NO320625B1 - Analytisk element samt analytisk flerlagselement og fremgangsmate for bestemmelse av en spesifikk bindingsligand ved bruk av vanadiumbromperoksydase som et signalgenererende enzym - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører analytiske elementer og metoder for anvendelse av disse for å detektere spesifikke bindingsligander i fluide prøver. Mer spesielt angår oppfinnelsen anvendelsen av en vanadiumbromperoksidase som et signalgenererende enzym i slike analytiske elementer.

Det er et stadig behov innen medisinsk praksis og forskning, og i analytiske og diagnostiske prosedyrer, for hurtige og nøyaktige bestemmelser av kjemiske og biologiske stoffer som er til stede i forskjellige fluider, slik som biologiske fluider. For eksempel må tilstedeværelsen av proteiner, hormoner, legemidler, vimser, mikroorganismer, narkotiske stoffer og steroider bestemmes hurtig og nøyaktig for effektiv forskning, diagnose og behandling.

Det har i de senere tiår blitt utviklet en rekke forskjellige analytiske metoder for å detektere de nevnte stoffene. Metodene har blitt meget pålitelige og i noen tilfeller egnet for automatisering samt egnet for bruk i kit-form. De fleste av disse metodene baserer seg på det som er kjent innen teknikken som "spesifikke bindingsreaksjoner" mellom en substans som skal detekteres (heri identifisert som en "spesifikk bindingsligand" eller "ligand") og en tilsvarende "reseptor" som gjenkjenner og reagerer med liganden på spesifikk måte. De fleste kjente spesifikke bindingsreaksjonene er mellom immunoreaktanter (i "immunoanalyser"). slik som antistoffer med antigener eller antistoffer med haptener, men andre er også kjent slik som avidin med biotin.

Generelt kan immunoanalyser gi en kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse av tilstedeværelsen eller fraværet (eller mengden) av et spesifikt antigen, antistoff eller antigen-antistoff-kompleks. I én form av immunoanalyse, kjent som en "konkurrerende bindingsimmunoanalyse", blir en merket analog av liganden som skal bestemmes anbragt i konkurranse med en fastsatt mengde av et passende antistoff som kan reagere med både liganden og ligandanalogen. Markøren på analogen kan hensiktsmessig detekteres i sin "frie" eller kompleksdannede (dvs. reagerte) form. Slik detektering vil så fortelle brukeren hvor mye ligand det befinner seg i prøven som testes.

I et alternativt immunoanalyseformat, kjent som en "sandwich"-immunoanalyse eller immunometrisk analyse, blir liganden bragt i kontakt med to eller flere reseptormolekyler som bindes til liganden ved forskjellige epitopiske seter. Én reseptor blir merket på hensiktsmessig måte og den andre enten immobilisert på et fast substrat eller er i stand til å bli immobilisert derpå. Mengden av ligand er direkte proporsjonal med mengden av bundet kompleks blant liganden og de to reseptorene. Immunoanalyser har tradisjonelt blitt utført i oppløsning eller i testanordninger der fluider fjernes på en eller annen måte fra reagensene som deltar i immunoanalysen. Selv om oppløsningsteknikker har fått bred aksept på dette område, så krever de typisk analysatorutstyr som ofte har innviklede oppløsningshåndterings- og transportmuligheter. Det analytiske utstyret som benyttes i slike analyser kan dessuten involvere kompleks væskehåndtering, og kan nødvendiggjøre personell med erfaring, både for drift og den absolutt riktige rensing som kan være nødvendig for å unngå forurensning fra prøve til prøve.

Et alternativ til oppløsningskjemi er bruken av tørre analytiske elementer. Det skal forstås at ikke alle vandige oppløsninger kan benyttes i tørre analytiske elementer på grunn av forstyrrelse fra beleggmidler, bindemidler og andre reagenser som er nødvendige for å opprettholde strukturell integritet i nevnte elementer. Videre er det også ofte nødvendig med en rekke vitenskapelige disipliner i forbindelse med vellykket elementkonstruksjon. Tørre analytiske elementer må dessuten benytte oppdeling i seksjoner uten innbyrdes forbindelse for å segregere inkompatible komponenter; dette er ikke tilfelle i oppløsningskjemi der separat væskelagring og suksessive væsketilsetninger kan benyttes.

Tørre analytiske elementer og deres anvendelse for immunoanalyser er beskrevet i en rekke publikasjoner, inkludert US patent 4.258.001 til Pierce et al., US patent 4.670.381 til Frickey et al., WO 82/2601 (publisert 5. august 1982), EP patentsøknad 051 183 (publisert 12. mai 1982) og EP patentsøknad 066 648 (publisert 15. desember 1982).

Forbedrede tørre analytiske elementer og deres anvendelse i immunoanalyser er beskrevet i samtidig søknad US Serial No. 938.460 inngitt 31. august 1992 til Belly et al. hvor enzymmarkører er benyttet for detektering. Pepperrotperoksidase er den foretrukne enzymmarkøren som er beskrevet i Belly et al.-dokumentet. Slike elementer gir anledning til detektering av analytter som er til stede i meget lave konsentrasjoner ved anvendelse av en spesiell vasketeknikk for å separere ubundede reaktanter fra bundede (eller kompleksdannede) immunoreaktanter.

I immunoanalysene som utføres i de tørre analytiske elementene som benytter peroksidase som markør er peroksidasens stabilitet av stor viktighet fordi enhver endring i dens konsentrasjon påvirker analysesensitiviteten på kritisk måte. I analysene beskrevet i US patent 5.372.932 til Friedman et al., blir 4-hydroksy- eller 4'-alkoksyarylacetamider benyttet som midler for å forbedre stabiliteten til enzymet eller enzymmarkøren i et tørt analytisk element. Selv om disse midlene har resultert i forbedret stabilitet, har det blitt observert at peroksidasemarkørens stabilitet fremdeles er mindre enn ønsket i tørre analytiske elementer.

Butler og Walker har nylig beskrevet en familie av vanadiumbromperoksidaser (VBrPO) ekstrahert fra akvatiske og marine alger og noen fra terrestriske lav og fungi som, i nærvær av hydrogenperoksid og bromidanion, katalytisk produserer aktive bromforbindelser som er potente oksidasjonsmidler (se Butler et al., Chem. Revs.. 93, sider 1937-1944,1993, og referanser angitt deri).

