴ４の百分率は
それぞれ約70％、20〜25％および５〜10％であ
る。この特定の検査のためのマトリツクス結合さ
れたＴ４を設計するに当り、検査中のTBG，
TBPAおよびＡ１ｂへの誘導体の結合はゼロか
または検査に用いられるラベル付き特異結合剤へ
の誘導体への結合よりも非常に少ないことが重要
である。 たとえばヨーロツパ特許明細書第26103号から、
天然結合剤へのＴ４の結合は、Ｔ４分子のアミノ
酸末端のアミノ基およびカルボン酸基に非常に関
係していることが知られている。これらの基のい
ずれかまたは両方を除かれたか、またはそれらが
普通の方法でイオン化することを妨げるよう化学
的に改変されたか、または大きな化学基の付着に
よつて改変されたＴ４誘導体の場合、天然結合剤
への誘導体の結合はＴ４よりも実質的に少ない、
一方、Ｔ４分子のアミノ酸末端を介して牛の血清
アルブミンのような大きな蛋白質に連結したその
ような誘導体よりなる免疫原にまで高められた抗
血清とこれらの誘導体との結合力はしばしばはＴ
４それ自体の結合力に匹敵する。 検査に必要な反応剤の一つはＴ４に対する放射
性原子でラベル付けされた抗体である。Ｔ４それ
自体は免疫原ではないがそれは牛の血清アルブミ
ンと連結して羊や兎の中に抗体を生ずるようこの
形で用いることができる。次いで抗体は精製さ
れ、ヨード125のような放射性原子でラベル付け
する。また別法として、モノクローナル抗体を生
ずるハイブリドーマ技術を用いてもよい。これら
すべての操作の技術は周知であるからここには記
載しない。 必要なもう一つの反応剤はＴ４の誘導体であ
る。これはラベル付き抗体と反応後、液状の検査
媒体から容易に分離し得るものでなければならな
い。この性質は前述の一般説明において述べたよ
うに種々の方法で達成できる： Ｔ４は例えば固体粒子の形または検査管それ
自体の形でのマトリツクスに結合されていても
よい。 Ｔ４は異なつた抗原に結合されていてもよ
い。 Ｔ４はキレート剤、または容易に析出される
かあるいは水溶液から除去される他の化学的に
反応性ある種に結合されていてもよい。 このＴ４誘導体はラベル付きのＴ４抗体に強く
結合することもまた必要である。Ｔ４抗体は結合
の目的でＴ４分子（前記したような）の左手端を
認識するから、Ｔ４は例えばマトリツクスに分子
の右手端の何かの基（例えばカルボン酸またはア
ミノ基によつて）結合されるべきである。Ｔ４は
マトリツクスに結合されてしまうと免疫反応性を
失なうかも知れない可能性がある。この問題はマ
トリツクスとＴ４の間に長い架橋を作ることによ
つて避けられる。 Ｔ４誘導体の第三の必要条件は生物学的液体中
で天然結合剤（特にTBGとTBPA）と実質的に
非反応性であるべきことである。この性質は種々
な方法で達成される： ａ TBGとTBPAは結合の目的でＴ４分子のア
ミノ酸末端を主として認識することは知られて
いる。それ故、Ｔ４へそのカルボン酸またはア
ミノ基を介してマトリツクスを結合するために
はこれら結合剤の反応性を抑制することで十分
であろう。そのような材料は発表されており
（Archives of Biochemistry and Biophysics，
135，304−310（1969））、商業的に入手可能であ
る。 Ｔ４はいかなる場合についてもこれらの基の
うちの一つを介して普通結合されているだろう
が、ｂ）とｃ）において述べるように天然結合
剤との反応を抑制するために更に別の工程を取
る必要がある。 ｂ Ｔ４誘導体は次の方法の一つまたはそれ以上
を用いてＴ４の構造を改変することによつて作
ることができる： １ Ｔ４のアラニン側鎖のカルボン酸と末端ア
ミノ基の電荷を改変する。 ２ 末端のカルボン酸基またはアミノ基のいず
れかまたは両者に嵩高な基を加える。 ３ 天然に存在するＬ−配置ではなくＤ−配置
を有するＴ４の誘導体を作る。 ヨーロツパ特許明細書第26103号はTBGと
TBPAへの結合を抑制するよう改変されたＴ
４誘導体の一般論と特定の実施例を記載してい
る。 ｃ Ｔ４またはＴ４の誘導体を持つているマトリ
ツクスの表面はTBG，TBPAおよびＡ１ｂを
退ける基の付着によつて改変され得るが、Ｔ４
またはＴ４誘導体へ抗体の適切な結合をするこ
とを許容する。 上述したのと同様な考えは他の被分析体の検査
のための反応剤を立案するのに用いることができ
る。 例えば、トリ−ヨードチロニンはＴ４を結合す
るのと同じ三つの結合性蛋白質（TBG，TBPA
およびＡ１ｂ）に主として結合されて血液流の中
に存在する。 トリ−ヨードチロニンに対するラベル付きの抗
体、およびマトリツクスに結合されたトリ−ヨー
ドチロニン誘導体はＴ４についてのように調製す
ることができる。 ステロイドホルモンコルチゾルは血漿中に遊離
形（８％）で見出され、またグロブリンを結合す
る天然の血漿蛋白質コルチコステロイド（CBG
またはトランスコルチンとしても知られている）
および血清アルブミンに結合（92％）した形で見
出される。コルチゾル（同様にプロゲステロン）
のCBGへの結合はCBG分子の割れ目にはまり込
むと信じられているＡおよびＢリングを介して起
こることが知られている。 ステロイドに関する
重要な一つの論文は、“Steroid−Protein
Interactiens.Influence of Steroid Structure
and Temperature on the Binding of Steroids
to Guinea Pig Corticosteroid−Binding
Globulin”Mickelson K.E.and Westphal U.
