JPH11512282A - シグナル発生酵素としてバナジウムブロモペルオキシダーゼを使った特異的結合リガンドの測定用の分析要素および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の分析要素を用いて、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイのいずれの形式においても多種多様な特異的結合リガンドを高感度に且つ迅速に検出することができる。該アッセイは、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体；ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源；およびペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物を含んで成る化学発光シグナル発生洗浄用組成物と、バナジウムブロモペルオキシダーゼ標識免疫反応体を使って行われる。

Description

【発明の詳細な説明】 シグナル発生酵素としてバナジウムブロモペルオキシダーゼ を使った特異的結合リガンドの測定用の分析要素および方法発明の分野 本発明は、液体試料中の特異的結合リガンドを検出するための分析要素および それの使用方法に関する。より詳しくは、本発明は、そのような分析要素におけ るシグナル発生酵素としてのバナジウムブロモペルオキシダーゼの使用に関する 。発明の背景 分析および診断方法において、並びに医療および検査において、様々な液体例 えば生物学的液体中に存在する化学的および生物学的物質の迅速且つ正確な測定 が引き続き必要である。例えば、能率的な研究、診断および治療のためにはタン パク質、ホルモン、薬物、ウイルス、微生物、麻酔薬およびステロイド類の存在 を迅速且つ正確に測定しなければならない。 最近の数十年間で上述の物質を検出するための様々な分析方法が開発された。 それらの方法は信頼性が高くなり、ある場合には、自動化に適し、またキット形 態での使用に適するようになった。そのような方法の大部分は、検出しようとす る物質（本明細書中では「特異的結合リガンド」または「リガンド」と称する） と、該リガンドを認識して該リガンドと特異的に反応する対応する「レセプター 」との間の「特異的結合反応」として当該技術分野で知られているものに頼って いる。大部分の既知の特異的結合反応は、免疫反応体間（「イムノアッセイ」の 場合）、例えば抗体と抗原、または抗 体とハプテンとの間であるが、アビジンとビオチンのような別の反応も知られて いる。 一般に、イムノアッセイは、特定の抗原、抗体または抗原−抗体複合体の存在 または不在（または量）の定性および／または定量測定を提供することができる 。「競合結合イムノアッセイ」として知られるイムノアッセイの一形態では、測 定しようとするリガンドの標識類似体が、リガンドとリガンド類似体の両者と反 応することができる固定量の適当な抗体と競争状態に置かれる。類似体上の標識 は「遊離」形または複合体形（すなわち反応した形）において適宜検出すること ができる。そのような検出がひいては、試験している試料中にどれくらいのリガ ンドがあるかを使用者に教えるだろう。 「サンドイッチ」イムノアッセイまたはイムノメトリックアッセイとして知ら れる別のイムノアッセイ方式では、異なるエピトープ部位でリガンドに結合する ２以上のレセプター分子とリガンドとが接触せしめられる。一方のレセプターは 適当に標識され、そして他方のレセプターは固体支持体上に固定化されているか 、またはその上に固定化することができる。リガンドの量はリガンドと２つのレ セプターの間で結合した複合体の量に正比例する。 イムノアッセイは、伝統的には溶液中で、またはアッセイ中に沈澱する試薬か ら液体が何かの方法で除去される試験装置中で行われている。溶液技術はこの分 野で広く受け入れられているけれども、それらの技術は典型的には、複雑な溶液 取扱および輸送能をしばしば有する分析機器を必要とする。更に、そのようなア ッセイで使われる分析機器は、複雑な液体取扱が必要なことがあり、更に試料間 汚染を防ぐために必要であろう精密なクリーニングと操作の両方のために、熟練 した技術者を必要とする場合がある。 溶液化学に代わるものは乾式分析要素の使用である。乾式分析要 素では全部の水性溶液が使用できるわけではないことを理解すべきである。何故 なら、コーティング剤、バインダー、および前記要素の構造的完全性を維持する ために必要な他の試薬からの干渉があるためである。また、好結果をもたらす要 素の集成には多様な科学学問がしばしば要求される。更に、乾式分析要素は配合 禁忌の成分を分離するために区画区分を使用しなければならず、別々の液体貯蔵 と連続した液体添加を使用することができる溶液化学の場合にはそういったこと がない。 乾式分析要素およびイムノアッセイへのそれらの使用は、Pierce他への米国特 許第4,258,001 号、Frickey 他への米国特許第4,670,381 号、国際公開第 82/26 01号公報（1982年８月５日公開）、欧州特許出願第051 183 号（1982年５月12日 公開）、および欧州特許出願第066 648 号（1982年12月15日公開）をはじめとす る、多数の刊行物中に記載されている。 検出に酵素標識を使用する改良型乾式分析要素およびイムノアッセイへのそれ らの使用は、Belly 他への1992年８月31日出願の同時係属および同時譲渡出願で ある米国特許出願第 938,460号明細書中に記載されている。西洋ワサビペルオキ シダーゼがBelly 他の出願明細書に開示された好ましい酵素標識である。そのよ うな要素は、結合した（または複合体形成した）免疫反応体から未結合の反応体 を分離するための特定の洗浄技術を使って、非常に低い濃度で存在する分析物の 検出に備える。 標識としてペルオキシダーゼを使った乾式分析要素において行われるイムノア ッセイでは、ペルオキシダーゼの安定性が非常に重要である。何故なら、その濃 度のわずかな変化でもアッセイ感度に重大な影響を及ぼすからである。Friedman 他への米国特許第5,372,932号明細書に記載されたアッセイでは、乾式分析要素 中の酵素または 酵素標識の安定性を高めるための剤として４′−ヒドロキシまたは４′−アルコ キシアリールアセトアミドが使われている。それらの剤は改善された安定性をも たらしたけれども、ペルオキシダーゼ標識の安定性は乾式分析要素に望ましいも のよりもまだ低いことが観察された。 最近、ButlerおよびWalkerは、過酸化水素と臭化物アニオンの存在下で、有力 な酸化剤である活性臭素種を触媒的に生成する、水生および海生藻類から抽出さ れたバナジウムブロモペルオキシダーゼ（VBrPO）酵素群並びに陸生地衣類およ び真菌類から抽出された幾つかの酵素を記載した（Butler他，Chem ．