Ett av problemene med de fleste halogenperoksidasene er at deres pH-optima generelt befinner seg i det lavere pH-området, dvs. 3-5. Dette representerer et problem med tidligere kjente analytiske elementer som avhenger av et peroksyanion; peroksider har typisk en pKa-verdi på ca. 11,5. Vanadiumbromperoksidasene virker effektivt i et pH-områdepå ca. 6-10.

Selv om de analytiske elementene og metodene som er beskrevet i den tidligere teknikk viser forbedret analysesensitivitet og -stabilitet, så er det fremdeles et behov for ytterligere forbedringer på dette område. For eksempel er det fremdeles et behov for tilveiebringelse av et enklere analytisk element som ikke nødvendiggjør bruk av stabiliseirngsmidler som beskrevet i US patent 5.372.932 til Friedman et al. Videre er det et behov for å tilveiebringe et element som har forbedret enzymstabilitet og mer sensitivitet enn de tidligere kjente systemene.

Problemene som er identifisert ovenfor med hensyn til tidligere kjente, tørre, analytiske elementer og immunoanalyser har blitt overvunnet av foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av et analytisk element som omfatter, i i det minste én av dets soner, en vanadiumbromperoksidase-merket immunoreaktant.

Mer spesielt angår foreliggende oppfinnelse et analytisk element som er nyttig for bestemmelse av en spesifikk bindingsligand omfattende:

(i) en porøs spredningssone; og

(ii) minst én ytterligere sone som er i fluid kontakt med nevnte porøse spredningssone, hvor nevnte element, i i det minste én av nevnte soner, inneholder en vanadiumbromperoksidase-merket immunoreaktant som bindes spesifikt til en reseptor for en spesifikk bindingsligand av interesse.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for bestemmelse av en spesifikk bindingsligand, kjennetegnet ved: (A) anbringelse av en fluid prøve som mistenkes å inneholde nevnte spesifikke bindingsligand, i kontakt med et analytisk element som innbefatter:

(i) en porøs spredningssone, og

(ii) minst én ytterligere sone som er i fluid kontakt med nevnte porøse spredningssone, hvor elementet i minst en av nevnte soner inneholder en vanadiumbromperoksidase-merket immunoreaktant som spesifikt binder nevnte ligand; (B) påføring av en vaskeoppløsning på nevnte element for å bevirke en separering av den ureagerte formen av nevnte vanadiumbromperoksidase-merkede immunoreaktant fra den reaktive formen av nevnte vanadiumbromperoksidase-merkede immunoreaktant, hvor vaskeoppløsningen omfatter en sammensetning som har en pH-verdi fra ca. 6,5 til ca. 10, hvilken sammensetning innbefatter: (a) en kjemiluminescerende signalgenererende reagens som gir et signal som respons på den katalytiske aktiviteten til nevnte vanadiumbromperoksidase, hvor den signalgenererende reagensen er et 2,3-dihydro-l,4-ftalazindionderivat; (b) et halogen, pseudohalogen, halogengivende kilde eller pseudohalogengivende kilde; og

(c) et peroksid eller en peroksidgenererende reagenssammensetning, og

(C) detektering av enten nevnte ureagerte eller reagerte form av nevnte vanadiumbromperoksidase som et mål for nevnte spesifikke bindingsligand.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en meget sensitiv og stabil sammensetning for bruk i tørre analytiske elementer. Foreliggende element er nyttig for bestemmelse av en rekke forskjellige spesifikke bindingsligander, men er spesielt nyttig for bestemmelse av ligander ved lave konsentrasjoner. Fordelene med enzymstabilitet og forbedret detektering oppnås ved inkorporering av en vanadiumbromperoksidase-merket immunoreaktant i elementet. Fig. 1 er en grafisk representasjon av det kjemiluminescerende signalet som oppnås ved anvendelse av elementet ifølge foreliggende oppfinnelse, som inneholder et vanadiumbromperoksidase-signalgenererende enzym som en av dets komponenter og et kontrollelement som inneholder pepperrotperoksidase (HRP) som signalgenererende enzym, og 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid som en forsterker inneholdt i vaskesammensetningen som beskrevet i Eksempel 1 i US patent 5.372.931 til Friedman et al. Fig. 2 er en grafisk representasjon av signal-til-støy responsen som oppnås ved bruk av et element ifølge foreliggende oppfinnelse som inneholder et vanadiumbromperoksidase-signalgenererende enzym som en av dets komponenter og et kontrollelement som inneholder pepperrotperoksidase (HRP) som signalgenererende enzym, og 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid som en forsterker som inneholdes i vaskesammensetningen som beskrevet i Eksempel 1 i US patent 5.372.931 til Friedman et al. Fig. 3 er en grafisk representasjon av stabiliteten til en analyse med avsatt enzym ved bruk av et element ifølge foreliggende oppfinnelse som inneholder et vanadiumbromperoksidase-signalgenererende enzym og et kontrollelement som inneholder pepperrotperoksidase som signalgenererende enzym. Fig. 4(a) og (b) er stolpediagrammer som viser prosenten av kjemiluminescerende signal som er tilbake etter romtemperaturlagring ved forskjellige tidsperioder ved bruk av et element ifølge oppfinnelsen som inneholder et vanadiumbromperoksidase-signalgenererende enzym og et kontrollelement som inneholder pepperrotperoksidase (HRP) som signalgenererende enzym.

Foreliggende fremgangsmåte er en spesifikk bindingsanalyse, slik som en immunoanalyse, som enten kan være konkurrerende binding eller immunometrisk slik disse betegnelsene er kjent innen teknikken. Analyttene som er av interesse for bestemmelse er en spesifikk bindingsligand, en markert ligand, en markert ligandanalog, eller en reseptor derav.

Foreliggende oppfinnelse benyttes med fordel for å bestemme lave konsentrasjoner av ligander i forskjellige vandige væsker, slik som humane og animalske biologiske fluider, matvarer, industri- eller kommunale avløp, og andre fluider som er vanlig testet på denne måten. Biologiske fluider som kan testes inkluderer, men er ikke begrenset til, helt blod, serum, plasma, urin, spinalvæske, tårevæske, leddvaeske, lymfatisk væske, suspensjoner av vev eller plakk, gingivalvæske, vaginalvæske, kranievæske og andre væsker som er åpenbare for fagfolk innen teknikken.

