WO1997042503A1 - Procede et installations de separation de particules magnetiques dans un fluide pour l'analyse biologique, et application dudit procede - Google Patents

Procede et installations de separation de particules magnetiques dans un fluide pour l'analyse biologique, et application dudit procede Download PDF

Info

Publication number
WO1997042503A1
WO1997042503A1 PCT/FR1997/000794 FR9700794W WO9742503A1 WO 1997042503 A1 WO1997042503 A1 WO 1997042503A1 FR 9700794 W FR9700794 W FR 9700794W WO 9742503 A1 WO9742503 A1 WO 9742503A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
tube
magnetic
separation
section
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/000794
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Claude Bisconte De Saint Julien
Original Assignee
Biocom S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biocom S.A. filed Critical Biocom S.A.
Priority to EP97923133A priority Critical patent/EP0855030A1/fr
Priority to JP9539592A priority patent/JP2000500871A/ja
Priority to US08/952,493 priority patent/US6143577A/en
Publication of WO1997042503A1 publication Critical patent/WO1997042503A1/fr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/035—Open gradient magnetic separators, i.e. separators in which the gap is unobstructed, characterised by the configuration of the gap
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/971—Capture of complex after antigen-antibody reaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/806—Electrical property or magnetic property
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/81—Tube, bottle, or dipstick
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/824—Immunological separation techniques

Definitions

  • the present invention relates to a method and an installation for separating magnetic particles in a fluid for the biological analysis of rare events.
  • the invention more particularly finds its application in the fields of medical diagnosis and quality control, in particular in the food industry, but also in the therapeutic field for detecting and taking from samples a cell type with a low occurrence.
  • medical applications of the invention there may be mentioned:
  • Separation of fetal cells present in maternal blood involves selectively collecting cells present at the rate of approximately 1 fetal cell per 10 million non-fetal cells.
  • the implementation of the present invention should make it possible to replace the risk samples of amniotic cells.
  • immuno-affinity methods consisting in fixing an antibody on a support, which antibody reacts vis-à-vis an antigenic motif present on the surface of the cells sought (Forsgren and Sjoquist, 1986; Langone, 1982).
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • MCS Magnetic Affinity Cell Sorting
  • FACS and MACS methods are well known today and have already given rise to industrial implementation. In general, the results obtained with each of these methods differ little in terms of effectiveness and allow between 70 and 100% recovery. However, they are more or less suitable for the various applications envisaged.
  • the present invention is also based on the use of magnetic particles on the surface of which is immobilized a substance capable of specifically binding to a complementary substance which is free or present on the surface of cells.
  • the analysis is carried out in a liquid medium by subjecting the biological medium into which said magnetic particles have been introduced to a magnetic field.
  • the magnetic particles more particularly envisaged within the framework of the invention are microbeads of the type of those sold by the companies Dynal, Rhône Poulenc or Sigma.
  • paramagnetic microbeads of micron size can have on their surface different ligands depending on the application which is envisaged. These ligands are fixed to the surface of the microbeads by the techniques described in the prior art, these ligands can be:
  • Oligonuleotides for example oligo (dT) or oligo (dA) of variable sizes, biotinylated and therefore fixed to the surface of the microbeads by means of streptavidin.
  • oligonucleotides make it possible, by hybridization, to purify or extract RNA or DNA from samples previously treated so as to render the nucleic acids which it contains capable of hybridizing.
  • the use of these oligonucleotides attached to the surface of the paramagnetic beads can also constitute a preparatory phase for an amplification protocol by PCR or a cloning after PCR, or even be used for sequencing in solid phase.
  • the beads thus loaded with a ligand are brought into contact with the sample which may have undergone a preliminary treatment, in order to achieve the segregation of the event sought by the action of a magnetic field.
  • the use of this technique has the drawback of requiring multiple manipulations and leads to a set of beads more or less aggregated by the action of the magnet, among which are some rare cells.
  • the disproportion of the number of beads compared to the number of cells, of the order of 1 to 10 then makes the identification and collection of these cells impossible.
  • the object of the present invention is therefore to offer a method eliminating the steps of rinsing and elimination of cells and liquids not sought and jointly the automatic selection of the sought elements and the segregation with free paramagnetic beads.
  • Another object of the present invention is to improve the efficiency of the magnetic methods by avoiding the artefacts noted in the methods of the prior art and by simplifying the implementation protocol.
  • the sensitivities sought in the abovementioned fields can be of the order of 1 cell for 1 or even 10 grams of sample.
  • the European patent EP206077 is also known in the state of the art.
  • This patent discloses the general principle of magnetic immunoseparation by circulation in a tubular segment placed in a uniform magnetic field. It has appeared in certain use cases that the excess particles could be attracted too quickly at the start of the tube, and that agglomerates were created blocking the circulation of the labeled or unmarked cells. Given the scarcity of target cells, this situation is very troublesome.
  • the invention aims to remedy this drawback by proposing to create an inhomogeneous magnetic field. This characteristic prevents the formation of agglomerates of unbound particles in the upstream part of the tubular segment.
  • the invention firstly relates to a method of magnetic separation of cells, in particular bacteria, fetal cells, stem cells of the bone marrow and of circulating cancerous cells, of the type consisting in fixing the target cells. on paramagnetic beads and causing a magnetic field to act on a sample containing the fixed cells, the free cells and the excess paramagnetic beads, to isolate the paramagnetic beads, characterized in that the sample is circulated in a tube whose the section is much less than the length over which the magnetic field is applied.
  • the sample preferably flows at a speed of a few centimeters per second.
  • the excess beads due to their lower density than that of marked or unlabeled cells, or the clusters of paramagnetic beads, due to their high sensitivity to the magnetic field, are quickly attracted against the wall of the tube and are immobilized in the part proximal of the tube.
  • Unfixed cells are insensitive to the magnetic field and pass through the tube.
