CN101663584A - 未分离的循环癌细胞的Her-2/neu蛋白的检测和治疗 - Google Patents
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Abstract
通过进行灵敏的Her-2/neu免疫测试检测了在血液或外周血单核细胞(PBMC)样品中的循环癌细胞上的Her-2/neu蛋白表达。在进行所述免疫测试前无需分离癌细胞。阳性结果表明Her-2/neu在所述血样中的癌细胞上表达。该方法可以用于识别可能受益于采用如曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、拉帕替尼、CP-724,714、HKI-272和BMS-599626等靶向Her-2/neu的抗癌剂的治疗的癌症患者。
Description
背景技术
市场上检测来自癌细胞的Her-2/neu(也称为Her2/neu、HER2、c-erbB-2和erbB2)蛋白或相关基因的现有测试繁琐且非常耗时。而且,仅有25%~30%的乳腺癌患者基于在其原发肿瘤活检中发现Her-2/neu(也称为Her2/neu、HER2、c-erbB-2和erbB2)蛋白或基因的水平升高而接受Her-2/neu定向治疗。文献中的数据表明在原发肿瘤活检中具有Her2/neu阴性结果的大量女性(26名受测者中的11名)继续发展为对其循环癌细胞的Her2/neu阳性(Hayes DF等,Int J Oncol 21:1111-1117;MengS等,2004Proc Natl Acad Sci USA 101:9393-9398)。此外,相当数量的患乳腺癌的女性没有易用于测试Her-2-neu状态的活检材料。Hayes等与Meng等的文章中所用的方法繁琐而耗时,需要快速的、更方便的测试,尤其是能在医师的诊室内进行的测试。Hayes等的方法需要流式细胞术分析而Meng等的方法需要荧光原位杂交(FISH),这些都比本发明所述的Her-2/neu蛋白的直接检测(例如,通过ECL)更加复杂和耗时。而且,Meng等与Hayes等的方法需要免疫磁珠以便富集肿瘤细胞。相反,就通过避免可见于从全血或外周血单核细胞中分离癌细胞的步骤中的损失而改善灵敏度而言,无需这类分离步骤而进行的如本发明中的快速方法提供了额外的优点。
Her2/neu和Her-2/neu靶向治疗:在来自患乳腺癌的女性的约25%的活检样品中观察到Her2/neu癌基因的过表达,且所述过表达与较差的预后(prognosis)相关。曲妥珠单抗(HERCEPTIN)是抗Her2/neu受体的胞外域(ECD)的人源化单克隆抗体,并且抑制过表达该受体的人乳腺癌细胞的增殖(近期综述见Esteve FJ 2004,The Oncologist 9(增刊第3期):第4-9页)。乳腺癌细胞上的Her-2/neu蛋白表达可以容易地达到每个细胞500,000个分子以上的水平,与称为SK-BR-3的过表达Her-2/neu的人乳腺癌细胞系的情形相同。目前的Her2/neu测试依赖于对患者的活检组织切片进行所述蛋白的过表达或基因扩增的测试。在带有基因扩增或所述蛋白的至少2+的免疫染色的那些女性中,用单一药剂曲妥珠单抗或用曲妥珠单抗与如紫杉醇等化学治疗剂的组合显示出显著响应。近来,拉帕替尼(也称为GW-572016)已由美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗患Her-2/neu阳性乳腺癌的女性。除乳腺癌以外,Her-2/neu还在包括卵巢癌的其它癌细胞上过表达。
在医疗实践中迫切需要能从全血或PBMC样品快速且直接地进行的方便测试,该测试具有足够的灵敏度和特异性以便识别在循环乳腺癌细胞上有Her-2/neu蛋白过表达并因此可能受益于Her-2/neu靶向治疗(例如,曲妥珠单抗、拉帕替尼)或受益于其它抗Her-2/neu定向治疗的患乳腺癌的女性。由于文献中有证据表明目前不适于曲妥珠单抗或拉帕替尼治疗的数千名患乳腺癌的女性具有Her-2/neu过表达的循环肿瘤细胞并且具有被视作Her-2/neu阴性的原发肿瘤,因而所述测试越发重要。如果这类女性最初被识别出来,则她们可以受益于抗Her-2/neu靶向剂。
在WO 2006/041959(Wellstat Biologics Corp.)中描述了用于检测经分离的循环癌细胞上的Her-2/neu蛋白表达的方法。就测试容易性、测试的迅速性、最重要的是就通过减少对样品的大量操作来防止癌细胞损失而言,无需首先将循环癌细胞分离将是一个显著优点。但现有技术认为主要障碍在于获得具有足够的灵敏度和特异性以便从全血血样中或来自人外周血单核细胞样品的低水平循环乳腺癌细胞中检测Her-2/neu的免疫测试。
Hayes等(2002,Int J Oncol 21:1111-1117)和Meng等(2004Proc NatlAcad Sci USA 101:9393-9398)在他们的来自循环癌细胞的Her-2/neu的测试中都要求采用富集手段。利用流式细胞仪检测循环癌细胞上的Her-2/neu,Hayes等表明为了获取所需灵敏度这种富集是“必须”和“至关重要”的(见第1112页最后一句和第1113页第一句)。另外,Leone等(2003;J Leukocyte Biol 74:593-601)表明在正常外周血单核细胞(PMBC)中Her-2/neu转录物和蛋白都以低水平表达。可以预期Leone等表明的这种Her-2/neu表达会使得在大量PBMC存在时难以看到循环癌细胞中的Her-2/neu表达。
发明内容