Ligander som kan bestemmes inkluderer, men er ikke begrenset til, peptider, polypeptider, proteiner (slik som enzymer, antistoffer, lipoproteiner og glykoproteiner), legemidler, narkotika, steroider, toksiner og sakkarider (slik som polysakkarider). Spesifikke bindingsligander av spesiell interesse inkluderer digoksin, fenytoin, fenobarbital, teofyllin, C-reaktivt protein, human korionisk gonadotropin, thyroidstimulerende hormon, et thyroninderivat (slik som thyroksin og trijodthyronin), kreatinkinase-MB, karbamazepin, gentamicin, tobramycin eller vancomycin. Foreliggende oppfinnelse er særlig nyttig i bestemmelsen av digoksin, fenytoin, fenobarbital og C-reaktivt protein.

Foreliggende oppfinnelse utføres ved anvendelse av et analytisk element omfattende en porøs spredningssone, vanligvis et belagt lag som har egnet porøsitet for å kunne romme en testprøve (for eksempel 1 til 50 ul), fortynnet eller ufortynnet. Foreliggende element sammensettes ved bruk av teknikker som er velkjent på området. Den porøse spredningssonen er fortrinnsvis isotropisk porøs, og denne egenskapen oppnås ved hjelp av innbyrdes forbundede rom blant partiklene, fibrene eller andre fysiske komponenter i sonen. Med isotropisk porøs menes at fluider spredes jevnt gjennom hele sonen. Nyttige materialer for slike soner er vannuoppløselige og opprettholder deres strukturelle integritet under analysen. Konvensjonelle materialer og metoder for sammensetning av elementet er beskrevet for eksempel i US patent 3.992.158 til Przybylowicz et al., US patent 4.258.001 til Pierce et al., US patent 4.292.272 til Kitazima et al. og US patent 4.430.436 til Koyama et al. De foretrukne porøse spredningssonene fremstilles fra organopolymere partikler og et polymert adhesiv i en koherent, tredimensjonal struktur, som beskrevet i US patent 4.258.001 til Pierce et al.

Det er en eller flere ytterligere soner i elementet, som alle er i fluid kontakt med den porøse spredningssonen. Det skal forstås at betegnelsen "fluid kontakt" er benyttet i foreliggende sammenheng for å bety at fluider lett kan bevege seg fra én sone til en annen. Slike ytterligere soner, fortrinnsvis belagte polymerlag, inkluderer "subbing", reagens og strålingsblokkerende soner og består av ett eller flere hydrofile bindematerialer som kjent innen teknikken, slik som gelatin, akrylamidpolymerer og vinylpyrrolidonpolymerer. Noen soner kan være vannuoppløselige mens andre kan være vannoppløselige.

Sonene i foreliggende element kan være selvbærende, men disse sonene er fortrinnsvis anordnet på en hensiktsmessig dimensjonsstabil, kjemisk inert bærer. Bæreren er fortrinnsvis ikke-porøs og transparent overfor elektromagnetisk stråling. En valgt bærer bør være kompatibel med den tilsiktede deteksjonsmodus (for eksempel transmisjons-eller reflektansspektroskopi). Nyttige bærermaterialer inkluderer, men er ikke begrenset til, papir, metallfolier, polystyrener, polyestere, polykarbonater og celluloseestere.

Elementet omfatter eventuelt et absorberende materiale i fluid kontakt med sonene i foreliggende element. Absorberende materialer som benyttes i foreliggende oppfinnelse gir samlet ekstra væskekapasitet til elementet under tilveiebringelse av et reservoar for vaskefluidet som benyttes i foreliggende fremgangsmåte. Egnede absorberende materialer omfatter, men er ikke begrenset til, glassmikrofibre, papir, svamper, tøystoffer, plaster og lignende, så lenge materialet er i stand til å absorbere en væske.

I en foretrukket utførelse blir en ringformet seksjon av det absorberende materiale anbragt på spredningssonen hvorved det gis adgang for at spredningssonen kan gjennomføre prøvetagning og vasking.

I det minste én av sonene i foreliggende element er en vanadiumbromperoksidase-merket immunoreaktant som på spesifikk måte kan reagere med enten den spesifikke bindingsliganden av interesse eller dens reseptor. Ved konkurrerende bindingsimmunoanalyser er den merkede immunoreaktanten vanligvis en merket analog av den spesifikke bindingsliganden. Ved "sandwich"-analyser kan den merkede immunoreaktanten være en merket reseptor for liganden, eller den kan være et merket molekyl som spesifikt bindes til reseptoren (slik som et merket antistoff).

En slik merket immunoreaktant kan fremstilles ved anvendelse av en rekke forskjellige kjente prosedyrer inkludert den beskrevet av Yoshitake et al. Eur. J. Biochem.. 101, 395, 1979, og i US patent 5.106.732 til Kondo et al.

Med den heri benyttede betegnelse "vanadiumbromperoksidase" menes en hvilken som helst vanadiumhalogenperoksidativ substans (enzymatisk eller på annen måte) som katalyserer oksidasjonen av et stoff, slik som luminol, til dannelse av et passende kjemiluminescerende signal. Spesifikke eksempler på proteinholdige vanadiumbromperoksidasekilder som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse finnes i Butler et al., Chem. Revs.. 93, s. 1937-1944, (1993), og inkluderer, men er ikke begrenset til, de som oppnås fra Ascophyllum nodosum, Ceramirum rubrum, Laminaria saccharina, Fucus distichus, Corallina pilulifera, Corallina officinalis, Macrocystis pyrifera og lignende. Prosedyrer for isolering av vanadiumbromperoksidaser finnes i ovennevnte Butler et al.-referanse. Av disse proteinholdige vanadiumbromperoksidase-kildene er Ascophyllum nodosum spesielt foretrukket.

Ved inkorporering av en vanadiumbromperoksidase i det tørre analytiske elementet så vil foreliggende element, som nevnt ovenfor, helt uventet utvise forbedret enzymstabilitet og forbedret deteksjon uten behov for tilsetning av forsterkere, slik som beskrevet i US patent 5.372.931 til Friedman et al., i elementet.

Mengden av vanadiumbromperoksidase-merket immunoreaktant kan variere sterkt på grunn av mengden av andre komponenter som benyttes i reaksjonen og den forventede mengde analytt i testprøven. Mengden som er til stede i elementet er generelt minst ca. 0,01 ug/m , idet det foretrukne område er fra ca. 0,1 til ca. 100 ug/m .

