CN104122394A - 人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种人表皮生长因子受体2定量测定试剂盒及其检测方法,该试剂盒包括HER-2磁分离试剂,试剂1,试剂2,稀释液,HER-2标准品,HER-2质控品,清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液;所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球;所述的试剂1是含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体;所述的试剂2是含有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液;所述稀释液是含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液。其目的是提供一种特异性强,灵敏度高,获得检测结果的时间短,操作方式简便,检测结果准确可靠的人表皮生长因子受体2定量测定试剂盒及其检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定血清的试剂盒及其测试方法,尤其是人表皮生长因子受体2(HER-2)定量测定试剂盒及其检测方法。
背景技术
表皮生长因子受体(epidermal growth Tactor receptor,缩写EGFR)是ErbB家族成员之一,具有酪氨酸激酶活性,是一种重要的跨膜受体。EGFR被配体激活后,启动胞内信号传导,经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应,调节转录因子激活基因的转录,指导细胞迁移、黏附、增殖、分化、凋亡,且与肿瘤的形成和恶化密切相关。
目前乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤,也是常见的女性肿瘤死亡原因之一。大约有20%~30%的乳腺癌患者HER-2/neu高表达,HER-2/neu高表达与患者的不良预后密切相关。HER-2/neu基因是人表皮生长因子家族的第2位成员。定位于染色体17q21,其编码一种分子量为185ku的跨膜糖蛋白,具有酪氨酸激酶活性,结构上分为膜外配体结合域、跨膜区和膜内酪氨酸激酶的活性域。HER-2/neu蛋白的胞外部分可以从细胞的表面脱落至血液中,形成分子量大约为105ku的可溶性蛋白HER-ZECD。HER-ZECD的裂解启动了细胞膜上的受体磷酸化,从而激活了细胞核内her-2并导致基因转录、细胞增殖;或ECD裂解后,截短的细胞内酪氨酸激酶保持信号传导能力,相应的实验结果认为ECD的裂解会使细胞膜上的p95发生磷酸化,从而导致肿瘤细胞的增殖。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强,灵敏度高,获得检测结果的时间短,操作方式简便,检测结果准确可靠的人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法。
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒,包括HER-2磁分离试剂,试剂1,试剂2,稀释液,HER-2标准品,HER-2质控品,清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液;所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球:所述的试剂1是含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体;所述的试剂2是含有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液;所述稀释液是含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液;所述的HER-2标准品和HER-2质控品分别是含HER-2抗原的牛血清白蛋白(BSA)溶液;所述清洗浓缩液是含有吐温-20(TWEE\-20)和Proclin-300的缓冲液。
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒,其中所述HER-2磁分离试剂采用如下步骤制成:
(1)、称取7g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、1g NaN3和6g甲基纤维素于容器中,称取4g吐温20(TWEEN-20),加适量水使吐温20(TWEEN-20)完全溶解后,倒入上述容器中;
(2)、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述容器中,然后在容器中加入800ml纯化水,充分搅拌;
(3)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH,控制pH在7.95-8.05之间;
(4)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g,四环素0.04g,硫酸新霉素1g,全部倒入上述容器中,充分混匀;
(5)、最后用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml,用0.2μ μm滤器过滤,得到免疫磁珠缓冲液,备用;
(6)、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中,备用;取2mg兔抗小鼠抗体溶于PH9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml,获得一级抗体溶液,用移液枪吸取溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯,加入到所述抗体溶液中,置室温90min,获得二级抗体溶液;
(7)、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中,然后放入到高速冷冻离心机中,在3000g下离心30min,浓缩至0.5ml,获得三级抗体溶液;
(8)、取0.5ml免疫磁珠,加入5ml反应杯中,经磁铁吸附2分钟后,吸取上清,然后加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB,混匀30秒,然后加入步骤7获得的三级抗体溶液中,保持混匀状态,室温反应4小时,获得已经标记的免疫磁珠;
(9)、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液室温反应30分钟,然后加入1.5ml PH7.2 0.1mol/LPB清洗已经标记的免疫磁珠,混匀30秒;
(10)、用10ml PH7.2 0.1mol/L PB将步骤9获得的已经标记的免疫磁珠转入玻璃瓶;