本发明提供了一种检测全血血样中循环癌细胞上的Her-2/neu蛋白表达的方法,所述方法包括对所述血样进行能检测癌细胞相关Her-2/neu的免疫测试,其中阳性免疫测试结果表明在癌细胞上存在Her-2/neu;其中在进行免疫测试前未将循环癌细胞从全血中分离;且其中所述免疫测试:a)能在SK-BR-3乳腺癌细胞以小于或等于100个SK-BR-3细胞/ml血液的浓度掺加(spike)入血液中时检测来自所述SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu;和b)能够在至少1×106个人外周血单核细胞存在下进行测试时检测来自10个SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu。
本发明提供了一种检测血样中循环癌细胞上的Her-2/neu蛋白表达的方法,所述方法包括对所述血样进行能够检测癌细胞相关Her-2/neu的免疫测试,其中阳性免疫测试结果表明在所述癌细胞上存在Her-2/neu;其中在进行所述免疫测试之前没有将所述循环癌细胞从外周血单核细胞中分离;且其中所述免疫测试:a)能够在SK-BR-3乳腺癌细胞以小于或等于100个SK-BR-3细胞/ml血液的浓度掺加入血液中时检测来自所述SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu;和b)能够在至少1×106个人外周血单核细胞存在下进行测试时检测来自10个SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu。
本发明基于无需将循环癌细胞分离以检测这些细胞上的Her-2/neu蛋白表达的发现。就测试的容易性、测试的迅速性、最重要的是就通过减少对样品的大量操作来防止癌细胞损失而言,无需首先将循环癌细胞分离是一个显著优点。更少的步骤使本发明的方法进行起来更快和更廉价。此外,更少的步骤使所述方法更易于自动化。而且,本发明的改进测试通过消除分离步骤防止了癌细胞的损失,这种损失对检测来自血样中的循环癌细胞的Her-2/neu的灵敏度有显著的不利影响。
本发明提供了一种识别可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌剂的治疗的癌症患者的方法,所述方法包括上述检测方法。当用于识别这类患者时,从该患者抽取含癌细胞的血样。本发明提供了一种治疗如此识别出的癌症患者的方法,该方法包括对患者施用靶向Her-2/neu的抗癌剂。
附图说明
图1.SK-BR-3乳腺癌细胞(Her-2/neu过表达的阳性对照)与MDA-MB-468(Her-2/neu过表达的阴性对照)的裂解物中Her-2/neu的免疫测试检测的ECL信号的比较。所示为使用1个细胞/孔、2个细胞/孔和10个细胞/孔的裂解物的数据。
图2.SK-BR-3乳腺癌细胞(Her-2/neu过表达的阳性对照)与MDA-MB-468(Her-2/neu过表达的阴性对照)的裂解物中Her-2/neu的免疫测试检测的ECL信号的进一步比较。在该图中使用来自如图1所示的相同实验的数据,不同之处在于在该图中还包括从50个细胞/孔和250个细胞/孔的裂解材料获得的数据以便显示增加的X轴范围。
具体实施方式
此处所用的连接词“包含”是开放式的。采用该词语的权利要求除该权利要求中叙述的那些要素以外还可以包含其它要素。因而,例如,所述权利要求可以解读为还包含没有在其中具体叙述的其它步骤的方法,只要所叙述的要素或其等价物存在即可。
术语“未分离癌细胞”或“未经分离的癌细胞”:如此处使用,与带有测试用抗原的癌细胞有关的术语“未分离癌细胞”或“未经分离的癌细胞”是指在至少100,000个非癌细胞/ml样品、更优选为至少500,000个非癌细胞/ml样品、更优选为至少1,000,000个非癌细胞/ml样品且最优选为至少2,000,000个非癌细胞/ml样品存在下可检测抗原的癌细胞。例如,如果测试针对于发现于循环人癌细胞上的抗原,且如果循环人癌细胞处在500,000个人外周血单核细胞/ml测试样品的存在下,则所述样品中的循环人癌细胞是未经分离的癌细胞和未分离癌细胞。
在本发明的一个实施方式中,免疫测试是基于溶液的免疫测试。基于溶液的免疫测试:如此处所用,术语“基于溶液的免疫测试”是指使用抵抗抗原的至少一种抗体的在溶液中的所述抗原的免疫测试。适合基于溶液的免疫测试的检测技术包括电化学发光、化学发光、荧光化学发光、荧光偏振和时间分辨荧光。
在本发明的另一个实施方式中,免疫测试是夹心免疫测试。如本文所用,术语“夹心免疫测试”是指使用各自均抵抗抗原或抗原的一部分的抗体对(例如,抗体‘A’和抗体‘B’)来检测所述抗原的测试。对于所述抗体对,将抗体‘A’共价或非共价地标记至报道分子(例如,可电化学发光的分子或可发荧光的分子)。抗体‘A’的非共价标记的实例是使抗抗体‘A’的经标记的二抗与抗体‘A’结合。抗体‘B’与如测试板、磁体或电极等固体支持相直接连接(或使其间接连接)。适于夹心免疫测试的检测技术包括电化学发光、化学发光和荧光化学发光。
本发明提供了对血样中循环乳腺癌细胞上的Her-2/neu蛋白水平进行定量的足够灵敏的方法,还提供了用于识别可能受益于使用曲妥珠单抗、拉帕替尼或其它靶向Her-2/neu的药剂的治疗的患乳腺癌女性的方法。可以靶向Her-2/neu的其它药剂正在开发中并且具有与本发明用的曲妥珠单抗或拉帕替尼相似的适用性。这些药剂包括但不限于:Genentech开发的OMNITARG(帕妥珠单抗);Pfizer开发的CP-724,714和CP-654577(Munster等,2007,Clin Cancer Res 13:1238-1245;Barbacci等,2003,Cancer Res 63:4450-4459);Wyeth开发的HKI-272(Wong等,2006,J ClinOncol 24(6月20日增刊):3018;Rabindran等,2004,Cancer Res 2004,64:3958-3965);和Bristol-Myers-Squibb开发的BMS-599626。在Spector等,2007(Breast Cancer Res 9,从第205页开始)和Janmaat与Giaccone,2003(The Oncologist 8:576-586)中描述了在其特异性中包括Her-2/neu的其它抗癌剂。靶向Her-2/neu的额外的抗癌剂还包括靶向Her2的纳米颗粒生物缀合物(见Alexis F等,2007;第4181号摘要,2007美国癌症研究协会年会)和含化学治疗剂的抗Her2免疫脂质体(见Noble CO等,2004,Expert Opin Ther Targets 8:335-353)。