Foreliggende element kan eventuelt inneholde en umerket immunoreaktant som på spesifikk måte kan reagere med enten den spesifikke bindingsliganden av interesse eller dens reseptor. Ved konkurrerende bindingsanalyser er denne immunoreaktanten vanligvis en reseptor (slik som et antistoff) til liganden. Ved "sandwich"-immunoanalyser kan den umerkede immunoreaktanten være en reseptor for liganden, eller et bindingsmolekyl for reseptoren. I en foretrukken utførelse er immunoreaktanten et antistoff som er spesifikt til liganden.

Når den umerkede immunoreaktanten er til stede, så befinner den seg i en hvilken som helst sone i elementet, med unntagelse for at den vanligvis ikke befinner seg i den

samme sonen som den vanadiumbromperoksidase-merkede immunoreaktanten. Disse to komponentene i elementet holdes således adskilt på en eller annen måte inntil analysen har begynt. Disse komponentene kan separeres ved å plassere dem i forskjellige soner i elementet, eller de kan befinne seg i den samme sonen, men én er innkapslet med et

materiale som frigjør immunoreaktanten når analysen begynner. Immunoreaktantene holdes fortrinnsvis i separate soner eller lag.

Det er også foretrukket at de umerkede immunoreaktantene immobiliseres på egnede partikler som er dispergert gjennom det hele av en sone i elementet. Slike partikler kan bestå av et hvilket som helst egnet materiale omfattende glass, jernoksider, keramiske stoffer, organiske syntetiske eller naturlig forekommende polymerer, og ha en gjennomsnittlig partikkelstørrelse fra ca. 0,01 til ca. 10 um. Partiklene fremstilles fortrinnsvis fra syntetiske polymerer og har egnede overflategrupper for adsorpsjon eller kovalent tilfesting av immunoreaktantmolekylene. Det er kjent en rekke forskjellige slike materialer innen teknikken slik som de som er beskrevet i US patent 4.828.978 til Warren et al., US patent 4.997.772 til Sutton et al., US patent 5.147.777 til Sutton et al. eller US patent 5.177.023 til Sutton et al., og referanser som angitt deri.

Spesielt nyttige polymere partikler er de som fremstilles fra etylenisk umettede polymeriserbare monomerer som har reaktive karboksy-, 2-substituerte etylsulfonyl-eller vinylsulfonylgrupper, spesielt som beskrevet i ovennevnte Sutton et al.-patenter.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre et analytisk flerlagselement for bestemmelse av en spesifikk bindingsligand, kjennetegnet ved at elementet omfatter en ikke-porøs bærer som derpå, i fluid kontakt, har: (i) en første reagens eller bufferlag; (ii) et "subbing"-lag omfattende en umerket immunoreaktant som spesifikt bindes med en spesifikk bindingsligand av interesse; og (iii) et porøst spredningslag inneholdende en vanadiumbromperoksidase-merket

immunoreaktant.

Flerlagselementet ifølge foreliggende oppfinnelse kan eventuelt inneholde et absorberende materiale som er i fluid kontakt med en av de nevnte sonene.

I en mer foretrukket utførelse anordnes den vanadiumbromperoksidase-merkede immunoreaktanten i den øverste delen av det porøse spredningslaget ved bruk av fremstillingsteknikker slik som fargestoffstråle-avsetning, spraybelegg-avsetning og gravyr-avsetning som velkjent for fagfolk innen teknikken.

Foreliggende elementer kan inkludere en rekke forskjellige additiver i passende soner slik som kjent innen teknikken for å hjelpe fremstilling, fluidspredning, absorbtans av uønsket stråling og reseptorstabilitet.

Foreliggende element kan fremstilles ved anvendelse av konvensjonelle belegningsprosedyrer og -apparatur som beskrevet i den tidligere teknikken (inkludert gravyr-, gardin-, trakt- og andre belegningsteknikker). Elementene kan gis en rekke forskjellige former, inkludert avlange bånd av en hvilken som helst ønsket bredde, ark, slide-elementer eller chips. Videre kan foreliggende fremgangsmåte være manuell eller automatisert ved bruk av passende analytisk utstyr og prosedyrer. Generelt innbefatter fremgangsmåten anbringelse i kontakt av reagensene i elementet ved avsetting av en testprøve (for eksempel 1-50 fil) på den porøse spredningssonen. Bevegelsen av fluid inne i elementet vil på effektiv måte blande reagensene slik at reaksjonene kan finne sted.

Etter prøvepåføring blir elementet eksponert overfor en hvilken som helst kondisjonering, slik som inkubering, oppvarming eller annen prosedyre, som kan være ønskelig for å påskynde eller på annen måte lette dannelsen av de hensiktsmessige spesifikke bindingskompleksene i elementets forskjellige soner. Mens i noen tilfeller et egnet signal kan oppnås uten effektiv separering av de reagerte og ikke-reagerte formene av den vanadiumbromperoksidase-merkede immunoreaktanten, så er det foretrukket at formene separeres innenfor en sone i elementet, slik det er typisk i det som er kjent som heterogene immunoanalyser. Således kan et signal leses bedre i et definert område av sonen.

Påføring av en vaskeoppløsning (fra ca. 5 til ca. 200 ul) på elementet er den foretrukne prosedyre for å bevirke denne separeringen. Vaskeoppløsningen kan påføres på en hvilken som helst egnet måte som er kjent innen teknikken, men den påføres fortrinnsvis ved en kontinuerlig utmålt hastighet, for eksempel på opptil 10 ul/sek, og mest foretrukket ved ca. 1 ul/sek. En hvilken som helst hastighet og fremgangsmåte for påføring av vaskeoppløsning kan imidlertid benyttes så lenge som den porøse spredningssonen lett absorberer fluidet under påføring slik det lett sørges for ved bruk av ovennevnte absorberende materiale i elementet.

Vaskeoppløsningen kan omfatte et flertall fluidsammensetninger påført sekvensielt, men i det minste ett av fluidene må omfatte den signalgenererende sammensetningen som beskrevet i det nedenstående. Alternativt kan et overflateaktivt middel også anvendes i hvilke som helst av vaskeoppløsningene.

