CN105200157B - 胃癌的血浆miRNA生物标志物组合、其应用及胃癌早期诊断试剂盒 - Google Patents

胃癌的血浆miRNA生物标志物组合、其应用及胃癌早期诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了胃癌的血浆miRNA生物标志物组合及其应用，包括以下血浆miRNA：miR‑190a、miR‑331‑5p、miR‑362‑3p和miR‑369‑3p，以miR‑16作为内参。对miR‑190a、miR‑331‑5p、miR‑362‑3p和miR‑369‑3p联合检测可获得良好的胃癌诊断价值，可以实现胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断。以miR‑16作为内参，极大地提高了对本发明胃癌血浆miRNA生物标志物组合检测时相对定量的准确度。以本发明的生物标记物组合为靶标开发的胃癌miRNA检测试剂盒，检测快速方便、检测灵敏度、特异性高、成本低，可以满足绝大多数胃肿瘤病人的检测需求，应用范围广，经临床验证预测准确率高。

Description

胃癌的血浆miRNA生物标志物组合、其应用及胃癌早期诊断试 剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域中的miRNA及其应用，特别是涉及胃癌的血浆miRNA生物标志物组合及其在胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断中的应用。
背景技术
胃癌是常见恶性肿瘤之一，其死亡率位居第三。最近数据表明，在我国城市男性恶性肿瘤发病率和女性恶性肿瘤死亡率排名中，胃癌均位列第二，是严重威胁人类健康和制约经济社会发展的重大公共健康问题。胃癌的早期诊断意味着可以提早干预治疗，对患者的预后意义重大。目前，用于胃癌诊断主要依赖于内镜活检，而这种方法有创，给患者带来痛苦，且对实施此项技术的医师有较高要求。胃癌的无创检查方法主要是血清肿瘤标志物，例如癌胚抗原CEA、CA199等，但是诊断的灵敏度和特异性较低。因此，寻找具有较高灵敏度和特异性的肿瘤标志物对胃癌患者的早诊早治具有重要意义。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类平均长度约22(19-24)个核苷酸的非编码RNA，它广泛参与了机体正常生理活动调节。miRNA可以同时调节众多靶基因，其在细胞中的异常表达将会导致肿瘤的产生。miRNA不但能在肿瘤组织中检测到，而且在众多体液中也能稳定存在，能耐受酸碱等极端环境。不仅如此，有研究指出不同肿瘤患者血浆中miRNA的种类具有特异性，这种特性为利用miRNA作为非侵入性的诊断标志物进行早期胃癌检测提供了契机。在胃癌检测中，肖斌等发明了利用组织中的miR-30b检测(或诊断)胃癌的试剂盒，利用组织中的miR-30b检测(或诊断)胃癌具有灵敏度较高(达93.33％)的优点，但是此发明没有提及miR-30b诊断胃癌的特异性如何，也即区分正常人群的能力，另一方面，该试剂盒应用上受限，这是由于受检物癌灶组织标本需要经侵入性操作取得，况且如果能取得胃癌原发灶组织，完全可以通过病理来诊断(肖斌,邹全明,朱恩东,黎伯胜,毛旭虎,李娜,郭刚.一种用于诊断或检测胃癌的试剂盒[P].重庆：CN102002532A,2011-04-06.)。进一步的，张正东等发明了利用血浆/血清中miR-148a、miR-142、miR-26a和miR-195四种miRNA中的一种或几种诊断胃癌的试剂盒(张正东,王美林,康美云,刘桑,储海燕,仝娜,吴冬梅,赵庆洪,龚伟达.检测胃癌的血清/血浆微小RNA标志物及其应用[P].江苏：CN103773761A,2014-05-07.)，在此种试剂盒中，U6基因作为内参，但已有文献报道U6基因在血浆中表达并不稳定，因而以U6基因作为内参基因计算以上四种miRNA的含量就有可能产生误差，进而影响诊断的准确性(Benz F,Roderburg C,Vargas CD,et al.U6 is unsuitable fornormalization of serum miRNA levels in patients with sepsis or liverfibrosis.ExpMol Med.2013.45:e42；Xiang M,Zeng Y,Yang R,et al.U6 is not asuitable endogenous control for the quantification of circulatingmicroRNAs.BiochemBiophys Res Commun.2014.454(1):210-4.)，另外，此发明是利用四种miRNA中的一种或几种诊断胃癌，但是，发明人并没有说明何时采用一种miRNA诊断，何时采用两种、三种或四种miRNA联合诊断，也没有说明何时采用血清诊断，何时采用血浆诊断，而且如果当用一种miRNA诊断胃癌的结果与用多种miRNA联合诊断胃癌的结果不一致时，也就是说若一种miRNA诊断结果判定为胃癌，而多种miRNA联合诊断同一受试者结果判定为非胃癌时，此时该如何判定诊断结果，此发明中均未说明，无疑会给使用者造成困扰。因此，迫切需要一种准确、特异、灵敏的利用miRNA诊断胃癌的方法及其专用引物、探针与试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的是提供一组用于胃癌早期诊断和罹患风险评估的血浆miRNA标志物组合，利用该血浆miRNA生物标志物组合可用于诊断受试者是否罹患胃癌并进行罹患风险评估。