本发明采用的免疫测试具有足以检测来自每毫升血液中掺加的至少100个SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu的灵敏度,优选具有足以检测来自每毫升血液中掺加的至少30个SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu的灵敏度,更优选具有足以检测来自每毫升血液中掺加的至少10个SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu的灵敏度,更优选具有足以检测来自每毫升血液中掺加的至少3个SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu的灵敏度,且最优选具有足以检测来自每毫升血液中掺加的至少1个SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu的灵敏度。本发明采用的免疫测试耐干扰,从而能在至少1,000,000个人外周血单核细胞存在下进行检测时检测10个SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu。
在优选实施方式中,所述免疫测试产生与血样中的癌细胞相关Her-2/neu分子数成比例的信号。
从患有癌症、尤其是乳腺癌的患者取得血样(通常在约8ml~20ml范围内)。所包括的步骤详细描述如下:
1.必要时将红细胞和中性粒细胞耗竭。优选实施方式包括该步骤。
2.对来自循环癌细胞的Her-2/neu蛋白进行检测和定量。
1.必要时将红细胞和中性粒细胞耗竭。优选方法采用带抗凝剂(EDTA或柠檬酸盐)的BD Vacutainer CPT管。这些管含有经正确离心时(1,100×g,10分钟,甩平转子)能将红血球和中性粒细胞除去的材料。离心后,管的底部含有红细胞(红血球)和中性粒细胞的细胞沉淀。在细胞沉淀上方是凝胶屏障(gel barrier),而在凝胶屏障上方是作为血浆底部带的单核的细胞(肿瘤细胞、淋巴细胞和单核细胞)。然后可以容易地从凝胶屏障上方的顶部收集肿瘤细胞、淋巴细胞和单核细胞。由于该方法不仅除去红血球还除去中性粒细胞,因而优选该方法。
2.对来自循环癌细胞的Her-2/neu蛋白进行检测和定量。
然后可以通过使用与检测分子直接或间接相连的抗Her-2/neu的单克隆抗体(mAb)(如HERCEPTIN)或多克隆抗体(例如,来自R&D Systems的目录号为AF1129的山羊多克隆抗体)来完成Her-2/neu的检测。在电化学发光(ECL)的情形中,检测分子是钌。在公共领域中有大量文献详细地提供了用于在含三丙胺的溶液中将钌与抗体相连(例如,Lee等,Am J TropMed Hyg 2001,65:1-9)然后通过ECL检测磁珠上的抗原的有用方法。施加电位使钌标记激发并发光并且用ECL检测仪器(如ORIGEN分析仪或如来自BIOVERIS Corporation,盖瑟斯堡,美国马里兰州的384等商购仪器)进行检测。
本发明采用的免疫测试由至少一个抗体且优选为两组抗体组成。这些抗体可以为抗Her-2/neu的多克隆抗体或单克隆抗体。单克隆抗体优选为人源化小鼠单克隆抗体,例如曲妥珠单抗。曲妥珠单抗是本发明的免疫测试和治疗方法的优选实施方式。
在本发明的另一个实施方式中,使用了抵抗靶向Her-2/neu的抗体之一的二抗。在本发明的优选实施方式中,将所述二抗共价或非共价地标记于报道分子(例如,可电化学发光的分子或可发荧光的分子)。在本发明的另一个优选实施方式中,使用ECL并将所述二抗生物素化从而使得所述二抗能与链霉亲和素包被的磁珠连接。
为了检测Her-2/neu,可以从如R&D Systems(明尼阿波利斯,美国明尼苏达州)、Biosource(卡马里奥,美国加利福尼亚州)和BD Biosciences(圣地亚哥,美国加利福尼亚州)等来源商购各种抗Her-2/neu的单克隆抗体和多克隆抗体,其中包括抗胞外域和抗细胞质域的抗体。兔多克隆抗体也可获自LABVISION Corp(弗里蒙特,美国加利福尼亚州;如neuAb-21)和UPSTATE CELL SIGNALING SOLUTIONS(普莱西德湖,美国纽约州;如目录号06-562)。抗Her-2/neu的胞外域的山羊多克隆抗体可获自R&D Systems(目录号AF1129)。抗全长重组Her-2/neu的山羊多克隆抗体可获自EXALPHA BIOLOGICS(罗斯代尔,美国马里兰州;目录号M100P)。预计这种抗全长Her-2/neu的多克隆抗体能与Her-2/neu的胞外域和细胞质域结合而对胞外域不具特异性;这种抗体仍然有用但优选应将其与对Her-2/neu更具特异性的抗体组合使用。可利用的单克隆抗体同时抗胞外域(例如,R&D Systems目录号MAB1129)和细胞质域(例如,LABVISION neuAB-8),包括抗C末端肽(例如,LABVISION neuAB-15)。在Hudziak等(1997,美国专利第5,677,171号)中也公开了抗Her-2/neu的单克隆抗体。一个改良实施方式使用HERCEPTIN,这是因为与该抗体的结合最能预测作为对患者的治疗的HERCEPTIN的结合。虑及更高的灵敏度,另一个有利的实施方式使用多克隆抗体或与Her-2/neu蛋白上的许多抗原表位结合的抗体混合物(cocktail)。