Biochemistry1980，19，585−590である。この
論文は、例えばコルチゾルへ20ベータ・ヒドロキ
シル基を付加することは、約350の力価だけコル
チコステロイド結合性のグロブリン（CBG）に
対するその親和性定数（Ka）を減少すること、
酢酸コルチゾルへ９アルフア・フルオロ基を付加
することは約200の力価だけKaを減少すること、
およびプロゲステロンへ５ベータ・ヒドロキシル
基を付加することは約100の力価だけKaを減少す
ることを示している。 コルチゾルについての説明はまたステロイド類
プロゲステロン、エストラジオールおよびテスト
ステロンへも当てはまる。プロゲステロンはコル
チゾルと同じ方法でそのＡおよびＢリングを介し
てCBGへ結合することはよく知られている。同
様に、性ホルモン類テストステロンとエストラジ
オールは蛋白質性ホルモン結合グロブリンへ強く
結合し、そしてこの結合はＡおよびＢリングを介
してであると信じられている。 生物学的液体中の天然に存在する結合剤に著し
く結合しない、マトリツクスに結合された被分析
体誘導体を立案するのにこの知識を利用すること
ができる。 次の実施例は本発明を説明する。 実施例 １ 遊離のチロキシンの免疫放射線測定検査 配位子の固相誘導体は、標準的カルボジイミド
法によりアミノ基を介してＬ−チロキシンに連結
された粒子寸法１〜３ミクロンのポリアクリルア
ミドのサクシニル化アミノエチル誘導体であつ
た。検査に用いられた、マトリツクスに結合され
たＴ４の免疫原濃度は１×10-9Mであつた。 全検査操作中用いられた緩衝液は7.8ｇ／の
NaH2PO4・2H2O，9.0ｇ／のNaCl，5.0ｇ／
のBSAおよび１ｇ／のNaN3を含有していた。 用いられた第一の抗体は１：4000の稀釈で用い
られたＴ４への兎（ラビツト）抗血清であつた。
用いられたラベル付きの第二の抗体は、20μCi／
ｇの比放射能に125Iでラベル付けされ、系内で用
いるため100マイクロリツトル当り約100000cpm
に稀釈された、ロバから取つた抗ラベツト全抗体
であつた。 20マイクロリツトルの血清試料を100マイクロ
リツトルのラビツト抗・Ｔ４第一抗体と100マイ
クロリツトルの固相稀釈物と混合し、この混合物
を37゜で１時間培養した。次いで500マイクロリツ
トルの緩衝液を加へ、反応混合物を遠心分離して
上澄液を傾瀉した。100マイクロリツトルの抗・
ラビツト125Iラベル付き第二抗体の添加に先立ち
この洗浄工程を反復した。反応混合物を更に半時
間37℃で培養し、二回の洗浄工程を反復した。次
いで沈澱物の放射能を測定した。
結合された形態および非結合形態即ち遊離形態の
両方の形態を取つて生物学的液体中に存在し、か
つ遊離形態と結合形態が互いに平衡状態にある有
機物質または被分析体の遊離部分の検査に関す
る。上記蛋白質または他の結合性物質を以下天然
結合剤と称する。 血液のような生物学的液体中において遊離形態
と蛋白質に結合された形態の両方の形態で一緒に
見出されうる大部分の生理学的活性物質について
は、これら物質に関連する生理学的応答を制御で
き、従つて遊離（即ち非結合）および蛋白質に結
合された両方の物質を含む全物質の濃度よりも臨
床的に有意であることができるのは遊離形態の濃
度であると一般に考えられている。 ヨーロツパ特許明細書第26103号はこの種類の
検査方法を記載している。この方法は被分析体と
それのラベル付き誘導体とを、被分析体のための
特異結合剤との反応について競争させることを含
む。次に特異結合剤に結合されてしまつた被分析
体のラベル付き誘導体の量を測定し、生物学的液
体の中の遊離の被分析体の濃度を測定するために
その測定値を用いる。ラベル付きの誘導体および
用いられる特異結合剤の量は前記の平衡に実質的
に影響するには不十分である。また、被分析体の
ラベル付きの誘導体は生物学的液体中の天然結合
剤と実質的に非反応性であるように選ばれる。 前記ヨーロツパ特許明細書第26103号の方法は
ラベル付き種（スペシーズ）が被分析体の一変種
である競争免疫検査に関する。これに対し、本発
明はラベル付きの種が被分析体に対する抗体であ
る検査法に関する。この点につき本発明の検査法
は一部位免疫測定検査法とより密接に関係してい
る。 三種類の検査法は次のように要約することがで
きる： 典型的な競争免疫検査法においては、反応剤
は被分析体（抗原）、ラベル（たとえば放射性
原子）を付けられた被分析体の一変種、および
加えられた特異結合剤（被分析体に対する抗
体）である。用いられる特異結合剤の量はすべ
ての被分析体とそのラベル付き変種と反応する
には不十分である。被分析体とそのラベル付き
変種は特異結合剤との反応に競争して、検査試
料中の被分析体の濃度に依存する割合でそれと
結合する。次いで被分析体のラベル付き変種の
結合された部分は非結合部分から分離される。
この目的のために、特異結合剤は例えば固体粒
子の上または検査管の壁の上の被覆として提供
されてもよい。特異結合剤に結合される被分析
体のラベル付き変種の量は検査試料中の被分析
体の濃度に反比例する。 典型的一部位免疫測定検査法においては、反
応剤は被分析体（抗原）、被分析体のマトリツ
クス結合変種、および被分析体に対する特異結
合剤（抗体）である。用いられる特異結合剤の
量は検査試料中のすべての被分析体と反応する
に少なくとも十分である。）とは異なり、そ
れはラベル（例えば放射性原子）を付けられて
いる特異結合剤である。検査試料の被分析体は
ラベル付きの特異結合剤と反応する。次いで、
マトリツクス結合された被分析体の十分な量
が、過剰のラベル付き変種結合剤と反応するよ
う加えられる。次いで、マトリツクス結合され
た被分析体に結合されたラベル付き特異結合剤
の部分はそのように結合されていない部分から
分離される。マトリツクス結合された被分析体
に結合される特異結合剤の量は検査試料中の被
分析体の濃度に反比例する。免疫測定検査法は
1974年のBritish Medical Bulletin（44〜49ペ
ージ）の論文の主題である。 前記の）と）の中間の免疫検査法が発表
された。Journal of Steroid Biochemistry，
11，1597−1600およびFEBS Letters，96，２
（1978年12月）、298−300を見よ。反応剤は免疫
測定検査法）におけるように、被分析体（抗
原）、被分析体のマトリツクス結合変種および
被分析体のためのラベル付き特異結合剤（抗
体）である。この方法は免疫検査）における
ように、検査試料中の被分析体とそのマトリツ
クス結合変種とを、ラベル付き特異結合剤と反
応について競争せしめ、かつ検査試料中の被分
析体全部の濃度に依存する割合でそれに結合さ
れるようにすることである。 特異結合剤がラベルを付けられている検査方
法は、被分析体の一変種がラベルを付けられて
いる検査法とは異なり、かつある環境において
はそれよりも良好であることが認められてい
る。例えば、それはある環境においては抗原よ
りも抗体にラベルを付ける方がより容易であ
る。特異結合剤がラベル付けされる検査法の実
用的開発は、十分な純度のラベル付き抗体を提
供することの困難のために遅延していた。モノ