本发明所提供的胃癌的血浆miRNA生物标志物组合，包括以下血浆miRNA：miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p，以及miR-16作为内参。其中，miR-190a的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，miR-331-5p的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，miR-362-3p的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，miR-369-3p的序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，miR-16的序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
本发明的miRNA生物标志物组合能在血浆中稳定存在，其在正常人血浆、胃良性病变患者血浆和胃恶性肿瘤患者血浆中的表达量具有差异性，因此，能用于胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断。因此，本发明的miRNA生物标志物组合在胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及胃癌早期临床诊断中的应用也属于本发明内容。
以上述血浆miRNA生物标志物组合为靶标，用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术可用于诊断胃癌。
因此，上述血浆miRNA组合作为胃癌早期联合诊断生物标志物的应用也是本发明内容。
在所述PCR检测中所述miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p各生物标志物联合使用按下式系数分配用于对胃癌进行判断：
Y＝6.302×AmiR-190a+18.486×BmiR-331-5p+50.194×CmiR-362-3p+16.113×DmiR-369-3p
其中，AmiR-190a是miR-190a在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，BmiR-331-5p是miR-331-5p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，CmiR-362-3p是miR-362-3p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，DmiR-369-3p是miR-369-3p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)。
本发明的另一目的是提供一种用于胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断的miRNA试剂盒。
本发明所提供的miRNA试剂盒，包含与所述miRNA生物标志物组合PCR检测相关的引物，分别为：
miR-190a的RT引物(序列表中SEQ ID NO.6所示)和F端引物(序列表中SEQ IDNO.11所示)；
miR-331-5p的RT引物(序列表中SEQ ID NO.7所示)和F端引物(序列表中SEQ IDNO.12所示)；
miR-362-3p的RT引物(序列表中SEQ ID NO.8所示)和F端引物(序列表中SEQ IDNO.13所示)；
miR-369-3p的RT引物(序列表中SEQ ID NO.9所示和F端引物(序列表中SEQ IDNO.14所示)；
内参miR-16的RT引物(序列表中SEQ ID NO.10所示)和F端引物(序列表中SEQ IDNO.15所示)；以及
通用R端引物(序列表中SEQ ID NO.16所示)。
上述试剂盒具体可包括以下引物和探针：
1)用于合成cDNA的逆转录引物：是特异性的RT茎环引物，miR-190a的RT引物序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，miR-331-5p的RT引物序列如序列表中SEQ ID NO.7所示，miR-362-3p的RT引物序列如序列表中SEQ ID NO.8所示，miR-369-3p的RT引物序列如序列表中SEQ ID NO.9所示，miR-16的RT引物序列如序列表中SEQ ID NO.10所示；
2)用于实时荧光定量PCR的引物和TaqMan探针：miR-190a的F端引物(正向引物)序列如序列表中SEQ ID NO.11所示，R端引物(反向通用引物)序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQ ID NO.17所示；miR-331-5p的F端引物(正向引物)序列如序列表中SEQ ID NO.12所示，R端引物(反向通用引物)序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQ ID NO.18所示；miR-362-3p的F端引物(正向引物)序列如序列表中SEQ ID NO.13所示，R端引物(反向通用引物)序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQ ID NO.19所示；miR-369-3p的F端引物(正向引物)序列如序列表中SEQ ID NO.14所示，R端引物(反向通用引物)序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQ ID NO.20所示；miR-16的F端引物(正向引物)序列如序列表中SEQ ID NO.15所示，R端引物(反向通用引物)序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQ ID NO.21所示。
所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，如HEX、FAM等，优选为FAM，其3’端标记有淬灭荧光基团，如ECLIPSE、TAMRA、MGB等，优选为MGB。