  • the cells fixed on paramagnetic beads are entrained by the flow inside the tube, before being immobilized against the wall of the tube, in the distal part of the tube.
  • the sample is made to circulate in a spirally wound tube placed in a magnetic field whose lines of flows are substantially perpendicular to the plane of the spiral.
  • the section of the tube is between 0.5 and 3 millimeters and the length of the tube is greater than 10 centimeters.
  • the tube is placed in a non-homogeneous magnetic field.
  • This field can be produced by a permanent magnet or by an electromagnet.
  • the preparation is introduced into a reservoir connected to the separation tube, said reservoir being raised relative to the tube to ensure circulation of the sample by gravity.
  • the invention also relates to an installation for the magnetic immuno-separation of cells, in particular bacteria, fetal cells, stem cells of the bone marrow and of circulating cancerous cells, characterized in that it consists of a tube whose cross section is much less than the length, said tube being wound to form a spiral, and by at least one magnet arranged to create a magnetic field substantially perpendicular to the plane of the spiral formed by said tube.
  • it comprises a tube having two sections of increasing section, the second section being at least 10 times greater than the first section.
  • the invention also relates to applications of this method for:
  • FIG. 1 shows a front view of a device according to the invention
  • Figure 2 shows a sectional view of the tubing;
  • Figure 3 shows a view of an alternative embodiment.
  • FIGS. 6 shows a cross-sectional view of an alternative embodiment
  • Figure 5 shows a view of a second alternative embodiment using a peristatic pump
  • Figures 6 shows a view of another alternative embodiment in operates a peristatic pump
  • FIGS. 6 ' represents a view of another alternative embodiment using a peristatic pump
  • FIG. 1 represents a front view of an exemplary embodiment of a device according to the invention. It consists of a receptacle (1) which can contain approximately 10 to 50 milliliters, connected to a tube (2) wound in a spiral and ending in an outlet tube (3) provided with a valve (4).
  • a set of permanent magnets (5) is arranged radially to create a non-homogeneous magnetic field. The arrangement of the magnets is indicated by way of example, a different arrangement, for example in the form of parallel magnets, also being applicable.
  • the magnets (5) consist of bars made of samarium-cobalt. These magnetic bars can optionally be mounted on a rotating support disc.
  • This variant makes it possible to drive the paramagnetic balls fixed towards the outlet of the tubing at one stage of the process. For example, they rotate alternately ⁇ 20 °.
  • the maximum drive speed is a few millimeters per second, so as to optimize the efficiency on paramagnetic particles.
  • the particles will be mixed to facilitate rinsing and the elimination of cells and particles.
  • the cross-section of the tubing (2) is approximately 0.5 millimeters. It is made of a material such as TEFLON (registered trademark). The length is about 50 centimeters.
  • the use of the device is as follows: a) first of all a PBS (commercial name) type rinsing liquid is introduced into a 20 milliliter pipette; b) the blood sample (7) which has been previously incubated with paramagnetic particles is aspirated. 9 milliliters of physiological saline are added (8). c) the receptacle (1) is connected to the spiral tube (2), scrupulously avoiding the formation of bubbles; d) the receptacle (1) is raised by about 30 centimeters relative to the spiral e) the valve (6) provided between the receptacle (1) and the tube (2) is opened.
  • a PBS commercial name
  • the next step consists in recovering the rosettes or nuclei from the cells sought.
  • the spiral (2) is moved away from the influence of the magnetic bars (5), and the flow of the rest of the rinsing liquid is resumed. This one will entrain all the paramagnetic particles and the cells carrying paramagnetic particles.
  • the desired particles can thus be recovered by filtering, using a filter allowing the paramagnetic particles to pass, but not the cells.
  • a new reagent will be activated which will have the property of lysing the fixed cells by releasing the hardened and colored nuclei.
  • a reagent consists of the following mixture:
  • CETRIMIDE Trademark
  • This mixture is introduced into the receptacle (1) so that the volume does not exceed that of the spiral (2).
  • the coloring makes it easier to visualize the progression of the liquid.
  • This mixture is left in contact for 10 minutes with the spiral.
  • the magnets are actuated in alternating movements to facilitate the release of the nuclei. We can then rinse to recover the pure nuclei.
  • the magnets (5) are always present, no magnetic particles will contaminate the preparation.
  • the identification of the nuclei implies the use of molecular hybridization reagents. These make it possible to detect genetic anomalies such as the presence of a supernumerary centromere (trisomy 21) or amplified expressions of oncogenes, or even expressions of particular genes type P53.
  • the stoichiometrically colored pure nuclei make it possible to define a level of ploid which characterizes the stages of tumor cells.
  • Figure 1 shows an alternative embodiment of a device according to the invention.
  • the device comprises three containers (31 to 33) of reagents and samples connected to a separator pipe (35) spirally wound. Automatic taps or valves open or close the flow of each of the containers (31 to 33) to the separator pipe (35).
  • This separator pipe is placed in a magnetic field gradient generated by permanent magnets (36) arranged in a star, in alternating radial direction.
  • the downstream end of the separator pipe (35) opens on the one hand into a collection pipe (37) and on the other hand into a discharge pipe (38).
  • Valves or taps are provided on each of these pipes to control the flow from under to a rejection container (39), under to analysis means formed by a collection system on filter (40), by a collection container (41) or by a particle flow detector (42).
  • Figure 2 shows a sectional view of a segment of tubing. Under the effect of Bernoulli's forces, the particles tend to concentrate in the center of the flux, where speed is most important. Under the effect of magnetic fluxes, the paramagnetic beads (10) lighter and less bulky than the unmarked particles (11) than the marked cells (12) are very quickly attracted to the wall (13) of the tubing.
  • the trajectory of the unmarked cells (11) is not disturbed by the magnetic fluxes and these therefore remain in the center of the flux where they are quickly drawn towards the exit.