(11)、将1.5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的免疫磁珠的保存液中,加入到步骤10中的玻璃瓶中,混匀反应2小时,再加入5ml PH7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的免疫磁珠,并混匀30秒;
(12)、用50ml免疫磁珠保存液将免疫磁珠转入玻璃瓶,配制得免疫磁珠浓度为0.05%的标准浓度磁珠使用液;
(13)、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀,即得所述HER-2磁分离试剂(其使用浓度为0.025%);
所述试剂1采用如下步骤制成:
(1)、取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl20.05g于烧瓶中,然后在烧瓶中加入800ml纯化水,充分搅拌,使其中的固体完全溶解;
(2)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH,控制pH在7.35-7.45范围内;
(3)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g倒入上述烧杯中;
(4)、最后用纯化水定容至1000ml,用0.2μ μm滤器过滤,得试剂1稀释液,备用;
(5)、取10mg碱性磷酸酶(ALP),加入5ml生理盐水中,加入到浓缩管中,3000RPM离心20分钟,浓缩至1毫升,获得浓缩液;
(6)、向步骤5获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NalO4溶液,室温下避光搅拌20分钟,然后装入透析袋中,用1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜,收集保留液;
(7)、向步骤6获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使PH升高到9.0,然后立即加入2.5mg抗HER-2单克隆抗体,搅拌2小时,再加入0.1ml的4mg/ml NaBH4溶液,混匀,置4℃下2小时;
(8)、将步骤7获得溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4PBS透析,4℃过夜,收集保留液;
(9)、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时,然后3000rpm离心半小时,弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中,获得溶液;
(10)、将步骤9获得的溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4的PB缓冲液透析5个小时,去除铵离子,收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀,收集上清液,按照体积比为1体积的上清液:100体积的MgCl2的比例,添加1M MgCl2溶液,即得碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶联物,将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克降抗体的偶联物,用上述步骤4获得的试剂1稀释液,以1体积的偶联物:1000体积的试剂1稀释液的体积比混合均匀,即得试剂1。
所述试剂2采用如下步骤制成:
(1)、取TRIS1.56g、NaCl4.23g和0.5g甲基纤维素,全部加入容器中,取0.2mlProclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入容器中;
(2)、取800ml纯化水加入步骤1容器中,充分搅拌直至其中的固体物完全溶解,调PH在7.35-7.45之间;
(3)、根据Mak33的浓度量取最终量为0.9g的Mak33,称取牛γ球蛋白(1gG)20g,羊血清4ml,马血清5ml加入步骤2容器中;最后用纯化水定容至1000ml,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,即得试剂2;
所述稀释液采用如下步骤制成:
(1)、称取NaCl9.0g和BSA60g,加入容器中;
(2)、取0.5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解,加入步骤1容器中;
(3)、最后加纯化水定容1000ml,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,即得稀释液;所述清洗浓缩液采用如下步骤制成:
(1)、取TRIS12.54g和NaCl325.6g,加入容器中;
(2)、取5g Tween-20,加20ml水使其完全溶解后,加入步骤1容器中;
(3)、取0.2ml Proclin-300,用10ml纯化水完全溶解后,加入步骤2容器中;
(4)、取800ml纯化水加入步骤3容器中,充分搅拌,直至其中的固体物完全溶解;
(5)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调PH,控制其范围在7.35-7.45之间;
(6)、最后用纯化水定容1000ml,用0.2μ μm滤器过滤,即得清洗浓缩液;
所述酶促化学发光底物溶液采用如下步骤制成:
(1)、取TRIS2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g、光泽精0.002g和Proclin-300 0.2ml,加入烧杯中;
(2)、加入600ml纯化水于烧杯中,充分搅拌直至其中的固体物完全溶解,调PH在7.95-8.05之间;
(3)、向烧杯中加入250ml Lumi-PHos480,用纯化水定容至1000ml,混匀后用0.2μm滤器过滤,即得酶促化学发光底物溶液。
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒,其中所述HER-2校准品中HER-2抗原的浓度分别为0、15、45、90、180、350ng/ml;所述HER-2质控品中HER-2抗原的浓度分别为15、180ng/ml。
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒,其中所述室温反应的温度为20℃-24℃。
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法,包括如下步骤:
1)、向试管架上的每一试管中分别加入30μl HER-2标准品、质控品和待测标本;
2)、向每一试管中加入45μl试剂1;
3)、向每一试管中加入45μl试剂2;
4)、向每一试管中加入30μl HER-2磁分离试剂;
5)、用多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后,将试管架连同全部试管置于水浴箱中,温浴45分钟;