Revs.，93 ，1937-1944頁，1993年およびその中の参考文献を参照のこと）。 大部分のハロペルオキシダーゼが抱える問題の１つは、それらの最適ｐＨが一 般に低いｐＨ域、即ち３〜５にあることである。これは、ペルオキシアニオンに 依存する従来技術の分析要素に問題を提供する。ヒドロペルオキシドは典型的に は約11.5のｐＫａを有する。バナジウムブロモペルオキシダーゼは、約６〜10の ｐＨ域で効率的に作用する。 従来技術において開示された分析要素および方法は高められたアッセイ感度お よび安定性を示すけれども、この技術分野においては更なる改良がまだ必要であ る。例えば、Friedman他への米国特許第5,372,932 号明細書に記載された安定剤 の使用を必要としない、より単純な分析要素を提供する必要性がある。更に、既 知の従来法よりも改善された酵素安定性および高い感度を有する要素を提供する 必要性がまだある。発明の要約 従来技術の乾式分析要素およびイムノアッセイに関する上述の課 題は、少なくとも１つの区画に、バナジウムブロモペルオキシダーゼ標識免疫反 応体を含んで成る分析要素を使用することによる本発明により解決された。 より具体的には、本発明は、特異的結合リガンドの測定に有用な分析要素であ って、 (i) 多孔質展開区画 (ii) 前記多孔質展開区画と液体接触状態にある１または複数の追加の区画、 および (iii) 所望により、上記区画と液体接触状態にある吸収材料を含んで成り、前 記区画のうちの少なくとも１つに、着目の特異的結合リガンドまたはそれのレセ プターのいずれかと特異的に反応することができるバナジウムブロモペルオキシ ダーゼ標識免疫反応体を含有することを特徴とする分析要素に関する。 本発明はまた、上述のイムノアッセイ分析要素を使用する特異的結合リガンド の測定方法であって、 (Ａ)特異的結合リガンドを含むと思われる液体試料を前記分析要素と接触せし め； (Ｂ)前記分析要素を、 (a) バナジウムブロモペルオキシダーゼの酵素活性に応じてシグナルを与え る化学発光シグナル発生試薬であって、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン ジオン誘導体であるシグナル発生試薬； (b) ハロゲン、ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供 給源；および (c) ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物 を含んで成る洗浄用組成物と接触せしめ；そして (Ｃ)着目の特異的結合リガンドの測度として、反応した形態または未反応の形 態のいずれかのバナジウムブロモペルオキシダーゼ標 識免疫反応体を検出する ことを含んで成る方法も提供する。 本発明は、乾式分析要素に使われる高感度で且つ安定な組成物を提供する。本 発明の要素は様々な特異的結合リガンドの測定に有用であるが、低濃度のリガン ドの測定に特に有用である。酵素安定性および高められた検出能という利点は、 該要素の中にバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識免疫反応体を含めることに よって達成される。図面の簡単な説明 図１は、要素の一成分としてバナジウムブロモペルオキシダーゼシグナル発生 酵素を含有する本発明の要素、およびFriedman他への米国特許第5,372,931 号明 細書の実施例１に記載されたような洗浄用組成物中に含まれる増強剤としての３ ′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリドとシグナル発生酵素としての西洋 ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とを含有する対照要素を使って得られた化学 発光シグナルを表すグラフである。 図２は、要素の一成分としてバナジウムブロモペルオキシダーゼシグナル発生 酵素を含有する本発明の要素、およびFriedman他への米国特許第5,372,931 号明 細書の実施例１に記載されたような洗浄用組成物中に含まれる増強剤としての３ ′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリドとシグナル発生酵素としての西洋 ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とを含有する対照要素を使って得られたシグ ナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を表すグラフである。 図３は、バナジウムブロモペルオキシダーゼシグナル発生酵素を含有する本発 明の要素およびシグナル発生酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを含有する 対照要素を使った、スポット形成エンザ イムアッセイの安定性を表すグラフである。 図４(a)および(b)は、バナジウムブロモペルオキシダーゼシグナル発生酵素を 含有する本発明の要素およびシグナル発生酵素として西洋ワサビペルオキシダー ゼ（ＨＲＰ）を含有する対照要素を使った、様々な時間での室温貯蔵後の化学発 光シグナル残存率を表す棒グラフである。発明の詳細な説明 本発明の方法は、特異的結合アッセイ、例えば競合結合方式またはイムノメト リック方式（これらの用語は当該技術分野で既知である）のいずれでもよいイム ノアッセイである。測定しようとする着目の分析物は、特異的結合リガンド、標 識リガンド、標識リガンド類似体、またはそれのレセプターである。 本発明は、様々な水性液体、例えばヒトおよび動物の生物学的液体、食品、工 業または都市廃液、およびこの方法で通常試験されている他の液体中の低濃度の リガンドを測定するために有利に用いられる。試験することができる生物学的液 体としては、非限定的に、全血、血清、血漿、尿、脊髄液、涙液、滑液、リンパ 液、組織もしくはプラークの懸濁液、歯肉滲出液、膣液、脳室液および当業者に 容易に明らかである他の液体が挙げられる。 測定することができるリガンドとしては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク 質（例えば酵素、抗体、リポタンパク質および糖タンパク質）、薬物、麻酔薬、 ステロイド、毒素および糖類（例えば多糖類）が挙げられるが、それに限定され ない。特に着目される特異的結合リガンドとしては、ジゴキシン、フェニトイン 、フェノバルビタール、テオフィリン、Ｃ反応性タンパク質、ヒト絨毛性性腺刺 激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、チロニン誘導体（例えばチロキ シンおよびトリヨードチロニン）、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、カルバマゼピン 、ゲンタマイシン、トブラマイシンまたはバンコマイシンが挙げられる。