CN113588943A - 一种天然聚合多糖用于制备样本处理液及其在免疫层析检测试剂盒的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然聚合多糖Biosaccharide Gum‑1的新用途，具体为将天然聚合多糖Biosaccharide Gum‑1应用于降低体外诊断试剂盒非特异性信号。本发明进一步提供了一种包含天然聚合多糖Biosaccharide Gum‑1的样本处理液。处理液中的Biosaccharide Gum‑1可以增强荧光微球标记物的复溶性，更加易于从标记垫上释放，另外Biosaccharide Gum‑1由于其成膜特性，迅速在免疫反应包被膜上形成一层线性聚多糖膜，减小荧光微球标记物在包被膜上的非特异吸附，进而改善荧光免疫层析法检测试剂盒的检测灵敏度，同时降低试剂盒的假阳性。本发明提供的样本处理液具有以下优点：改善免疫层析法试剂盒中标记物的复溶性和标记垫的释放能力；降低试剂盒的非特异检测信号，改善免疫层析法试剂的检测灵敏度；减少试剂盒的假阳性。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体地，涉及一种天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1用于制备样本处理液及其在免疫层析检测试剂盒的应用。
背景技术
免疫层析检测试剂盒是基于免疫层析原理建立起来的一种适用于现场检测的技术，典型的免疫试纸包括样品垫、标记垫、包被膜和吸收垫。以硝酸纤维素膜作为固相载体包被的抗原或抗体得到反应膜，经毛细管虹吸作用使待测样品中的抗体或抗原与反应膜上包被物质结合，通过标记垫上胶体金或荧光标记物呈现反应结果。
硝酸纤维素膜是免疫层析试纸的重要功能部分，必须能够吸附足量的蛋白以保证能有锐利紧凑的捕获线形成，同时，非特异性背景应该足够低，以方便地进行结果读取。蛋白(如BSA)能有效地降低非特异背景，但它们也可能对膜的侧向流速率造成不利影响；通常也使用Tween 20、Triton X-100、PVP、Brij、PEG等表面活性剂或亲水聚合物进行封闭以降低膜的疏水性，同时也减少背景着色，并使反应膜达到均一或一致的样品润湿率
对于传染疾病检测，检测的重复性、灵敏度和精确性要求极高。例如，新型冠状病毒S蛋白抗体检测试剂盒(荧光免疫层析法)，要求检测的非特异背景更低以降低假阳性，同时还要求好的灵敏度以提高阳性检出率。在采用双抗原夹心法原理实现检测新冠病毒蛋白抗体的过程中，不可避免会采用单一的抗原作为包被抗原和标记抗原，夹心法检测时可能存在两个荧光标记抗原结合到同一个抗体从而导致灵敏度降低，出现弱阳性样本漏检的现象。因此如何增强待检测物与标记物的结合是提高检测灵敏度和准确性所必须解决的技术问题。
在实际测试过程中，血清等样本经样本处理液处理后复溶标记垫上的荧光微球标记物。但是，一些形状大小不规则的荧光微球标记物在结合过程中往往不能均一地包被蛋白，并且可能无法在溶液中形成排斥；这将导致聚集的形成，导致侧向流检测出现问题，极可能产生假阳性结果。
Biosaccharide Gum-1是一种通过细菌发酵获得的线性结构的阴离子多糖，由半乳糖醛酸，L-岩藻糖和D-半乳糖组成。这种天然衍生的聚合物在水性环境中被水合，从而形成了称为水凝胶的凝胶膜状结构。鉴于其既可以在皮肤表面也可以在头发上形成膜的能力，并且还可以捕获水分子，因此它具有优良的保湿特性，提供了舒适性和柔软性等卓越的感官能力。Biosaccharide Gum-1在化妆品行业得到大量应用。
我们首次发现Biosaccharide Gum-1可以比较好的增强标记垫上的标记物复溶和释放能力，也能有效降低反应膜的非特异背景，改善检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1用于制备样本处理液，这种技术可以改善标记垫上的标记物的复溶和释放能力，降低体外诊断试剂盒的非特异检测信号，提高待检测物与标记物的结合效果的方法。
为达到上述目的，本发明的第一个方面提供了一种天然聚合多糖BiosaccharideGum-1用于制备样本处理液的方法，所述方法包括：在pH为8.0-8.5的缓冲液中，制备含0.2％-0.4％(v/v)浓度Biosaccharide Gum-1的样本处理液；