所述试剂盒还包括以下用于逆转录反应体系的试剂(可检测100次)：1mL逆转录缓冲液(10×)，100μL脱氧核苷酸(100mM),50μL RNA酶抑制剂(20U/μL),150μL逆转录酶(50U/μL)。
所述试剂盒还包括以下用于实时荧光定量PCR反应体系的试剂(可检测100次)：1.5ml PCR预混液(2×)，100μL F端引物液(20μM)，100μL R端引物液(20μM)，20μLTaqman探针引物(10μM)和2mL无核酸酶水。
以上述血浆miRNA生物标志物组合为靶标，使用上述miRNA试剂盒基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术诊断胃癌的方法，可进行以下操作：
1)制备待测人血浆样本，以健康人血浆样本作为正常对照；
2)提取血浆总RNA；
3)将血浆总RNA逆转录成cDNA；
4)以cDNA为模板，在miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16(内参)的特异引物和TaqMan探针的引导下，用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16(内参)在待测人血浆和健康人血浆中的表达量采用2-ΔΔCt表示待测样本中目的miRNA表达量相对于正常对照组变化的倍数：
2-ΔΔCt值中，ΔCt＝Ct目的miRNA-Ct内参miRNA，
ΔΔCt＝ΔCt待测样本-ΔCt正常对照；
5)采用2-ΔΔCt相对定量法分析数据，Logistic回归方程(判断公式)：Y＝6.302×AmiR-190a+18.486×BmiR-331-5p+50.194×CmiR-362-3p+16.113×DmiR-369-3p，其中，AmiR-190a是miR-190a在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，BmiR-331-5p是miR-331-5p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，CmiR-362-3p是miR-362-3p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，DmiR-369-3p是miR-369-3p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，ΔΔCt＝(CtmiRNA-CtmiR-16)Cancer-(CtmiRNA-CtmiR-16)Mean Normal，CtmiRNA和CtmiR-16分别代表用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测到的目的miRNA(miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p或miR-369-3p)和内参miRNA(miR-16)的Ct值，Cancer代表待测人血浆样本，Nomal代表健康人血浆样本(正常对照)，Mean normal代表所有健康人血浆样本(正常对照)的平均值。
当Y>4.6时，即预测概率值大于4.6时判为阳性(患胃癌)，反之为阴性(未患胃癌)。
以上方法中，所述步骤3)中的15μL逆转录反应体系为：5μL总RNA，1.5μL逆转录缓冲液(10×)1μL逆转录酶(50U/μL)，0.15μL dNTPs(100mM)，0.19μL RNA酶抑制剂(20U/μL)，3μL RT引物(500nM)和4.16μL无核酸酶水；逆转录反应条件为：16℃反应30min，42℃反应30min，85℃反应5min，然后置于4℃保存。
所述步骤4)中的20μL基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR反应体系为：1.33μLcDNA，0.4μL F端引物(20μM)，0.4μL R端引物(20μM)，0.1μL TaqMan探针(10μM)，10μL实时定量PCR预混液(2×)和7.77μL无核酸酶水；基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR反应条件为：95℃反应10min，95℃反应15秒，60℃反应60秒，40个循环。
本发明基于提出的miRNA生物标志物组合进而得到早期胃癌诊断试剂盒和应用，具有以下有益效果：
(1)miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p可作为胃癌早期诊断和罹患风险评估的生物标志物组合，对miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p联合检测可获得良好的胃癌诊断价值，可以实现胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断，提高患者的生存率。
(2)以miR-16作为内参，极大地提高了对本发明胃癌血浆miRNA生物标志物组合检测时相对定量的准确度。
(3)本发明还提供了以miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p这四个miRNA生物标记物组合为靶标的胃癌miRNA检测试剂盒，检测快速方便、检测灵敏度、特异性高、成本低，可以满足绝大多数胃肿瘤病人的检测需求，应用范围广，经临床验证预测准确率高。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为miR-190a在胃癌患者血浆和健康对照血浆中表达量的差异对比和ROC曲线图；
图2为miR-331-5p在胃癌患者血浆和健康对照血浆中表达量的差异对比和ROC曲线图；
图3为miR-362-3p在胃癌患者血浆和健康对照血浆中表达量的差异对比和ROC曲线图；
图4为miR-369-3p在胃癌患者血浆和健康对照血浆中表达量的差异对比和ROC曲线图；