本発明 は、ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタールおよびＣ反応性タンパク質 の測定に最も有用である。 本発明は、多孔質展開区画、通常は希釈されたまたは未希釈の試験試料（例え ば１〜50μｌ）を収容するのに適当な多孔度を有する塗布層、を含んで成る分析 要素を使って行われる。本発明の要素は当業界で周知の技術を使って集成される 。好ましくは、多孔質展開区画は等方性多孔質であり、その性質は粒子間、繊維 間または該区画の他の物理成分間の空間により提供される。等方性多孔質とは、 液体が区画全体に均一に展開されることを意味する。そのような区画に有用な材 料は水不溶性であり、そしてアッセイ中それらの構造的完全性を維持するもので ある。要素を集成する従来の材料および方法は、例えば、Przybylowicz他への米 国特許第3,992,158 号、Pierce他への米国特許第4,258,001 号、Kitazima他への 米国特許第4,292,272 号、およびKoyama他への米国特許第4,430,436 号明細書に 記載されており、その内容は参考として本明細書中に組み込まれる。好ましい多 孔質展開区画はPierce他への米国特許第4,258,001号明細書中に記載されたよう に、干渉性三次元構造において有機ポリマー粒子と高分子接着剤とから調製され る。 要素中には１または複数の追加の区画があり、その全てが多孔質展開区画と液 体接触状態にある。「液体接触状態」という語は、本明細書中では液体が１つの 区画から別の区画へと容易に移動することができることを表すために用いられる 。そのような追加の区画、好ましくは被覆ポリマー層は、下塗区画、試薬区画お よび放射線遮断区画を含み、当業界で既知であるような１または複数の親水性バ インダー材料、例えばゼラチン、アクリルアミドポリマーおよびビ ニルピロリドンポリマーから構成される。ある区画は水不溶性であることができ 、またある区画は水溶性であることができる。 本発明の要素の区画は自立性であることができるが、好ましくは、それらの区 画は適当な寸法安定性の、化学的に不活性の支持体上に配置される。好ましくは 、該支持体は非孔質で且つ電磁線に対して透明である。特定の支持体は意図する 検出モード（例えば透過率または反射率分光分析法）と適合できなければならな い。有用な支持体材料としては、紙、金属ホイル、ポリスチレン、ポリエステル 、ポリカーボネートおよびセルロースエステルが挙げられるが、それらに限定さ れない。 所望により、該要素は本発明の要素の区画と液体接触状態で吸収材料を含んで 成る。本発明で使われる吸収材料は全体で該要素に液体収容量を加え、本発明の 方法で使われる洗浄液のための貯槽を提供する。適当な吸収材料はガラス微小繊 維、紙、スポンジ、布、プラスチックなどを含むが、該材料が液体を吸収するこ とができる限り、それらに限定されない。 好ましい態様では、展開区画が試料および洗浄液を取り入れやすくするために 吸収材料の輪状切片が展開区画の上に置かれる。 本発明の要素の少なくとも１つの区画に、着目の特異的結合リガンドまたはそ のレセプターのいずれかと特異的に反応することができるバナジウムブロモペル オキシダーゼ標識免疫反応体が存在する。競合結合イムノアッセイでは、標識免 疫反応体は一般に特異的結合リガンドの標識類似体である。サンドイッチアッセ イでは、標識免疫反応体はリガンドのための標識レセプターであることができ、 または該レセプターに特異的に結合する標識分子（例えば標識抗抗体）であるこ とができる。 そのような標識免疫反応体は、Yoshitake 他，Eur ．J．Biochem., 101, 395，1979およびKondo 他への米国特許第5,106,732 号明細書に記載された ものをはじめとする、様々な既知の手順のいずれかにより調製することができる 。 本明細書中で用いる「バナジウムブロモペルオキシダーゼ」とは、ルミノール のような物質の酸化を触媒して適当な化学発光シグナルを生成する任意のバナジ ウムハロペルオキシダーゼ活性を有する物質（酵素または他のもの）であること を意味する。本発明において使用することができるタンパク様バナジウムブロモ ペルオキシダーゼ源の特定例はButler他，Chem ．Rev.，93，1937-1944頁(1993) 中に見つけることができ、非限定例としてアスコフィルム・ノドサム（Ascophyl lum nodosum ）、セラミルム・ルブルム（Ceramirum rubrum）、ラミナリア・サ ッカリナ（Laminaria saccharina）、フカス・ディスチクス（Fucus distichus ）、コラリナ・ピルリフェラ（Corallina pilurifera）、コラリナ・オフィシナ リス（Corallina officinalis ）、マクロシスチス・ピリフェラ（Macrocystis pyrifera ）等から得られるものが挙げられる。バナジウムブロモペルオキシダー ゼの単離方法は上述のButler他の文献中に見つけることができる。それらのタン パク様バナジウムブロモペルオキシダーゼ源のうち、アスコフィルム・ノドサム （Ascophyllum nodosum）が特に好ましい。 上述したように、乾式分析要素の中にバナジウムブロモペルオキシダーゼを含 めることにより、本発明の要素は、全く予想外にも、Friedman他への米国特許第 5,372,931 号明細書に記載されたような増強剤を添加する必要なしに、改善され た酵素安定性と高められた検出能を示す。 本発明において使われるバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識免疫反応体の 量は、反応に使われる別の成分の量および試験試料中 の分析物の推定量によって広範囲に渡り異なることができる。通常、要素中に存 在する量は少なくとも約0.01μg/m²であり、好ましい範囲は約0.1 〜約100 μg/ m²である。 本発明の要素は、所望により、着目の特異的結合リガンドかそれのレセプター のいずれかと特異的に反応することができる未標識の免疫反応体を含んでもよい 。競合結合イムノアッセイでは、この免疫反応体は通常はリガンドに対するレセ プター（例えば抗体）である。サンドイッチイムノアッセイでは、未標識の免疫 反応体はリガンドに対するレセプターであるか、または該レセプターに対する結 合分子であることができる。好ましい態様では、そのような免疫反応体はリガン ドに特異的な抗体である。 