  • the marked cells (12) are found in the last part of the tubing (2).
  • the tubing can be made by two segments of increasing section, the first serving to retain the excess beads, and the second to retain the marked cells.
  • Figures 3 and 4 show views respectively in median section and in cross section of an alternative embodiment.
  • the tubing (2) is formed by a groove (14) made in a plastic plate (15). It opens on the one hand on one of the side edges to allow connection to a connecting pipe with the receptacle (1) supply, and on the other hand with a transverse orifice (16) passing through the plate (15) allowing the evacuation of fluids.
  • the device is formed of two symmetrical plates (15, 15 ') and are connected so as to define between them the liquid circulation pipe. They have housings for the magnets (17) on the exterior surfaces.
  • FIG. 5 represents a view of a second alternative embodiment using a peristatic pump.
  • the progression of the liquids is not conditioned by gravity, but by a peristatic pump.
  • the device consists of a tubular element (22) forming a separating loop. One end sucks the treated sample as in the previous examples.
  • the tubular element (22) is arranged in the field of permanent magnets (24 to 28) oriented perpendicular to the direction of movement of the liquid, in alternating directions.
  • the tubular element (22) is disposable, which avoids any contamination of its interior walls.
  • This tubular element (22) is connected to the suction tube of a peristaltic pump (29) of known type.
  • the waste is collected in a test tube (30) at the outlet of the pump (29).
  • the circulation of the fluid inside the tube is preferably continuous, with a speed of one order of 1 cm per second. The continuous circulation prevents the formation of cellular adhesions on the wall of the separation tube.
  • FIGS. 6, 6 and 6 show a partial view of an alternative embodiment.
  • the magnets form a squirrel cage (32) formed by a plurality of magnetic bars (33 to 40) magnetized radially in alternating directions.
  • This structure allows one or more tubular elements (22) to be positioned and several samples to be processed in parallel.
  • the use of such a device is as follows:
  • the free end (23) of the separator pipe (22) is immersed in the sample which has previously received the paramagnetic particles.
  • It activates the pump (29) which will pass the magnetic particles and cells in the separator loop arranged in the magnetic field.
  • the magnetic particles and the rosettes formed by the marked cells will stop in this loop while the other cells will evacuate.
  • it is preferable to replace the peristaltic pump by another means of aspiration, for example a syringe suction or a source of depression, to avoid crushing of unmarked cells.
  • Image analysis is able to resolve certain discriminations.
  • the total number of artifacts must remain below these values, which requires high performance of the chain of separation of marked cells and unlabeled cells, and high quality of cell recovery.
  • the usual slide collection and staining procedures generate "noise" which is not compatible with such requirements.
  • the filtration device according to the invention makes it possible to meet these requirements. It consists of a piece (41) of molded silicone, for single use. This part (41) has a thickness of the order of 2 millimeters and has twelve protrusions (51) with a diameter of 6 millimeters and a height of 10 millimeters. These protrusions (51), normally closed, can be perforated by a hollow needle (48) provided at the end of the separator tube (42).
  • the silicone part (41) is positioned in a rigid perforated plate (43).
  • the perforations are arranged in a manner complementary to the protuberances (51) of the part (41).
  • This plate (43) can be tightly connected to a support (45) and held in position by claws (44).
  • An O-ring completes the sealing of this assembly.
  • the support (45) also has perforations arranged opposite the perforations of the plate (43).
  • the support is connected to a vacuum source.
  • a microporous filtration membrane (47) is disposed between the plate (43) and the support (45). It is advantageously a microporous polycarbonate membrane whose cells have a section of 2 microns.
  • the part (41) is delivered with a protective film placed under the underside. One or more protrusions can be opened.
  • the plate (41) is placed on the support (43) after positioning the membrane microporous, and the assembly is locked using the claws (44).
  • the separation tube (2) is delivered with a protective cap which prevents any contamination. This cap is removed and one of the protuberances of the part (41) is perforated.
  • the isolated paramagnetic particles pass through the membrane while the rosettes remain on the surface.
  • the porosity of the microporous membrane allows the passage of paramagnetic particles whose cross-section is of the order of a micron, but not the rosettes, whose cross-section is of the order of 5 microns.
  • the porosity can be 1 to 2 microns.
  • the coloring can be done before filtration by fluorescent dyes of the IP or BET type (trade names) or even by coloring on the filter after the latter has been extracted from the containment system.
  • the combination of a separator device formed by a tube of section much less than the length placed in a magnetic field gradient, and a filtration system as described above, has many advantages. Such an association first of all facilitates the automation of biological analysis. It also makes it possible to carry out analyzes and uses for therapeutic purposes requiring a high degree of sterility.
  • the paramagnetic beads allow sorting of the cells, and in particular a separation of the sought cells and the other cells.
  • the filter removes certain excess cells, such as platelets, as well as excess paramagnetic beads.
  • the filter also has the function of cell concentration rare sought on a reduced surface facilitating the analysis by imagery. This filter also makes it possible, for therapeutic applications in particular, to carry out a culture of the cells sought.
  • the filter serves as a cell support and can be supplied with a nutritive liquid capable of promoting cell multiplication.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé d'immunoséparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de celles cancéreuses circulantes, du type consistant à fixer les cellules cibles sur des billes paramagnétiques et à faire agir un champ magnétique sur un échantillon contenant les cellules fixées, les cellules libres et les billes paramagnétiques excédentaires, pour isoler les billes paramagnétiques, que l'on fasse circuler l'échantillon dans un tube (2) dont la section est très inférieure à la longueur sur laquelle s'applique le champ magnétique.

Description

PROCEDE ET INSTALLATIONS DE SEPARATION DE PARTICULES MAGNÉTIQUES DANS UN FLUIDE POUR L'ANALYSE BIOLOGIQUE, ET APPLICATION DUDIT PROCEDE. La présente invention concerne un procédé et une installation de séparation de particules magnétiques dans un fluide pour l'analyse biologique d'événements rares .
