DE69016267T2 - Festphasen-Test zur Verwendung mit einem physikalischen Entwickler. - Google Patents

Festphasen-Test zur Verwendung mit einem physikalischen Entwickler.

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DE69016267T2
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Description

  • Diese Erfindung betrifft einen Test aufeinen Analyten, insbesondere einen Festphasentest. Bei einem Festphasentest ist ein für wenigstens den zu bestimmenden Liganden (Analyten) spezifisches Bindungsmittel auf einem festen Träger angebracht, wodurch es in diesem Test nicht notwendig ist, ein zusätzliches Mittel zum Auftrennen der in dem Test gebildeten gebundenen und freien Phasen zu verwenden.
  • Auf dem betreffenden Fachgebiet sind Tests auf Analyten bekannt, bei denen der in den Tests verwendete Tracer einen besonderen Metall-Marker, wie z.B. ein kolloidales Metallteilchen, aufweist. So ist beispielsweise bei einem solchen Test ein für den Analyten spezifisches Bindungsmittel auf einem festen Träger angebracht, und der Tracer besteht aus einem für den Analyten spezifischen Liganden, welcher Ligand des Tracers mit einem speziellen Marker aus kolloidalem Metall markiert ist. Bei einem solchen Test ist der Tracer indirekt an das Bindungsmittel aufdem festen Träger gebunden, und zwar dadurch, daß der Analyt an das Bindungsmittel gebunden wird, und daß der Tracer an den Analyten gebunden wird, wodurch das Vorliegen und/oder die Menge des Analyten in einer Probe dadurch bestimmt werden kann, daß man das Vorliegen und/oder die Menge des Tracers aus kolloidalem Metall nachweist, welcher indirekt an das Bindungsmittel auf dem festen Träger gebunden ist. Eine Anzahl solcher Tests ist in der EP-A-158 746 und in der EP-A- 293 947 beschrieben.
  • Das von einem solchen Tracer erzeugte Signal kann dadurch signifikant verbessert werden, daß man den indirekt an die Oberfläche der festen Phase gebundenen Metall-Marker einem Verfahren des sogenannten physikalischen Entwickelns unterwirft.
  • Die auf dem Fachgebiet bekannten physikalischen Entwickler bestehen im allgemeinen aus einer Lösung, welche ein lösliches Metallsalz, wie z.B. Silbernitrat, ein Reduktionsmittel, wie z.B. Hydrochinon, und ein zur Einstellung eines spezifischen pH-Wertes angemessenes Puffersystem enthält.
  • In der EP-A-158 746 ist aufSeite 10, Zeilen 18 bis 32, ein Verfahren zum signifikanten Verbessern des Signals eines aus einem kolloidalen Metall bestehenden Markers dadurch, daß man den indirekt an die Oberfläche eines Blotting-Mediums gebundenen Metall-Marker einem Verfahren des sogenannten physikalischen Entwickelns unterwirft, beschrieben.
  • Im Falle der Anwendung eines physikalischen Entwicklers auf Silberbasis wird die Reduktion der Silberionen zu metallischem Silber an der Oberfläche des Metall-Markers katalysiert, was zu einer spezifischen Ablagerung von metallischem Silber an der Stelle des Metall-Markers führt. Dann katalysieren die so gebildeten Teilchen aus metallischem Silber ihrerseits die Reduktion, wodurch ein autokatalytisches Verfahren geschaffen wird. Die Wirkung einer physikalischen Entwicklung besteht darin, daß das rötliche, optische Goldsignal sich in ein dunkelbraunes bis schwarzes Silbersignal mit einer viel höheren Intensität verwandelt. Die Anwendung dieser nach dem Stande der Technik bekannten Technik unter Verwendung eines physikalischen Entwicklers führt zu einem verbesserten Signal, obgleich eine Anzahl von Nachteilen damit verbunden ist.
  • Eines der Hauptprobleme bei der Verwendung physikalischer Entwickler ist die Löslichkeit der Metallsalze. Es ist in der Tat wohlbekannt, daß Metallionen, wie z.B. Silberionen, mit vielen Gegenionen unlösliche Salze bilden. Abgesehen davon, daß durch diese unlöslichen Salze der Vorrat an verfügbaren Silberionen erschöpft wird, bilden diese unlöslichen Salze auch Kerne, an welchen das Reduktionsverfahren ebenfalls katalysiert wird, was zu einem ernstlich erhöhten Störpegel führt. Außerdem können Silberionen lichtempfindliche Silbersalze, wie z.B. Silberbromid und Silberchlorid bilden, welche unter der Einwirkung von Licht leicht zu metallischem Silber reduziert werden, wodurch ein autokatalytisches Verfahren begonnen wird. Es ist daher unbedingt notwendig, mit äußerst reinen Kontaktoberflächen, z.B. Gefäßen, mit Chemikalien von Analysenreinheit und mit ultrareinem Wasser zu arbeiten. Gewöhnlich ist es auch erforderlich, Mehrfachwaschstufen zwischen der Inkubation mit dem Metall-Tracer und der physikalischen Entwicklung des Markers einzuführen, um in dem Inkubationsmedium vorhandene, unerwünschte Ionen zu entfernen. Alles dies tendiert dahingehend, herkömmliche Tests auf der Basis von physikalisch entwickeltem Metall komplizierter, teurer und fehleranfälliger zu machen.
  • Der Hauptnachteil der herkömmlichen Verfahren liegt in der eigentlichen Natur des physikalischen Entwickelns. Im Falle eines physikalischen Entwicklers aufz.B. Silberbasis reduziert das Reduktionsmictel alle Silberionen mit einer bestimmten Geschwindigkeit. Zur Erzielung optimaler Empfindlichkeit muß das Verstärkungsverfahren dadurch vorzeitig abgebrochen werden, daß man den physikalischen Entwickler aus der den Metall-Marker enthaltenden Phase entfernt, noch bevor die durch Nicht-Marker induzierte Reduktion, die sogenannte "Selbst-Kernbildung", in Erscheinung tritt. Es versteht sich von selbst, daß physikalische Entwickler flexibler und stärker werden, wenn das Verhältnis zwischen der metallspezifischen Reduktion und der Selbst-Kernbildung erhöht werden kann. Bei den traditionellerweise angewendeten Tests kann dieses Verhältnis kaum erhöht werden. Der einzige Parameter, der moduliert werden kann, ist die Gesamtgeschwindigkeit des Verfahrens; die Selbst-Kernbildung läßt sich nur auf Kosten einer langsameren Verstärkung des Metall-Markers hinausschieben. Einer der naheliegendsten Wege, dies zu bewerkstelligen, liegt im Verändern der Konzentration, der Natur oder der Umgebung des Reduktionsmittels. Eine häufig angewendete Methode besteht in der Verwendung von Hydrochinon bei einem pH- Wert unter 4. Die reduzierende Wirkung des Hydrochinons ist in saurer Umgebung stark gehemmt; der Benützer des physikalischen Entwicklers hat daher genügend Zeit, um die Verstärkung des Metall-Markers zu stoppen, bevor die Selbst-Kernbildung zuviel Rauschen verursacht. Säurezugaben sind jedoch in vielen Fällen mit der Natur des Bindens zwischen dem markierten spezifischen Bindungsmittel und der diesem entsprechenden bindungsfähigen Substanz nicht erträglich. Die meisten monoklonalen Antikörper haben nur eine geringe oder eine durchschnittliche Affinität für ihre Antigene bei diesem pH-Wert. außerdem kann kein wirklicher Gewinn an Empfindlichkeit erreicht werden, weil die Verstärkung des Markers in dem gleichen Ausmaß verlangsamt wird, wie die Selbst-Kernbildung verlangsamt wird. In der EP-A- 293 947 ist ein Verfahren zum Verringern der Gesamtgeschwindigkeit des Entwicklungsverfahrens und der Selbst-Kernbildung dadurch, daß man die Metallionen mit einer heterocyclischen Base komplex bindet, wodurch die Geschwindigkeit, mit der dieselben freigesetzt werden, verzögert wird, beschrieben.