在本发明的一个实施方式中,通过在样品进行细胞裂解前使一种抗Her-2/neu的抗体与癌细胞结合而对完整无损的癌细胞进行免疫测试中的一步。用于与完整无损的癌细胞结合的这种抗体必须抗Her-2/neu的胞外域。作为另一种选择,可以在基于溶液的免疫测试的所有步骤之前将癌细胞裂解并对细胞裂解物进行免疫测试。在这种情况下,免疫测试可以利用与Her-2/neu的胞外域或细胞质域选择性结合的抗体。在本发明的更具体的实施方式中,免疫测试使用与Her-2/neu的细胞质域选择性结合的一种或两种抗体。
在本发明的基于溶液的免疫测试的优选实施方式中,采用抵抗抗原的抗体来将溶液中的抗原与如磁体、电极或测试板等固体支持物间接相连。基于溶液的免疫测试的实例是采用电化学发光(ECL)从而用抵抗抗原的两种抗体来检测所述抗原的实例,其中所述抗体之一由钌标记而另一个与能连接至电极的磁珠相连。除电化学发光以外,可以产生本应用所需的高灵敏度的其它基于溶液的免疫测试包括但不限于:
a)化学发光,如Liu Y等,2003(J Food Protection 66:512-517)所述。
b)荧光化学发光(FCL),如Yu H等,2000(Biosens Bioelectron14:829-840)所述。
c)荧光偏振免疫测试(见Howanitz JH,1988Arch Pathol Lab Med112:775-779)。
d)时间分辨荧光免疫测试(Butcher H等,2003,J Immunol Methods272:247-256;Soukka等,2001,Clin Chem 47:1269-1278;Howanitz JH,1988Arch Pathol Lab Med 112:775-779)。
在本发明的夹心免疫测试的优选实施方式中,采用了其中一个抗体由钌标记而另一个抗体与能连接至电极的磁珠相连的电化学发光(ECL)。
由于其灵敏度,可以将用于识别可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌剂的治疗的患者的本发明的方法有效地应用于这样的患者:取自所述患者的肿瘤活检组织此前通过Her-2/neu用组织测试被确定为(例如,通过免疫组织化学或FISH分析)对Her-2/neu表达为阴性。
参考下列实施例可以更好地理解本发明,所述实施例仅为说明性而不限制本文所述的发明。
实施例
实施例1
患有转移性乳腺癌的患者进入诊室并直接抽取血样(8mL~40mL)至含有如柠檬酸盐等抗凝剂的BD Vacutainer CPT管内。将所述材料在1500RCF(相对离心力)~1800RCF离心20分钟。将凝胶屏障上方的细胞层除去并置于已含有如多克隆抗体或HERCEPTIN(曲妥珠单抗)等抗Her-2/neu抗体的另一个容器(例如,管)内。所述抗体已预先由钌标记。用钌标记抗体的常规方法描述于现有技术中,如Lee等,Am J Trap MedHyg 2001,65:1-9。然后将样品中的细胞裂解。裂解可以通过现有技术中描述的许多细胞裂解剂实现,所述细胞裂解剂例如但不限于裂解缓冲液A[1%NP-40,20mM Tris(pH 8.0),137mM NaCl,10%甘油,2mMEDTA,1mM原钒酸钠,10μg/mL抑肽酶,10μg/mL亮肽素]。将经生物素化且抗Her-2/neu的二抗加入裂解物中。例如,该二抗是抗Her-2/neu的生物素化多克隆抗体,如来自R&D Systems的多克隆抗体(目录号BAF1129)。接着将三丙胺溶液与链霉亲和素包被的磁珠一同加入细胞裂解物中,所述磁珠将两个抗体和所结合的抗原带至电极附近。施加电流并用如商购ECL检测装置(BIOVERIS Corporation)等ECL检测装置检测电化学发光(ECL)。在这些仪器内,紧靠工作电极上方安置有光电倍增管(PMT)用于有效光俘获。在工作电极下方,安置有磁体用于俘获涂布有靶标抗原的珠体。信号与所发现的结合于循环肿瘤细胞表面上的Her-2/neu的量成比例。
实施例2
提供了与实施例1中所用的方法相同的方法,不同之处在于将两个抗Her-2/Neu多克隆抗体用于检测。
实施例3
方法与实施例1和2中所用的方法相同,不同之处在于在添加抗体对中的每一个之前将PBMC样品裂解。
实施例4
方法与实施例1和3中所用的方法相同,不同之处在于直接使用全血血样而非PBMC样品。
实施例5
提供了与实施例1~4中所用的方法相同的方法,不同之处在于患者之前具有基于其原发肿瘤分析的Her2/neu阴性结果或没有易于获得的肿瘤组织用于分析。
实施例6
具有高于如实施例1~5中所示的对照样品的Her-2/neu水平的患者被视为具有Her-2/neu阳性的肿瘤细胞,因而以包含如曲妥珠单抗等抗Her-2/neu的单克隆抗体的方案进行治疗。优选治疗由以90分钟输注施用的4mg/kg的初始负荷剂量与以30分钟输注施用的2mg/kg的周维持剂量组成。
实施例7
具有高于如实施例1~5中所示的对照样品的Her-2/neu水平的患者被视为具有Her-2/neu阳性的肿瘤细胞,因而以包含拉帕替尼的方案进行治疗。采用拉帕替尼的给药方案的实例是在重复的21天循环中与2000mg/m2/日的卡培他滨组合(在第1~14天以相隔约12小时的两剂口服施用)将该药剂在第1~21天以1,2500mg每日一次口服给药(5片250mg/片的片剂)。