L'invention trouve plus particulièrement son application dans les domaines du diagnostic médical et du contrôle de qualité notamment dans l'industrie agro¬ alimentaire, mais aussi dans le domaine thérapeutique pour détecter et prélever dans des échantillons un type cellulaire à faible occurrence. On peut citer à titre d'exemples d'applications médicales de l'invention :
La séparation de cellules foetales présentent dans le sang maternel. Il s'agit dans ce cas de recueillir, de façon sélective, des cellules présentes à raison de environ 1 cellule foetale pour 10 millions de cellules non foetales . La mise en oeuvre de la présente invention devrait permettre de remplacer les prélèvements à risque de cellules amniotiques.
- La préparation de cellules souches de la moelle osseuse permettant de re-ensemencer des moelles détruites à la suite de traitement anticancéreux par chimiothérapie ou radiothérapie. Comme dans le cas des cellules foetales, le nombre de cellules de la moelle osseuse dans le sang périphérique est très inférieur à celui des autres cellules, de l'ordre de 1 pour 200 000.
La détection précoce des cellules cancéreuses circulantes ou micro métastase, qui est du plus haut intérêt pour déterminer des stratégies exploratoires et thérapeutiques. Là encore, l'objectif est d'isoler et d'identifier 1 cellule pour environ 5 millions de cellules nucléées .
Dans le domaine du contrôle biologique des aliments ou de l'environnement, l'objectif est d'obtenir un résultat rapide sans passer par la phase traditionnelle de multiplication en culture. Les sensibilités attendues sont de l'ordre de 1 cellule (bactérie, levure ou moisissure) pour 1 gramme voire 10 grammes de produit. Il existe dans l'art antérieur de nombreux dispositifs permettant d'atteindre ce but. On peut citer parmi ceux-ci :
Les méthodes physiques basées sur les différences de taille, de densité ou de charge électrique (De Duve, 1971 ; Zeiller, 1972 ; Pretlow et Pretlow, 1982) .Mais ces méthodes présentent un manque de spécificité.
- Les méthodes d' immuno-affinité consistant à fixer un anticorps sur un support, lequel anticorps réagit vis-à-vis d'un motif antigénique présent à la surface des cellules recherchées (Forsgren et Sjoquist, 1986 ; Langone, 1982) . Différents procédés dérivant des méthodes d' immuno-affinité, tels que la chromatographie d'affinité (Hunt et al., 1982), ont été proposés.
- La séparation cellulaire associée à une détection de fluorescence relevant de la méthode dite
"FACS" pour l'expression anglaise "Fluorescence Activated Cell Sorting" . Cette méthode largement décrite met en oeuvre des équipements sophistiqués comprenant un flux liquide dans lequel défilent les cellules. Un faisceau laser excite la fluorescence et déclenche ainsi un signal qui permet de dévier électriquement la cellule dans un récipient. Cette méthode est très efficace et permet d'atteindre un enrichissement de près de 100 % mais elle n'est pas adaptée au tri de populations importantes. Les méthodes de séparation magnétique désignées "MACS" pour l'expression anglaise "Magnetic Affinity Cell Sorting", qui reposent sur l'utilisation de particules magnétiques ingérées par les cellules (Melville et al., 1975) ou fixées sélectivement aux cellules par le biais d'anticorps (Molday et al., 1977) .
Les méthodes FACS et MACS sont aujourd'hui bien connues et ont déjà donné lieu à une mise en oeuvre industrielle. D'une façon générale, les résultats obtenus avec chacune de ces méthodes diffèrent peu en terme d'efficacité et permettent entre 70 et 100 % de récupération. Toutefois, elles sont plus ou moins adaptées aux diverses applications envisagées .
La présente invention est fondée également sur la mise en oeuvre de particules magnétiques à la surface desquelles est immobilisée une substance capable de se lier spécifiquement à une substance complémentaire libre ou présente sur la surface de cellules. L'analyse est réalisée en milieu liquide en soumettant le milieu biologique dans lequel a été introduit lesdites particules magnétiques à un champ magnétique.
Les particules magnétiques plus particulièrement envisagées dans le cadre de 1 ' invention sont des microbilles du type de celles commercialisées par les Sociétés Dynal, Rhône Poulenc ou Sigma.
Ces microbilles paramagnétiques de taille micronique peuvent comporter à leur surface différents ligands selon l'application qui est envisagée. Ces ligands sont fixés à la surface des microbilles par les techniques décrites dans l'art antérieur, ces ligands peuvent être :
Des anticorps poly ou monoclonaux spécifiques d'antigènes présents à la surface de certains types cellulaires, comme les protéines CD2, CD4, CD8 exprimées à la surface des lymphocytes T. Ces anticorps sont fixés à la surface des microbilles par exemple par le biais d'immunoglobulines.