其中，所述缓冲液是但不限于20mM-100mM的磷酸盐、Tris、硼酸等缓冲液；
优选的，所述缓冲液的pH值为8.0-8.5；
优选的，所述样本处理液还含有0.5％-2％(v/v)吐温20、0.9％-5％氯化钠和0.03％的proclin300等成份。
优选的，所述天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1的CAS号是178463-23-5。
本发明进一步提供了所述制备的样本处理液在免疫层析检测中的用途。同时，举例介绍用于检测新型冠状病毒S蛋白抗体的检测试剂盒(荧光免疫层析法)。
本发明进一步提供了新型冠状病毒蛋白S抗体检测试剂盒(荧光免疫层析法)，所述试剂盒含有本发明所述的样本处理液。
本发明公开了天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1在降低体外诊断试剂盒非特异性信号方面的应用。
优选的，所述体外诊断试剂盒为免疫层析法检测试剂盒，优选为，新型冠状病毒抗体荧光免疫层析法检测试剂盒。
优选的，所述处理液包括天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1。
优选的，所述处理液选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或硼酸缓冲液。
优选的，所述处理液中聚合多糖Biosaccharide Gum-1的浓度为0.2％-0.4％(V/V)。
优选的，所述磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或硼酸缓冲液的浓度为20mM-100mM。
优选的，所述处理液还包括吐温20、氯化钠以及proclin300。
本发明公开了一种免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括样本处理液，所述样本处理液包括天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1。
优选的，所述处理液中聚合多糖Biosaccharide Gum-1的浓度为0.2％-0.4％(V/V)。
本发明进一步公开了所述的处理液在制备免疫检测试剂盒中的用途，优选的，所述免疫检测试剂盒为荧光免疫层析检测试剂盒。
本公开的第三个方面提供的新型冠状病毒S蛋白抗体检测试剂盒(荧光免疫层析法)，采用新型冠状病毒抗原RBD蛋白标记荧光微球制备标记垫；采用新型冠状病毒抗原RBD蛋白包被硝酸纤维素膜制备反应膜；
其中，所述荧光微球为聚苯乙烯包埋镧系元素微球、聚乙烯包埋量子点微球或聚苯乙烯包埋有机荧光染料微球。其中，所述荧光微球的尺寸优选为50-300nm。
可选的，所述标记垫上含有的抗原标记微球是将所述抗原标记微球以2-3mg/mL的浓度溶于喷涂缓冲液中，使用3-5μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在标记垫上干燥后得到的。
在发明公开了一种试纸条，所述试纸条包括在基板上依次相连接的吸水垫、反应膜、标记垫和样品垫；所述反应膜上设置有C线和T线，所述T线上包被有新型冠状病毒抗原RBD蛋白，所述标记垫中含有包被了新型冠状病毒抗原RBD蛋白标记微球；所述C线上包被有新型冠状病毒抗原RBD蛋白的兔多克隆抗体。
本发明进一步公开了荧光免疫层析试纸条的检测原理为。将待检样品滴入样品垫中，若样品中有待测抗体，待检样品中的待测抗体先和所述抗原标记微球表面的抗原结合，由于毛细管作用，待测抗体和抗原标记微球形成的复合体沿基膜向前泳动，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素基膜上的新型冠状病毒抗原RBD蛋白，由于包被在硝酸纤维素基膜上的新型冠状病毒抗原RBD蛋白和抗原标记微球分别能与待测抗体的结合，从而形成“抗原标记微球-待测抗体-包被抗原”的双抗原夹心复合体，从而使得荧光微球富集在检测线上，形成特异性的层析线；没有和待测抗体结合的抗原标记微球则会直接通过检测线，达到质控线后被质控线上的抗体捕获，从而使得荧光微球富集在质控线上形成层析线，即判为阳性结果；若样品中无待测抗体，由于无法在检测线上形成“抗原标记微球-待测抗体-包被抗原”复合体，从而使得检测线上不会产生荧光微球富集，没有和待测抗体结合的抗原标记微球则会直接通过检测线，达到质控线后被质控线上兔抗新型冠状病毒抗原RBD蛋白的多克隆抗体捕获，从而使得荧光微球富集在质控线上，即判为阴性结果。