存在する場合、未標識の免疫反応体は、要素の任意の区画に置かれるが、ただ しバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識免疫反応体と同じ区画には置かれない 。よって、該要素のそれらの２つの成分は、アッセイが始まるまでは何らかの形 で分離された状態に維持される。それらを該要素の異なる区画に配置することに よりそれらの成分を分離してもよいし、または同じ区画にあるけれども、アッセ イが始まると免疫反応体を放出する材料により一方がカプセル封入されてもよい 。好ましくは、それらの免疫反応体は別々の区画または層に保持される。 該要素の一区画全体に分散されている適当な粒子の上に未標識免疫反応体が固 定化されるのも、同様に好ましい。そのような粒子はガラス、酸化鉄、セラミッ ク、有機合成または天然ポリマーをはじめとする任意の適当な材料から成り、そ して約0.01〜約10μm の平均粒度を有することができる。好ましくは、該粒子は 合成ポリマーから調製され、そして免疫反応体分子の吸着または共有結合による 接着のための適当な表面基を有する。そのような材料は当業界でい ろいろ知られており、例えばWarren他への米国特許第4,828,978 号、Sutton他へ の米国特許第4,997,772 号、Sutton他への米国特許第5,147,777 号またはSutton 他への米国特許第5,177,023 号明細書、およびその中に記載された参考文献中に 記載されている。 特に有用なポリマー粒子は、反応性カルボキシ、２−置換エチルスルホニルま たはビニルスルホニル基を有するエチレン型不飽和重合性モノマーから調製され たものであり、特に前の段落に参照したSutton他の特許明細書中に記載されたも のである。 本発明の好ましい態様では、特異的結合リガンドの測定用の多層分析要素が提 供される。具体的には、多層分析要素は非孔質支持体を含んで成り、その上に液 体接触状態において、 第一試薬または緩衝剤層、 着目の特異的結合リガンドまたはそれのレセプターのいずれかと反応するこ とができる未標識の免疫反応体を含んで成る下塗層、 均一に分散された、着目の特異的結合リガンドまたはそれのレセプターのい ずれかと反応することができるバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識免疫反応 体を含有する多孔質展開層 を有する。 本発明の多層要素は、所望により上述した区画のうちの１つと液体接触状態に ある吸収材料を含有してもよい。 より好ましい態様では、バナジウムブロモペルオキシダーゼ標識免疫反応体は 、当業者に周知であるようなインクジェット蒸着、吹付塗蒸着およびグラビア蒸 着をはじめとする（がそれらに限定されない）製造技術を使うことによって多孔 質展開層の最上部に置かれる。 本発明の要素は、製造、液体の拡がり、望ましくない放射線の吸収、およびレ セプター安定性を助けるために当業界で知られている ような様々な添加剤を適当な区画中に含むことができる。 本発明の要素は、従来技術に記載されているような従来の塗布技術および装置 （グラビア塗布、流し塗、ホッパー塗布および他の塗布技術）を使って調製する ことができる。要素は様々な形状に作ることができ、例としては、所望の幅を有 する細長いテープ、シート、スライドまたはチップの形が挙げられる。更に、本 発明の方法は手動であることができるし、または適当な分析機器と手順を使って 自動化することができる。通常、本発明の方法は、試験試料（例えば、１〜50μ ｌ）を多孔質展開区画の上にスポットすることにより、要素中の試薬類を接触さ せることを含む。要素内で液体が移動することにより、試薬が効果的に混合され て反応が起こる。 試料の適用後、要素は、要素の種々の区画における適当な特異的結合複合体の 形成を加速するかまたは他の方法で促進するために望ましいであろう任意のコン ディショニング、例えばインキュベーション、加熱または他の操作に暴露される 。ある場合には、反応した形または未反応の形のバナジウムブロモペルオキシダ ーゼ標識免疫反応体の効率的分離を行わなくても適当なシグナルが得られるけれ ども、不均一イムノアッセイとして知られるものに典型的であるように、要素の 一区画の中で両形態が分離されることが好ましい。そうすれば、該区画の限定領 域においてシグナルをより良好に読み取ることができる。 該要素への洗浄溶液（約５〜約200 μｌ）の適用は、この分離を行うための好 ましい操作である。洗浄溶液は当業界で既知の任意の適当な方法で適用すること ができるが、好ましくは、例えば10μｌ／秒までの連続した計量速度で、より好 ましくは約１μｌ／秒の速度で適用される。しかしながら、上述した吸収材料を 要素に使うことによって容易に提供されるように多孔質展開区画が適用の間中液 体を吸収する限り、どんな洗浄溶液の適用速度および方法でも使用することがで きる。 洗浄溶液は連続して適用される複数の液体組成物を含んで成ることができるが 、その液体の少なくとも１つが後述するようなシグナル発生組成物を含まなけれ ばならない。あるいは、洗浄溶液のいずれかの中に界面活性剤を使うこともでき る。 本発明の方法で用いる洗浄溶液は、約6.5 〜約10のｐＨを有する、化学発光シ グナル発生のための分析用組成物であって、 (a) バナジウムブロモペルオキシダーゼの触媒活性に応じてシグナルを提供す る化学発光シグナル発生試薬であって、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン ジオン誘導体であるシグナル発生試薬； (b) ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源；および (c) ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物 を含んで成る組成物である。 前に指摘したように、本発明に使われるシグナル発生組成物は、その成分の１ つとして、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン誘導体（本明細書中で は“ＤＰＤ”とも言う）を含有する。化学発光反応において励起状態に変換され 、続いて光の放出を伴いながら非励起状態に戻ることができるいずれの遊離型ま たは複合型ＤＰＤでも、本発明の実施に有用である。相当な数のそういった化合 物が当技術分野において知られており、それらとしてはKricka他への米国特許第 4,598,044 号明細書およびGrundermann 他，Chemi-luminescence in Organic Ch emistry，Springer-Verlag，Berlin，1987，204-207 頁に記載されたものが挙げ られる。 