- Des oligonuléotides, par exemple oligo(dT) ou oligo(dA) de tailles variables, biotinylés et donc fixés à la surface des microbilles par le biais de streptavidine. Ces oligonucléotides permettent par hybridation de purifier ou extraire de l'ARN ou de l'ADN d'échantillons préalablement traités de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider. La mise en oeuvre de ces oligonucléotides fixés à la surface des billes paramagnétiques peut aussi constituer une phase preparative pour un protocole d'amplification par PCR ou un clonage après PCR, ou encore être utilisée pour un séquençage en phase solide. Les billes ainsi chargées d'un ligand sont mises en contact avec l'échantillon ayant éventuellement subi un traitement préalable, afin de réaliser la ségrégation de l'événement recherchée par l'action d'un champ magnétique. Mais l'utilisation de cette technique présente 1 ' inconvénient de nécessiter des manipulations multiples et conduit à un ensemble de billes plus ou moins agrégées par l'action de l'aimant parmi lesquelles se trouvent quelques rares cellules . La disproportion du nombre de billes par rapport au nombre de cellules, de l'ordre de 1 pour 10, rend alors l'identification et le recueil de ces cellules impossible. Diverses solutions sont proposées dans 1 'art antérieur pour supprimer ces inconvénients, comme l'action d'un détergent qui libèrent les noyaux cellulaires mais interdisent ultérieurement l'usage ou l'identification visuelle ou par un anticorps des cellules séparées, ou encore l'usage de produits de détachement qui agissent de façon variable. Or, dans certains cas, le caractère vital des cellules séparées est primordial, soit parce que l'on envisage une réutilisation thérapeutique des cellules, cas des cellules souches hématopoïétiques, soit une remise en culture cellulaire in vitro pour amplifier un signal, cas des cellules foetales. Les techniques classiques mettant en oeuvre des microbilles décrites ci-dessus peuvent alors avoir une action lésante sur les cellules et empêchent l'utilisation de colonnes séparatrices imposant aux cellules un parcours compliqué et traumatisant.
Les procédés de l'état de la technique ne sont donc pas totalement satisfaisants. Notamment des artefacts réduisent les performances théoriquement prévisibles. En effet, les billes paramagnétiques excédentaires ont parfois tendance à former une gangue emprisonnant totalement une cellule cible. Compte tenu de la très faible occurrence des cellules cibles, ce phénomène est particulièrement néfaste. Par ailleurs, les opérations de séparation nécessitent le respect minutieux d'un protocole fastidieux et répétitif, qui est source d'erreur.
Le but de la présente invention est donc d'offrir un procédé supprimant les étapes de rinçage et d'élimination des cellules et liquides non recherchés et conjointement la sélection automatique des éléments recherchés et la ségrégation d'avec les billes paramagnétiques libres.
Un autre but de la présente invention est d'améliorer l'efficacité des procédés magnétique en évitant les artefacts relevés dans les procédés de l'art antérieur et en simplifiant le protocole de mise en oeuvre.
Elle a pour but de faciliter la séparation en vue de la numération, de l'analyse, ou du traitement, de matériel biologique présent à de très faibles concentrations dans un échantillon. Les sensibilités recherchées dans les domaines susvises peuvent être de l'ordre de 1 cellule pour 1 voire 10 grammes d'échantillon.
On connaît également dans l'état de la technique le brevet européen EP206077.
Ce brevet divulgue le principe général d' immunoseparation magnétique par circulation dans un segment tubulaire placé dans un champ magnétique uniforme. Il est apparu dans certains cas d'utilisation que les particules excédentaires pouvait être attirées trop rapidement au début du tube, et qu'il se créait des agglomérats bloquant la circulation des cellules marquées ou non. Compte tenu de la rareté des cellules cibles, cette situation est très gênante. L'invention vise à remédier à cet inconvénient en proposant de créer un champ magnétique inhomogène. Cette caractéristique évite la formation d'agglomérats de particules non fixées dans la partie amont du segment tubulaire. L'application d'un champ magnétique inhomogène associé au flux produit par l'écoulement de l'échantillon dans le tube de section faible par rapport à la longueur conduit à une meilleure répartition des particules et facilite la libération des agglomérats par l'effet d'entraînement des cellules libres ou fixées, de dimensions supérieures. Ces cellules exercent une légère pression sur les agglomérats de particules magnétiques, qui sont libérés dans les zones de champ faible pour venir se refixer de façon isolées et non plus agglomérées dans la zone de champ fort suivante.
Ces buts sont atteints grâce à un procédé et une installation combinant, après la mise en contact de l'échantillon et des billes, à la fois le flux et la séparation magnétique. A cet effet, l'invention concerne tout d'abord un procédé de séparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de celles cancéreuses circulantes, du type consistant à fixer les cellules cibles sur des billes paramagnétiques et à faire agir un champ magnétique sur un échantillon contenant les cellules fixées, les cellules libres et les billes paramagnétiques excédentaires, pour isoler les billes paramagnétiques, caractérisé en ce que l'on fasse circuler l'échantillon dans un tube dont la section est très inférieure à la longueur sur laquelle s'applique le champ magnétique.
L'échantillon s'écoule de préférence à une vitesse de quelques centimètres par seconde. Les billes excédentaires, en raison de leur densité inférieure à celle des cellules marquées ou non marquées, ou les amas de billes paramagnétiques, du fait de leur forte sensibilité au champ magnétique, sont rapidement attirées contre la paroi du tube et sont immobilisées dans la partie proximale du tube.
Les cellules non fixées sont insensibles au champ magnétique et traversent le tube. Les cellules fixées sur des billes paramagnétiques sont entraînées par le flux à l'intérieur du tube, avant d'être immobilisées contre la paroi du tube, dans la partie distale du tube.
On procède ainsi à une séparation géométrique des composants de l'échantillon, qui permet une récupération des cellules cibles par différents moyens simples à mettre en oeuvre.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré, on fait circuler l'échantillon dans un tube enroulé en spiral placé dans un champ magnétique dont les lignes de flux sont sensiblement perpendiculaires au plan de la spirale.
Avantageusement, la section du tube est comprise entre 0,5 et 3 millimètres et la longueur du tube est supérieure à 10 centimètres.
De préférence, le tube est placé dans un champ magnétique non homogène. Ce champ peut être produit par un aimant permanent ou par un électroaimant . Selon une variante avantageuse, la préparation est introduite dans un réservoir raccordé au tube de séparation, ledit réservoir étant surélevé par rapport au tube pour assurer une circulation de l'échantillon par gravité.
L' invention concerne également une installation pour 1 ' immunoseparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de celles cancéreuses circulantes caractérisée en ce qu'elle est constituée par un tube dont la section est très inférieure à la longueur, ledit tube étant enroulé pour former une spirale, et par au moins un aimant disposé pour créer un champ magnétique sensiblement perpendiculaire au plan de la spirale formée par ledit tube . Selon un mode de réalisation particulier, elle comporte un tube présentant deux tronçons de section croissante, la deuxième section étant au moins 10 fois supérieure à la première section.