クローナル抗体の開発と共に、この困難は克服
されつつある、そしてそのような検査法は未来
においてますます重要となることが期待されて
いる。 本発明は被分析体のためのラベル付き特異結合
剤を用いる）類における検査法を提供するもの
であり、この検査法は一つまたはそれ以上の天然
結合剤に結合された被分析体の一部分と平衡して
いる生物学的液体中に存在する被分析体の遊離部
分を測定するよう適合されたものである。 生物学的液体中の被分析体分子の与えられた集
団において、被分析体分子の幾らかが天然結合剤
または存在する他の結合剤に結合されることが判
るであろう。これらの被分析体分子をここでは被
分析体の結合部分と称する。他の被分析体分子は
結合されない、以後これらを被分析体の遊離部分
と称する。 本発明は下記の諸工程により生物学的液体中の
被分析体の遊離部分の濃度の測定方法を提供する
（ただし被分析体は被分析体および被分析体に対
する抗体とよりなる特異結合対の一員であり、被
分析体の上記遊離部分は、被分析体に対する一つ
またはそれ以上の天然結合剤に結合された被分析
体の一部分も含有する生物学的液体中に存在し、
被分析体の結合部分と遊離部分は互いに平衡して
いる）： ａ 生物学的液体の試料と、被分析体に対するラ
ベル付き抗体のある量と、被分析体の誘導体と
で混合物を形成する工程（ただし被分析体に対
する上記ラベル付き抗体の量は上記平衡に実質
的に影響するには不十分であり、かつ被分析体
の上記誘導体は上記天然結合剤と実質的に非反
応性である）、 ｂ 試料中に存在する被分析体の遊離部分の濃度
に依存する割合で被分析体の遊離部分とその誘
導体が被分析体に対するラベル付き抗体に結合
されるようになり得るある時間の間、上記混合
物を保つ工程、 ｃ 被分析体の誘導体に結合された被分析体に対
する上記ラベル付き抗体の量および／または被
分析体の誘導体に結合されていない被分析体に
対する上記ラベル付き抗体の量を測定する工
程、および ｄ 生物学的液体中の遊離の被分析体の濃度を測
定するため上記測定値を用いる工程。 被分析体の性質については、本発明の方法は一
般に適用しうるものである。本発明方法を適用し
得る被分析体の種類の例には、ホルモン、生化学
的伝達体、ステロイド、医薬品、医薬品代謝産
物、ポリペプチド、蛋白質、ビタミン、腫瘍抗
原、毒素、アルカロイドおよび単、二、および多
糖類がある。 被分析体は特異結合対の一員である。 被分析体の遊離部分は生物学的液体中で天然結
合剤に結合している被分析体の部分と平衡してい
る。従つて、もし少量の遊離被分析体が系から除
去されると（たとえばその被分析体に対する抗体
に結合されることにより）、そのとき対応する少
量の被分析体が、平衡を回復するように、生物学
的液体中の天然結合剤によつて遊離せしめられ
る。しかもこの工程は一般に検査に要する時間よ
りも少なくかついかなる場合においても検査に要
する時間よりも実質的に大きくない時間内におい
て生起する。 被分析体に対する抗体（以下特異結合剤とも称
する）のラベル付き変種が利用される。上述のよ
うに、ラベル付き特異結合剤は被分析体に対する
抗体である。免疫検査法または免疫測定検査法に
おいて用いられる任意のラベルでそれはラベル付
きされておつてもよい。ラベルの最も重要な群は
放射性原子、酵素または酵素系の成分、および化
学発光及び螢光基である。酵素検査法は信号を発
する二つまたはそれ以上の成分、たとえば酵素と
その基質使用を含み、そして特異結合剤はこれら
成分の一つまたはそれ以上によつてラベル付けさ
れたものであつてもよい。最も普通の場合、特異
結合剤は少なくとも一つの放射性原子、好ましく
はガンマ線を発するもの、によつてラベル付けら
れたものである。抗体および他の特異結合剤にラ
ベルを付ける技術は当業者に良く知られているか
らここでは記載しない。 この明細書において用いられる「ラベル付き」
なる言葉はいくらか説明を要する。この言葉は前
述の狭い意味において用いられるばかりでなく、
いくらか広い意味においても用いられる。本発明
の方法のａ）およびｂ）工程を行なう一つの方法
は次の工程によつて行なわれる： 生物学的液体の試料と、被分析体のための特
異結合剤のある量と、被分析体の誘導体との混
合体を形成する工程（ただし上記特異結合剤の
量は上記平衡に実質的に影響するには不十分で
あり、被分析体の上記誘導体は上記天然結合剤
と実質的に非反応性である）、 被分析体の遊離部分とその誘導体が、試料中
に存在する被分析体の遊離部分の濃度に依存す
る割合で特異結合剤に結合するようになり得る
ある時間の間、上記混合物を保つ工程、 形成された被分析体誘導体／特異結合剤の複
合体を反応混合物の残りから分離する工程、 上記特異結合剤のための抗体（または他の特
異結合剤）の過剰と共に前記複合体を培養する
工程（ただし上記抗体は一つのマーカー原子ま
たは基でラベル付けされている）、および 複合体に結合されていない抗体を除くために
複合体を洗う工程。 本発明方法のこの実施態様において、特異結合
剤は、結合目的のためにラベル付けされた抗体に
よつて）工程において認められたその分子部分
により最初から「ラベル付け」されていると見な
される。 ラベル付き特異結合剤の、被分析体に対する、
および被分析体誘導体に対する親和性は本発明に
よる検査法を最適化する上において一つの重要な
因子であることが判つた。親和性は被分析体への
結合に関する解離定数によつて表わすのが好都合
である。この解離定数は被分析体／特異結合剤の
複合体の濃度で割られた遊離特異結合剤濃度を掛
けた遊離の被分析体の濃度として定義される。本
発明の方法において、用いられたラベル付き特異
結合剤の解離定数は、検査試料中の遊離被分析体
濃度よりも約20倍、好ましくは10倍多いか少ない
値以内であることが望ましい。もし親和性が低過
ぎると、検査感度は低下する。もし高過ぎると、
検査は実際において見出される濃度以下の遊離被
分析体濃度において最高感度を有す。被分析体お
よび被分析体誘導体に対するラベル付き特異結合
剤の親和性が非常に異なつているならば、これら
の限定は全く同一の方法では当てはまらない。 検査試料中の遊離の被分析体の濃度が、たとえ
ばチロキシンの場合のように低いときには、ラベ
ル付き特異結合剤の解離定数は対応的に低くある
べきである。このことは、被分析体に対する高い
親和性を持つている特異結合剤の使用を必要とす
る。 抗血清は通常は抗原（被分析体）に対する異な
つた親和性を有する抗体の混合物である。在来の
競争免疫検査（たとえば在来の放射線免疫検査）
においては、優勢であるのは混合物中の高親和性
抗体の効果であり、低親和性抗体の大量の存在は
有害ではない。抗体がラベルを付けられている本
発明の方法においては、低親和性の抗体の大量の
存在は有害であり、平坦なドーズ応答曲線をもた
らす。それ故、本発明の方法においては適当な親
和性を有し、かつ不適当な（一般に低い）親和性
を有する抗体と混合されていない抗体を用いるこ
とが好ましい。モノクローナル抗体が好ましい。 被分析体に対し望ましい親和性を有する特定の
ラベル付き特異結合剤の使用が決定されると、用
いられるべきラベル付き特異結合剤の量は容易に
決定される。もしあまり少なすぎるラベル付き特