そのような化合物は一般に「ルミノール型ヒドラジン類」として知られており 、例としてフタル酸ヒドラジン、ナフタレン−１，２ −ジカルボン酸ヒドラジン、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジン、 フェナントレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジン、フルオレン−１，２−ジカ ルボン酸ヒドラジン、ベンゾ〔ｇ，ｈ，ｉ〕ペリレン−１，２−ジカルボン酸ヒ ドラジン、コロネン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジン、および当業者に容易に 明白である他のものが挙げられる。 特に、本発明において使用できるＤＰＤは次の構造式により定義される： 上式中Ｚ¹，Ｚ²，Ｚ³およびＺ⁴は独立に水素；約１〜約６個の炭素原子を含むア ルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、sec −ペンチルお よびヘキシル；約２〜約６個の炭素原子を含むアルケニル、例えばエテニル、１ −プロペニル、イソブテニル、２−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ビニル、 ２−（Ｎ，Ｎ−ジイソブチルアミノ）ビニル、２−（Ｎ，Ｎ−ジイソペンチルア ミノ）ビニルおよび２−ヘキセニル；ヒドロキシ；約１〜約６個の炭素原子を含 むアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、ｔ−ブトキシおよ びヘキソキシ；カルボキシ；アルキルまたはアルカノイルで置換されたアミノを 含めたアミノ、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、アミド（例えばアセトアミ ドおよびヘキサナミド）、ジメチルアミノ、ジエチルアミノおよびジイソブチル アミノ；または置換されたアミノアリールを含めたアミノアリール、例えばｐ− （Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル、ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニ ルおよび５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン−８−イル （＝ルミニル）である。 Ｚ¹とＺ²の少なくとも一方がアミノ（前に定義したような置換アミノを含む） 、共役アミノアルケニル（上述したような置換アミノアルケニルを含む）または アミノアリール、例えばｐ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル、ｐ−（Ｎ， Ｎ−ジエチルアミノ）フェニルおよび５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４− フタラジンジオン−８−イルである。本明細書中で用いる「共役アミノアルケニ ル」とは、アミノ基からアルケニル基を経由してそれが置換基として結合してい るフタラジンジオンの芳香環へと電子共鳴することのできる一価の基を言い、そ の例としては、例えば、ジアルキルアミノビニル基、例えば２−（Ｎ，Ｎ−ジイ ソプロピルアミノ）ビニル、２−（Ｎ，Ｎ−ジイソブチルアミノ）ビニルおよび ２−（Ｎ，Ｎ−ジイソペンチルアミノ）ビニル；並びにジアルキルアミノブタジ エニル基、例えば４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）−１，３−ブタジエン−１− イルが挙げられる。 あるいは、Ｚ¹，Ｚ²，Ｚ³およびＺ⁴のいずれか２つの隣接した基、いずれか３ つの隣接した基または全ての基（すなわち、２つもしくは３つの隣接基の組合せ 、または４つ全部の基）が一緒になって、１または複数の芳香環を含む縮合環系 を形成することができる。そのような縮合環は１または複数のヒドロキシにより 、アミノ（上述したような置換または非置換の）によりまたは約１〜約４個の炭 素原子を有するアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシおよびイソプロポキシに より、置換されてもよい。好ましくは、そのような縮合環は１または複数の第一 級、第二級もしくは第三級アミン、ヒドロキシまたはアルコキシにより置換され る。 代表的な有用ＤＰＤ化合物としては、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（４ −アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミスクシンイミド、Ｎ−（６− アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミ ノール、Ｎ−エチルイソルミノールおよび７−ジメチルアミノナフタレン−１， ２−ジカルボン酸ヒドラジドが挙げられるが、それらに限定されない。ルミノー ル〔５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン〕およびイソル ミノール〔６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン〕が好ま しく、ルミノールが最も好ましい。 他の有用なＤＰＤ化合物の群はGundermann他の上記刊行物の中に記載されてお り、その例としては、置換または非置換フタル酸ヒドラジド、アントラセン−２ ，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナントレンジカルボン酸ヒドラジド、フル オレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ベンゾ〔ｇ，ｈ，ｉ〕ペリレン−１ ，２−ジカルボン酸ヒドラジドおよびコロネン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジ ド、例えば次の構造により表されるもの、が挙げられる： 本発明において有用であると当業者が認める別のフタラジンジオン類似体とし ては、Masuya他への欧州特許出願第91310875.9号、およびYamaguchi への米国特 許第5,324,835 号明細書の中に開示されているものが挙げられる。前記刊行物の 内容は参考として本明細書中に組み込まれる。 上記に示した化合物は商業的に入手可能であるか、または当業者に周知である 従来の出発物質および手順を使って調製することができる。 本発明に使われる洗浄用組成物の第二成分は、ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲ ン供給源または擬ハロゲン供給源である。本明細書中で用いる「ハロゲンまたは ハロゲン供給源」という語は、本発明の洗浄用組成物に加えるとハロゲンアニオ ン、すなわちフッ化物、塩化物、臭化物またはヨウ化物アニオンを生成する任意 の物質を意味する。