实施例8
具有高于如实施例1~5中所示的对照样品的Her-2/neu水平的患者被视为具有Her-2/neu阳性的肿瘤细胞,因而以包含CP-724,714的方案进行治疗。采用CP-724,714的给药方案的实例是将该药剂每日两次以250mg的口服剂量给药。
实施例9
具有高于如实施例1~5中所示的对照样品的Her-2/neu水平的患者被视为具有Her-2/neu阳性的肿瘤细胞,因而以包含HKI-272的方案进行治疗。采用HKI-272的给药方案的实例是将该药剂以240mg~320mg的口服剂量在第1天给药一次然后从第8天开始每日一次。
实施例10
在该实施例中,将纯化的重组Her-2/neu(胞外域)用作检测采用电化学发光的基于溶液的免疫测试的灵敏度的标准品。将该标准品稀释于含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中(磷酸盐缓冲盐水;pH=7.2)。
配制测试缓冲液:
·测试缓冲液1:PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的0.5%Tween-20和0.5%牛血清白蛋白(BSA)
Her-2/neu标准品(重组Her-2/neu胞外域)获自Oncogene Science(产品号EL541)。生物素化和非生物素化形式的山羊抗人Her-2/neu多克隆抗体(目录号分别为BAF1129和AF1129)均获自R&D Systems,Inc.(明尼阿波利斯,明尼苏达州55413,美国)。用Lorence & Lu(PCT WO 2006/041959A2)中指示的方法对多克隆抗体AF1129进行钌标记(“TAG标记”)。
下面在本实施例和后续实施例中,将钌标记的多克隆抗体AF1129和生物素化的多克隆抗体BAF1129称作“TAG-pAb”和“生物素-pAb”)。
电化学发光测试如下进行:
·依次将稀释于4个PBS测试缓冲液中的25μl/孔Her-2/neu标准品和50μl/孔TAG-pAb与生物素-pAb的混合物[以下两组浓度之一:(A)50μl中各1μg/ml(在每孔250μl的最终测试体积中最终浓度为0.2μg/ml);和(B)50μl中0.7μg/ml的生物素-pAb(在每孔250μl的最终测试体积中最终浓度为0.14μg/ml),和50μl中1.2μg/ml的TAG-pAb(在每孔250μl的最终测试体积中最终浓度为0.24μg/ml)]加入96孔U形底聚丙烯板的孔内并在室温持续振荡下温育(例如,2小时)。
·在各孔内加入25μl中的10μg链霉亲和素磁珠(例如,DynabeadsM-280 Streptavidin,BioVeris,Corporation,盖瑟斯堡,美国马里兰州)并在持续振荡下温育(例如,30分钟)。
·在各孔内加入测试缓冲液1以使最终体积为每孔250μl。本测试中被分析物(重组Her-2/neu胞外域)的量从16pg/孔至160pg/孔至1600pg/孔变化。还包括不带分析物的对照孔。对所有条件以至少一式两孔进行测试。然后用384分析仪(BioVeris,Corporation,盖瑟斯堡,美国马里兰州)对96孔板的电化学发光进行分析。
结果显示,在两组所用条件下使用TAG-pAb和生物素-pAb以基于溶液的免疫分析能够检测到所有受测的重组Her-2/neu胞外域水平(16pg/孔、160pg/孔和1600pg/孔),并且所述水平均高于基线(表1)。
表1.通过采用钌标记的多克隆抗体(TAG-pAb)和生物素化的多克隆抗体(生物素-pAb)的免疫测试对重组Her-2/neu的电化学发光(ECL)检测
*高于来自不带抗原的对照孔的平均信号的平均ECL信号。
实施例11
·方法与实施例10中所用的方法相同,不同之处在于:分析SK-BR-3乳腺癌细胞(Her-2/neu过表达的阳性对照细胞)的和MDA-MB-468乳腺癌细胞(对Her-2/neu过表达呈阴性)的细胞提取物。
根据ATCC推荐条件使SK-BR-3和MDA-MB-468细胞(来自ATCC,马纳萨斯,美国弗吉尼亚州)生长于6孔组织培养板中,用PBS将其洗涤2次,并用血细胞计数器对等分试样进行计数。用Pierce裂解缓冲液(如Lorence & Lu[PCT WO 2006/041959A2]中所述)进行SK-BR-3细胞的裂解并获得上清液。每孔中裂解上清液的量有所不同,为提取自1~250个SK-BR-3或MDA-MB-468细胞的裂解上清液,并使用实验10中所述的免疫测试采用最终测试浓度为0.2μg/ml的TAG-pAb和0.2μg/ml的生物素-pAb对Her-2/neu进行分析。
本实验的结果如图1和图2所示。图1通过图表展示了数据组的较低端以便最佳地观察该测试检测来自低细胞数的Her-2/neu的能力。图1仅包括最多达10细胞/孔的细胞范围的数据。图2通过图表展示了整个数据组(多达250细胞/孔)。
可以由本实验中的SK-BR-3细胞的裂解物检测Her-2/neu并且检测到的Her-2/neu高于基线,所述裂解物包括本实验中使用最低量的SK-BR-3裂解物的那些孔中的裂解物(每孔添加有1个细胞的孔中的裂解物;图1)。而且,在Her-2/neu免疫测试中,SK-BR-3细胞(Her-2/neu过表达的阳性对照)的裂解物在从1个细胞/孔~250个细胞/孔的整个受测范围内均给出比MDA-MB-468细胞(对Her-2/neu过表达呈阴性)的裂解物高得多的信号,表明Her-2/neu检测结果的高特异性(图1和图2)。
实施例12
在本实验中,免疫测试方法与实施例10中所用的方法相同,不同之处在于人外周血单核细胞(PBMC)获自商业来源(Cellular Technology Ltd.;克利夫兰,美国俄亥俄州;产品号CTL-UP1),并且以与实施例11的乳腺癌细胞相同的方式制备裂解物。