Vaskeoppløsningen som benyttes i foreliggende fremgangsmåte er en analytisk sammensetning for tilveiebringelse av et kjemiluminescerende signal som har en pH-verdi fra ca. 6,5 til ca. 10, hvor sammensetningen innbefatter: (a) en kjemiluminescerende signalgenererende reagens som gir et signal som respons på den katalytiske aktiviteten til en vanadiumbromperoksidase, hvor den signalgenererende reagensen er et 2,3-dihydro-l,4-ftalazindionderivat; (b) et halogen, pseudohalogen, en halogengivende kilde eller pseudohalogengivende kilde; og

(c) et peroksid eller peroksidgenererende reagenssammensetning.

Som angitt ovenfor inneholder den signalgivende sammensetningen som benyttes i foreliggende oppfinnelse, som en av dens komponenter, et 2,3-dihydro-l,4-ftalazindionderivat (identifisert heri som "DPD"). Ethvert fritt eller konjugert DPD som kan omdannes til en eksitert tilstand i en kjemiluminescerende reaksjon og deretter returnere til en ikke-eksitert tilstand med emisjon av lys er nyttig ved utførelse av foreliggende oppfinnelse. Det er kjent et betydelig antall slike forbindelser i teknikken, inkludert de som er beskrevet i US patent 4.598.044 til Kricka et al. og i Grundermann et al., Chemiluminescence in Organic Chemistry, Springer-Verlag, Berlin, 1987, sider 204-207.

Slike forbindelser er generelt kjent som "hydrazider av luminol-typen" og innbefatter ftalsyrehydrazider, naftalen-1,2-dikarboksylsyrehydrazider, antracen-2,3-dikarboksylsyrehydrazider, fenantren-1,2-dikarboksylsyrehydrazider, fluoren-1,2-dikarboksylsyrehydrazider, benzo[g,h,i]-perylen-l,2-dikarboksylsyrehydrazider, koronen- 1,2-dikarboksylsyrehydrazider og andre som er opplagte for fagfolk innen teknikken.

Spesielt de DPD'er som kan benyttes i foreliggende oppfinnelse er definert ved følgende strukturelle formel:

hvor Z<1>, Z<2>, Z<3> og Z<4> uavhengig er hydrogen; en alkyl inneholdende fra ca. 1 til ca. 6 karbonatomer slik som metyl, etyl, isopropyl, t-butyl, sek-pentyl og heksyl; en alkenyl inneholdende fra ca. 2 til ca. 6 karbonatomer slik som etenyl, 1-propenyl, isobutenyl, 2-(N,N-diisopropylamino)vinyl, 2-(N,N-diisobutylamino)vinyl, 2-(N,N-diisopentylamino)vinyl og 2-heksenyl; en hydroksy; en alkoksy inneholdende fra ca. 1 til ca. 6 karbonatomer, slik som metoksy, etoksy, isopropoksy, t-butoksy og heksoksy; en karboksy; en amino innbefattende amino substituert med alkyl eller alkanoyl, slik som metylamino, etylamino; amido (for eksempel acetamido og heksanamido); dimetylamino, dietylamino og diisobutylamino; en konjugert aminoalkenyl (for eksempel som definert nedenfor); eller en aminoaryl inkludert substituert aminoaryl, slik som p-(N,N-dimetylamino)fenyl, p-(N,N-dietylamino)fenyl og 5-amino-2,3-dihydro-l,4-ftalazindion-8-yl (også kjent som luminyl).

I det minste én av Z<1> og Z<2> er en amino (inkludert substituert amino, som definert ovenfor), konjugert aminoalkenyl (inkludert substituert aminoalkenyl som beskrevet ovenfor) eller en aminoaryl slik som p-(N,N-dimetylamino)-fenyl, p-(N,N-dietylamino)fenyl og 5-amino-2,3-dihydro-l,4-ftalazindion-8-yl. Den heri benyttede betegnelsen "konjugert aminoalkenyl" refererer til en enverdig gruppe som kan gjennomgå elektronresonans fra aminogruppen gjennom alkenylgruppen til den aromatiske ringen i ftalazindionforbindelsen hvor den er substituert, og inkluderer for eksempel en dialkylaminovinylgruppe slik som 2-(N,N-diisopropylamino)vinyl, 2-(N,N-diisobutylamino)vinyl og 2-(N,N-diisopentylamino)vinyl; og

dialkylaminobutadienylgrupper, slik som 4-(N,N-dietylamino)-l,3-butadien-l-yl.

Alternativt kan hvilke som helst to, tilstøtende tre eller alle avZ<1>,Z<2>,Z<3>ogZ<4>(dvs. kombinasjoner av to eller tre tilstøtende grupper, eller alle fire grupper) tas sammen til dannelse av et kondensert ringsystem inneholdende en eller flere aromatiske ringer. Slike kondenserte ringer kan være substituert med en eller flere hydroksy, amino (substituert eller usubstituert som beskrevet ovenfor) eller en alkoksy med fra ca. 1 til ca. 4 karbonatomer slik som metoksy, etoksy og isopropoksy. Slike kondenserte ringer er fortrinnsvis substituert med en eller flere primære, sekundære eller tertiære aminer, hydroksy eller alkoksy som beskrevet ovenfor.

Representative nyttige DPD-forbindelser inkluderer, men er ikke begrenset til, luminol, isoluminol, N-(4-aminobutyl)-N-etylisoluminol hemisuccinimid, N-(6-aminoheksyl)-N-etylisoluminol, N-etylisoluminol og 7-dimetylaminonaftalen-l,2-dikarboksylsyrehydrazid. Luminol (5-amino-2,3-dihydro-l,4-ftalazindion) og isoluminol (6-aniino-2,3-dihydro-l,4-ftalazindion) er foretrukket, og luminol er mest foretrukket.

Andre nyttige klasser av DPD-forbindelser er beskrevet i den ovennevnte Gundermann et al.-publikasjonen og innbefatter substituerte eller usubstituerte ftalsyrehydrazider, antracen-2,3-dikarboksylsyrehydrazider, fenantrendikarboksylsyrehydrazider, fluoren-1,2-dikarboksylsyrehydrazider, benzo[g,h,i]perylen-1,2-dikarboksylsyrehydrazider og koranen-1,2-dikarboksylsyrehydrazider, slik som de som er illustrert ved de følgende strukturene:

Andre ftalazindionanaloger som fagfolk innen teknikken anser som nyttige i foreliggende oppfinnelse inkluderer de som beskrives i EP patentsøknad 91310875.9 til Masuya et al. og US patent 5.324.835 til Yamaguchi.

De ovenfor identifiserte forbindelsene kan oppnås kommersielt, eller kan fremstilles ved bruk av kommersielle utgangsmaterialer og prosedyrer som er velkjent for fagfolk innen teknikken.