これは塩化物、臭化物およびヨウ化物のようなハロゲンを包 含する。ハロゲン供給源は金属または非金属ハロゲン塩を含んで成ることができ る。非金属塩としては、非限定的例として、アンモニウム、アルキルアンモニウ ム、置換アルキルアンモニウム、アリールアンモニウム、置換アリールアンモニ ウム、ヒドラジニウム、オキソニウム、トロピリウム、スルホニウム塩などが挙 げられる。ハ ロゲン供給源は、上記カチオン種と対イオンとしてのハロゲンとの任意の組合せ を含むホモポリマーまたはコポリマーを含んで成る高分子材料であってもよい。 そのような材料の一例はNH₄Br である。典型的には、ハロゲン供給源は第ＩＡ族 金属塩として組成物に添加される。第ＩＡ族金属意外の金属塩も考えられる。本 発明の特に好ましい態様では、ハロゲン供給源はNaBrである。 本明細書中で用いる「擬ハロゲンまたは擬ハロゲン供給源」という語は、本発 明で使用する組成物に加えるとハロゲンに匹敵する高い電子親和力を有するアニ オンを提供する任意の物質を意味する。擬ハロゲン供給源は典型的には、第ＩＡ 族金属化合物であるが、それに限定されないということに注意すべきである。擬 ハロゲンまたは擬ハロゲン供給源は、ハロゲン供給源について上述したような金 属または非金属化合物であることができ、例えば、アンモニウム、アルキルアン モニウム化合物およびそれのポリマーであることができる。分析用シグナル発生 組成物中に存在することができる適当な擬ハロゲンとしては、CN^-，SCN^-，OCN^- ，アジド、イソニトリル等が挙げられるが、それらに限定されない。それらの擬 ハロゲンのうちSCN^-が特に好ましい。本発明で使われる好ましい擬ハロゲン供給 源はNaSCNである。 本発明で使われる洗浄用組成物の第三成分は、ペルオキシドまたはペルオキシ ド生成試薬配合物である。「ペルオキシド」という語は、従来技術において典型 的に用いられている無機または有機ペルオキシド化合物を包含する。ペルオキシ ド生成試薬配合物とは、本発明で使われるシグナル発生組成物に加えるとペルオ キシドを生じることができる任意の試薬配合物を包含する意味である。そのよう なペルオキシド生成試薬配合物は当業者に周知であり、非限定例としては、ペル ボレート、ペルアセテート、尿素ペルオキシド、およ び有機ペルオキシド、例えば過酸、ペルオキシ安息香酸およびオキソン、並びに ヒドロペルオキシドが挙げられる。 本発明で使われる洗浄用組成物は、約6.0 〜約8.0 のpKa を有する１または複 数の適当な生物学的緩衝剤を使って、通常約6.5 〜約10、より好ましくは約6.8 〜約8.0 のpHに緩衝化される。それらの緩衝剤は当業界で周知のものである。そ のような緩衝剤の典型例としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン− HCl〔Tris-HCl〕；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸〔MES〕；ピペラジ ン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）〔PIPES〕；３−（Ｎ−モルホリ ノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸〔MOPSO〕；リン酸塩緩衝剤などが挙 げられるが、それらに限定されない。上述した生物学的緩衝剤のうち、Tris-HCl が特に好ましい。 本発明において使われる洗浄用組成物中の各成分の量は、それの意図する用途 、試薬類の特定感度、および当業者に良く判るような他の要因によって異なり得 る。よって、次の一般的範囲は当業者への指標を与えるものであって、本発明の 実施を制限するものではない。 具体的には、所望のpHを維持するのに必要である緩衝剤の量を決定する方法は 周知であることから、本発明において使われる緩衝剤の量は当業者には容易に明 らかである。シグナル発生化合物であるＤＰＤの量は、通常は少なくとも約0.01 ミリモル濃度であり、約0.1 〜約10ミリモル濃度の範囲が好ましい。 第二成分、すなわちハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン 供給源については、通常少なくとも約0.1 ミリモル濃度の量で存在する。より好 ましくは、ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン供給源はシ グナル発生組成物中に約50ミリモル〜約100 ミリモル濃度の量で存在する。 第三成分、すなわちペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物について は、該成分は少なくとも約0.02ミリモル濃度の量でシグナル発生組成物中に存在 する。より好ましくは、ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬配合物は約0. 5 ミリモル〜約1.0 ミリモル濃度の量で存在する。 本発明の要素は、反応した形または未反応形のバナジウムブロモペルオキシダ ーゼ標識免疫反応体に応じて化学発光シグナルを提供する種々様々なアッセイ形 式において使用することができる。 次の実施例は本発明の範囲を例証するために与えられる。それらの実施例は例 示目的にのみ与えられるため、本発明をそれに限定すべきではない。 特記しない限り、全ての試薬および装置はイーストマン・コダック・カンパニ ーまたは他の商業源から入手した。 実施例１ 水性化学発光組成物およびバナジウムブロモペルオキシダーゼ溶液の調製 化学発光シグナル発生用水性組成物は次のようにして調製した： 0.05Ｍ Tris-HCl 緩衝剤中に100 μＭのジエチレントリアミンペンタ酢酸（DT PA）、0.75ＭのNaBrおよび１％臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）を含 有する緩衝液（pH 8.0）を調製した。 二液型混合物からシグナル発生組成物を調製した。第一液は１ mMのルミノー ルNaを含み、第二液は1 mM H₂O₂を含み、両者とも上記緩衝液中に調製した。そ れらの二液を使用直前に混合した。 ４℃で貯蔵したバナジウムブロモペルオキシダーゼ〔アスコフィルム・ノドサ ム（Ascophylum nodosum）由来〕原液を 0.05M Tris-HCl，pH 8 および0.01％ウ シ血清アルブミン（ＢＳＡ）中に系列希 釈して、10〜50,000アトモルの範囲の既知濃度のバナジウムブロモペルオキシダ ーゼ溶液を得た。 