L' invention concerne également des applications de ce procédé pour :
• 1 ' immunofiltration du sang en circulation extracorporelle
• le diagnostic prénatal
• l'analyse biologique en laboratoire. L'invention sera mieux comprise à la lecture de ce qui suit, faisant référence aux dessins annexés relatifs à des exemples non limitatifs de réalisation, où : - la figure 1 représente une vue de face d'un dispositif selon l'invention ;
- la figure 1 ' représente une vue de face d'un dispositif selon l'invention ;
- la figure 2 représente une vue en coupe de la tubulure ; la figure 3 représente une vue d'une variante de réalisation.
- la figure 4 représente une vue en coupe transversale d'une variante de réalisation , la figure 5 représente une vue d'une deuxième variante de réalisation en oeuvre une pompe péristatique , la figures 6 représente une vue d'une autre variante de réalisation en oeuvre une pompe péristatique; la figures- 6' représente une vue d'une autre variante de réalisation en oeuvre une pompe péristatique;
- la figures 6" représente une vue d'une autre variante de réalisation en oeuvre une pompe péristatique;
- la figure 7 représente une vue en coupe d'un module de filtration pour la séparation des particules magnétiques . La figure 1 représente une vue de face d'un exemple de réalisation d'un dispositif selon l'invention. Il est composé d'un réceptacle (1) pouvant contenir environ 10 à 50 millilitres, raccordé à une tubulure (2) enroulée en spirale et se terminant par une tubulure de sortie (3) munie d'une vanne (4) . Un ensemble d'aimants permanents (5) est disposé radialement pour créer un champ magnétique non homogène. La disposition des aimants est indiquée à titre d'exemple, une disposition différente, par exemple sous forme d'aimants parallèles, étant également applicable. Les aimants (5) sont constitués par des barreaux en samarium-cobalt. Ces barreaux magnétiques peuvent éventuellement être montés sur un disque support rotatif. Cette variante permet d'entraîner à une étape du procédé les billes paramagnétiques fixées vers la sortie de la tubulure. A titre d'exemple, ils tournent alternativement de ± 20°. La vitesse maximale d'entraînement est de quelques millimètres par secondes, de façon à optimiser l'efficacité sur les particules paramagnétiques .
On peut prévoir différents modes d'entraînement des aimants :
Si le mouvement se fait continûment dans le sens de l'écoulement, on facilitera l'évacuation des cellules et des particules ;
Si le mouvement se fait continûment en sens inverse de l'écoulement, on retardera l'évacuation des cellules et des particules ;
Si le mouvement est alternatif, on réalisera un brassage des particules facilitant le rinçage et l'élimination des cellules et des particules.
La section de la tubulure (2) est d'environ 0,5 millimètres. Elle est réalisée en un matériau tel que le TEFLON (marque déposée) . La longueur est d'environ 50 centimètres.
L'utilisation du dispositif est la suivante: a) on introduit tout d'abord un liquide de rinçage de type PBS (nom commercial) dans une pipette de 20 millilitres ; b) on aspire l'échantillon de sang (7) qui a été préalablement incubé avec des particules paramagnétiques. On ajoute 9 millilitres de sérum physiologique (8) . c) on connecte le réceptacle (1) à la tubulure en spirale (2) en évitant scrupuleusement la formation de bulles ; d) on surélève le réceptacle (1) de 30 centimètres environ par rapport à la spirale e) on ouvre la vanne (6) prévue entre le réceptacle (1) et la tubulure (2) . Les liquides s'écoulent alors continûment du réceptacle (1) vers la tubulure (2) en spirale sous l'effet de la pression hydrostatique. f) on arrête l'écoulement après avoir laisser passer la moitié des 20 millilitres de liquide de rinçage. On peut, pendant cette phase, augmenter l'efficacité du rinçage en faisant tourner les aimants
(5) de façon alternative, par exemple en répétant 5 fois un cycle de déplacement de 20° dans le sens trigonométrique, puis retour à la position initiale, puis 20° dans le sens antitrigonométrique.
L'étape suivante consiste à la récupération des rosettes ou des noyaux des cellules recherchées . 1) Récupération des rosettes
On éloigne la spirale (2) de l'influence des barreaux magnétiques (5), et on reprend l'écoulement du reste de liquide de rinçage. Celui ci va entraîner toutes les particules paramagnétiques et les cellules porteuses de particules paramagnétiques. Les particules recherchées pourront ainsi être récupérées par filtrage, à l'aide d'un filtre laissant passer les particules paramagnétiques, mais pas les cellules.
2) Récupération des noyaux des cellules recherchées. Pour récupérer les noyaux des cellules, on maintiendra 1 ' influence magnétique et on fera agir un nouveau réactif qui aura la propriété de lyser les cellules fixées en libérant les noyaux durcis et colorés. A titre d'exemple, un tel réactif est constitué par le mélange suivant :
- Détergent, par exemple CETRIMIDE (Marque commerciale)
- Fixateur, par exemple formaldehyde - Colorant nucléaire, par exemple iodure de propidium.
Ce mélange est introduit dans le réceptacle (1) de telle sorte que le volume ne dépasse pas celui de la spirale (2) . La coloration facilite la visualisation de la progression du liquide. On laisse ce mélange en contact 10 minutes avec la spirale. On actionne en mouvements alternés les aimants pour faciliter la libération des noyaux. On peut alors rincer pour récupérer les noyaux purs. Les aimants (5) étant toujours présents, aucune particule magnétique ne viendra contaminer la préparation. En revanche, les cellules étant détruites, l'identification des noyaux implique l'utilisation de réactifs d'hybridation moléculaire. Ceux-ci permettent de détecter des anomalies génétiques comme la présence d'un centromère surnuméraire (trisomie 21) ou des expressions amplifiées d'oncogènes, ou encore des expressions de gênes particuliers type P53. Par ailleurs, les noyaux purs colorés de façon stoechiométriques permettent de définir un niveau de ploïde qui caractérise les stades de cellules tumorales.