  • Es besteht daher ein großer Bedarfnach einer Verbesserung der Empfindlichkeit und der praktischen Durchführbarkeit von Festphasentests, welche aufdem Nachweis von Metallen basieren. Überraschenderweise ist gefunden worden, daß das Verhältnis zwischen dem an den Tracer gebundenen Signal und der Selbst- Kernbildung um ein Mehrfaches erhöht werden kann, wenn die nachstehend beschriebene Vorrichtung verwendet wird, wodurch eine höhere Empfindlichkeit und Geschwindigkeit erreicht werden.
  • Die Fig. 1 zeigt einen Querschnitt durch eine diagnostische Festphasenvorrichtung, welche für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung bestimmt ist.
  • Die Fig. 2 zeigt einen Querschnitt durch eine andere diagnostische Festphasenvorrichtung, welche für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehen ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Testverfahren und auch neue Festphasentestvorrichtungen, welche für die Verwendung mit einem sogenannten physikalischen Entwickler vorgesehen sind.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein neues Testverfahren zum Nachweisen des Vorliegens eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines Tracers, welcher einen Metall-Marker aufweist, geschaffen, bei welchem Verfahren das Signal des Tracers durch Anwendung eines physikalischen Entwicklers verstärkt wird.
  • Der Test wird mit einer Vorrichtung durchgeführt, welche einen Träger für einen Testbereich und ein daran gebundenes, für den nachzuweisenden Analyten spezifisches Bindungsmittel aufweist. Eine absorbierende Schicht steht in Berührung mit dem Träger, welche zur Aufnahme von Flüssigkeiten und von jeglichem, nicht an den Testbereich gebundenem Analyten dient. Der Test umfaßt die Stufen des Führens der flüssigen Probe und des Tracers durch ein poröses Medium und mit geregelter Fließgeschwindigkeit, um dieselben mit dem Testbereich in Berührung zu bringen und um das Binden zwischen dem Analyten und dem Bindungsmittel bzw. zwischen dem Tracer und dem Analyten stattfinden zu lassen, des Führens eines physikalischen Entwicklers durch das poröse Medium, um das von dem Tracer erzeugte Signal zu verstärken, und des Abtrennens der Vorrichtung, damit der Testbereich abgelesen werden kann. Die Poren in dem porösen Medium haben eine Größe zwischen 0,2 und 12 um.
  • In idealer Weise bewirkt man, daß die flüssige Probe und der Tracer zu dem Bindungsmittel aufeine solche Art und Weise fließen, daß die Probe mit dem Bindungsmittel in Kontakt kommt, noch bevor ein wesentlicher Kontakt des Tracers mit entweder der Probe oder dem Bindungsmittel stattgefunden hat. Aufdie Zugabe des Tracers kann eine Waschstufe zum Entfernen von ungebundenem Tracer entweder sofort oder nach einer kurzen Inkubation folgen, welche Inkubation dazu dient, die Empfindlichkeit dadurch zu erhöhen, daß man ein stärkeres Binden zwischen dem Bindungsmittel und dem Tracer zuläßt. In der vorliegenden Vorrichtung sind die Poren in dem porösen Medium genügend groß, um ein Hindurchtreten der flüssigen Probe, des Tracers und des physikalischen Entwicklers zu ermöglichen, sie sind aber ausreichend klein, um ein Hindurchtreten von störenden Substanzen, welche in der flüssigen Probe und in dem physikalischen Entwickler vorhanden sind, zu verhindern.
  • Bei einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das poröse Medium ein getrenntes Filter, und der Testbereich ist auf jener Seite des Trägers angeordnet, welche dem Filter gegenüberliegt. Die absorbierende Schicht steht aufder entgegengesetzten Seite zu jener, aufwelcher der Testbereich angeordnet ist, mit dem Träger in Berührung. Um das Vorliegen des Tracers aufdem Träger nachzuweisen, wird das Filter entfernt, und die Sichtbarkeit des Tracers wird als Maß des Analyten in dem Testbereich aufdem Träger bestimmt. Die letztgenannte steht in direkter Wechselbeziehung mit dem Vorliegen des Analyten in der flüssigen Probe.
  • Bei einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das poröse Medium der Träger, und der Testbereich ist aufjener Seite des Trägers angeordnet, welche mit der absorbierenden Schicht in Berührung steht. Um das Vorliegen des Tracers auf dem Träger nachzuweisen, müssen der Träger und die absorbierende Schicht voneinander getrennt werden, und die absorbierende Schicht voneinander getrennt werden, und die Sichtbarkeit des Tracers wird als Maß des Analyten in dem Testbereich des Trägers bestimmt. Die letztgenannte steht in direkter Wechselbeziehung mit dem Vorliegen des Analyten in der flüssigen Probe.
  • Vorzugsweise hat das poröse Medium Porengrößen von unter 12 um, vorzugsweise von unter 6 um. Die Porengrößen müssen jedoch ausreichen, um ein Hindurchtreten des Tracers zu ermöglichen; die Porengröße sollte daher über 0,2 um, vorzugsweise über 0,4 um sein. Durch eine sorgfältige Auswahl der Porengröße und der Dicke des Filters und/oder Trägers kann nicht nur das Hintergrund-Anfärben im Testbereich signifikant verringert werden, sondern es kann auch die Fließgeschwindigkeit der Reagenzien dahingehend geregelt werden, daß eine gewünschte Empfindlichkeit und eine praktische rasche Testverarbeitung erzielt werden.