Den andre komponenten i vaskesammensetningen som benyttes i foreliggende oppfinnelse er et halogen, pseudohalogen, halogengivende kilde eller pseudohalogengivende kilde. De heri benyttede uttrykk "halogen eller halogengivende kilde" betegner et hvilket som helst materiale som tilsatt til vaskesammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse gir et halogenanion, dvs. et fluorid-, klorid-, bromid-eller jodidanion. Dette inkluderer halogenene slik som klorid, bromid og jodid. Den halogengivende kilden kan omfatte et metall- eller ikke-metall halogensalt. Dcke-metallsalter inkluderer, men er ikke begrenset til, ammonium, alkylammonium, substituert alkylammonium, arylammonium, substituert arylammonium, hydrazinium, oksonium, tropylium, sulfonium og lignende. Den halogengivende kilden kan også være et polymert materiale omfattende en homopolymer eller kopolymer inneholdende en hvilken som helst kombinasjon av de ovenfor nevnte kationiske gruppene med et halogen som et motion. Et eksempel på et slikt materiale er NKtBr. Den halogengivende kilden blir typisk tilsatt til sammensetningen som et Gruppe IA-metallsalt. Andre metallsalter foruten Gruppe IA-holdige metaller er også aktuelle i foreliggende sammenheng. I en meget foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse er den halogengivende kilden NaBr.

De heri benyttede uttrykk "pseudohalogen eller pseudohalogengivende kilde" skal betegne et hvilket som helst materiale som tilsatt til sammensetningen som benyttes i foreliggende oppfinnelse gir anioner som har en høy elektronaffinitet som er sammenlignbar med den til halogenene. Det skal påpekes at den pseudohalogengivende kilden typisk er, men er ikke begrenset til, en Gruppe IA-metallforbindelse. Pseudohalogenet eller den pseudohalogengivende kilden kan være en metall- eller ikke-metallforbindelse som beskrevet ovenfor for halogengivende kilder, som for eksempel ammonium, alkylammonium osv. og polymerer derav. Egnede pseudohalogener som kan være til stede i den analytiske signalgivende sammensetningen inkluderer, men er ikke begrenset til, CN", SCN", OCN", azid, isonitril og lignende. Av pseudohalogenene er SCN" særlig foretrukket. En foretrukket pseudohalogengivende kilde som benyttes i foreliggende oppfinnelse er NaSCN.

Den tredje komponenten i vaskesammensetningen som benyttes i foreliggende oppfinnelse er et peroksid eller en peroksidgenererende reagenssammensetning. Betegnelsen "peroksid" inkluderer uorganiske eller organiske peroksidforbindelser som er typisk benyttet i den tidligere teknikk. Det er ment at peroksidgenererende reagenssammensetning skal inkludere en hvilken som helst reagenssammensetning som kan produsere peroksid når den er tilsatt til den signalgivende sammensetningen som benyttes i foreliggende oppfinnelse. Slike peroksidgenererende reagenssammensetninger er velkjente for fagfolk innen denne teknikken og inkluderer perborater, peracetater, ureaperoksid og organiske peroksider slik som persyrer, peroksybenzosyre og oksoner samt hydroperoksider.

Vaskesammensetningen som benyttes i foreliggende oppfinnelse blir generelt bufret til en pH-verdi fra ca. 6,5 til ca. 10, mer foretrukket fra ca. 6,8 til ca. 8,0, ved anvendelse av en eller flere egnede biologiske buffere som har en pKa-verdi fra ca. 6,0 til ca. 8,0. Disse bufrene er velkjent innen teknikken. Illustrerende eksempler på slike buffere inkluderer tris(hydroksymetyl)aminometan-HCl (tris-HCl); 2-[N-morfolino]etansulfonsyre (MES); piperazin-N,N'-bis[2-etansulfonsyre] (PIPES); 3-[N-morfolino]-2-hydroksypropansulfonsyre (MOPSO), fosfatbuffere og lignende. Av de ovennevnte biologiske bufrene er tris-HCl særlig foretrukket.

I vaskesammensetningen i foreliggende oppfinnelse kan mengdene av hver komponent variere avhengig av dens tilsiktede bruk, spesielt reagensenes sensitivitet og andre faktorer som er velkjent for fagfolk innen teknikken. Følgende generelle områder er således ment å gi en veiledning for fagmannen.

Spesielt, mengden av buffer som benyttes i foreliggende oppfinnelse vil lett forstås av en fagmann innen teknikken fordi det er velkjent hvordan mengden av en hvilken som helst buffer som er nødvendig for opprettholdelse av en ønsket pH-verdi skal bestemmes. Mengden av signalgenererende forbindelse, DPD, er generelt minst ca. 0,01 mMolar, idet en mengde i området fra ca. 0,1 til ca. 10 mMolar er foretrukket.

Når det gjelder den andre komponenten, dvs. halogenet, pseudohalogenet, den halogengivende kilden eller pseudohalogengivende kilden, så er den normalt til stede i en mengde på minst ca. 0,1 mMolar. Mer foretrukket er halogenet, pseudohalogenet, den halogengivende kilden eller pseudohalogengivende kilden til stede i den signalgivende sammensetningen i en mengde fra ca. 50 til ca. 100 mMolar.

Med hensyn til den tredje komponenten, dvs. peroksidet eller den peroksidgenererende reagenssammensetningen, så er denne komponenten til stede i vaskesammensetningen i en mengde på minst ca. 0,02 mMolar. Mer foretrukket er peroksidet eller den peroksidgenererende reagenssammensetningen til stede i en mengde fra ca. 0,5 mMolar til ca. 1,0 mMolar.

Foreliggende element kan benyttes i en rekke forskjellige analyseformater for tilveiebringelse av kjemiluminescerende signal som respons på den reagerte eller ureagerte formen av den vanadiumbromperoksidase-merkede immunoreaktanten.

Følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse. Hvis ikke annet er angitt, så er alle reagenser og apparatur oppnådd fra Eastman Kodak Company eller andre kommersielle kilder.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av en vandig kjemiluminescerende sammensetning og en vanadiumbromperoksidase- oppløsning

Det ble fremstilt en vandig sammensetning for tilveiebringelse av et kjemiluminescerende signal, som følger: En bufferoppløsning (pH 8,0) ble fremstilt inneholdende 100 uM dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA), 0,75 M NaBr og 1%

cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB) i en 0,05 M tris-HCl buffer.