次いで次の試薬マトリックス組成を有する塗布要素を調製した： ビーズ展開層： 0.1 M Tris，pH 8.0 ポリマービーズ （VtE） バインダー （MaWnaMt） 0.5 g/m² TSH Ab ビーズ DTPA （10^-4M） ゲルパッド： ゼラチン 0.2 M Tris，pH 8.0 DPTA （10^-4M） TX-100 硬化剤 （BVSME） 支持体： 7 mil Estar （ポリエチレ ンテレフタレート） 上記試薬マトリックスには次の定義を用いる。 Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤。 ポリマービーズ：ポリ（ビニルトルエン−コ−メタクリル酸ビーズ）。 バインダー：ポリ（メチルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチ ルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレ ート）。 TSH Abビーズ：甲状腺刺激ホルモン(TSH)に対する抗体が共有結合で取り付け られたポリ（スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロパン酸）。 TX-100：Triton X-100、すなわちRohm and Haas Co．により販売されているオ クチルフェノキシポリエトキシエタノール界面活性剤。 BVSME ：ビス（ビニルスルホニル）メチルエーテル。 MaWnaMt ：ポリ（メチルアクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチル プロパンスルホン酸ナトリウム塩−コ−アセトアセトキシエチルメタクリレート ）（90/4/6）。高感度検出イムノアッセイ塗膜上での化学発光シグナルについてのバナジウムブ ロモペルオキシダーゼの評価 上記で調製した化学発光シグナル発生組成物およびバナジウムブロモペルオキ シダーゼ緩衝液を次のようにして使用した： EKTACHEM（商標）C-スライド基板上に上記塗膜の16mm²切片を置くことにより スライドの形の要素を集成した（前に参照したBelly他への米国特許出願第938,4 60 号に記載の通りに）。試料を適用することができる直径10mmの中心穴を有す るWhatman GF/Bマイクロファイバーガラス吸収材料（Whatman Specialty Produc ts Division,製品番号PD 008-12A-100）を前記塗膜の上に置いた。次いで吸収剤 層の上に不透質の輪状のプラスチックトップピースをのせ、集成品全体をテープ でとめた（完全集成品の詳細については、Belly 他への米国特許出願第938,460 号の図１と図２を参照のこと）。 次いで該要素を100 μｌの前記化学発光シグナル発生組成物により１μｌ／秒 の速度で洗浄した。洗浄溶液の適用後、５μｌの化学発光シグナル発生組成物中 の前記バナジウムブロモペルオキシダーゼの適当な希釈液を塗膜上にスポットし た。要素を即座に分解して、TURNER（商標）TD-20eルミノメーターを使って周囲 温度にて塗膜の化学発光シグナルを測定した。ルミノメーターは、塗膜の中央の 直径10mm部分の読み取りができるようなアダプターを使うことによって、分解し た16mm²塗膜に適応するように改良した。 図１は、このアッセイの上記条件下での化学発光出力（改良ルミノメーター中 に置いた後ｔ＝４分での10秒間積分）を示す。より詳 しくは、図１は、本発明の要素が従来技術の要素のものと同様に容易に検出でき る絶対シグナルを生成することを示す。 図１では、対照要素は、Friedman他への米国特許第5,372,931 号明細書に記載 されたような洗浄用組成物中にシグナル発生酵素として西洋ワサビペルオキシダ ーゼと、増強剤として３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリドを含有す る。ただし、洗浄用組成物を次のように変更した：指定された成分に加えて、0. 05 M Tris-HCl，pH 8.0，0.1 ％塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC），1 50μM ３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリド。 図２は、当業者へのシステム感度の識別尺度としての、シグナル対ノイズ比（ Ｓ／Ｎ比）を示す。図２のデータは、本発明の要素と、シグナル発生酵素として 西洋ワサビペルオキシダーゼを含む対照要素とを使って得られた。ＨＲＰ対照の 洗浄用組成物は、増強剤としてFriedman他への米国特許第5,372,931 号明細書に 記載されたような３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリドを含んだが、 次のような変更を有した：指摘の成分に加えて、0.05 M Tris-HCl，pH 8.0，0.1 ％塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC），150μM ３′−クロロ−４′− ヒドロキシアセトアニリド。この図は、本発明の要素が対照要素よりも大きな感 度を与えることを示す。 実施例２ 要素の安定性の比較 この実施例は、乾式要素中でのＨＲＰの安定性と乾式要素中でのバナジウムブ ロモペルオキシダーゼの安定性とを比較する。7 mil Estar（ポリエチレンテレ フタレート）支持体上に塗布した次の試薬マトリックス組成を有する下塗要素を 調製した。 記号：VtE ＝ポリ（ビニルトルエンーコーメタクリル酸）(98/2) MaWnaMt ＝ポリ（メチルアクリレート−コ−２−アクリル アミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩− コ−アセトアセトキシエチルメタクリレート）(90/4/6) TES ＝Ｎ−〔２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシ メチル）エチル〕タウリン BVSME ＝ビス（ビニルスルホニル）メチルエーテル IMnAg ＝ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−２ −ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−メチレンビス アクリルアミド）(85/5/10)。 この実施例では、バナジウムブロモペルオキシダーゼ原液について実施例１に 記載したのと同じ試薬を使用したが、ただし、バナジウムブロモペルオキシダー ゼ原液とＨＲＰ原液を10 mM リン酸塩緩衝剤，pH 7.0中に10^-8Ｍに希釈した。 吸収材料をスライド集成品に含めなかったことを除いて、実施例１に記載した 手順を使って両要素を集成した。次いで、前記バナジウムブロモペルオキシダー ゼ原液または前記ＨＲＰ原液のいずれか10μｌを要素の上にスポットした。 