異結合剤を用いると、検査法は、実際に遭遇する
濃度以下の遊離被分析体濃度のある範囲に渉つて
のみ敏感である。同様に、もしあまり多すぎるラ
ベル付き特異結合剤を用いると、検査法は高い遊
離被分析体濃度においてのみ敏感である。 前に述べたように、用いられるラベル付き特異
結合剤の量は、生物学的液体中の被分析体の遊
離／結合平衡に実質的に影響するに不十分でなけ
ればならぬ。もし被分析体に対して十分高い親和
性を有するラベル付き特異結合剤が選ばれるなら
ば、そのときには遊離／結合被分析体平衡に著し
く影響することなく好適量を検査のために用い得
ることが判る。逆に言うと、被分析体の遊離／結
合平衡に実質的に影響することを避けるように、
少量のラベル付き特異結合剤を使用することの必
要は、被分析体に対し高い親和性を有するラベル
付き特異結合剤の使用を命令する要因の一つであ
る（しかし唯一の要因ではない）。 被分析体の誘導体は、ラベル付き特異結合剤と
の反応に被分析体と競争するために用いる。被分
析体のこの誘導体は、生物学的液体の中で被分析
体のための天然結合剤と実質的に非反応性である
ことが必要である。もしかなりの反応が起こるな
らば、生物学的液体中における被分析体の遊離／
結合平衡は、遊離の被分析体の濃度の真の指示を
検査が与えないような程度まで、乱されるであろ
う。その上、被分析体誘導体のある割合はラベル
付き特異結合剤との反応のため遊離の被分析体と
競争するのに役立たないであろう、そしてこの割
合は検査されている生物学的液体の特定の試料中
の天然結合剤の量と種類によつて決るであろう。 被分析体の誘導体は、被分析体に結合されてし
まつたラベル付き特異結合剤を迅速かつ容易に測
定させ得る性質を持つている（この目的のため
に、被分析体に結合されていないすべてのラベル
付き反応剤は被分析体の誘導体に結合されるよう
になるという仮定をしている）。これに関連して
二種類の検査法がある。 均質検査法。これらにおいては、被分析体の
誘導体に結合されたラベル付き特異結合剤の部
分は、ラベルによつて発せられた信号の測定に
先立つてそのように結合されていないラベル付
き特異結合剤の部分から分離されない。このこ
とは実用的であり、かつ酵素、化学発光および
螢光検査系には有利である。しかし、被分析体
の誘導体に結合されているラベル付き特異結合
剤のラベルによつて発せられた信号が、被分析
体に結合されたラベル付き特異結合剤のラベル
によつて発せられた信号とはある点で異なるこ
とが必要である。それ故、この場合、被分析体
の誘導体はそれに結合されるようになるラベル
付き特異結合剤の部分によつて発せられる信号
を改変するように選ばれなければならない。 不均質検査法。これらにおいては、被分析体
の誘導体に結合されたラベル付き特異結合剤の
部分は、一つまたは他の部分によつて発せられ
た信号の測定に先立ち被分析体に結合されたラ
ベル付き特異結合剤の部分から分離される。放
射線検査系は通常は不均質であり、その他の検
査系もまたそうであろう。この場合、被分析体
の誘導体は一つの分離手段として役立つ。それ
故、被分析体の誘導体は固相においても、ある
いは液体から固相にすでに移つた形態において
も、一般に用いられる。 不均質検査法のため、被分析体の誘導体の要件
は次の如く要約することができる。ａ ラベル付
き特異結合剤との反応後、それは液体の検査媒
質から容易に分離できなければならない。 ｂ それはラベル付き特異結合剤と反応しなけれ
ばならない、そして ｃ それは生物学的液体中において被分析体のた
めの天然結合剤と実質的に非反応性でなければ
ならない。 被分析体の誘導体が、ラベル付き特異結合剤と
反応後液体の検査媒質から容易に分離しうるとい
う性質ａは次のような種々な方法で達成される。 被分析体は、たとえば固形粒子の形で、また
は分析管それ自体の形でのマトリツクスに結合
されていてもよい。その場合、分離は遠心法ま
たは単に傾瀉洗条によつて容易に達成される。 被分析体誘導体は異なるハプテンまたは抗原
を含有してもよい。被分析体のための天然結合
剤に対して非反応性であるこの異なる抗原に対
する抗体は所望の分離を達成するためマトリツ
クスに結合された形またはその他の形で用いる
ことができる。 被分析体誘導体はキレート剤を含有していて
もよく、あるいは溶液から容易に沈澱されるか
またはイオン交換樹脂のような吸着剤に結合さ
れているかまたは有機溶剤で抽出される他の化
学的に反応性ある種を含有していてもよい。 被分析体誘導体はビオチンを含有してもよ
い。この場合、分離はたとえばマトリツクスに
結合された形でアビジンまたはストレプトアビ
ジンを用いて達成される。 被分析体は被分析体の誘導体を形成するためあ
る点で改変されることは明らかである。この改変
は化学的改変であつてもよい、あるいは被分析体
をマトリツクスに結合る量よりも多くない量であ
つてもよい。しかし、改変は被分析体のその特異
結合剤に対する天然の親和性を破壊してはならな
い、そしてこのことは生物学的液体中に天然の結
合剤が存在する場合においてもそうでなければな
らない。このことを考えに入れて、特殊薬剤によ
る結合の目的のため認識されない被分析体分子の
ある部分において、被分析体の改変または結合は
通常実施すべきである。被分析体は固体マトリツ
クスに結合される際その特異結合剤に対する親和
性を失なうという可能性もある。この問題は被分
析体とマトリツクスとの間に長い架橋を作ること
によつて避けることができる。 被分析体の誘導体が被分析体のための天然結合
剤と実質的に非反応性であるという性質ｃ）もま
た種々な方法で達成される： マトリツクスへの被分析体の結合は、天然結
合剤による結合のため認識される被分析体分子
のある部分を介して行なわれてもよい。 被分析体の改変は天然結合剤による結合のた
め認識される被分析体分子のある部分で行なわ
れてもよい。 被分析体またはその誘導体を担持するマトリ
ツクスの表面は天然結合剤の作用を退けるかさ
もなくば妨げる基の付着によつて改変されても
よい。 蛋白質結合部位の性質によつて、被分析体と
マトリツクスとの間の架橋は、被分析体がマト
リツクスへの接近によつて保護されるほど短か
いように整えられてもよい（しかし、架橋は被
分析体がラベル付き特異結合剤と反応できるに
十分な長さである）。 この特長の組み合せを有する被分析体誘導体の
選択は被分析体の性質によつて異なる。被分析体
がチロイドホルモンまたはステロイドであるとき
の選択に影響する要因は以下に論議する。 用いられる被分析体誘導体の量はラベル付き特
異結合剤の量に関係する。もしラベル付き特異結
合剤の濃度に対する被分析体誘導体の濃度のモル
比が非常に大きいときには、被分析体誘導体に結
合されたラベルの割合は常に100％に近い。従つ
て、もし比率が非常に小さいときには、割合は常
に０％に近い。モル比は約１から50までの範囲
内、好ましくは約10であることが望ましい。 培養の時間と温度、および検査媒質のPHを含
む。本発明方法実施のための好適な条件は被分析
体のための従来の検査法の知識から容易に決定で
きる。反応剤は種々な方法で混合することができ
る。即ち ラベル付き特異結合剤と被分析体誘導体は検