  • Dem Fachmann wird klar sein, daß das Bindungsmittel ausreichend fest gebunden werden muß, damit es unter den Testbedingungen aufdem Träger verbleibt. Vorzugsweise ist das Bindungsmittel an den Testbereich in einer Konzentration von wenigstens 10 ug/cm² gebunden. Der bevorzugte Träger ist eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße zwischen 0,2 um und 12 m. In höchstem Maße bevorzugt ist der Träger eine Nitrozellulose mit einer Porengröße zwischen 0,2 und 5 um, insbesondere von etwa 0,45 um.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden durch die vorliegende Erfindung Festphasentestvorrichtungen geschaffen, welche für die Verwendung in den obigen Verfahren bestimmt sind.
  • Die für die Verwendung gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform vorgesehene Vorrichtung hat vorzugsweise, siehe z.B. die Fig. 2, einen Träger 4, welcher eine Oberseite und eine Unterseite sowie einen Testbereich aufseiner Oberseite aufweist. Ein abtrennbares Filter 5 liegt aufder Oberseite des Trägers. An den Testbereich ist ein Bindungsmittel in einer ausreichenden Konzentration gebunden, um das Sichtbarwerden des an den Testbereich gebundenen Tracers unter den Testbedingungen zu ermöglichen. Dem Fachmann wird klar sein, daß das Bindungsmittel genügend fest gebunden sein muß, damit es unter den Testbedingungen aufdem Träger verbleibt. Die bevorzugte Vorrichtung umfaßt weiterhin eine absorbierende Schicht 2, welche in Flüssigkeitsverbindung mit dem Träger 4 und dem Filter 5 steht. Die absorbierende Schicht 2 dient zur Aufnahme von Flüssigkeiten sowie von jeglichem nicht spezifisch an den Testbereich gebundenem Analyten und Tracer. Die absorbierende Schicht 2 kann auch mit dem Träger und dem Filter im Sinne einer Regelung des Fließens der Reagenzien zusammenwirken. In der vorliegenden Vorrichtung hat das Filter 5, aufwelches die flüssige Probe, der Tracer und insbesondere der physikalische Entwickler aufgebracht werden, ausreichend kleine Porengrößen, damit störende Substanzen, welche in der flüssigen Probe und in dem physikalischen Entwickler vorhanden sein können, entfernt werden; und es hat ausreichend große Porengrößen, um das Hindurchtreten von Flüssigkeit sowie von jeglichem Analyten und Tracer zu ermöglichen. Es ist klar, daß der Träger 4 genügend porös sein soll, um das Hindurchtreten von Flüssigkeit sowie von jeglichem nicht spezifisch an den Testbereich gebundenem Analyten und Tracer zu ermöglichen.
  • Die für die Verwendung gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform vorgesehene Vorrichtung hat vorzugsweise, siehe z.B. die Fig. 1, einen Träger 4, welcher eine Oberseite und eine Unterseite sowie einen Testbereich aufseiner Unterseite aufweist. An den Testbereich ist ein Bindungsmittel in einer ausreichenden Konzentration gebunden, um das Sichtbarwerden des an den Testbereich gebundenen Tracers unter den Testbedingungen zu ermöglichen. Die bevorzugte Vorrichtung umfaßt weiterhin eine absorbierende Schicht 2, welche in Flüssigkeitsverbindung mit dem Träger steht. Die absorbierende Schicht 2 dient zur Aufnahme von Flüssigkeiten sowie von jeglichem nicht spezifisch an den Testbereich gebundenem Analyten und Tracer. Die absorbierende Schicht 2 kann auch mit dem Träger 4 im Sinne einer Regelung des Fließens der Reagenzien zusammenwirken. In der vorliegenden Vorrichtung soll der Träger 4, aufwelchen die flüssige Probe, der Tracer und der physikalische Entwickler aufgebracht werden, ausreichend kleine Porengrößen haben, damit störende Substanzen, welche in der flüssigen Probe und insbesondere in dem physikalischen Entwickler vorhanden sind, entfernt werden; und er soll genügend große Porengrößen haben, um das Hindurchtreten von Flüssigkeit sowie von jeglichem, nicht spezifisch an den Testbereich gebundenem Analyten und Tracer zu ermöglichen. Die für die Verwendung gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform vorgesehene Vorrichtung soll derart konstruiert sein, daß der Träger 4 und die absorbierende Schicht 2 voneinander losgelöst werden können, um den Nachweis des an den Testbereich auf der Unterseite des Trägers 4 gebundenen Tracers zu ermöglichen. In idealer Weise sollten die obigen Vorrichtungen Teil eines entsprechenden Behälters 1 sein. Solche Behälter können eine Vielfalt von Formen annehmen, doch sollten sie vorzugsweise ein Mittel 3 zum Auftrennen der Schichten enthalten, damit man den Test ablesen kann. Solche Mittel haben vorzugsweise die Form eines Presspassungsträgers, welcher entweder das Filter, wie in Fig. 2, oder den Träger, wie in Fig. 1, umfaßt, welcher Träger aufseiner Unterseite den Testbereich aufweist.
  • Überraschenderweise führt die Verstärkung des Signals des an den Testbereich gebundenen Tracers mit einem physikalischen Entwickler dann, wenn die Konstruktion der Vorrichtungen wie oben beschrieben geregelt wird, zu einem deutlichen Farbsignal mit vernachlässigbarer Anfärbung des Hintergrundes bei dem Testbereich und um diesen herum. Die oben beschriebene Regelung der Porengrößen und Oberflächen ermöglicht sogar die Erzielung einer sichtbaren Ausgabe der Meßwerte von schwer nachzuweisenden Analyten im Testbereich nach der physikalischen Entwicklung. Die Testvorrichtungen und -verfahren der vorliegenden Erfindung sind praktisch für die Verwendung in jedem beliebigen Testformat und -schema mit spezifischem Binden annehmbar. Die Vorrichtungen und Verfahren sind für die Verwendung sowohl in qualitativen als auch in quantitativen Verfahren geeignet.
  • Das poröse Medium, insbesondere die Filterschicht der ersten bevorzugten Ausführungsform und der Träger der zweiten bevorzugten Ausführungsform, können irgendein poröses Material umfassen, welches befähigt ist, aus den Reagenzien jene Substanzen einzufangen, die nicht der Tracer sind, und auf denen Metallionen während der physikalischen Entwicklung abgelagert werden können. Solche Substanzen umfassen insbesondere Metallkerne und unlösliche Metallsalze, welche in dem Entwickler oder sonstigen flüssigen Reagens vorhanden sind. Bei auf dem Fachgebiet bekannten Vorrichtungen bewirken diese Substanzen häufig das Entstehen eines unannehmbaren Hintergrundrauschens im Testbereich des Trägers.