La figure 1 ' présente une variante de réalisation d'un dispositif selon l'invention. Le dispositif comporte trois récipients (31 à 33) de réactifs et d'échantillons reliés à un tuyau séparateur (35) enroulé en spiral. Des robinets ou vannes automatiques ouvrent ou ferment le débit de chacun des récipients (31 à 33) vers le tuyau séparateur (35) . Ce tuyau séparateur est placé dans un gradient de champ magnétique engendré par des aimants permanents (36) disposés en étoile, en sens radial alterné. L'extrémité aval du tuyau séparateur (35) débouche d'une part dans un tuyau de recueil (37) et d'autre part dans un tuyau d'évacuation (38) . Des vannes ou robinets sont prévus sur chacun de ces tuyaux pour commander l'écoulement sous vers un récipient de rejet (39), sous vers des moyens d'analyse formés par un système de recueil sur filtre (40), par un récipient de recueil (41) ou par un détecteur de flux de particules (42) . La figure 2 représente une vue en coupe d'un segment de tubulure. Sous l'effet des forces de Bernoulli, les particules ont tendance à se concentrer dans le centre du flux, où la vitesse est la plus importante. Sous l'effet des flux magnétiques, les billes paramagnétiques (10) plus légères et moins volumineuses que les particules non marquées (11) que les cellules marquées (12) sont très rapidement attirées vers la paroi (13) de la tubulure.
La trajectoire des cellules non marquées (11) n'est pas perturbée par les flux magnétiques et celles-ci restent donc dans le centre du flux où elles sont rapidement entraînées vers la sortie.
Les cellules (12) marquées se retrouvent dans la dernière partie de la tubulure (2) . Eventuellement, la tubulure peut être réalisée par deux segments de section croissante, la première servant à retenir les billes excédentaires, et la seconde à retenir les cellules marquées. Les figures 3 et 4 représentent des vues respectivement en coupe médiane et en coupe transversale d'une variante de réalisation.
La tubulure (2) est formée par une rainure (14) réalisée dans une plaque de matière plastique (15) . Elle débouche d'une part sur l'un des bord latéraux pour permettre le raccordement à une tubulure de liaison avec le réceptacle (1) d'alimentation, et d'autre part avec un orifice transversal (16) traversant la plaque (15) permettant l'évacuation des fluides. Le dispositif est formé de deux plaques symétriques (15, 15') et sont raccordées de manière à définir entre elles la tubulure de circulation du liquide. Elles présentent sur les surfaces extérieures des logements pour les aimants (17) .
La figure 5 représente une vue d'une deuxième variante de réalisation mettant en oeuvre une pompe péristatique. Dans cette variante, la progression des liquides n'est pas conditionnée par la gravité, mais par une pompe péristatique.
Le dispositif est constitué par un élément tubulaire (22) formant une boucle séparatrice. L'une des extrémités aspire l'échantillon traité comme dans les exemples précédents. L'élément tubulaire (22) est disposé dans le champs d'aimants permanents (24 à 28) orientés perpendiculairement à la direction de déplacement du liquide, en sens alternés. L'élément tubulaire (22) est jetable, ce qui évite toute contamination de ses parois intérieures. Cet élément tubulaire (22) est raccordé au tube d'aspiration d'une pompe péristaltique (29) de type connu. Les déchets sont recueillis dans un tube d'essai (30) à la sortie de la pompe (29) . La circulation du fluide à l'intérieur du tube est de préférence continu, avec une vitesse de 1 'ordre de 1 cm par seconde. La circulation en continu évite la formation d'adhésions cellulaires sur la paroi du tube de séparation.
Les figures 6, 6 et 6" représentent une vue partielle d'une variante de réalisation. Les aimants forment une cage d'écureuil (32) constitué par une pluralité de barreaux magnétiques (33 à 40) aimantés radialement en sens alterné. Cette structure permet de positionner un ou plusieurs éléments tubulaires (22), et de traiter en parallèle plusieurs échantillons. L'utilisation d'un tel dispositif est la suivante :
- on immerge l'extrémité libre (23) du tuyau séparateur (22) dans l'échantillon qui a reçu au préalable les particules paramagnétiques. - on met en action la pompe (29) qui va faire passer les particules magnétiques et les cellules dans la boucle séparatrice disposée dans le champ magnétique. Les particules magnétiques et les rosettes constituées par les cellules marquées vont s'arrêter dans cette boucle tandis que les autres cellules vont s'évacuer. Pour procéder ainsi à une purge cellulaire, notamment dans un but thérapeutique, consistant à éliminer les cellules marquées afin de ne recueillir que les cellules non marquées, il est préférable de remplacer la pompe peristaltique par un autre moyen d'aspiration, par exemple une seringue aspirante ou une source de dépression, afin d'éviter l'écrasement des cellules non marquées .
Ce mode de réalisation présente plusieurs avantages :
- il permet de traiter en parallèle un grand nombre d'échantillons, il permet d'automatiser la gestion des étapes, il permet de traiter de très grand volumes,
- il évite les volumes morts en amont de la zone de traitement de l'élément tubulaire. En effet, après le passage de l'échantillon, on peut éliminer le tube est passer les réactifs à partir de récipients non contaminés . Le risque de récupérer des cellules non spécifiques est très réduit. Par ailleurs, on peut alors faire plonger tous les tuyaux dans le même récipient réactif, ce qui simplifie les manipulations.