査試料へ同時にまたは順次に加えられる。それ
により遊離の被分析体と被分析体誘導体はラベ
ル付き特異結合剤との反応のために競争する。 ラベル付き特異結合剤は被分析体誘導体に結
合された形で検査試料へ加える。ラベル付き特
異結合剤のうちのいくらかは複合体より遊離し
て遊離の被分析体に結合するようになる。 上に述べたように、ラベル付き特異結合剤は被
分析体に対する抗体である。抗体は二価であるこ
とが知られている。ここで一つの問題が起こるの
でないかと考えられよう、何故なら抗体の分子は
被分析体の分子および被分析体誘導体の分子の両
方と反応するかも知れないからである。もしこれ
が大きい程度に起こるとすれば、これは検査の感
度を低下するであろう。しかし、すべての一部位
免疫測定検査法に理論的に共通であるこの問題は
実際には著しく程度に起るようには見えない。こ
の問題は、もし必要ならば、たとえば抗体を二つ
の小さい一価の分子（例えばFab断片）に分断し
て抗体を一価にすることによつて避けることがで
きる。 本発明の方法は主として検査への一つの平衡到
達法として意図されている。しかし、ある種の反
応は平衡に達するのにかなり遅い、特に被分析体
が大きい分子である場合、および／または被分析
体誘導体が不溶性マトリツクスに結合されている
場合にはそうである。そのような場合、この方法
は一つの動力学的または非平衡到達法に適応させ
ることができる。 不均質検査法においては、被分析体誘導体に結
合されたラベル付き特異結合剤の部分の、被分析
体に結合された部分からの分離は、液相からの固
体の分離を通常包含している、そしてこれは従来
の手段、例えば遠心分離によつて行うことができ
る。結合された部分および／または結合されてい
ない部分によつて発せられる信号の測定もまた在
来手段で行なうことができる。 平衡状態においてラベル付き特異結合剤とその
他の場所との間における被分析体誘導体の分布
は、存在する天然結合剤とラベル付き特異結合剤
の量により、被分析体とその誘導体に対するそれ
らの親和性定数により、そして存在する被分析体
とその誘導体の量により決定される。ラベル付き
特異結合剤に結合された被分析体誘導体の量に関
する知識およびその他の関連性のあるデータから
遊離した形の被分析体の量を計算することは理論
的には可能であろうが、これは実施可能な方法で
はない、そして標準的検査法、即ち「ドーズ応答
曲線」または「標準曲線」の使用に頼らねばなら
ない。この方法においては、この方法の所要の適
用範囲を測る、知られた遊離の被分析体の含有量
（たとえば平衡透析によつて測定された）の、多
数の標準血清がこの方法において測定される。結
果をグラフ上にプロツトし、未知の試料はこの曲
線から読み取る。試料、ラベル付き特異結合剤お
よび被分析体誘導体の実際の量は、検査法の所望
の適用範囲に渉る適切な傾斜の（従つて適切な検
査感度の）ドーズ応答曲線を与えるように最適化
する。検査を最適化する方法は、放射線免疫検査
および関連の方法を実施する人々にはよく知られ
た方法であり、以下に記載するような反復コンピ
ユーター法を用いて行なうことができる。 生物学的液体中で遊離形と結合形の両方におい
て見出される多くの被分析体では、与えられた被
分析体のための天然結合剤の数は二つまたはそれ
以上である。蛋白質の二つまたはそれ以上の結合
が可逆的である場合、遊離の被分析体、結合され
てない天然結合剤および天然結合剤のそれぞれに
結合された被分析体の間の化学的平衡は、複雑で
ありかつ相互に影響し合う。質量作用の法則はこ
の全体の平衡の成分部分を記載する便利な方法を
提供する。これらはまた完全な複雑平衡の完全な
説明を確立するに用いることができる。 各天然結合剤（全濃度〔Pj〕）においては、遊
離の被分析体〔F1〕、結合された被分析体〔B1j〕
および結合されていない蛋白質（〔Pj〕−〔B1j〕）
の間に、次のように表わし得る一つの平衡定数
K1jを有する一つの平衡が成立する： K1j＝〔B1j〕／〔F1〕（〔Pj〕−〔B1j〕） 遊離の被分析体が、ｎ個の天然結合剤の各々に
結合している被分析体と共存する一般の場合、遊
離形および結合形は次のように全被分析体〔T1〕
と関係している： 〔T1〕＝〔F1〕＋j=o 〓j=1 〔B1j〕 上の二つの式を用いると、遊離の被分析体と被
分析体の種々な結合形との間の完全な平衡は各天
然結合剤の全濃度、被分析体と各天然結合剤との
平衡定数および被分析体の全濃度によつて表わす
ことができる： 全被分析体〔T1〕＝〔F1〕＋j=o 〓j=1 〔K1j〔Pj〕〔F1〕／１＋K1j〔F1〕〕 加算列における各ｊ番目の項はｊ番目の蛋白質
に結合している被分析体の濃度を表わす。 本発明においてはこれら技術は平衡状態におけ
る天然結合剤とラベル付き特異結合剤に対する被
分析体と被分析誘導体の両者の結合を表わすよう
拡大することができる。 ラベル付き特異結合剤が被分析体と被分析体誘
導体の両方に対する特異の抗体であることは（そ
の濃度は〔P(o+1)〕である）望ましいが必ずしも
必要ではない。ラベル付き特異結合剤についての
被分析体誘導体の平衡定数K2(o+1)は特異結合剤に
ついての被分析体の平衡定数K1(o+1)）と同じであ
つてもよいが、これがそうであることは必ずしも
常に必要ではない。もし遊離の被分析体誘導体を
〔F2〕で表わすとすれば、天然結合剤とラベル付
き特異結合剤の間の被分析体の分布は次式によつ
て与えられる： 〔T1〕＝〔F1〕＋j=o 〓 〓j=1 〔K1j〔Pj〕〔F1〕／１＋K1j〔F1〕〕＋〔K1(o+1)〔
P(o+1)〕〔F1〕／１＋K1(o+1)〔F1〕＋K2(o+1)〔F2〕〕
(1) 被分析体誘導体（全濃度〔T2〕が天然結合剤
に対して残余の結合力を持たない場合、ラベル付
き特異結合剤の遊離形と結合形の間の被分析体の
分布は次のようである： 〔T2〕＝〔F2〕＋〔K2(o+1)〔P(o+1)〔F2〕／１＋K1(
o+1)〔F1〕＋K2(o+1)〔F2〕〕(2) もし天然結合剤とラベル付き特異結合剤の平衡
定数が被分析体誘導体、天然結合剤およびラベル
付き特異結合剤の全濃度と共に知られているなら
ば、概算〔F1〕と〔F2〕を得るべく同時に式(1)
と(2)を解くことにより、検査中平衡状態において
被分析体誘導体に結合しているラベル付き特異結
合剤の量を概算することが可能であり、〔F1〕と
〔F2〕はそのように結合しているラベル付き特異
結合剤の直接概算を得べく式(2)の中で用いられ
る。これらの計算は数値解析を行なう人々にはよ
く知られた反復コンピユーター法を用いて都合よ
く行なうことができる。 検査中の被分析体誘導体は天然結合剤に非結合
性であることが望ましいが必ずしもそうでなくて
もよい。被分析体誘導体の弱い残留結合体が天然
結合剤のいずれかに対して生じた場合（平衡定数
K2j）、検査中平衡にある遊離形と種々な結合形
の間における被分析体誘導体の分布は次のとおり
である： 〔T2〕＝〔F2〕＋〔K2(o+1)〔P(o+1)〕〔F2〕／１＋K1(
o+1)〔F1〕＋K2(o+2)〔F2〕〕＋j=o 〓j=1 〔Kj〔Pj〕〔F2〕〕 (3) 加算における各ｊ番目の項はｊ番目の蛋白質に