通过在各孔中添加下列物质来制备测试用样品:
·10个SK-BR-3细胞或对照PBS测试缓冲液(PBS,pH=7.2,含0.5%BSA和0.5%Tween 20)的细胞裂解物。
·625,000个人PBMC或对照PBS测试缓冲液(PBS,pH=7.2,含0.5%BSA和0.5%Tween 20)的细胞裂解物。
在这些合并的裂解物中,添加下列物质:
·在各孔内添加Tag-pAb和生物素-pAb(每种抗体的最终测试浓度为0.2μg/ml),并将96孔板在室温持续振荡下温育2小时。
·在各孔内添加25μl中的10μg链霉亲和素磁珠(例如,DynabeadsM-280Streptavidin,目录号110028,BioVeris,Corporation,盖瑟斯堡,美国马里兰州)并在持续振荡下温育30分钟。
·在各孔内添加PBS测试缓冲液(PBS,pH=7.2,含0.5%BSA和0.5%Tween 20)以使最终体积为250μl/孔。然后如实施例10所述对96孔板进行电化学发光分析。
本实验的结果如表2所示。无法从625,000个人PBMC中检测到Her-2/neu(表2)。相反,即使从所用的最小量的SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物(10个SK-BR-3细胞的裂解物/孔;见表6)中也可以检测到Her-2/neu。另外,添加625,000个人PBMC的细胞裂解物不干扰对乳腺癌细胞中Her-2/neu的检测(表2)。
表2.在存在或不存在人PBMC裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中Her-2/neu的ECL免疫测试检测
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
**负:ECL信号低于背景水平。
实施例13
在这两个实验中,如实施例10中使用Her-2/neu蛋白标准品和实施例11中使用SK-BR-3裂解物那样进行免疫测试,不同之处在于使用人源化单克隆抗体曲妥珠单抗(Herceptin)代替生物素-pAb并且测试了下列四种ECL免疫测试条件之一:
·条件1:将曲妥珠单抗用钌直接标记。使用如实施例10中指定的最终测试浓度为0.2μg/ml的生物素化多克隆抗体。
·条件2:将曲妥珠单抗用生物素直接标记。使用如实施例10中指定的最终测试浓度为0.2μg/ml的钌标记多克隆抗体。
·条件3和4:在这两种条件中,没有将曲妥珠单抗直接标记;而是使用二抗(生物素标记的抗人IgG)。
о条件3:首先将曲妥珠单抗(当以250μl/孔进行ECL时最终浓度为0.2μg/ml)直接与细胞裂解物温育50分钟。在该步骤后添加生物素标记的抗人IgG(最终浓度0.2μg/ml;eBioscience,圣地亚哥,美国加利福尼亚州;目录号13-4998,生物素标记的山羊抗人IgG抗体)和TAG-pAb(最终浓度0.2μg/ml),然后将这些测试组分在室温温育1小时,接着添加链霉亲和素珠(如此前在实施例10中所用)。
о条件4:浓度与条件3相同,不同之处在于改变了试剂的添加顺序。在条件4中,首先将曲妥珠单抗和钌标记的pAb(TAG-pAb)与细胞裂解物温育50分钟。在该步骤后添加生物素标记的抗人IgG,然后将这些测试组分在室温温育1小时,接着添加链霉亲和素珠(如此前在实施例10中所用)。
在使用曲妥珠单抗的第一个实验中,在测试Her-2/neu阳性对照样品时测试了条件1和2。在该实验中,使用1600pg/孔的Her-2/neu时,条件1产生了远远高于背景的信号,并且比条件2更灵敏。
表3A根据条件1和2(这两种条件详见实施例13的正文)使用标记的曲妥珠单抗对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中Her-2/neu标准品的ECL免疫测试检测
*负:ECL信号低于背景水平。
在使用曲妥珠单抗的下一个实验中,设计了条件3和4来改善相对于条件1和2的灵敏度,并将条件3和4用于测试SK-BR-3细胞裂解物的Her-2/neu。结果显示在条件3和4下,在基于溶液的测试中可以将曲妥珠单抗与多克隆抗体共同使用以检测至少1个SK-BR-3细胞/孔的裂解物的Her-2/neu(表3B)。条件4在检测少量的SK-BR-3细胞时比条件3更灵敏。
表3B.使用未标记的曲妥珠单抗、生物素标记的抗人IgG和TAG-pAb对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中Her-2/neu的ECL免疫测试检测。测试了如实施例13的正文中限定的两种不同免疫测试条件(条件3和4)。
基于该实施例的结果,在使用曲妥珠单抗的4种测试条件中,使用抗曲妥珠单抗的二抗的条件3和4相对于将曲妥珠单抗直接标记且未使用二抗的条件1和2提供了有利结果。
实施例14
在本实验中,使用TAG-pAb和生物素-pAb的免疫测试方法与实施例12中所用的方法相同,且使用曲妥珠单抗的免疫测试方法与实施例13的条件4相同。来自6个额外供体的人外周血单核细胞(PBMC)获自Cellular Technology Ltd.(克利夫兰,美国俄亥俄州;产品号CTL-UP1),且如实施例12那样制备裂解物。在本实施例中,在有或没有SK-BR-3细胞的裂解物(以10细胞/孔进行测试)掺加入这些PBMC裂解物的条件下以500,000细胞/孔~1,000,000细胞/孔测试PBMC的裂解物。