图5为miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p(以miR-16为内参)四个miRNA联合检测的ROC曲线图。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物和TaqMan探针由Life Technologies公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、胃癌血浆miRNA生物标志物组合
本发明确定的胃癌血浆miRNA生物标志物组合，包括以下血浆miRNA：
miR-190a：5’-ugauauguuugauauauuaggu-3’(序列表中SEQ ID NO.1)，
miR-331-5p：5’-cuagguauggucccagggaucc-3’(序列表中SEQ ID NO.2)，
miR-362-3p：5’-aacacaccuauucaaggauuca-3’(序列表中SEQ ID NO.3)，
miR-369-3p：5’-aauaauacaugguugaucuuu-3’(序列表中SEQ ID NO.4)；
miR-16(内参)：5’-uagcagcacguaaauauuggcg-3’(序列表中SEQ ID NO.5)。
以上四种胃癌血浆miRNA(miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p)均为已知的生物标志物，选择其组合，是基于芯片筛选优化的结果。
miRNA种类筛选实验：
发明人前期曾利用血浆miR-214作为胃癌的诊断标志物，其ROC曲线下面积为0.845，相关结果已发表(见Zhang KC,et al.Hemolysis-free plasma miR-214 as novelbiomarker of gastric cancer and is correlated with distant metastasis.Am JCancer Res 2015；5:821-829.)，小于上述本发明确定的多标志物联合诊断的曲线下面积0.87，可见联合诊断更具有诊断优势。
设置内参miRNA的目的是为了更准确测定血浆中其他miRNA含量，miR-16已被证实可在血浆中稳定存在且不同状态下含量能保持一致，前期的研究和已有文献也将其作为稳定内参使用(Zhang KC,et al.Hemolysis-free plasma miR-214 as novel biomarker ofgastric cancer and is correlated with distant metastasis.Am J Cancer Res2015；5:821-829；Schwarzenbach H,et al.Diagnostic potential of PTEN-targetingmiR-214 in the blood of breast cancer patients.Breast Cancer ResTreat.2012.134(3):933-41.)。
实施例2、胃癌miRNA检测试剂盒及使用方法
在实施例1确定的胃癌血浆miRNA生物标志物组合基础上，进一步提供其在胃癌miRNA检测中的应用方案。
一、胃癌miRNA检测试剂盒的组成
本发明的胃癌miRNA检测试剂盒，包括：1)用于逆转录反应的引物和试剂；2)用于实时荧光定量PCR反应的引物、TaqMan探针和试剂。
1、用于逆转录反应的引物
本发明提供的逆转录引物为Oligo(dT)特异性的RT引物，具体序列如下：
miR-190a的RT引物：5’-gttggctctggtgcagggtccgaggtattcgcacacctaata-3’(序列表中SEQ ID NO.6)，
miR-331-5p的RT引物：5’-gttggctctggtgcagggtccgaggtattcgcacggatccct-3’(序列表中SEQ ID NO.7)，
miR-362-3p的RT引物：5’-gttggctctggtgcagggtccgaggtattcgcactgaatcct-3’(序列表中SEQ ID NO.8)，
miR-369-3p的RT引物：5’-gttggctctggtgcagggtccgaggtattcgcacaaagatca-3’(序列表中SEQ ID NO.9)，
miR-16(内参)的RT引物：5’
-gttggctctggtgcagggtccgaggtattcgcaccgccaata-3’(序列表中SEQ ID NO.10)。
用于逆转录反应的5种RT引物分开逐瓶封装，封装的体积是100次的用量，RT引物500μL/瓶，RT引物浓度为500nM。
2、用于逆转录反应的试剂
用于配制逆转录反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配制成逆转录反应体系，逆转录反应体系为15μL/次，封装的体积是100次的用量，具体试剂组成见表1。
表1 胃癌miRNA检测试剂盒中用于逆转录反应的试剂组成
组分 体积 使用浓度
逆转录缓冲液 1.5μL 10×
逆转录酶 1μL 50U/μL
dNTPs 0.15μL 100mM
RT引物 3μL 500nM
RNA酶抑制剂 0.19μL 20U/μL
无核酸酶水 4.16μL -
RNA 5μL -
3、用于实时荧光定量PCR反应的引物、TaqMan探针
本发明提供用于实时荧光定量PCR反应的引物、TaqMan探针序列如下：
miR-190a：
F端引物(正向引物)：5’-gcgcgctgatatgtttgata-3’(序列表中SEQ ID NO.11)，
R端引物(反向通用引物)：5’-gtgcagggtccgaggt-3’(序列表中SEQ ID NO.16)，
TaqMan探针：5’-cgaggtattcgcacacctaata-3’(序列表中SEQ ID NO.17)；
miR-331-5p：
F端引物(正向引物)：5’-gcgcgtctaggtatggtccc-3’(序列表中SEQ ID NO.12)，
R端引物(反向通用引物)：5’-gtgcagggtccgaggt-3’(序列表中SEQ ID NO.16)，