  • Die Porengröße und die Dicke des porösen Mediums werden vorzugsweise derart geregelt, daß durch das Fließen von Flüssigkeiten durch den Testbereich die erforderliche Empfindlichkeit sowie ein schneller und genauer Test geschaffen werden. Die für das Filter und/oder den Träger ausgewählte Porengröße und die entsprechende Fließgeschwindigkeit hängen von dem erwarteten Bereich für die Analytenkonzentration und von der Bindungsaffinität des Analyten für das Bindungsmittel und/oder den Tracer ab. In dem Maße, wie der erwartete Bereich für die Analytenkonzentration zunimmt, können auch die Porengröße und die Fließgeschwindigkeit zunehmen.
  • Das poröse Medium ist vorzugsweise hinsichtlich seiner Porengröße derart bemessen, daß die Fließgeschwindigkeit des physikalischen Entwicklers durch den Testbereich wenigstens 0,01 ml/min und generell nicht mehr als 60 ml/min beträgt. Eine besonders bevorzugte Fließgeschwindigkeit liegt zwischen 0,5 ml/min und 20 ml/min.
  • Die Auswahl des Materials für die Filterschicht ist nicht kritisch, vorausgesetzt, daß deren Poren genügend groß sind, um es den Bestandteilen in den für den Test aufgebrachten Flüssigkeiten, einschließlich des Tracers und des Analyten, zu ermöglichen, durch die Schicht hindurchzutreten und zu dem Testbereich zu gelangen. Das Filter kann praktischerweise aus einer Bahn eines Faservliesstoffes mit willkürlich ausgerichteten Fasern, wie z.B. aus Bahnen von Nitrozellulose-Faservliesstoffen oder aus Bahnen aus Reyon-Faservliesstoffen, hergestellt sein.
  • Der Träger für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann irgendeiner von jenen sein, die dem Fachmann wohlbekannt sind, vorausgesetzt, daß er genügend porös ist, um es den auf die Vorrichtung aufgebrachten Flüssigkeiten zu ermöglichen, durch den porösen Träger hindurchzutreten und zu der absorbierenden Schicht zu gelangen. Außerdem muß der Träger aus einem Material aufgebaut sein, welches Bestandteile und Chemikalien in der Probe und in den Reagenzien nicht unspezifisch bindet.
  • Innerhalb des Trägers befindet sich der Testbereich, wo das Bindungsmittel fest gebunden ist. Der Testbereich kann sich über die gesamte Oberfläche des Trägers erstrecken oder er kann nur einen Teil des Trägers ausmachen. Vorzugsweise macht der Testbereich nur einen Teil des Trägers aus und ist von einer Hintergrundfläche umgeben, welche frei von Bindungsmittel ist. Dem Fachmann wird jedoch klar sein, daß der Testbereich genügend groß sein sollte, um das Bindungsmittel in einer Konzentration aufnehmen zu können, bei welcher der spezifisch an den Testbereich gebundene Tracer unter den Testbedingungen sichtbar wird. Der Träger und der Testbereich können aus dem gleichen Material oder aus verschiedenen Materialien angefertigt sein. Die sichtbare Wirkung einer positiven Reaktion im Testbereich kann auch dadurch verstärkt werden, daß man ein leicht unterscheidbares Muster benützt. Vorzugsweise ist der Träger eine Nitrozellulosemembran, und der Testbereich ist ein Teil dieser Membran. Der Ausdruck "Nitrozellulose" bezieht sich auf Salpetersäureester von Zellulose, wobei dieselben eine alleinige Nitrozellulose sein können oder ein gemischter Ester von Salpetersäure und einer anderen, bevorzugten Säure sein können. Die Träger, welche aus Zellulose, die entweder mit Salpetersäure allein, oder mit einem Gemisch aus Salpetersäure in einer anderen Säure, wie z.B. Essigsäure, verestert worden ist, ausgebildet sind, werden häufig als Nitrozellulosepapier bezeichnet. Der Träger hat eine mittlere Porengröße, welche größer als die Größe des in dem Tracer verwendeten, teilchenförmigen Markers ist, so daß der Tracer, welcher unter den Testbedingungen nicht gebunden wird, durch den Träger zu der absorbierenden Schicht fließt und in dem Testbereich nicht eingefangen oder unspezifisch gebunden wird. Im allgemeinen sollte die mittlere Porengröße wenigstens 0,2 um, und vorzugsweise wenigstens 0,4 4m, betragen. Im allgemeinen überschreitet die Porengröße 12 um nicht. Andere Arten von Trägern umfassen Whatman 31 ET Chromatography Paper, Nylon 66, wie z.B. Biodyne (Handelsmarke), und PVDF (Polyvinylidenfluorid), wie z.B. Immobilon (Handelsmarke). Hinsichtlich der Auswahl poröser Materialien sei weiterhin auf Electrophoresis (1986), 7, 1-18, und Journal of Immunological Methods (1984), 72, 313-340, verwiesen.
  • Das als Bindungsmittel aufdem Testbereich verwendete Material wird jeweils für die an einem besonderen Test beteiligte Chemie ausgewählt. Vorzugsweise ist das Bindungsmittel eine spezifische Bindungsmittelspezies, welche ein Glied von einem spezifischen Paar von Bindungsmitteln enthält, z.B. ein Antigen oder einen Antikörper. Die Auswahl eines geeigneten Bindungsmittels fällt in den Aufgabenbereich des Fachmannes. In ähnlicher Weise sind die Verfahren zum festen Binden eines Bindungsmittels an einen festen Träger dem Fachmann wohlbekannt. So kann das Bindungsmittel an den Testbereich durch kovalentes oder nicht-kovalentes Binden, direkt oder indirekt gebunden werden. Vorzugsweise wird das Bindungsmittel an dem Testbereich adsorbiert.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Bindungsmittel ein Antikörper, der an den Testbereich durch Adsorption in einer Konzentration von wenigstens 1 ug/cm² fest gebunden ist. Das Bindungsmittel kann in einer Konzentration von wenigstens 10 ug/cm², und vorzugsweise von wenigstens 40 ug/cm², adsorbiert sein. In einigen Fällen kann eine Polyhydroxyverbindung (z.B. Glycerin, Erythrit oder Sorbit) oder ein Zucker (z.B. Glukose oder Saccharose) in einer Bindungsmittel-Über zugslösung enthalten sein, um ein nicht-spezifisches Binden während des Tests zu verhindern. In ähnlicher Weise kann das restliche Bindungsvermögen des Testbereiches und des Trägers durch Behandlung des Testbereiches und des Trägers mit einer oder mehreren Arten von Proteinen, welche sich an die in dem Test verwendeten Materialien nicht spezifisch binden, z.B. Rinderserumalbumin, blockiert werden. Es können auch Netzmittel verwendet werden, um ein richtiges Fließen der Testreagenzien durch den Testbereich zu gewährleisten. Geeignete Netzmittel umfassen Saccharose und normalerweise erhältliche, grenzflächenaktive Mittel, z.B. das nicht-ionische Tween 20 (Sigma Chemicals)
  • Die absorbierende Schicht der Vorrichtung kann aus irgendeinem absorbierenden Material angefertigt werden. Die absorbierende Schicht muß ein Absorptionsvermögen aufweisen, welches ausreicht, um die aufdie Testvorrichtung während des Tests aufgebrachten Flüssigkeiten zu absorbieren. Das absorbierende Material sollte auch eine treibende Kraft schaffen, welche bewirkt, daß auf den Testbereich aufgebrachte Reagenzien in die absorbierende Schicht fließen. Geeignete absorbierende Materialien umfassen absorbierende Zellulosekissen, welche die Fähigkeit besitzen, 3 bis 5 ml an Flüssigkeiten pro g des Kissens zu absorbieren.