通过上述技术方案，本公开提供了含有天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1的新型样本处理液的制备方法。在样本处理液这样的水溶液中，Biosaccharide Gum-1迅速在硝酸纤维素膜上形成水凝胶样的凝胶膜状结构，本公开利用Biosaccharide Gum-1这种成膜特性在硝酸纤维素膜上达到封闭的作用，从而降低体外诊断试剂盒的非特异检测信号；利用Biosaccharide Gum-1的线性结构的阴离子多糖特性，增强水溶性的特点，改善了标记物的复溶和释放能力。本公开的技术具有以下优点：有效降低体外诊断试剂盒的非特异检测信号，改善标记物的复溶和释放能力，提高试剂检测性能；特别的，当利用本公开所提供的方法进行新型冠状病毒蛋白抗体的检测时，可以获得更高的检测灵敏度和特异性。
附图说明
图1.Biosaccharide gum-1多糖的基本单元结构
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1制备含有不同浓度天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1的样本处理液
在pH为8.0-8.5的硼酸缓冲液中，加入终浓度为1％(v/v)的吐温20、终浓度为0.9％氯化钠和终浓度为0.03％的proclin300，添加Biosaccharide Gum-1，制备不同工作浓度的包含Biosaccharide Gum-1的处理液，如下：
处理液1：pH为8.0-8.5的硼酸缓冲液，1％(v/v)的吐温20、终浓度为0.9％氯化钠和终浓度为0.03％的proclin300，Biosaccharide Gum-1浓度为0.2％(v/v)。
处理液2：pH为8.0-8.5的硼酸缓冲液，1％(v/v)的吐温20、终浓度为0.9％氯化钠和终浓度为0.03％的proclin300，Biosaccharide Gum-1浓度为0.4％(v/v)。
处理液3：pH为8.0-8.5的硼酸缓冲液，1％(v/v)的吐温20、终浓度为0.9％氯化钠和终浓度为0.03％的proclin300，Biosaccharide Gum-1浓度为0.6％(v/v)。
处理液4：pH为8.0-8.5的硼酸缓冲液，1％(v/v)的吐温20、终浓度为0.9％氯化钠和终浓度为0.03％的proclin300，Biosaccharide Gum-1浓度为0.8％(v/v)。
处理液5：pH为8.0-8.5的硼酸缓冲液，1％(v/v)的吐温20、终浓度为0.9％氯化钠和终浓度为0.03％的proclin300，Biosaccharide Gum-1浓度为0％(v/v)。
实施例2荧光免疫层析试纸条的制备
用喷金点膜机将新型冠状病毒抗原RBD蛋白和新型冠状病毒抗原RBD蛋白的兔多克隆抗体喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测T线和质控C线，然后烘干；将抗原标记荧光微球以2.3mg/mL的浓度溶于喷涂缓冲液中，使用4μL/cm的喷涂速度均匀的喷涂在标记垫上，所述喷涂缓冲液为含有0.3-0.7％的BSA和0.2-0.3％的Tween-20浓度为0.01-0.03M硼酸盐缓冲液，pH值为8.0-8.5。
对于T线和C线，喷金点膜机的喷涂速度为1μL/cm，T线为浓度1mg/mL的新型冠状病毒抗原RBD蛋白，C线为浓度1mg/mL的新型冠状病毒抗原RBD蛋白的兔多克隆抗体。
然后将样品垫、金标垫、喷有T线和C线的反应膜(硝酸纤维素膜)和吸水纸依次连接组装，而后裁切包装成新型冠状病毒S蛋白抗体检测试条。
实施例3样本处理液的特异性测定