对于单独的PBMC供体,使用TAG-pAb和生物素-pAb的结果如表4~9所示,对于所有供体的平均值的结果如表10所示。如表4~9所示且如表10中所总结,在所有供体PBMC中获得了非常一致的结果。即使高达1,000,000个PBMC的裂解物也给出了比仅10个SK-BR-3细胞的裂解物明显更低的Her-2/neu信号。即使在高达1,000,000个PBMC的裂解物的存在下也能由10个SK-BR-3细胞的裂解物获得高信号。这些结果表明人PBMC不会干扰本免疫测试从少量的过表达Her-2/neu的乳腺癌细胞中检测Her-2/neu的能力。
对于单独的PBMC供体,使用曲妥珠单抗、生物素标记的抗人IgG和TAG-pAb的结果如表11~16所示,对于所有供体的平均值的结果如表17所示。使用采用这些抗体的基于溶液的免疫测试获得的结果与使用TAG标记的多克隆抗体和生物素标记的多克隆抗体时获得的结果非常相似。在所有使用的供体PBMC中,结果再一次一致。与由仅10个SK-BR-3细胞的裂解物所获得的高信号相反,来自各个供体的1,000,000个PMBC的裂解物都没有给出高于基线的Her-2/neu信号。这些结果再次表明人PBMC不会干扰本方法从少量的过表达Her-2/neu的乳腺癌细胞中检测Her-2/neu的能力。
表4.在存在或不存在来自供体0706号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用生物素-pAb和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
表5.在存在或不存在来自供体0920号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用生物素-pAb和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
表6.在存在或不存在来自供体1026号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用生物素-pAb和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
表7.在存在或不存在来自供体0711号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用生物素-pAb和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
表8.在存在或不存在来自供体0524号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用生物素-pAb和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
表9.在存在或不存在来自供体0116G号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用生物素-pAb和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
表10.表4~9的数据的平均值:在存在或不存在人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用生物素-pAb和Tag-pAb)。所示为所有供体PBMC的数据的平均值。
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
表11.在存在或不存在来自供体0706号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用曲妥珠单抗、生物素标记的抗人IgG和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
**负:ECL信号略低于背景水平。
表12.在存在或不存在来自供体0920号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用曲妥珠单抗、生物素标记的抗人IgG和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
**负:ECL信号略低于背景水平。
表13.在存在或不存在来自供体1026号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用曲妥珠单抗、生物素标记的抗人IgG和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
**负:ECL信号略低于背景水平。
表14.在存在或不存在来自供体0711号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用曲妥珠单抗、生物素标记的抗人IgG和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
**负:ECL信号略低于背景水平。
表15.在存在或不存在来自供体0524号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用曲妥珠单抗、生物素标记的抗人IgG和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
**负:ECL信号略低于背景水平。
表16.在存在或不存在来自供体0116G号的人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用曲妥珠单抗、生物素标记的抗人IgG和Tag-pAb)
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