6)、将试管架连同全部试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀1分钟,然后快速倒转分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上,用力拍击分离器底部,以除去粘在试管内壁上的所有液滴;
7)、将清洗浓缩液按照1体积的清洗浓缩液:7体积纯化水的比例添加纯化水,得到清洗液,向每一试管中加200μl清洗液,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出;
8)、再次将试管架连同全部试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀1分钟,然后快速倒转分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上,用力拍击分离器底部,以除去粘在试管内壁上的所有液滴;
9)、再次向每一试管中加200μl清洗浓缩液,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出;
10)、第3次将试管架连同全部试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀1分钟,然后快速倒转分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上,用力拍击分离器底部,以除去粘在试管内壁上的所有液滴;
11)、加200μl酶促化学发光底物溶液至试管中,混匀5秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测,即可得到相关数据。
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法,其中所述待测标本为高值HOOK样本时,使用稀释液对标本进行稀释。
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法,其试剂盒包括HER-2磁分离试剂,试剂1,试剂2,稀释液,HER-2标准品,HER-2质控品,清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液;实验表明,本发明的人表皮生长因子受体2也即癌胚抗原(HER-2)定量测定试剂盒及其检测方法,具有较高的灵敏度和特异性,和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。
下面对本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法作进一步详细说明。
具体实施方式
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒,包括HER-2磁分离试剂,试剂1,试剂2,稀释液,HER-2标准品,HER-2质控品,清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液;所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球;所述的试剂1是含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克降抗体;所述的试剂2是含有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液;所述稀释液是含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液;所述的HER-2标准品和HER-2质控品分别是含HER-2抗原的牛血清白蛋白(BSA)溶液;所述消洗浓缩液是含有吐温-20(TWEEN-20)和Proclin-300的缓冲液。
上述HER-2磁分离试剂采用如下步骤制成:
(1)、称取7g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、1g NaN3和6g甲基纤维素于容器中,称取4g吐温20(TWEEN-20),加适量水使吐温20(TWEEN-20)完全溶解后,倒入上述容器中;
(2)、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述容器中,然后在容器中加入800ml纯化水,充分搅拌;
(3)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH,控制pH在7.95-8.05之间;
(4)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g,四环素0.04g,硫酸新霉素1g,全部倒入上述容器中,充分混匀;
(5)、最后用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml,用0.2μ μm滤器过滤,得到免疫磁珠缓冲液,备用;
(6)、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中,备用;取2mg兔抗小鼠抗体溶于PH9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml,获得一级抗体溶液,用移液枪吸取溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯,加入到所述抗体溶液中,置室温90min,获得二级抗体溶液;
(7)、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中,然后放入到高速冷冻离心机中,在3000g下离心30min,浓缩至0.5ml,获得三级抗体溶液;
(8)、取0.5ml免疫磁珠,加入5ml反应杯中,经磁铁吸附2分钟后,吸取上清,然后加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB,混匀30秒,然后加入步骤7获得的三级抗体溶液中,保持混匀状态,室温反应4小时,获得已经标记的免疫磁珠;
(9)、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液室温反应30分钟,然后加入1.5ml PH7.2 0.1mol/LPB清洗已经标记的免疫磁珠,混匀30秒;
(10)、用10ml PH7.2 0.1mol/L PB将步骤9获得的已经标记的免疫磁珠转入玻璃瓶;
(11)、将1.5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的免疫磁珠的保存液中,加入到步骤10中的玻璃瓶中,混匀反应2小时,再加入5ml PH7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的免疫磁珠,并混匀30秒;
(12)、用50ml免疫磁珠保存液将免疫磁珠转入玻璃瓶,配制得免疫磁珠浓度为0.05%的标准浓度磁珠使用液;