TaqMan探针：5’-cgaggtattcgcacggatccct-3’(序列表中SEQ ID NO.18)；
miR-362-3p：
F端引物(正向引物)：5’-tcgcgtaacacacctattca-3’(序列表中SEQ ID NO.13)，
R端引物(反向通用引物)：5’-gtgcagggtccgaggt-3’(序列表中SEQ ID NO.16)，
TaqMan探针：5’-cgaggtattcgcactgaatcct-3’(序列表中SEQ ID NO.19)；
miR-369-3p：
F端引物(正向引物)：5’-tcgcgtaataatacatggtt-3’(序列表中SEQ ID NO.14)，
R端引物(反向通用引物)：5’-gtgcagggtccgaggt-3’(序列表中SEQ ID NO.16)，
TaqMan探针：5’-cgaggtattcgcacaaagatca-3’(序列表中SEQ ID NO.20)；
miR-16(内参)：
F端引物(正向引物)：5’-cgcgcgtagcagcacgtaaa-3’(序列表中SEQ ID NO.15)，
R端引物(反向通用引物)：5’-gtgcagggtccgaggt-3’(序列表中SEQ ID NO.16)，
TaqMan探针：5’-cgaggtattcgcaccgccaata-3’(序列表中SEQ ID NO.21)。
上述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团FAM，其3’端标记有淬灭荧光基团MGB(其他报告荧光基团如HEX也可，其他淬灭荧光基团如ECLIPSE、TAMRA也可)。
用于实时荧光定量PCR反应的引物、TaqMan探针分开逐瓶封装，封装的体积是100次的用量，F端引物100μL/瓶，F端引物浓度为20μM，R端引物100μL/瓶，R端引物浓度为20μM，TaqMan探针20μL/瓶，TaqMan探针浓度为10μM。
4、用于实时荧光定量PCR反应的试剂
用于配制实时荧光定量PCR反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配制成实时荧光定量PCR反应体系，实时荧光定量PCR反应体系为20μL/次，封装的体积是100次的用量，具体试剂组成见表2。
表2 胃癌miRNA检测试剂盒中用于实时荧光定量PCR反应的试剂组成
组分 体积 使用浓度
PCR预混液 10μL 2×
F端引物 0.4μL 20μM
R端引物 0.4μL 20μM
TaqMan探针 0.1μL 10μM
无核酸酶水 7.77μL -
逆转录产物 1.33μL -
二、胃癌miRNA检测试剂盒的使用方法
本发明胃癌miRNA检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1、制备待测人血浆样本，以健康人血浆作为正常对照
采集空腹抗凝新鲜血5mL，3000rpm离心10min，收集上层血浆，-80℃保存。
2、提取血浆中的总RNA
总RNA提取采用QIAGEN公司试剂盒(miRNeasy Mini Kit：货号217004)，按说明书方法操作使用。
提取总RNA样本后通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量，最终加入逆转录反应体系中的总RNA样本OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间的可获得最优反应结果，这是因为保证了RNA的纯度和质量。
3、将血浆总RNA逆转录成cDNA
15μL逆转录反应体系：5μL总RNA，1.5μL逆转录缓冲液(10×)1μL逆转录酶(50U/μL)，0.15μL dNTPs(100mM)，0.19μL RNA酶抑制剂(20U/μL)，3μL RT引物(500nM)和4.16μL无核酸酶水。
逆转录反应条件：16℃反应30min，42℃反应30min，85℃反应5min，然后置于4℃保存。
4、以cDNA为模板，在miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16(内参)的特异引物和TaqMan探针的引导下，用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16(内参)在待测人血浆和健康人血浆中的表达量(2-ΔΔCt值：Ct值代表一种目的miRNA达到实验设计阈值(15-40)所需要的PCR循环的次数，当Ct值>40时，认为样本中不含有该目的miRNA，在目标miRNA与内参扩增效率相同的情况下可以直接得到目的miRNA相对于内参miRNA的定量ΔCt＝Ct目的miRNA-Ct内参miRNA，ΔΔCt＝ΔCt待测样本-ΔCt正常对照，采用2-ΔΔCt表示待测样本中目的miRNA表达量相对于正常对照组变化的倍数)，反应体系及反应条件如下：
20μL实时荧光定量PCR反应体系：1.33μL cDNA，0.4μL F端引物(20μM)，0.4μL R端引物(20μM)，0.1μL TaqMan探针(10μM)，10μL实时定量PCR预混液(2×)和7.77μL无核酸酶水；
实时荧光定量PCR反应条件：95℃反应10min，95℃反应15秒，60℃反应60秒，40个循环。
5、结果判定