Den signalgivende sammensetningen ble fremstilt fra en todelt blanding. Den første delen inneholdt 1 mM Na-luminol og den andre delen inneholdt 1 mM H2O2, begge fremstilt i ovennevnte buffer. Disse to delene ble kombinert umiddelbart før bruk.

En vanadiumbromperoksidase (fra Ascophylum nodosum)-forrådsoppløsning lagret ved 4°C ble seriefortynnet i 0,05 M tris-HCl, pH 8, og 0,01% bovin serumalbumin (BSA) for oppnåelse av en kjent konsentrasjon av vanadiumbromperoksidasen varierende fra 10 til 50.000 attomol.

Det ble deretter fremstilt et belagt element som hadde følgende reagensmatrisesammensetning:

Kulespredningslag: 0,1 M tris, pH 8,0

polymerkuler (VtE)

bindemiddel (MaWnaMt)

0,5 g/m<2> TSH Ab-kuler

DTPA (10^M)

Gelpute: gelatin

0,2 M tris pH 8,0

DTPA (lO^M)

TX-100

herdemiddel (BVSME)

Bærer: 0,178 mm Estar (polyetylentereftalat)

Følgende definisjoner gjelder for den ovenfor angitte reagensmatrisen:

Tris: Tris(hydroksymetyl)aminometan-buffer.

Polymerkuler: Poly(vinyltoluen-ko-metakrylsyrekuler).

Bindemiddel: Poly(metylakrylat-ko-natirum 2-akrylamido-2-metylpropansulfonat-ko-2-acetoacetoksyetylmetakrylat).

TSH Ab-kuler: Poly(styren-ko-3-(p-vinylbenzyltio)propansyre) som på kovalent måte har tilfestet et antistoff mot thyroidstimulerende hormon (TSH).

TX-100: Triton X-100, et oktylfenoksy polyetoksyetanol-overflateaktivt middel solgt av Rohm and Haas Co.

BVSME: Bis(vinylsulfonyl)metyleter.

MaWnaMt = poly(me1ylakrylat-ko-2-akrylamido-2-metylpropansulfonsyre, natriumsalt-ko-acetoacetoksyetylmetakrylat) (90/4/6).

Evaluering av vanadiumbromperoksidase for kjemiluminescerende signal på et sensitivt immunoanalvse- deteks j onsbelegg

De ovenfor fremstilte bufrede oppløsningene av kjemiluminescerende signalgivende sammensetning og vanadiumbromperoksidase ble benyttet som følger: Et element i form av et preparatglass ble satt sammen ved anbringelse av en 16 mm<2> del av det ovenfor fremstilte belegg på en EKTACHEM (varemerke) C-preparatglassbasis (som beskrevet i US Serial No. 938.460 til Belly et al., nevnt ovenfor). Et Whatman GF/B-absorberende mikrofiberglassmateriale (Whatman Specialty Products Division, produkt nr. PD 008-12A-100) med et senterhull av en diameter på 10 mm for å muliggjøre anbringelse av en prøve, ble plassert over belegget. Et ugjennomtrengelig ringformet plasttoppstykke ble deretter plassert på det absorberende laget og hele det sammensatte elementet ble deretter forseglet med teip (med hensyn til fullstendige detaljer om det sammensatte elementet vises det til Fig. 1 og 2 i US Serial No. 938.460 til Belly et al.).

Elementet ble deretter vasket med 100 ul av den ovenfor beskrevne kjemiluminescerende signalgivende sammensetningen i en mengde på 1 fil/sek. Etter påføringen av vaskeoppløsningen ble den passende fortynningen av vanadiumbromperoksidase som beskrevet ovenfor i 5 ul av den kjemiluminescerende signalgivende sanmiensetningen avsatt på belegget. Elementet ble umiddelbart tatt fra hverandre og det kjemiluminescerende signalet til belegget ble målt ved anvendelse av et TURNER (varemerke) TD-20e luminometer ved omgivelsestemperatur. Luminometeret var modifisert for å romme det demonterte 16 mm<2> belegget ved bruk av et adapter som sørget for avlesning av den sentrale 10 mm diameter-delen av belegget.

Fig. 1 viser den kjemiluminescerende utgangen (10 sek. integral ved t=4 minutter erter anbringelse i det modifiserte luminometeret) under de ovenfor angitte betingelser for denne analysen. Mer spesielt viser Fig. 1 at det foreliggende element gir et absolutt signal som er lett å detektere slik som det i det tidligere kjente elementet.

På Fig. 1 inneholder kontrollelementet pepperrotperoksidase som et signalgenererende enzym, og 3,-klor-4l<->hydroksyacetanilid som en forsterker i vaskesammensetningen beskrevet i US patent 5.372.931 til Friedman et al., hvor vaskesammensetningen ble modifisert som følger: 0,05 M tris-HCl, pH 8,0, 0,1% cetyltrimetylammoniumklorid

(CTAC), 150 uM 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid i tillegg til de angitte komponentene deri.

Fig. 2 viser signal-til-støy-forholdet, et anerkjent mål for systemsensitivitet for fagfolk innen teknikken. Dataene på Fig. 2 ble oppnådd ved anvendelse av foreliggende element og et kontrollelement som inneholdt pepperrotperoksidase som et signalgenererende enzym. Vaskesammensetningen for HRP-kontrollen inkluderte 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid som en forsterker som beskrevet i US patent 5.372.931 til Friedman et al., modifisert som følger: 0,05 M tris-HCl, pH 8,0,0,1%

cetyltrimetylammoniumklorid (CTAC), 150 uM 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid i tillegg til de angitte komponentene deri. Denne figuren viser at foreliggende element gir større sensitivitet enn kontrollelementet.

EKSEMPEL 2

Sammenligning av elementstabilitet

Dette eksemplet sammenligner stabiliteten til vanadiumbromperoksidase i et tørrelement med den til HRP i et tørrelement. Det ble fremstilt et basisbelagt element som hadde følgende reagensmatrisesammensetning belagt på en 0,178 mm Estar (polyetylentereftalat)-bærer:

Tegnforklaring: VtE = poly(vinyltoluen-ko-metakrylsyre) (98/2)

MaWnaMt = poly(metylakrylat-ko-2-akrylarnido-2-metylpropansulfonsyre, natriumsalt-ko-acetoacetoksyetylmetakrylat) (90/4/6)

TES = N-[2-hydroksy-l,l-bis(hydroksymetyl)etyl] taurin BVSME = bis(vinylsulfonyl)metyleter

IMnAg = poly(N-isopropylakrylamid-ko-2-hyaroksyetylrnetakrylat-ko-metylenbisakrylamid) (85/5/10).