  • Geeignete absorbierende Materialien umfassen auch irgendwelche der sogenannten superabsorbierenden Materialien, wie z.B. jene, welche in den Windelprodukten verwendet werden, Zellulose, Zelluloseacetat, Reyon/Baumwolle, mikroporösen Polypropylen-Kunststoff und irgendeine Kombination von Baumwoll-Linters, wie z.B. Grade 470, GB003, GB004 oder S300 von Schleicher und Schuell, wobei die letztgenannte Sorte in höchstem Maße bevorzugt ist.
  • Zur Erzielung einer vernünftigen Verstärkung des an den Testbereich gebundenen Tracers sollte der Test so aufgebaut sein, daß der physikalische Entwickler mit dem gebundenen Tracer während wenigstens 1 Sekunde in Berührung steht, wobei der Kontakt unter normalen Testbedingungen länger als 5 s, und vorzugsweise mehr als 10 s, dauern wird. Die Obergrenze ist bei Verwendung der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung weniger kritisch, weil die durch Nicht-Tracer-Substanzen induzierte Reduktion, die sogenannte "Selbst-Kernbildung", im Testbereich nur nach einer langen Entwicklungszeit in Erscheinung tritt. Beispielsweise wurde im Falle der Verwendung eines auf dem Fachgebiet bekannten, physikalischen Entwicklers bei der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung nach einer 10-minütigen Entwicklungsdauer noch kein scheinbarer Hintergrund bemerkt. Die Entwicklungszeit kann daher ohne weiteres auf bis zu 30 min erhöht werden. In den meisten Fällen kann nach einer Entwicklungsdauer von 1 min eine ausreichende Empfindlichkeit erhalten werden. Unter bevorzugten Testbedingungen wird die optimale Empfindlichkeit nach einer Dauer des physikalischen Entwickelns von 10 bis 30 s erhalten.
  • Der physikalische Entwickler ist eine Lösung, welche ein lösliches Metallsalz und ein Reduktionsmittel enthält, und welche befähigt ist, das von dem Tracer erzeugte Signal zu verbessern. Geeignete physikalische Entwickler sind z.B. in der EP-A- 0 158 746 beschrieben worden.
  • Die Reduktionsmittel für die Verwendung in diesem physikalischen Entwickler sollen irgendein Mittel umfassen, welches Metallionen, vorzugsweise Silber-, Gold-, Platin-, Palladium- oder Thalliumionen, aus einem physikalischen Entwickler in der Nähe einer aktiven Stelle reduziert. Vorzugsweise bilden diese Reduktionsmittel stabile Lösungen mit einem oder mehreren Bestandteilen des physikalischen Entwicklers. Als Reduktionsmittel können besonders 1,2-Dihydroxybenzol, 1,4-Dihydroxybenzol (Hydrochinon), 4-Methylaminophenolsulfat (Metol (Handelsmarke)), 4-Aminophenol, 1,4-Diaminobenzol, 1,2-Diaminobenzol, N- (4-Hydroxyphenyl) glycin, 2,4-Diaminophenol, 1-Phenyl-3 -hydroxypyrazol (Phenidon (Handelsmarke)) oder Gemische hievon erwähnt werden. Als andere Bestandteile (Hilfsmittel) des physikalischen Entwicklers können Puffer, Konservierungsmittel, z.B. Oxidationsinhibitoren oder organische Stabilisatoren, Geschwindigkeitsregulatoren, Bakterizide und dgl., wie z.B. Natriumsulfit, Natriumbisulfit, Natriumcitrat und dgl., erwähnt werden.
  • Der Tracer ist ein mit einem Metallteilchen, vorzugsweise einem aus kolloidalem Gold bestehenden Marker, markierter Ligand, wobei der Ligand des Tracers befähigt ist, direkt oder indirekt an den Analyten gebunden zu werden, der seinerseits an das Bindungsmittel aufdem Träger gebunden ist. Vorzugsweise ist der Ligand ein Glied aus einem spezifischen Paar von Bindungsmitteln, z.B. ein Antigen oder Antikörper.
  • Der Metall-Marker für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Test soll irgendein Teilchen umfassen, welches die Reduktion von Metallionen katalysieren kann, was zu einer Ablagerung der entsprechenden Metallteilchen an der Stelle des Tracers führt. Oft können die so zur Verfügung gestellten Metallteilchen ihrerseits die Reduktion katalysieren, was zu einem autokatalytischen Verfahren führt. Die zu verwendenden Metall-Marker umfassen Metalle, Metallverbindungen oder Polymere, welche gegebenenfalls mit Metallen oder Metallverbindungen überzogen oder imprägniert sind, wobei dieselben jeweils auf ihrer Oberfläche die Reduktion von Metallionen direkt oder indirekt katalysieren können. Als Beispiele solcher Metalle können Gold, Silber, Thallium, Platin, Palladium sowie Kupfer, Nickel und dgl. angeführt werden, wobei Gold bevorzugt wird. Als Beispiele von Metallverbindungen können die den jeweiligen Metallen entsprechenden Komplexe und Sulfide genannt werden. Mit Metallen oder Metallverbindungen überzogene oder imprägnierte Polymere haben ähnliche Eigenschaften wie die Metalle oder Metallverbindungen, doch können die Größe, die Dichte und der Metallgehalt in optimaler Weise miteinander kombiniert werden. Für die Verwendung in dem bevorzugten Test sollte der Marker so ausgewählt werden, daß der spezifische Ligand an den Marker gebunden werden kann, ohne daß er seine Affinität für den Analyten verliert.