対する被分析体誘導体の弱い残留結合を表わす。 式(3)は被分析体誘導体に結合されたラベル付き
特異結合剤の量を概算するに用いるときすべての
点において式(2)に入れ換わる。 これら計算は本発明の利用する検査を最適化す
るに特に有用であり、特に、要求される被分析体
誘導体とラベル付き特異結合剤の両者の品質と量
を決定する上において有用である。 上に述べたコンピユーター計算法を用いること
により、ラベル付き特異結合剤の平衡定数の概算
値と被分析体誘導体とラベル付き特異結合剤の両
者の濃度を変えることにより、被分析体の遊離／
結合平衡のわずかな変化；適当な傾斜のドーズ応
答曲線（従つて適当な検査感度）；および天然結
合剤に対する被分析体誘導体の弱い残留結合より
起こる測定された遊離の被分析体の概算の無視し
得るひずみ；と両立し得るこれらすべての最適範
囲を決定することが可能である。三つの特異被分
析体についてのコンピユーター計算の結果は実施
例２，３および４に示す。 この項においては、チロイドホルモン類につい
て本発明によつて放射線検査を計画する上におい
て、特にマトリツクスに結合された被分析体誘導
体の構造を含む、要因のいくつかを論ずる。これ
らは次の式を有す： Ｘはチロキシン（Ｔ４）においてはＩである。 Ｘはトリ−ヨードチロニン（Ｔ３）においては
Ｈである。 Ｔ４は三つの天然に存在するＴ４を結合する蛋
白質、即ちチロキシンを結合するグロブリン
（TBG）、チロキシンを結合するプレアルブミン
（TBPA）およびアルブミン（Ａ１ｂ）に大量に
（99.98％）結合されて人間の血液中で運ばれてい
る。これら各々に結合されているＴ４の百分率は
それぞれ約70％、20〜25％および５〜10％であ
る。この特定の検査のためのマトリツクス結合さ
れたＴ４を設計するに当り、検査中のTBG，
TBPAおよびＡ１ｂへの誘導体の結合はゼロか
または検査に用いられるラベル付き特異結合剤へ
の誘導体への結合よりも非常に少ないことが重要
である。 たとえばヨーロツパ特許明細書第26103号から、
天然結合剤へのＴ４の結合は、Ｔ４分子のアミノ
酸末端のアミノ基およびカルボン酸基に非常に関
係していることが知られている。これらの基のい
ずれかまたは両方を除かれたか、またはそれらが
普通の方法でイオン化することを妨げるよう化学
的に改変されたか、または大きな化学基の付着に
よつて改変されたＴ４誘導体の場合、天然結合剤
への誘導体の結合はＴ４よりも実質的に少ない、
一方、Ｔ４分子のアミノ酸末端を介して牛の血清
アルブミンのような大きな蛋白質に連結したその
ような誘導体よりなる免疫原にまで高められた抗
血清とこれらの誘導体との結合力はしばしばはＴ
４それ自体の結合力に匹敵する。 検査に必要な反応剤の一つはＴ４に対する放射
性原子でラベル付けされた抗体である。Ｔ４それ
自体は免疫原ではないがそれは牛の血清アルブミ
ンと連結して羊や兎の中に抗体を生ずるようこの
形で用いることができる。次いで抗体は精製さ
れ、ヨード125のような放射性原子でラベル付け
する。また別法として、モノクローナル抗体を生
ずるハイブリドーマ技術を用いてもよい。これら
すべての操作の技術は周知であるからここには記
載しない。 必要なもう一つの反応剤はＴ４の誘導体であ
る。これはラベル付き抗体と反応後、液状の検査
媒体から容易に分離し得るものでなければならな
い。この性質は前述の一般説明において述べたよ
うに種々の方法で達成できる： Ｔ４は例えば固体粒子の形または検査管それ
自体の形でのマトリツクスに結合されていても
よい。 Ｔ４は異なつた抗原に結合されていてもよ
い。 Ｔ４はキレート剤、または容易に析出される
かあるいは水溶液から除去される他の化学的に
反応性ある種に結合されていてもよい。 このＴ４誘導体はラベル付きのＴ４抗体に強く
結合することもまた必要である。Ｔ４抗体は結合
の目的でＴ４分子（前記したような）の左手端を
認識するから、Ｔ４は例えばマトリツクスに分子
の右手端の何かの基（例えばカルボン酸またはア
ミノ基によつて）結合されるべきである。Ｔ４は
マトリツクスに結合されてしまうと免疫反応性を
失なうかも知れない可能性がある。この問題はマ
トリツクスとＴ４の間に長い架橋を作ることによ
つて避けられる。 Ｔ４誘導体の第三の必要条件は生物学的液体中
で天然結合剤（特にTBGとTBPA）と実質的に
非反応性であるべきことである。この性質は種々
な方法で達成される： ａ TBGとTBPAは結合の目的でＴ４分子のア
ミノ酸末端を主として認識することは知られて
いる。それ故、Ｔ４へそのカルボン酸またはア
ミノ基を介してマトリツクスを結合するために
はこれら結合剤の反応性を抑制することで十分
であろう。そのような材料は発表されており
（Archives of Biochemistry and Biophysics，
135，304−310（1969））、商業的に入手可能であ
る。 Ｔ４はいかなる場合についてもこれらの基の
うちの一つを介して普通結合されているだろう
が、ｂ）とｃ）において述べるように天然結合
剤との反応を抑制するために更に別の工程を取
る必要がある。 ｂ Ｔ４誘導体は次の方法の一つまたはそれ以上
を用いてＴ４の構造を改変することによつて作
ることができる： １ Ｔ４のアラニン側鎖のカルボン酸と末端ア
ミノ基の電荷を改変する。 ２ 末端のカルボン酸基またはアミノ基のいず
れかまたは両者に嵩高な基を加える。 ３ 天然に存在するＬ−配置ではなくＤ−配置
を有するＴ４の誘導体を作る。 ヨーロツパ特許明細書第26103号はTBGと
TBPAへの結合を抑制するよう改変されたＴ
４誘導体の一般論と特定の実施例を記載してい
る。 ｃ Ｔ４またはＴ４の誘導体を持つているマトリ
ツクスの表面はTBG，TBPAおよびＡ１ｂを
退ける基の付着によつて改変され得るが、Ｔ４
またはＴ４誘導体へ抗体の適切な結合をするこ
とを許容する。 上述したのと同様な考えは他の被分析体の検査
のための反応剤を立案するのに用いることができ
る。 例えば、トリ−ヨードチロニンはＴ４を結合す
るのと同じ三つの結合性蛋白質（TBG，TBPA
およびＡ１ｂ）に主として結合されて血液流の中
に存在する。 トリ−ヨードチロニンに対するラベル付きの抗
体、およびマトリツクスに結合されたトリ−ヨー
ドチロニン誘導体はＴ４についてのように調製す
ることができる。 ステロイドホルモンコルチゾルは血漿中に遊離
形（８％）で見出され、またグロブリンを結合す
る天然の血漿蛋白質コルチコステロイド（CBG
またはトランスコルチンとしても知られている）
および血清アルブミンに結合（92％）した形で見
出される。コルチゾル（同様にプロゲステロン）
のCBGへの結合はCBG分子の割れ目にはまり込
むと信じられているＡおよびＢリングを介して起
こることが知られている。 ステロイドに関する
重要な一つの論文は、“Steroid−Protein
Interactiens.Influence of Steroid Structure
and Temperature on the Binding of Steroids
to Guinea Pig Corticosteroid−Binding
Globulin”Mickelson K.E.and Westphal U.