采用2-ΔΔCt相对定量法分析数据：针对选定的四种miRNA标志物的性质，通过Logistic回归方程拟合四个目的miRNA(miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p)的血浆表达量，得到Logistic回归方程(判断公式)：Y＝6.302×AmiR-190a+18.486×BmiR-331-5p+50.194×CmiR-362-3p+16.113×DmiR-369-3p，其中，AmiR-190a是miR-190a在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，BmiR-331-5p是miR-331-5p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，CmiR-362-3p是miR-362-3p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，DmiR-369-3p是miR-369-3p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，ΔΔCt＝(CtmiRNA-CtmiR-16)Cancer-(CtmiRNA-CtmiR-16)Mean Normal，CtmiRNA和CtmiR-16分别代表用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测到的目的miRNA(miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p或miR-369-3p)和内参miRNA(miR-16)的Ct值，Cancer代表待测人血浆样本，Nomal代表健康人血浆样本(正常对照)，Mean normal代表所有健康人血浆样本(正常对照)的平均值。当Y>4.6时，即预测概率值大于4.6时判为阳性(患胃癌)，反之为阴性(未患胃癌)。
应用例1
采用实施例1的胃癌miRNA检测试剂盒对50例胃癌病人及50例健康人(正常对照)血浆中目的miRNA的表达量进行检测，即miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p的表达量(2-ΔΔCt值)，以miR-16为内参。
具体检测方法，包括以下步骤：
1、采集血浆
采集50例胃癌病人(所有病人都经过资深病理医生的病理诊断，之前未患其它肿瘤，且未经过化学药物或放射治疗)和50例健康人(正常对照，均为无肿瘤患者良性病人)空腹抗凝新鲜血5mL，3000rpm离心10min，收集上层血浆，-80℃保存。
2、提取血浆中的总RNA
提取前，将血浆在4℃、12000rpm离心15min(目的是去除血浆中细胞裂解物)，采用QiagenmiRNeasy Mini kit试剂盒(购自QIAGEN公司)按照说明书从400μL血浆中提取总RNA。
通过测定OD260/OD280的比值控制总RNA的质量，最终加入逆转录反应体系中的总RNA的OD260/OD280比值在1.8-2.0之间的可获得最优反应结果，这是因为保证提取RNA的质量和纯度。
3、将血浆总RNA逆转录成cDNA
15μL逆转录反应体系：5μL总RNA，1.5μL逆转录缓冲液(10×)1μL逆转录酶(50U/μL)，0.15μL dNTPs(100mM)，0.19μL RNA酶抑制剂(20U/μL)，3μL RT引物(500nM)和4.16μL无核酸酶水。
逆转录反应条件：16℃反应30min，42℃反应30min，85℃反应5min，然后置于4℃保存。
4、基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR反应
以cDNA为模板，在miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16(内参)的特异引物和TaqMan探针的引导下，用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16(内参)在待测人血浆和健康人血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，反应体系及反应条件如下：
20μL实时荧光定量PCR反应体系：1.33μL cDNA，0.4μL F端引物(20μM)，0.4μL R端引物(20μM)，0.1μL TaqMan探针(10μM)，10μL实时定量PCR预混液(2×)和7.77μL无核酸酶水；
实时荧光定量PCR反应条件：95℃反应10min，95℃反应15秒，60℃反应60秒，40个循环。
5、结果分析
miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p在胃癌病人血浆(patient)和健康人(正常对照，control)血浆中的含量如图1-图4(左侧图)所示，miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p四个miRNA在胃癌病人血浆和健康人血浆中的表达量均有显著性差异，P值分别为P＝0.003(miR-190a)、P＝0.017(miR-331-5p)、P<0.001(miR-362-3p)和P<0.001(miR-369-3p)，通过受试工作者曲线(ROC)分析单个miRNA的诊断效能，结果如图1-图4(右侧图)所示，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.72(miR-190a)、0.65(miR-331-5p)、0.75(miR-362-3p)和0.77(miR-369-3p)，灵敏度分别为80％(miR-190a)、94％(miR-331-5p)、58％(miR-362-3p)和76％(miR-369-3p)，特异度分别为66％(miR-190a)、36％(miR-331-5p)、80％(miR-362-3p)和72％(miR-369-3p)，可见单个miRNA诊断的曲线下面积均在0.8以下，诊断效能较低；再利用公式Y＝6.302×AmiR-190a+18.486×BmiR-331-5p+50.194×CmiR-362-3p+16.113×DmiR-369-3p拟合四个miRNA检测数据得到的ROC曲线如图5所示，ROC曲线下面积为0.87，诊断效能高。另实际检测灵敏度(在患者中检出患者的能力)为0.84，特异度为0.84(在非患者中检出非患者的能力)，参见表3数据，说明拟合后的灵敏度和特异性得到了提高，表明对miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p四个miRNA联合检测具有良好的胃癌诊断价值。