(1)样品制备：采集人血清100μL。
(2)检测：取试纸条，室温平衡10分钟，打开包装取出试纸条；将50μL血清与50μL的样本处理液(实施例一中的各种样本处理液)，从中取90μL混合液加入到新型冠状病毒蛋白抗体检测试条样品垫上，静置15分钟后，将试纸条按照箭头方向插入干式荧光免疫检测仪中判定结果。比较不同样本处理液条件下的平行实验的结果。
(3)结果判定：当试纸条的T/C＜0.12时，判为阴性，记为“-”；当试纸条的T/C＜0.12时，判为阳性，记为“+”。
选用含干扰物的血清，包括过敏原阳性血清、类风湿疾病患者血清进行特异性测定，检测结果如表1所示。
结果表明，在没有加入Biosaccharide Gum-1的处理液5中，检测结果T/C偏高，干扰物造成了假阳性。
在处理液1中，Biosaccharide Gum-1的工作浓度为0.2％(v/v)和处理液2中Biosaccharide Gum-1的工作浓度为0.4％(v/v)。这两个实施例的测试结果均为阴性，消除了过敏原阳性血清、类风湿疾病患者血清中干扰物质的影响。
在处理液3中，Biosaccharide Gum-1的工作浓度为0.6％(v/v)；处理液4中，Biosaccharide Gum-1的工作浓度为0.8％(v/v)。但是，虽然测试结果均为阴性，但是测定信号T/C均高于处理液1和处理液2的T/C，表明过高浓度的Biosaccharide Gum-1可能不利于消除背景干扰。
因此，本发明优选的Biosaccharide Gum-1的工作浓度为0.2％-0.4％(v/v)。
表1样本处理液特异性试验结果
实施例4样本处理液的灵敏度测定
将兔抗新型冠状病毒抗原RBD蛋白抗体进行梯度稀释，用试纸条进行灵敏度检测，检测结果见表2，表2结果显示，处理液1和处理液2的试纸条的灵敏度可达0.4mg/mL，而用处理液5的灵敏度为0.6mg/mL，说明利用本公开所述的方法能提高检测灵敏度。工作浓度为0.2％-0.4％(v/v)的Biosaccharide Gum-1更有效，因此作为优选。
表2样本处理液灵敏度试验结果
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1在降低体外诊断试剂盒非特异性信号方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述体外诊断试剂盒为免疫层析法检测试剂盒，优选为，新型冠状病毒抗体荧光免疫层析法检测试剂盒。
3.一种用于免疫层析的样本处理液，其特征在于，所述处理液包括天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1。
4.根据权利要求3所述的处理液，其特征在于，所述处理液选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或硼酸缓冲液。
5.根据权利要求3-4任一权利要求所述的处理液，其特征在于，所述处理液中聚合多糖Biosaccharide Gum-1的浓度为0.2％-0.4％(V/V)。
6.根据权利要求5所述的处理液，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或硼酸缓冲液的浓度为20mM-100mM。
7.根据权利要求6所述的处理液，其特征在于，所述处理液还包括吐温20、氯化钠以及proclin300。
8.一种免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本处理液，所述样本处理液包括天然聚合多糖Biosaccharide Gum-1，优选的，所述免疫检测试剂盒为荧光免疫层析检测试剂盒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述处理液中聚合多糖BiosaccharideGum-1的浓度为0.2％-0.4％(V/V)。
10.权利要求3-7任一所述的处理液在制备免疫检测试剂盒中的用途，优选的，所述免疫检测试剂盒为荧光免疫层析检测试剂盒。
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