De samme reagensene som beskrevet i Eksempel 1 for vanadiumbromperoksidase-forrådsoppløsning ble benyttet i dette eksemplet med unntagelse for at vanadiumbromperoksidasen og HRP-forrådsoppløsningene ble fortynnet til 10" Q M i en 10 mM fosfatbuffer, pH 7,0.

Begge elementer ble satt sammen ved bruk av prosedyren beskrevet i Eksempel 1 med unntagelse for at det absorberende materialet ikke ble innbefattet i preparatglasselementet. Deretter ble 10 ul av enten ovennevnte vanadiumbromperoksidaseoppløsning eller ovennevnte HRP-forrådsoppløsning avsatt på elementene.

Hvert element ble deretter aldret i mørket ved romtemperatur i 30 minutter, 2,4, 6,24 og 48 timer. Etter hvert intervall ble elementet åpnet for å fjerne beleggmaterialet som deretter ble ekstrahert i 1 ml av en buffer inneholdende fosfat (pH 7,0), 0,15 M NaCl og 0,1% BSA. Det ekstraherte materialet ble deretter sentrifugert i ca. 2 rninutter for å separere de partikkelformige og faste materialene.

Målingen av enzymaktivitet ble gjennomført ved tilsetning av 200 ul av den passende signalgenererende oppløsningen til 10 ul av den ekstraherte supernatanten. For vanadiumbromperoksidasen ble foreliggende signalgivende vaskesammensetning benyttet. For HRP ble reagenssammensetningen som er beskrevet i Eksempel 1 i US patent 5.372.931 til Friedman et al. benyttet. Det kjemiluminescerende signalet ble deretter bestemt ved bruk av et DYNATECH (varemerke) ML3000 luminometer ved 37°C.

Resultatene fra disse forsøkene er vist grafisk på Fig. 3 (1,0 sek. integral, ved t=5 min., for hvert intervallpunkt). Figurer 4(a) og (b) er plottinger av dataene fra Fig. 3 og viser prosent gjenværende aktivitet i (a) HRP og (b) vanadiumbromperoksidase. Spesielt viser disse figurene klart at stabiliteten til det vanadiumbromperoksidaseholdige elementet forblir vesentlig konstant over en lengre tidsperiode (opp til 48 timer). I motsetning til dette, vises det tydelig en dramatisk nedgang i det HRP-holdige elementet.

Claims (10)

1. Analytisk element for bestemmelse av en spesifikk bindingsligand, karakterisert ved at elementet omfatter: (i) en porøs spredningssone; og (ii) minst én ytterligere sone som er i fluid kontakt med nevnte porøse spredningssone, hvor nevnte element, i i det minste én av nevnte soner, inneholder en vanadiumbromperoksidase-merket immunoreaktant som bindes spesifikt til en reseptor for en spesifikk bindingsligand av interesse.

2. Element ifølge krav 1, karakterisert ved at vanadiumbromperoksidasen er oppnådd fra Ascophyllum nodosum, Ceramirum rubrum, Laminaria saccharina, Fucus distichus, Corallina pilulifera, Corallina officinalis eller Macrocystis pyrifera.

3. Element ifølge krav 2, karakterisert ved at vanadiumbromperoksidasen er oppnådd fra Ascophyllum nodosum.

4. Element ifølge krav 1, karakterisert ved at det ytterligere omfatter (iii) et absorberende materiale i fluid kontakt med én eller flere av nevnte soner.

5. Analytisk flerlagselement for bestemmelse av en spesifikk bindingsligand, karakterisert ved at elementet omfatter en ikke-porøs bærer som derpå, i fluid kontakt, har: (i) en første reagens eller bufferlag; (ii) et "subbing"-lag omfattende en umerket immunoreaktant som spesifikt bindes med en spesifikk bindingsligand av interesse; og (iii) et porøst spredningslag inneholdende en vanadiumbromperoksidase-merket immunoreaktant.

6. Flerlagselement ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte vanadiumbromperoksidase er oppnådd fra Ascophyllum nodosum, Ceramirum rubrum, Laminaria saccharina, Fucus distichus, Corallina pilulifera, Corallina officinalis eller Macrocystis pyrifera.

7. Flerlagselement ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte vanadiumbromperoksidase er oppnådd fra Ascophyllum nodosum.

8. Flerlagselement ifølge krav 5, karakterisert ved at det porøse spredningslaget er et kulebesatt spredningslag.

9. Flerlagselement ifølge krav 5, karakterisert ved at det ytterligere omfatter (iv) et absorberende materiale i fluid kontakt med én eller flere av nevnte soner.

10. Fremgangsmåte for bestemmelse av en spesifikk bindingsligand, karakterisert ved: (A) anbringelse av en fluid prøve som mistenkes å inneholde nevnte spesifikke bindingsligand, i kontakt med et analytisk element som innbefatter: (i) en porøs spredningssone, og (ii) minst én ytterligere sone som er i fluid kontakt med nevnte porøse spredningssone, hvor elementet i minst en av nevnte soner inneholder en vanadiumbromperoksidase-merket immunoreaktant som spesifikt binder nevnte ligand; (B) påføring av en vaskeoppløsning på nevnte element for å bevirke en separering av den ureagerte formen av nevnte vanadiumbromperoksidase-merkede immunoreaktant fra den reaktive formen av nevnte vanadiumbromperoksidase-merkede immunoreaktant, hvor vaskeoppløsningen omfatter en sammensetning som har en pH-verdi fra ca. 6,5 til ca. 10, hvilken sammensetning innbefatter: (a) en kjemiluminescerende signalgenererende reagens som gir et signal som respons på den katalytiske aktiviteten til nevnte vanadiumbromperoksidase, hvor den signalgenererende reagensen er et 2,3-dihydro-l,4-ftalazindionderivat; (b) et halogen, pseudohalogen, halogengivende kilde eller pseudohalogengivende kilde; og (c) et peroksid eller en peroksidgenererende reagenssammensetning, og (C) detektering av enten nevnte ureagerte eller reagerte form av nevnte vanadiumbromperoksidase som et mål for nevnte spesifikke bindingsligand.