采用2-ΔΔCt相对定量法分析数据，Logistic回归方程(判断公式)：Y＝6.302×AmiR-190a+18.486×BmiR-331-5p+50.194×CmiR-362-3p+16.113×DmiR-369-3p，其中，AmiR-190a是miR-190a在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，BmiR-331-5p是miR-331-5p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，CmiR-362-3p是miR-362-3p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，DmiR-369-3p是miR-369-3p在血浆中的表达量(2-ΔΔCt值)，ΔΔCt＝(CtmiRNA-CtmiR-16)Cancer-(CtmiRNA-CtmiR-16)Mean Normal，CtmiRNA和CtmiR-16分别代表用实时荧光定量PCR技术检测到的目的miRNA(miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p或miR-369-3p)和内参miRNA(miR-16)的Ct值，Cancer代表待测病例血浆样本组，Nomal代表正常对照组，Mean normal代表所有正常对照组的平均值。结果50例胃癌病人和50例健康人(正常对照)的Y值如表3所示，可见84％胃癌病人的Y值均大于4.6，因此，当Y>4.6时，即预测概率值大于4.6时判为阳性(患胃癌)，反之为阴性(未患胃癌)，进一步证明对miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p联合检测(以miR-16为内参)可获得良好的胃癌诊断价值，miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16(内参)组合可作为胃癌早期诊断和罹患风险评估的生物标志物。
表3 50例胃癌病人和50例健康人(正常对照)的Y值
编号 健康人Y值 胃癌病人Y值
1 5.082154* 7.270277
2 4.203833 7.145472
3 2.408014 5.862875
4 4.999296 4.149756*
5 2.729897 8.425358
6 2.784680 5.521001
7 3.762528 5.203695
8 4.429290 4.873292
9 3.956768 5.164628
10 3.787315 6.237817
11 5.726863* 4.928621
12 8.230445* 4.662352
13 2.419111 8.088269
14 1.652719 3.111506*
15 2.445635 3.403169*
16 2.935082 6.578638
17 3.830886 7.050210
18 3.143325 7.508130
19 3.699946 8.169511
20 3.336969 4.897835
21 4.032678 7.382041
22 7.108193* 7.365273
23 3.508201 5.409306
24 4.191105 6.016298
25 2.124487 5.408450
26 2.376147 6.002520
27 3.152604 6.689729
28 7.414814* 5.430355
29 2.471623 4.598793*
30 7.953907* 4.946882
31 2.954346 9.402461
32 4.563389 4.393378*
33 4.528242 5.328124
34 4.570282 6.804477
35 2.930119 10.638080
36 4.256062 6.843471
37 3.617573 4.226361*
38 4.623819* 5.831218
39 3.139009 5.764704
40 3.203487 3.393095*
41 4.986607* 6.059314
42 3.998552 6.184685
43 3.761845 4.082384*
44 3.096082 6.800455
45 3.874151 5.481712
46 2.730548 6.237979
47 2.581285 6.065958
48 4.211282 6.193347
49 4.036079 5.755212
50 3.683738 8.716248
目前临床常用生物标志物如CEA、AFP和CA125等用于诊断胃癌的灵敏度仅为4.7-20.8％，即使联合使用其灵敏度也只有69.1％(He CZ,Zhang KH,Li Q,et al.Combineduse of AFP,CEA,CA125 and CAl9-9 improves the sensitivity for the diagnosis ofgastric cancer.BMC Gastroenterol 2013.13:87.)。以上数据表明，使用miRNA联合标志物诊断胃癌的灵敏度(指相对胃癌病人样本)能达到84％，高于目前临床常用生物标志物灵敏度，也高于发明人前期发表的利用miR-214作为生物标志物的诊断灵敏度(Zhang KC,etal.Hemolysis-free plasma miR-214 as novel biomarker of gastric cancer and iscorrelated with distant metastasis.Am J Cancer Res 2015；5:821-829)。尽管有8名胃癌患者和正常人没有被此方法检测出(表3中带*号数据标出)，但考虑到肿瘤的异质性和个体之间的差异(如临床中经常有如下情况：正常人CEA值高于正常上限，肿瘤患者CEA值却在正常范围内)，这种结果符合临床医学规律，表明本发明标志物组合联合筛选方法真实、有效，可以被接受和实施。