Biochemistry1980，19，585−590である。この
論文は、例えばコルチゾルへ20ベータ・ヒドロキ
シル基を付加することは、約350の力価だけコル
チコステロイド結合性のグロブリン（CBG）に
対するその親和性定数（Ka）を減少すること、
酢酸コルチゾルへ９アルフア・フルオロ基を付加
することは約200の力価だけKaを減少すること、
およびプロゲステロンへ５ベータ・ヒドロキシル
基を付加することは約100の力価だけKaを減少す
ることを示している。 コルチゾルについての説明はまたステロイド類
プロゲステロン、エストラジオールおよびテスト
ステロンへも当てはまる。プロゲステロンはコル
チゾルと同じ方法でそのＡおよびＢリングを介し
てCBGへ結合することはよく知られている。同
様に、性ホルモン類テストステロンとエストラジ
オールは蛋白質性ホルモン結合グロブリンへ強く
結合し、そしてこの結合はＡおよびＢリングを介
してであると信じられている。 生物学的液体中の天然に存在する結合剤に著し
く結合しない、マトリツクスに結合された被分析
体誘導体を立案するのにこの知識を利用すること
ができる。 次の実施例は本発明を説明する。 実施例 １ 遊離のチロキシンの免疫放射線測定検査 配位子の固相誘導体は、標準的カルボジイミド
法によりアミノ基を介してＬ−チロキシンに連結
された粒子寸法１〜３ミクロンのポリアクリルア
ミドのサクシニル化アミノエチル誘導体であつ
た。検査に用いられた、マトリツクスに結合され
たＴ４の免疫原濃度は１×10-9Mであつた。 全検査操作中用いられた緩衝液は7.8ｇ／の
NaH2PO4・2H2O，9.0ｇ／のNaCl，5.0ｇ／
のBSAおよび１ｇ／のNaN3を含有していた。 用いられた第一の抗体は１：4000の稀釈で用い
られたＴ４への兎（ラビツト）抗血清であつた。
用いられたラベル付きの第二の抗体は、20μCi／
ｇの比放射能に125Iでラベル付けされ、系内で用
いるため100マイクロリツトル当り約100000cpm
に稀釈された、ロバから取つた抗ラベツト全抗体
であつた。 20マイクロリツトルの血清試料を100マイクロ
リツトルのラビツト抗・Ｔ４第一抗体と100マイ
クロリツトルの固相稀釈物と混合し、この混合物
を37゜で１時間培養した。次いで500マイクロリツ
トルの緩衝液を加へ、反応混合物を遠心分離して
上澄液を傾瀉した。100マイクロリツトルの抗・
ラビツト125Iラベル付き第二抗体の添加に先立ち
この洗浄工程を反復した。反応混合物を更に半時
間37℃で培養し、二回の洗浄工程を反復した。次
いで沈澱物の放射能を測定した。
【表】
前記コンピユーター最適化法を三つのホルモン
の遊離部分の免疫測定検査に適用した。 実施例 ２ チロキシン（Ｔ４）は三つの天然に存在する蛋
白質であるTBG，TBPAおよびアルブミンに大
量に結合されて人間の血液流中で運ばれている。
これらの各々に結合されているＴ４の百分率はそ
れぞれ70％、20〜25％および５〜10％である。遊
離のチロキシンの濃度は典型的には1.7×10-11M
の領域にあり、全Ｔ４の約0.02％である。Ｔ４と
天然結合剤の各々との平衡定数についての興味あ
る論文は： H.P.Prince and D.B.Ramsden，Clinical
Endocrinology，＆，（1977）pp307〜324である。 Ｔ４について１：10-11Mの平衡解離定数を有
するラベル付き抗体が、マトリツクス結合された
Ｔ４誘導体の１×10-11Mの濃度とラベル付き抗
体の１×10-12Mの濃度を用いて遊離チロキシン
の免疫放射線測定検査に好適であることが見出さ
れた。 実施例 ３ テストステロンは二つの天然に存在する蛋白質
SHBG（TeBG）とアルブミンに大量に結合され
て人間の血液流中で運ばれている。成人男性にお
いては、約55％のテストステロンはSHBG
（TeBG）に結合され、43％はアルブミンに結合
され、テストステロンの約２％は遊離形である。
成人女性では約79％のテストステロンはSHBG
（TeBG）に結合され、20％はアルブミンに結合
され、約１％は遊離形である。 遊離のテストステロンの濃度は成人男性では普
通４×10-10Mの領域にあり、成人女性では２×
10-11Mである。テストステロンと天然結合剤の
各々との平衡定数についての興味ある論文は次の
如くである： ａ M.J.Iqbal and M.W.Johnson，J.Steroid
Biochem.，10（1979）pp535−540 ｂ R.G.Smith，P.K.Besch，B.M.Dill and V.
C.Buttram，Fertility and Sterility，31
（1979）pp513−517 テストステロンについて１×10-10の平衡解離
定数を有するラベル付き抗体が、マトリツクス結
合されたテストストロン誘導体の１×10-10Mの
濃度とラベル付き抗体の１×10-11Mの濃度を用
いて遊離テストステロンの免疫放射線測定検査に
好程なことが見出された。 実施例 ４ コルチゾルは天然に存在する二つの蛋白質、ト
ランスコルチン（CBG）とアルブミンに大量に
結合されて人間の血液流中で運ばれている。これ
らに結合されているコルチゾルの百分率はそれぞ
れ77％と15％であり、約８％のコルチゾルは遊離
形で存在する。遊離のコルチゾルの濃度は典型的
には６×10-8Mの領域にあるが日によつてかなり
の変動がある。コルチゾルと天然結合剤の各々と
の平衡定数についてここに興味ある一つの論文が
ある： I.Jerkunica，J.Sophianopoulos and D.
Sgoutas，Clin.Chem，26（1980）pp1734−1737 １×10-7Mの平衡解離定数を有するラベル付き
抗体が、一つのマトリツクス結合されたコルチゾ
ル誘導体の１×10-7Mの濃度と一つのラベル付き
抗体の１×10-8Mの濃度を用いて遊離コルチゾル
の免疫放射線測定検査に好適であることが見出さ
れた。
の遊離部分の免疫測定検査に適用した。 実施例 ２ チロキシン（Ｔ４）は三つの天然に存在する蛋
白質であるTBG，TBPAおよびアルブミンに大
量に結合されて人間の血液流中で運ばれている。
これらの各々に結合されているＴ４の百分率はそ
れぞれ70％、20〜25％および５〜10％である。遊
離のチロキシンの濃度は典型的には1.7×10-11M
の領域にあり、全Ｔ４の約0.02％である。Ｔ４と
天然結合剤の各々との平衡定数についての興味あ
る論文は： H.P.Prince and D.B.Ramsden，Clinical
Endocrinology，＆，（1977）pp307〜324である。 Ｔ４について１：10-11Mの平衡解離定数を有
するラベル付き抗体が、マトリツクス結合された
Ｔ４誘導体の１×10-11Mの濃度とラベル付き抗
体の１×10-12Mの濃度を用いて遊離チロキシン
の免疫放射線測定検査に好適であることが見出さ
れた。 実施例 ３ テストステロンは二つの天然に存在する蛋白質
SHBG（TeBG）とアルブミンに大量に結合され
て人間の血液流中で運ばれている。成人男性にお
いては、約55％のテストステロンはSHBG
（TeBG）に結合され、43％はアルブミンに結合
され、テストステロンの約２％は遊離形である。
成人女性では約79％のテストステロンはSHBG
（TeBG）に結合され、20％はアルブミンに結合
され、約１％は遊離形である。 遊離のテストステロンの濃度は成人男性では普
通４×10-10Mの領域にあり、成人女性では２×
10-11Mである。テストステロンと天然結合剤の
各々との平衡定数についての興味ある論文は次の
如くである： ａ M.J.Iqbal and M.W.Johnson，J.Steroid
Biochem.，10（1979）pp535−540 ｂ R.G.Smith，P.K.Besch，B.M.Dill and V.