次いで各要素を室温で遮光下で30分間，2，4，6，24および48時間熟成した。 各間隔後、要素を切って塗料をはがし、次いでそれをリン酸塩（pH 7.0）、0.15 M NaCl および0.1 ％BSA を含有する緩衝液１ml中で抽出した。抽出材料を約２ 分間遠心して粒状物と固形物を分離した。 酵素活性の測定は、抽出された上澄液10μｌに適当なシグナル発生組成物 200 μｌを添加することにより行った。バナジウムブロモペルオキシダーゼには、本 発明のシグナル発生洗浄用組成物を使った。ＨＲＰには、Friedman他への米国特 許第5,372,931 号明細書の実施例１に開示された試薬組成物を使った。次いで37 ℃でDYNATECH（商標）ML3000ルミノメーターを使って化学発光シグナルを測定し た。 それらの実験の結果を図３にグラフ的に示す（各時点についてｔ＝５分で1.0 秒間積分）。図４(a)および(b)は、(a)ＨＲＰおよび(b)バナジウムブロモペルオ キシダーゼの％残余活性を表す図３からのデータのプロットである。具体的には 、それらの図は明らかに、バナジウムブロモペルオキシダーゼ含有要素の安定性 が長期間（48時間まで）に渡り本質的に一定のままであることを示す。対照的に 、ＦＲＰ含有要素では大幅な減衰が明らかに認められる。 上記態様および実施例は本発明の範囲と精神を例示するために与えられる。そ れらの態様および実施例は、当業者に別の態様および実施例を明らかにするであ ろう。それらの別の態様および実施例は本発明の考えの中に含まれる。従って、 本発明は添付の請求の範囲によってのみ制限される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 キセル，トーマス，ロバート アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，ウィローウッド ドライ ブ，200 (72)発明者 グロールクス，サラ，フィンガー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14519, オンタリオ，フィッシャー ロード，6794 (72)発明者 コプシーンスキー，マルサ，ミラー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14559, スペンサーポート，ワシントン ストリー ト，395

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．特異的結合リガンドの測定用の分析要素であって、 (i) 多孔質展開区画；および (ii) 前記多孔質展開区画と液体接触状態にある少なくとも１つの追加の区画 を含んで成り、前記区画のうちの少なくとも１つに、着目の特異的結合リガンド のためのレセプターに特異的に結合するバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識 免疫反応体を含有することを特徴とする分析要素。 ２．前記バナジウムブロモペルオキシダーゼがアスコフィルム・ノドサム（As cophyllum nodosum ）、セラミルム・ルブルム（Ceramirum rubrum）、ラミナリ ア・サッカリナ（Laminaria saccharina）、フカス・ディスチクス（Fucus dis tichus ）、コラリナ・ピルリフェラ（Corallina pilurifera）、コラリナ・オフ ィシナリス（Corallina officinalis）またはマクロシスチス・ピリフェラ（Ma crocystis pyrifera ）から得られる、請求項１に記載の要素。 ３．前記バナジウムブロモペルオキシダーゼがアスコフィルム・ノドサム（As cophyllum nodosum ）から得られる、請求項２に記載の要素。 ４．(iii) １または複数の前記区画と液体接触状態である吸収材料を更に含ん で成る、請求項１に記載の要素。 ５．特異的結合リガンドの測定用の多層分析要素であって、 非孔質支持体を含んで成り、その上に液体接触状態において次の層： (i) 第一試薬または緩衝剤層； (ii) 着目の特異的結合リガンドと特異的に結合する未標識の免 疫反応体を含んで成る下塗層；および (iii) バナジウムブロモペルオキシダーゼ標識免疫反応体を含む多孔質展開層 を有することを特徴とする多層分析要素。 ６．前記バナジウムブロモペルオキシダーゼがアスコフィルム・ノドサム（As cophyllum nodosum ）、セラミルム・ルブルム（Ceramirum rubrum）、ラミナリ ア・サッカリナ（Laminaria saccharina）、フカス・ディスチクス（Fucus dis tichus ）、コラリナ・ピルリフェラ（Corallina pilurifera）、コラリナ・オフ ィシナリス（Corallina officinalis）またはマクロシスチス・ピリフェラ（Ma crocystis pyrifera ）から得られる、請求項５に記載の多層要素。 ７．前記バナジウムブロモペルオキシダーゼがアスコフィルム・ノドサム（As cophyllum nodosum ）から得られる、請求項６に記載の多層要素。 ８．前記多孔質展開層がビーズ型展開層である、請求項５に記載の多層要素。 ９．(iv) １または複数の前記層と液体接触状態である吸収材料を更に含んで 成る、請求項５に記載の多層要素。 10．特異的結合リガンドの測定方法であって、 (Ａ)特異的結合リガンドを含むと思われる液体試料を、 (i) 多孔質展開区画；および (ii) 前記多孔質展開区画と液体接触状態にある少なくとも１つの追加の区 画 を含んで成る分析要素であって、前記区画のうちの少なくとも１つに、前記リガ ンドに特異的に結合するバナジウムブロモペルオキシダーゼ標識免疫反応体を含 有する分析要素と接触せしめ； (Ｂ)前記分析要素に洗浄溶液を適用して、前記バナジウムブロモペルオキシダ ーゼ標識免疫反応体の反応形と前記バナジウムブロモペルオキシダーゼ標識免疫 反応体の未反応形とを分離し、ここで前記洗浄溶液は (a) バナジウムブロモペルオキシダーゼの酵素活性に応じてシグナルを与 える化学発光シグナル発生試薬であって、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジ ンジオン誘導体であるシグナル発生試薬； (b) ハロゲン、ハロゲン、擬ハロゲン、ハロゲン供給源または擬ハロゲン 供給源；および (c) ペルオキシドまたはペルオキシド生成試薬組成物 を含んで成る、約6.5 〜約10のpHを有する組成物を含み；そして (Ｃ)前記特異的結合リガンドの測度として、前記バナジウムブロモペルオキシ ダーゼ標識免疫反応体の未反応形または反応形のいずれかを検出する ことを含んで成る方法。