(13)、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀,即得所述HER-2磁分离试剂(其使用浓度为0.025%);
所述试剂1采用如下步骤制成:
(1)、取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中,然后在烧瓶中加入800ml纯化水,充分搅拌,使其中的固体完仝溶解:
(2)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH,控制pH在7.35-7.45范围内:
(3)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g倒入上述烧杯中;
(4)、最后用纯化水定容至1000ml,用0.2μ μm滤器过滤,得试剂1稀释液,备用:
(5)、取10mg碱性磷酸酶(ALP),加入5ml生理盐水中,加入到浓缩管中,3000RPM离心20分钟,浓缩至1毫升,获得浓缩液;
(6)、向步骤5获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NalO4溶液,室温下避光搅拌20分钟,然后装入透析袋中,用1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜,收集保留液:
(7)、向步骤6获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使PH升高到9.0,然后立即加入2.5mg抗HER-2单克隆抗体,搅拌2小时,再加入0.1ml的4mg/mlNaBH;溶液,混匀,置4℃下2小时:
(8)、将步骤7获得溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4PBS透析,4℃过夜,收集保留液;
(9)、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时,然后3000rpm离心半小时,弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中,获得溶液;
(10)、将步骤9获得的溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4的PB缓冲液透析5个小时,去除铵离子,收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀,收集上清液,按照体积比为1体积的上清液:100体积的MgCl2的比例,添加1M MgCl2溶液,即的碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶联物,将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶联物,用上述步骤4获得的试剂1稀释液,以1体积的偶联物:1000体积的试剂1稀释液的体积比混合均匀,即得试剂1。
所述试剂2采用如下步骤制成:
(1)、取TRIS1.56g、NaCl 4.23g和0.5g甲基纤维素,全部加入容器中,取0.2mlProclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入容器中;
(2)、取800ml纯化水加入步骤1容器中,充分搅拌直至其中的固体物完全溶解,调PH在7.35-7.45之间;
(3)、根据Mak33的浓度量取最终量为0.9g的Mak33,称取牛γ-球蛋白(1gG)20g,羊血清4ml,马血清5ml加入步骤2容器中;最后用纯化水定容至1000ml,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,即得试剂2:
所述稀释液采用如下步骤制成:
(1)、称取NaCl9.0g和BSA60g,加入容器中:
(2)、取0.5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解,加入步骤1容器中;
(3)、最后加纯化水定容1000ml,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,即得稀释液:
所述清洗浓缩液采用如下步骤制成:
(1)、取TR1S12.54g和NaCl325.6g,加入容器中;
(2)、取5gTween-20,加20ml水使其完全溶解后,加入步骤1容器中;
(3)、取0.2ml Proclin-300,用10ml纯化水完全溶解后,加入步骤2容器中;
(4)、取800ml纯化水加入步骤3容器中,充分搅拌,直至其中的固体物完全溶解;
(5)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调PH,控制其范围在7.35-7.45之间;
(6)、最后用纯化水定容1000ml,用0.2μ μm滤器过滤,即得清洗浓缩液;
所述酶促化学发光底物溶液采用如下步骤制成:
(1)、取TRIS2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g、光泽精0.002g和Proclin-300 0.2ml,加入烧杯中;
(2)、加入600ml纯化水于烧杯中,充分搅拌直至其中的固体物完全溶解,调PH在7.95-8.05之间;
(3)、向烧杯中加入250ml Lumi-PHos480,用纯化水定容至1000ml,混匀后用0.2μm滤器过滤,即得酶促化学发光底物溶液。
上述HER-2校准品中HER-2抗原的浓度分别为0、15、45、90、180、350ng/ml;所述HER-2质控品中HER-2抗原的浓度分别为15、180ng/ml。
上述室温反应的温度为20℃-24℃。
本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法,其包括如下步骤:
1)、向试管架上的每一试管中分别加入30μl HER-2标准品、质控品和待测标本;
2)、向每一试管中加入45μl试剂1;
3)、向每一试管中加入45μl试剂2;
4)、向每一试管中加入30μl HER-2磁分离试剂;
5)、用多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后,将试管架连同全部试管置于水浴箱中,温浴45分钟;
6)、将试管架连同全部试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀1分钟,然后快速倒转分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上,用力拍击分离器底部,以除去粘在试管内壁上的所有液滴;
7)、将清洗浓缩液按照1体积的清洗浓缩液:7体积纯化水的比例添加纯化水,得到清洗液,向每一试管中加200μl清洗液,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出;
8)、再次将试管架连同全部试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀1分钟,然后快速倒转分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上,用力拍击分离器底部,以除去粘在试管内壁上的所有液滴;