C.Buttram，Fertility and Sterility，31
（1979）pp513−517 テストステロンについて１×10-10の平衡解離
定数を有するラベル付き抗体が、マトリツクス結
合されたテストストロン誘導体の１×10-10Mの
濃度とラベル付き抗体の１×10-11Mの濃度を用
いて遊離テストステロンの免疫放射線測定検査に
好程なことが見出された。 実施例 ４ コルチゾルは天然に存在する二つの蛋白質、ト
ランスコルチン（CBG）とアルブミンに大量に
結合されて人間の血液流中で運ばれている。これ
らに結合されているコルチゾルの百分率はそれぞ
れ77％と15％であり、約８％のコルチゾルは遊離
形で存在する。遊離のコルチゾルの濃度は典型的
には６×10-8Mの領域にあるが日によつてかなり
の変動がある。コルチゾルと天然結合剤の各々と
の平衡定数についてここに興味ある一つの論文が
ある： I.Jerkunica，J.Sophianopoulos and D.
Sgoutas，Clin.Chem，26（1980）pp1734−1737 １×10-7Mの平衡解離定数を有するラベル付き
抗体が、一つのマトリツクス結合されたコルチゾ
ル誘導体の１×10-7Mの濃度と一つのラベル付き
抗体の１×10-8Mの濃度を用いて遊離コルチゾル
の免疫放射線測定検査に好適であることが見出さ
れた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被分析体および被分析体に対する抗体とから
なる特異結合対の一員である被分析体の遊離部分
の濃度の測定方法であつて、上記被分析体の遊離
部分は被分析体のための一つまたはそれ以上の天
然結合剤に結合された被分析体の一部分も含有す
る生物学的液体中に存在し、被分析体の結合部分
と遊離部分は互いに平衡している被分析体の遊離
部分の濃度の測定方法において、 ａ 生物学的液体の試料と、被分析体に対するラ
ベル付き抗体のある量と、被分析体の誘導体と
で混合物を形成し、このとき被分析体に対する
上記ラベル付き抗体の量は上記平衡に実質的に
影響するには不十分なものとし、被分析体の上
記誘導体は上記天然結合剤と実質的に非反応性
であるものとし、 ｂ 試料中に存在する被分析体の遊離部分の濃度
に依存する割合で、被分析体の遊離部分とその
誘導体が被分析体に対するラベル付き抗体に結
合されるようになる時間の間、上記混合物を保
ち、 ｃ 被分析体の誘導体に結合された被分析体に対
する上記ラベル付き抗体の量および／または被
分析体の誘導体に結合されていない被分析体に
対する上記ラベル付き抗体の量を測定し、 ｄ 生物学的液体中の遊離の被分析体の濃度を測
定するため上記測定値を用いる ことを特徴とする方法。 ２ 被分析体に対する抗体のためのラベルを放射
性原子、酵素もしくは酵素系の成分、および化学
発光および螢光基からなる群から選択する特許請
求の範囲第１項記載の方法。 ３ 工程ａ）とｂ）を、 生物学的液体の試料と、被分析体に対する抗
体のある量および被分析体の誘導体との混合物
を形成し、被分析体に対する上記抗体の量は上
記平衡に実質的に影響するには不十分なものと
し、被分析体の上記誘導体は上記天然結合剤と
実質的に非反応性であるものとし、 被分析体の遊離部分とその誘導体が、試料中
に存在する被分析体の遊離部分の濃度に依存す
る割合で被分析体に対する抗体に結合されるよ
うになる時間の間、上記混合物を保ち、 形成された被分析体誘導体／被分析体に対す
る抗体の複合体を反応混合物の残りから分離
し、 被分析体に対する上記抗体のため抗体の過剰
と共に上記複合体を培養し、上記抗体はマーカ
ー原子または基でラベル付けされており、およ
び 複合体に結合されていない抗体を除くために
複合体を洗う ことによつて行なう特許請求の範囲第１項または
第２項記載の方法。 ４ 被分析体に対するラベル付き抗体が、被分析
体への結合に関し、検査試料中の遊離被分析体の
濃度よりも約20倍多いかまたは少ない数値以内の
解離定数を有する特許請求の範囲第１項〜第３項
のいずれか一つに記載の方法。 ５ 解離定数が遊離の被分析体の濃度よりも10倍
多いかまたは少ない数値の範囲内にある特許請求
の範囲第４項に記載の方法。 ６ 被分析体誘導体において被分析体は、反応混
合物から容易に分離するため固体マトリツクスに
結合される特許請求の範囲第１項〜第５項のいず
れか一つに記載の方法。 ７ 被分析体誘導体がその抗体に結合しうる形で
別のハプテンまたは抗原を含有する特許請求の範
囲第１項〜第５項のいずれか一つに記載の方法。 ８ 被分析体誘導体において被分析体が、天然結
合剤により結合のため識別される被分析体分子の
一部分を介して固体マトリツクスに結合される特
許請求の範囲第１項〜第７項のいずれか一つに記
載の方法。 ９ 被分析体誘導体がアビジンまたはストレプト
アビジンに結合しうる形でビオチンを含む特許請
求の範囲第１項〜第５項のいずれか一つに記載の
方法。 １０ 被分析体誘導体において被分析体が、天然
結合剤により結合のため識別される被分析体分子
の一部分において改変される特許請求の範囲第１
項〜第７項のいずれか一つに記載の方法。 １１ 被分析体誘導体において被分析体が、天然
結合剤の作用を退けるかさもなくば妨げる基の付
着によつて改変された表面を有する固体マトリツ
クスに結合される特許請求の範囲第１項〜第７項
のいずれか一つに記載の方法。 １２ 被分析体に対するラベル付き抗体濃度に対
する被分析体誘導体濃度のモル比が約１から50ま
での範囲内にある特許請求の範囲第１項〜第１１
項のいずれか一つに記載の方法。 １３ 工程ｄが、遊離の被分析体の種々の知られ
た濃度を含有する一連の標準を測定し、得られた
測定値を遊離被分析体濃度に対する信号のグラフ
上にプロツトし、そして検査試料の遊離被分析体
濃度をグラフから読み取ることによつて行なわれ
る特許請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一
つに記載の方法。 １４ 被分析体がチロキシンまたはコルチゾルで
ある特許請求の範囲第１項〜第１３項のいずれか
一つに記載の方法。 １５ 被分析体がテストステロンである特許請求
の範囲第１項〜第１３項のいずれか一つに記載の
方法。
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|---|---|---|---|
| GB8208273 | 1982-03-22 | ||
| GB8208273 | 1982-03-22 |
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