**负:ECL信号略低于背景水平。
表17.表11~16的数据的平均值:在存在或不存在人PBMC的裂解物时对SK-BR-3乳腺癌细胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫测试检测(使用曲妥珠单抗、生物素标记的抗人IgG和Tag-pAb)。所示为所有供体PBMC的数据的平均值。
*这些值的背景是仅来自测试缓冲液的信号。
**负:ECL信号略低于背景水平。
Claims (25)
1.一种检测全血血样中的循环癌细胞上的Her-2/neu蛋白表达的方法,所述方法包括对所述血样进行能够检测癌细胞相关Her-2/neu的免疫测试,其中阳性免疫测试结果表明在所述癌细胞上存在Her-2/neu;
其中在进行所述免疫测试之前没有将所述循环癌细胞从所述全血中分离;
且其中所述免疫测试:
a)能够在SK-BR-3乳腺癌细胞以小于或等于100个SK-BR-3细胞/ml血液的浓度掺加入血液中时检测来自所述SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu;和
b)能够在至少1×106个人外周血单核细胞存在下进行测试时检测来自10个SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu。
2.一种检测血样中的循环癌细胞上的Her-2/neu蛋白表达的方法,所述方法包括对所述血样进行能够检测癌细胞相关Her-2/neu的免疫测试,其中阳性免疫测试结果表明在所述癌细胞上存在Her-2/neu;
其中在进行所述免疫测试之前没有将所述循环癌细胞从外周血单核细胞中分离;
且其中所述免疫测试:
a)能够在SK-BR-3乳腺癌细胞以小于或等于100个SK-BR-3细胞/ml血液的浓度掺加入血液中时检测来自所述SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu;和
b)能够在至少1×106个人外周血单核细胞存在下进行测试时检测来自10个SK-BR-3乳腺癌细胞的Her-2/neu。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中,所述免疫测试是基于溶液的免疫测试。
4.如权利要求3所述的方法,其中,所述免疫测试采用选自由电化学发光、化学发光、荧光化学发光、荧光偏振和时间分辨荧光组成的组的技术用于检测。
5.如权利要求1或2所述的方法,其中,所述免疫测试是夹心免疫测试。
6.如权利要求5所述的方法,其中,所述免疫测试采用选自由电化学发光、化学发光和荧光化学发光组成的组的技术用于检测。
7.如权利要求1或2所述的方法,其中,所述免疫测试产生与所述血样中存在的癌细胞相关Her-2/neu分子数成比例的信号。
8.如权利要求1或2所述的方法,其中,所述免疫测试使用与Her-2/neu的细胞质域选择性结合的一种或两种抗体。
9.如权利要求8所述的方法,其中,所述免疫测试使用与Her-2/neu的细胞质域选择性结合的两种抗体。
10.如权利要求1或2所述的方法,其中,所述免疫测试使用抗Her-2/neu的多克隆抗体。
11.如权利要求10所述的方法,其中,所述免疫测试使用抗所述多克隆抗体的二抗。
12.如权利要求1或2所述的方法,其中,所述免疫测试使用抗Her-2/neu的单克隆抗体。
13.如权利要求12所述的方法,其中,所述免疫测试使用抗所述单克隆抗体的二抗。
14.如权利要求12所述的方法,其中,所述单克隆抗体是人源化小鼠单克隆抗体。
15.如权利要求14所述的方法,其中,所述单克隆抗体是曲妥珠单抗。
16.一种识别可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌剂的治疗的癌症患者的方法,所述方法包括权利要求1的方法,其中含癌细胞的所述血样取自所述患者。
17.如权利要求16所述的方法,其中,通过Her-2/neu的组织测试已预先确定来自所述患者的肿瘤活检组织的Her-2/neu表达为阴性。
18.如权利要求17所述的方法,其中,所述组织测试选自由免疫组织化学和荧光原位杂交分析组成的系列。
19.一种治疗可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌剂的治疗的癌症患者的方法,所述方法包括对根据权利要求16~18中任一项所述的方法识别出的患者施用所述靶向Her-2/neu的抗癌剂。
20.如权利要求19所述的方法,其中,所述抗癌剂选自由曲妥珠单抗、拉帕替尼、CP-724,714、HKI-272和BMS-599626组成的系列。
21.一种识别可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌剂的治疗的癌症患者的方法,所述方法包括权利要求2的方法,其中,含癌细胞的所述血样抽取自所述患者。
22.如权利要求21所述的方法,其中,通过Her-2/neu的组织测试已预先确定来自所述患者的肿瘤活检组织的Her-2/neu表达为阴性。
23.如权利要求22所述的方法,其中,所述组织测试选自由免疫组织化学和荧光原位杂交分析组成的系列。
24.一种治疗可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌剂的治疗的癌症患者的方法,所述方法包括对根据权利要求21~23中任一项所述的方法识别出的患者施用所述靶向Her-2/neu的抗癌剂。
25.如权利要求24所述的方法,其中,所述抗癌剂选自由曲妥珠单抗、拉帕替尼、CP-724,714、HKI-272和BMS-599626组成的系列。
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