9)、再次向每一试管中加200μl清洗浓缩液,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出;
10)、第3次将试管架连同全部试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀1分钟,然后快速倒转分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上,用力拍击分离器底部,以除去粘在试管内壁上的所有液滴;
11)、加200μl酶促化学发光底物溶液至试管中,混匀5秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测,即可得到相关数据。
上述待测标本为高值HOOK样本时,使用稀释液对标本进行稀释。
Claims (6)
1.人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒,其特征在于:包括HER-2磁分离试剂,试剂1,试剂2,稀释液,HER-2标准品,HER-2质控品,清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液;所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球;所述的试剂1匙含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体;所述的试剂2是含有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液;所述稀释液是含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液;所述的HER-2标准品和HER-2质控品分别是含HER2抗原的牛血清白蛋白(BSA)溶液;所述清洗浓缩液是含有吐温-20(TWEE\-20)和Proclin-300的缓冲液。
2.按照权利要求1所述的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒,其特征在于:所述HER-2磁分离试剂采用如下步骤制成:
(1)、称取7g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、1g NaN3和6g甲基纤维素于容器中,称取4g吐温20(TWEEN-20),加适量水使吐温20(TWEEN-20)完全溶解后,倒入上述容器中;
(2)、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述容器中,然后在容器中加入800ml纯化水,充分搅拌;
(3)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH,控制pH在7.95-8.05之间;
(4)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g,四环素0.04g,硫酸新霉素1g,全部倒入上述容器中,充分混匀;
(5)、最后用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml,用0.2μ μm滤器过滤,得到免疫磁珠缓冲液,备用;
(6)、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中,备用;取2mg兔抗小鼠抗体溶于PH9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml,获得一级抗体溶液,用移液枪吸取溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯,加入到所述抗体溶液中,置室温90min,获得二级抗体溶液;
(7)、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中,然后放入到高速冷冻离心机中,在3000g下离心30min,浓缩至0.5ml,获得三级抗体溶液;
(8)、取0.5ml免疫磁珠,加入5ml反应杯中,经磁铁吸附2分钟后,吸取上清,然后加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB,混匀30秒,然后加入步骤7获得的三级抗体溶液中,保持混匀状态,室温反应4小时,获得已经标记的免疫磁珠;
(9)、加入0.3ml1mol/L的TRIS溶液室温反应30分钟,然后加入1.5ml PH7.2 0.1mol/LPB清洗已经标记的免疫磁珠,混匀30秒;
(10)、用10ml PH7.20.1mol/LPB将步骤9获得的已经标记的免疫磁珠转入玻璃瓶;
(11)、将1.5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的免疫磁珠的保存液中,加入到步骤10中的玻璃瓶中,混匀反应2小时,再加入5ml PH7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的免疫磁珠,并混匀30秒;
(12)、用50ml免疫磁珠保存液将免疫磁珠转入玻璃瓶,配制得免疫磁珠浓度为0.05%的标准浓度磁珠使用液;
(13)、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀,即得所述HER-2磁分离试剂(其使用浓度为0.025%);
所述试剂1采用如下步骤制成:
(1)、取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl2、0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中,然后在烧瓶中加入800ml纯化水,充分搅拌,使其中的固体完全溶解;
(2)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH,控制pH在7.35-7.45范围内;
(3)、称取牛血清白蛋白(BSA)3g倒入上述烧杯中;
(4)、最后用纯化水定容至1000ml,用0.2μ μm滤器过滤,得试剂1稀释液,备用;
(5)、取10mg碱性磷酸酶(ALP),加入5ml生理盐水中,加入到浓缩管中,3000RPM离心20分钟,浓缩至1毫升,获得浓缩液;
(6)、向步骤5获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NalO4溶液,室温下避光搅拌20分钟,然后装入透析袋中,用1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜,收集保留液;
(7)、向步骤6获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使PH升高到9.0,然后立即加入2.5mg抗HER-2单克隆抗体,搅拌2小时,再加入0.1ml的4mg/ml NaBH1溶液,混匀,置4℃下2小时;