  • Besonders bevorzugte Marker zur Verwendung in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind entweder (i) kolloidale Metallteilchen, gegebenenfalls in der Form eines Sols, welche Metalle oder Metallsulfide enthalten; oder (ii) Metallchelate, insbesondere jene, welche Ethylendiaminotetraessigsäure- (EDTA) - oder Diethylentriaminpentaessigsäure- (DTPA) -Gruppen enthalten, oder (iii) Polymere, welche gegebenenfalls mit Metallen oder Metallsulfiden imprägniert sind, z.B. Polymerisationsprodukte von Benzidinderivaten, wie z.B. Diaminobenzidinpolymere.
  • Versuche haben gezeigt, daß ein wesentlicher Bereich von kolloidalem Gold verwendet werden kann, einschließlich eines Bereiches von etwa 1 nm bis etwa 55 nm, wobei der bevorzugte Teilchengrößenbereich in einen Bereich von 2 bis 20 nm fällt, und wobei die in höchstem Maße bevorzugte Größe etwa um 4 bis 10 nm liegt.
  • Die Herstellung kolloidaler Marker, insbesondere kolloidaler Goldteilchen, das Binden derselben an spezifische Bindungsmittel oder an irgendwelche Mittel, die von denselben gebunden werden können, und die verschiedenen Methoden des direkten oder indirekten Verbindens derselben mit den gewünschten bindungsfähigen Substanzen sind bekannt. Diesbezüglich sei auf die US-PS 4 313 784; die EP-A-158 746; die EP-A-165 633, sowie auf Immunohistochemistry, Cuello, A.C. (Hsg.), IBRO-Handbuchreihe, Wiley, New York, 1983, Seiten 347 bis 372; und auf Techniques in Immunocytochemistry, Bd. 2, Seiten 217 bis 284 (1983), verwiesen.
  • Im allgemeinen kann das Binden leicht dadurch bewirkt werden, daß man die Teilchen mit einem wässerigen Medium des entsprechenden pH-Wertes in Berührung bringt, in welchem die gewünschten Bindungsmittel, z.B. Antikörper, gelöst sind. Um die Teilchen vor nicht-selektiven Wechselwirkungen mit nicht-spezifischen Proteinen der Testproben zu schützen, mag es angemessen sein, Löschmittel oder Stabilisatoren, wie z.B. immunchemisch inerte, polare Makromoleküle, wie z.B. Rinderserumalbumin (BSA), Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyethylenglykol (PEG), zu dem wässerigen Medium zuzugeben. Nach einer geeigneten Zeitspanne werden die nicht-stabilisierten Teilchen und die freien oder locker gebundenen Bindungsmittel durch wiederholtes Zentrifugieren und Waschen abgetrennt. Gewünschtenfalls können die Teilchen auch nach einem in J. Cell Biol., 90, 533-536, beschriebenen Verfahren nach Größen geteilt werden.
  • Alternativ können die Proteine auch nach einem in der US- PS 3 857 931 beschriebenen Verfahren unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimid-Kupplungsmittels kovalent an die Marker gebunden werden.
  • Das Binden von Metallchelaten an Bindungsmittel, wie z.B. Antikörper, kann leicht nach Methoden durchgeführt werden, die z.B. in Analytical Biochemistry, 142, 68-79 (1984), und in Cancer Research, 45, 5694-5699 (1985), beschrieben sind. Im allgemeinen umfassen die Reaktionen zum Kuppeln von Komplexbildnern, wie z.B. Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) und dgl., mit Proteinen eine Diazonium-Kupplungsreaktion und eine Acylierung mit aktivierten Carboxylgruppen. Die so erhaltenen, an den Komplexbildner konjugierten Proteine behalten ihre Immunreaktivität bei und können leicht mit dem gewünschten metallischen Element beladen werden.
  • Als Polymere, welche als Marker für die Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, können Polymerisationsprodukte von Benzidinderivaten angeführt werden, welche gegebenenfalls mit Metallen oder Metallverbindungen beladen sind. Die Verwendung und Herstellung von Diaminobenzidinpolymeren ist z.B. in J. Histochem. Cytochem., 30, 183-184 (1982); und in Neuroscience, 13, 513-525 (1984), beschrieben.
  • Die Vorteile der oben beschriebenen, neuen Tests liegen klar aufder Hand, weil diese Tests alle Vorteile der Verwendung eines physikalischen Entwicklers bieten, aber ohne die Nachteile, welche sich aus der Verwendung dieses Entwicklers bei den aufdem Fachgebiet bekannten Tests ergeben, darunter die charakteristische, kritische Bedeutung, welche dem Waschen, der zeitlich richtigen Einteilung und ultrasauberen Behältern zukommt.
  • Abgesehen davon, daß bei den vorliegenden Tests die Notwendigkeit sehr sauberer Berührungsflächen, z.B. von Gefäßen, von Chemikalien mit einem Analysen-Reinheitsgrad, von ultrareinem Wasser und von Mehrfachwaschstufen wegfällt, ermöglichen die vorliegenden Tests auch eine Erhöhung in dem Verhältnis zwischen dem tracerspezifischen Signal und dem durch Selbst-Kernbildung geschaffenen Hintergrundrauschen um ein Mehrfaches. Demzufolge kann die Empfindlichkeit dadurch erhöht werden, daß man den Tracer länger mit dem physikalischen Entwickler in Berührung hält, oder es kann die Entwicklungsgeschwindigkeit erhöht werden. In einigen Fällen kann eine Kombination von sowohl erhöhter Gesamtgeschwindigkeit als auch erhöhter Empfindlichkeit durchgeführt werden.
  • Da das Filter, der Träger und die absorbierende Schicht gezwungen werden können, praktisch irgendeine Form anzunehmen, kann eine eindrucksvolle Vielfalt von Vorrichtungen für eine geeignete Darstellung ins Auge gefaßt werden. Die Tests der vorliegenden Erfindung können daher leicht aufeinen Gebrauch durch erfahrenes Laboratoriumspersonal ebenso wie auch durch Leute, die keine technische Schulung absolviert haben und die den Test unachtsam durchführen können, ausgerichtet werden.
  • Die nachstehenden, nicht-einschränkenden Beispiele dienen dem weiteren Verständnis der vorliegenden Erfindung.