Claims (5)

1.检测胃癌血浆miRNA生物标志物组合的试剂在制备胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及胃癌早期临床诊断试剂中的应用，所述胃癌血浆miRNA生物标志物组合包括以下血浆miRNA：miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p，以及miR-16作为内参；其中miR-190a的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，miR-331-5p的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，miR-362-3p的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，miR-369-3p的序列如序列表中SEQ IDNO.4所示，miR-16的序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；
在PCR检测中所述miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p和miR-369-3p各生物标志物联合使用按下式系数分配用于对胃癌进行判断：
Y＝6.302×AmiR-190a+18.486×BmiR-331-5p+50.194×CmiR-362-3p+16.113×DmiR-369-3p
其中，AmiR-190a是miR-190a在血浆中的相对表达量2-ΔΔCt值，BmiR-331-5p是miR-331-5p在血浆中的相对表达量2-ΔΔCt值，CmiR-362-3p是miR-362-3p在血浆中的相对表达量2-ΔΔCt值，DmiR-369-3p是miR-369-3p在血浆中的相对表达量2-ΔΔCt值。
2.权利要求1中所述的miRNA生物标志物组合作为胃癌早期联合诊断生物标志物的应用。
3.检测胃癌血浆miRNA生物标志物组合的试剂在制备胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断的miRNA检测试剂盒中的应用，所述miRNA检测试剂盒包含与权利要求1所述miRNA生物标志物组合PCR检测相关的引物，分别为：
序列表中SEQ ID NO.6所示的miR-190a的RT引物和序列表中SEQ ID NO.11所示的F端引物；
序列表中SEQ ID NO.7所示的miR-331-5p的RT引物和序列表中SEQ ID NO.12所示的F端引物；
序列表中SEQ ID NO.8所示的miR-362-3p的RT引物和序列表中SEQ ID NO.13所示的F端引物；
序列表中SEQ ID NO.9所示的miR-369-3p的RT引物和序列表中SEQ ID NO.14所示的F端引物；
序列表中SEQ ID NO.10所示的内参miR-16的RT引物和序列表中SEQ ID NO.15所示的F端引物；以及
序列表中SEQ ID NO.16所示的通用R端引物。
4.根据权利要求3所述应用，所述试剂盒具体包括：
1)用于合成cDNA的逆转录引物：是Oligo特异性的RT引物，miR-190a的RT引物序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，miR-331-5p的RT引物序列如序列表中SEQ ID NO.7所示，miR-362-3p的RT引物序列如序列表中SEQ ID NO.8所示，miR-369-3p的RT引物序列如序列表中SEQ ID NO.9所示，miR-16的RT引物序列如序列表中SEQ ID NO.10所示；
2)用于实时荧光定量PCR的引物和TaqMan探针：miR-190a的F端引物序列如序列表中SEQ ID NO.11所示，R端引物序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQ ID NO.17所示；miR-331-5p的F端引物序列如序列表中SEQ ID NO.12所示，R端引物序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQ ID NO.18所示；miR-362-3p的F端引物序列如序列表中SEQ ID NO.13所示，R端引物序列如序列表中SEQ IDNO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQ ID NO.19所示；miR-369-3p的F端引物序列如序列表中SEQ ID NO.14所示，R端引物序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQ ID NO.20所示；miR-16的F端引物序列如序列表中SEQ ID NO.15所示，R端引物序列如序列表中SEQ ID NO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQ ID NO.21所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括：
用于15μL逆转录反应体系检测100次用的试剂：1mL的10×逆转录缓冲液，100μL的100mM脱氧核苷酸,50μL的20U/μL RNA酶抑制剂,150μL的50U/μL逆转录酶；或/和
用于20μL实时荧光定量PCR反应体系检测100次用的试剂：1.5ml的2×PCR预混液，100μL的20μM F端引物液，100μL的20μM R端引物液，20μL的10μM Taqman探针引物和2mL无核酸酶水。
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