(8)、将步骤7获得溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4PBS透析,4℃过夜,收集保留液:
(9)、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时,然后3000rpm离心半小时,弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的PBS中,获得溶液;
(1())、将步骤9获得的溶液装入透析袋中,用0.15M PH7.4的PB缓冲液透析5个小时,去除铵离了,收集保留液后10,0000rpm离心30分钟去除沉淀,收集上清液,按照体积比为1体积的上清液:100体积的MgCl2的比例,添加1M MgCl2溶液,即得碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶联物,将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶联物,用上述步骤4获得的试剂1稀释液,以1体积的偶联物:1000体积的试剂1稀释液的体积比混合均匀,即得试剂1。
所述试剂2采用如下步骤制成:
(1)、取TRIS1.56g、NaCl4.23g和0.5g甲基纤维素,全部加入容器中,取0.2mlProclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入容器中;
(2)、取800ml纯化水加入步骤1容器中,充分搅拌直至其中的固体物完全溶解,调PH在7.35-7.45之间;
(3)、根据Mak33的浓度量取最终量为0.9g的Mak33,称取牛γ-球蛋白(lgG)20g,羊血清4ml,马血清5ml加入步骤2容器中;最后用纯化水定容至1000ml,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,即得试剂2;
所述稀释液采用如下步骤制成:
(1)、称取NaCl9.0g和BSA60g,加入容器中;
(2)、取0.5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解,加入步骤1容器中;
(3)、最后加纯化水定容1000ml,完全溶解后,用0.2μm滤器过滤,即得稀释液;
所述清洗浓缩液采用如下步骤制成:
(1)、取TRIS12.54g和NaCl325.6g,加入容器中;
(2)、取5gTween-20,加20ml水使其完全溶解后,加入步骤1容器中;
(3)、取0.2ml Proclin-300,用10ml纯化水完全溶解后,加入步骤2容器中;
(4)、取800ml纯化水加入步骤3容器中,充分搅拌,直至其中的固体物完全溶解;
(5)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调PH,控制其范围在7.35-7.45之间;
(6)、最后用纯化水定容1000ml,用0.2μ μm滤器过滤,即得清洗浓缩液:
所述酶促化学发光底物溶液采用如下步骤制成:
(1)、取TRIS2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g、光泽精0.002g和Proclin-300 0.2ml,加入烧杯中;
(2)、加入600ml纯化水于烧杯中,充分搅拌直至其中的固体物完全溶解,调PH在7.95-8.05之间;
(3)、向烧杯中加入250ml Lumi-PHos480,用纯化水定容至1000ml,混匀后用0.2μm滤器过滤,即得酶促化学发光底物溶液。
3.按照权利要求2所述的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒,其特征在于:所述HER-2校准品中HER-2抗原的浓度分别为0、15、45、90、180、350ng/ml;所述HER-2质控品中HER-2抗原的浓度分别为15、180ng/ml。
4.按照权利要求3所述的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒,其特征在于:所述室温反应的温度为20℃-24℃。
5.人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法,其特征在于:包括如下步骤:
1)、向试管架上的每一试管中分别加入30μl HER-2标准品、质控品和待测标本;
2)、向每一试管中加入45μl试剂1;
3)、向每一试管中加入45μl试剂2;
4)、向每一试管中加入30μl HER-2磁分离试剂;
5)、用多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后,将试管架连同全部试管置于水浴箱中,温浴45分钟;
6)、将试管架连同全部试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀1分钟,然后快速倒转分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上,用力拍击分离器底部,以除去粘在试管内壁上的所有液滴;
7)、将清洗浓缩液按照1体积的清洗浓缩液:7体积纯化水的比例添加纯化水,得到清洗液,向每一试管中加200μl清洗液,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出;
8)、再次将试管架连同全部试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀1分钟,然后快速倒转分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上,用力拍击分离器底部,以除去粘在试管内壁上的所有液滴;
9)、再次向每一试管中加200μl清洗浓缩液,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30杪;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出;
10)、第3次将试管架连同全部试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀1分钟,然后快速倒转分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上,用力拍击分离器底部,以除去粘在试管内壁上的所有液滴;
11)、加200μl酶促化学发光底物溶液至试管中,混匀5秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测,即可得到相关数据。
6.按照权利要求5所述的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法,其特征在于:所述待测标本为高值HOOK样本时,使用稀释液对标本进行稀释。
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