    • Beispiele 1.1 Herstellung von mit kolloidalem Gold markierten Anti- Mäuse-Immunglobulin- (Ig) -Antikörpern
  • Von der Firma Janssen Biotech, B-2430 Olen, Belgien, wurde ein Sol von kolloidalem Gold mit einem mittleren Durchmesser von 10 nm, nämlich Aurobeads G10, käuflich erworben. Durch Affinitätschromatographie gereinigte Ziegen-Anti-Mäuse- Ig-Antikörper wurden über Nacht bei 4ºC gegen einen 5 mM Carbonat-Puffer vom pH 9,2 dialysiert. Der pH-Wert des Goldsols wurde mit Kaliumhydroxid aufeinen pH-Wert von 9,0 gebracht. 100 ml dieses Goldsols wurden in einem Becher bei Zimmertemperatur gerührt. 1 mg der dialysierten Antikörper wurde zugegeben. Nach 2 min wurde 1 g Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben, welches in 10 ml Wasser aufgelöst und auf einen pH-Wert von 9,0 gebracht worden war. Nach 2 min wurde das Gold-Konjugat bei 4ºC während 1 h bei 15.000 x g zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstandes wurde das Pellet erneut in 100 ml von 20 mM Tris-HC1-Puffer vom pH 8,2 mit einem Gehalt von 1% BSA und 150 mM Natriumchlorid suspendiert. Diese Suspension wurde wiederum zentrifugiert, und das Pellet wurde erneut in dem gleichen Puffer auf ein Volumen suspendiert, bei welchem die optische Dichte bei 520 nm etwa 5,0 betrug.
    • 1.2 Herstellung eines geschützten physikalischen Entwicklers I
  • Zwei flüssige Komponenten dieses Entwicklers wurden getrennt hergestellt. Die Lösung A wurde durch Auflösen von 12 g Histidin, 0,4 g Silbernitrat, 4 g Natriumcitrat und 4 g Zitronensäure in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt.
  • Die Lösung B besteht aus 3,34 g Natriumcitrat.2H&sub2;O, 1,86 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 2 g Natriumsulfit, 0,3 g p-Methylaminophenol.Hydrochlorid und 0,4 g p-Aminophenol.HCl in 100 ml destilliertem Wasser.
    • 1.3 Herstellung eines geschützten physikalischen Entwicklers II
  • Zwei flüssige Komponenten des Entwicklers wurden getrennt hergestellt. Die Lösung A wurde durch Auflösen von 12 g Histidin, 0,4 g Silbernitrat, 4 g Natriumcitrat und 4 g Zitronensäure in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt.
  • Die Lösung B besteht aus 3,34 g Natriumcitrat.2H&sub2;O, 1,86 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 2 g Natriumsulfit und 2 g p-Methylaminophenol.Hydrochlorid in 100 ml destilliertem Wasser.
    • 1.4 Herstellung eines geschützten physikalischen Entwicklers III
  • Zwei flüssige Komponenten des Entwicklers wurden getrennt hergestellt. Die Lösung A wurde durch Auflösen von 8 g Imidazol, 0,18 g Silbernitrat, 1,4 g Natriumcitrat(.H&sub2;O) und 3,6 g Zitronensäure(.H&sub2;O) in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Lösung B wurde durch Auflösen von 3,3 g Natriumcitrat(.H&sub2;O), 1,0 g Zitronensäure(.H&sub2;O), 0,5 g p-Methylaminophenol.Hydrochlorid und 2,0 g Natriummetasulfat in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt.
    • 1.5 Standard-Testverfahren
  • Es wurde ein Standard-Testverfahren durchgeführt, um einige der verschiedenen Parameter zu untersuchen, welche das Immuntestverfahren der vorliegenden Erfindung beeinflussen. Eine Nitrozellulose-Blottingmembran (2x2 cm) wurde mit Mäuse-IgG als Antigen betüpfelt. Es wurde ein Konzentrationsbereich von 250 ug/ml bis 1 ug/ml angewendet. Auf dem Nitrozelluloseblatt wurden Tupfen von jeweils l 41 Antigen angebracht. Nach dem Trocknen der Tupfen während 15 min wurde die Nitrozellulose während 60 min in einer Lösung von "Trockenmilch" (Carnation) oder von äquivalenten Blockierungsprodukten (Rinderserumalbumin) in einem TRIS-Puffer mit einem Gehalt an 0,25M Tris(hydroxymethyl)aminomethan - 0,001 g/l, Thimerosal - 10 g/l "Trockenmilch" blockiert. Nach der Blockierungsstufe wurden die Membranen mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.
  • Um das neue Verfahren zu bewerten, wurde eine einfache Durchflußvorrichtung mit einem absorbierenden Papiertuch als feuchtigkeitsabsorbierendem Material zusammengebaut. Ein Stopfen eines kleinen Kunststoffproberöhrchens ohne Boden diente als Trichter zum Aufbringen der Probe. In der ersten Versuchsreihe wurde die betüpfelte Nitrozellulosemembran auf das Papier - mit dem Antigentupfen nach oben gekehrt - aufgelegt. Bei der zweiten Versuchsreihe wurde die Nitrozellulose auf das Papiertuch so aufgelegt, daß der Antigentupfen dem Papiertuch gegenüberlag.
  • In den Trichter wurden 350 ul von an kolloidales Gold gekuppeltem Ziegen-Anti-Mäuse-IgG, das wie unter 1.1 beschrieben hergestellt worden war, eingebracht. Nachdem die Goldsonde durch das Filter geflossen war, wurde das Filter mit 600 ul destilliertem Wasser gewaschen. Das Goldsignal wurde dadurch entwickelt, daß man 300 ul der unter 1.4 beschriebenen Lösung A mit 300 ul der unter 1.4 beschriebenen Lösung B vermischte. Nachdem die Flüssigkeit durch die Membran hindurchgegangen war, wurde die Membran dadurch gewaschen, daß 600 ul destilliertes Wasser auf das Filter aufgebracht wurden.
    • 1.6 Ergebnisse
  • Auf der Membran wurde ein schwarzbraunes Signal abgelesen. Für die erste Reihe wurde dasselbe aufder Oberseite der Membran abgelesen (Tabelle 2), und für das neue Verfahren wurde das Signal aufder Unterseite der Membran abgelesen (Tabelle 1). Das dabei erhaltene Verhältnis zwischen dem Signal und dem Hintergrundrauschen war für das neue Verfahren viel besser. Die Ergebnisse wurden mit einem Reflektometer (Barbieri Densi 301) quantifiziert. Tabelle 1 ERFINDUNGSGEMÄßES VERFAHREN Konz. Tupfen Hintergrund % Hintergrundrauschen/Signal % Signal/Hintergrundrauschen Tabelle 2 ZUM STAND DER TECHNIK GEHÖRENDES VERFAHREN Konz. Tupfen Hintergrund % Hintergrundrauschen/Signal % Signal/Hintergrundrauschen
  • In dem Maße, wie die Verstärkung durch das Silber fortschreitet, werden die Goldteilchen verstärkt. Nach einer gewissen Reaktionszeit bilden sich Silberteilchen, welche sich auf der Silbermembran niederschlagen und dem Filter eine graue Farbe verleihen.
  • Nach der neuen Methode treten die aufgelösten Silberionen durch das Filter hindurch und verstärken die Goldteilchen; die größeren Silberteilchen, welche nach einer gewissen Reaktionszeit in Erscheinung treten, können die Membran nicht durchdringen und verbleiben aufderen Oberseite. Bewertet man die Ergebnisse, so kann man beobachten, daß bei dem klassischen Verfahren die Sichtbarkeit des Signals durch die nicht-spezifischen Silberniederschläge gestört wird. Bei dem neuen Verfahren kann das spezifische Signal wegen des vollständig weißen Hintergrundes der Membran ohne Probleme beurteilt werden. Die Nitrozellulose diente bei diesem Versuch als feste Phase und als Filter, um die unerwünschten Silberteilchen fernzuhalten.
    • 1.7 Modifizierungen an dem Standard-Testverfahren
  • Um die Filterwirkung der festen Phase zu demonstrieren, wurde der folgende Versuch durchgeführt: Bei dem einen Versuch wurde ein Stück Nitrozellulose mit dem Antigentupfen nach oben gekehrt verwendet, und bei dem anderen Versuch wurde eine zweite Nitrozellulosemembran aufdie Festphasenmembran aufgelegt (ebenfalls mit dem Antigentupfen nach oben gekehrt). Es wurde das unter 1.5 beschriebene Standard-Testverfahren durchgeführt. Bei diesem Versuch diente die zweite Membran als Filter. Dieser Versuch zeigte, daß ein ähnliches, verbessertes Verhältnis zwischen dem Signal und dem Hintergrundrauschen wie bei dem Versuch 1.5 erhalten werden kann, was zu einer höheren Empfindlichkeit führt.
  • Eine andere Modifizierung des Standard-Testverfahrens besteht darin, daß man die Waschstufe zwischen der Zugabe des Goldkonjugates und der Silber-Verstärkungsreagenzien wegläßt. Durch diese Methode wird das Verfahren noch weiter vereinfacht. Innerhalb dieser Modifizierung wurde bei dem neu vorgeschlagenen Verfahren kein Hintergrundanfärben beobachtet. Bei der klassischen Methode wurde die Membran grauschwarz angefärbt.
    • 1.8 Einfluß der Zusammensetzung der Silber-Verstärkungsreagenzien
  • Es wurde der Einfluß der Zusammensetzung des geschützten physikalischen Entwicklers untersucht.
  • Es wurde das Standard-Testverfahren (1.5) unter Verwendung der unter 1.2, 1.3 und 1.4 beschriebenen Lösungen durchgeführt. Die Ergebnisse wurden durch die Zusammensetzung des geschützten physikalischen Entwicklers nicht beeinflußt.
  • Bei allen Versuchen führte das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu einem viel besseren Hintergrund und zu einem viel besseren Verhältnis zwischen dem Signal und dem Hintergrundrauschen, wodurch die Empfindlichkeit des Verfahrens verbessert wurde.

Claims (10)

1. Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines Tracers, welcher einen Metall-Marker aufweist, bei welchem Verfahren das Signal des Tracers durch Anwendung eines physikalischen Entwicklers verstärkt wird, und welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
a) Bereitstellen einer Vorrichtung, welche einen Träger für einen Testbereich, welcher ein für den nachzuweisenden Analyten spezifisches Bindungsmittel enthält, und eine absorbierende Schicht in Berührung mit dem Träger aufweist, welche zur Aufnahme von Flüssigkeiten und von jeglichem, nicht an den Testbereich gebundenem Analyten dient;
b) Führen der flüssigen Probe und des Tracers durch ein poröses Medium und mit geregelter Fließgeschwindigkeit, um dieselben mit dem Testbereich in Berührung zu bringen und um die Reaktion zwischen dem Analyten und dem Bindungsmittel bzw. zwischen dem Tracer und dem Analyten stattfinden zu lassen, wobei die Poren in dem porösen Medium eine Größe zwischen 0,2 und 12 um haben;
c) Führen eines physikalischen Entwicklers durch das poröse Medium, um das von dem Tracer erzeugte Signal zu verstärken; und
d) Abtrennen der Vorrichtung, damit der Testbereich abgelesen werden kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das poröse Medium ein getrennter Filter ist und der Testbereich aufjener Seite des Trägers angeordnet ist, welche dem Filter gegenüberliegt, und wobei die absorbierende Schicht aufder entgegengesetzten Seite zu jener, aufwelcher der Testbereich angeordnet ist, mit dem Träger in Berührung steht.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das poröse Medium der Träger ist, und wobei der Testbereich aufjener Seite des Trägers angeordnet ist, welche mit der absorbierenden Schicht in Berührung steht.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, wobei der Träger Nitrozellulose mit einer Porengröße zwischen 0,2 und 5 um ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Metall-Marker ein kolloidaler Gold-Marker mit einer Teilchengröße zwischen 2 und 20 nm ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der physikalische Entwickler ein lösliches Silbersalz und ein Reduktionsmittel umfaßt.
7. Vorrichtung zum Nachweisen des Vorliegens eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines Tracers, der einen Metall-Marker aufweist, bei welcher Vorrichtung das Signal des Tracers durch Anwendung eines physikalischen Entwicklers verstärkt wird, und welche Vorrichtung umfaßt:
a) einen Träger, welcher eine Oberseite und eine Unterseite sowie einen Testbereich aufseiner Oberseite aufweist, welcher Testbereich ein für den nachzuweisenden Analyten spezifisches Bindungsmittel enthält
b) einen Filter, welcher aufdie Oberseite des Trägers aufgelegt ist, und in welchem Filter die Poren eine Größe zwischen 0,2 und 12 um haben; und
c) eine absorbierende Schicht, welche in Flüssigkeitsverbindung mit dem Träger steht und zur Aufnahme von Flüssigkeiten sowie von jeglichem nicht spezifisch an den Testbereich gebundenem Analyten bzw. Tracer dient.
8. Vorrichtung zum Nachweisen des Vorliegens eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines Tracers, der einen Metall-Marker aufweist, bei welcher Vorrichtung das Signal des Tracers durch Anwendung eines physikalischen Entwicklers verstärkt wird, und welche Vorrichtung umfaßt:
a) einen Träger, welcher eine Oberseite und eine Unterseite sowie einen Testbereich aufseiner Unterseite aufweist, welcher Testbereich ein für den nachzuweisenden Analyten spezifisches Bindungsmittel enthält; und
b) eine absorbierende Schicht, welche in Flüssigkeitsverbindung mit dem Träger steht und zur Aufnahme von Flüssigkeiten sowie von jeglichem Analyten und jeglichem Tracer, der nicht spezifisch an den Testbereich gebunden ist, dient.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, worin der Metall-Marker ein kolloidaler Gold-Marker mit einer Teilchengröße zwischen 2 und 20 nm ist.
10. Immunoassay-Kit, welcher eine Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8 in Kombination mit einem physikalischen Entwickler enthält.
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