La séparation des cellules marquées et des particules magnétiques non fixées après la mise en oeuvre d'un système de traitement selon l'une des variantes précédentes s'effectue avantageusement au moyen d'un dispositif de filtration dont un exemple de réalisation est décrit en figure 7.
La recherche d'événements aussi rares que les cellules foetales ou les micrométastases implique d'extrêmes qualités et efficacité de toutes les étapes du procédé. Il faut tout d'abord que les anticorps soient très efficaces pour assurer une bonne récupération des cellules visées. Il faut éviter les pertes cellulaires lors des manipulations de rinçage et de recueil . Il faut aussi réduire au maximum les faux positifs résultant de cellules non spécifiques, mais aussi de cristaux de colorants et de résidus variés qui en fluorescences peuvent se confondre avec des cellules .
L'analyse d'image est capable de résoudre certaines discriminations. Toutefois, dans le cas d'éléments rares de l'ordre de 1 à 50 cellules par échantillon, le nombre total d'artefact doit rester inférieur à ces valeurs, ce qui nécessitent des performances élevées de la chaîne de séparation des cellules marquées et des cellules non marquées, et une grande qualité de la récupération des cellules . Les procédures habituelles de recueil sur lame et de coloration génèrent un "bruit" qui n'est pas compatible avec de telles exigences .
Le dispositif de filtration selon l'invention permet par contre de répondre à ces exigences. Il est constitué par une pièce (41) en silicone moulé, à usage unique. Cette pièce (41) présente une épaisseur de l'ordre de 2 millimètres et présente douze protubérances (51) d'un diamètre de 6 millimètres et d'une hauteur de 10 millimètres. Ces protubérances (51), normalement obturées, peuvent être perforées par une aiguille creuse (48) prévue à l'extrémité du tube séparateur (42) .
La pièce en silicone (41) est positionnées dans une plaque perforée (43) rigide. Les perforations sont disposées de manière complémentaire aux protubérances (51) de la pièce (41) . Cette plaque (43) peut être raccordée de manière étanche à un support (45) et maintenu en position par des griffes (44) . Un joint torique vient compléter l'étanchéité de cet assemblage. Le support (45) présente également des perforations disposées en regard des perforations de la plaque (43) . Le support est raccordé à une source de dépression. Une membrane de filtration microporeuse (47) est disposée entre la plaque (43) et le support (45) . Il s'agit avantageusement d'une membrane microporeuse en polycarbonate dont les alvéoles présentent une section de 2 microns .
Le fonctionnement de ce module de filtration est le suivant :
La pièce (41) est livrée avec un film protecteur placé sous la face inférieure. On peut ouvrir une ou plusieurs protubérances. On place la plaque (41) sur le support (43) après avoir positionnée la membrane microporeuse, et on verrouille l'ensemble à l'aide des griffes (44) .
Le tube de séparation (2) est livré avec un capuchon protecteur qui évite toute contamination. On retire ce capuchon et on perfore l'une des protubérances de la pièce (41) .
Lors du recueil des rosettes issues du séparateur, les particules paramagnétiques isolées traversent la membrane tandis que les rosettes restent en surface. La porosité de la membrane microporeuse laisse passer les particules paramagnétiques dont la section est de l'ordre du micron, mais pas les rosettes, dont la section est de l'ordre de 5 microns.
Pour le recueil des noyaux, en l'absence de billes, la porosité peut être de 1 à 2 microns.
La coloration peut se faire avant la filtration par des colorants fluorescents de type IP ou BET (nom commerciaux) ou encore par coloration sur le filtre après que ce dernier ait été extrait du système de contention.
L'association d'un dispositif séparateur formé par un tube de section très inférieure à la longueur placé dans un gradient de champ magnétique, et d'un système de filtration tel que décrit ci-dessus, présente de nombreux avantages . Une telle association facilite tout d'abord l'automatisation de l'analyse biologique. Elle permet également de procéder à des analyses et à des utilisations à fins thérapeutiques nécessitant un haut degré de stérilité. Les billes paramagnétiques permettent un tri des cellules, et notamment une séparation des cellules recherchées et des autres cellules. Le filtre permet d'éliminer certaines cellules excédentaires, telles que des plaquettes, ainsi que les billes paramagnétiques excédentaires . Le filtre a également pour fonction la concentration des cellules rares recherchées sur une surface réduite facilitant l'analyse par imagerie. Ce filtre permet également, pour des applications thérapeutiques notamment, de procéder à une culture des cellules recherchées. A cet effet, le filtre sert de support de cellules et peut être alimenté avec un liquide nutritif propre à favoriser la multiplication cellulaire.
L' invention sera mieux comprise dans ce qui précède à titre d'exemple non limitatif.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé d' immunoseparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de cellules cancéreuses circulantes, du type consistant à fixer les cellules cibles sur des billes paramagnétiques et à faire agir un champ magnétique sur un échantillon contenant les cellules fixées, les cellules libres et les billes paramagnétiques excédentaires, pour isoler les billes paramagnétiques, caractérisé en ce que l'on fait circuler l'échantillon dans un tube (2) dont la section est très inférieure à la longueur sur laquelle s'applique le champ magnétique inhomogène. 2 Procédé d' immunoseparation magnétique selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on fait circuler l'échantillon dans un tube (2) enroulé en spirale placé dans un gradient de champ magnétique.
3 - Procédé d' immunoseparation magnétique selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la section du tube est comprise entre 0,5 et 3 millimètres.
4 - Procédé d'immunoseparation magnétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la longueur du tube est supérieure à 10 centimètres.
5 - Procédé d'immunoseparation magnétique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la préparation est introduite dans un réservoir raccordé au tube de séparation, ledit réservoir étant surélevé par rapport au tube pour assurer une circulation de l'échantillon par gravité.
6 - Procédé d'immunoseparation magnétique selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'on introduise sans mélange et sans couche interface dans le réservoir un premier volume de l'échantillon et un second volume d'un liquide de rinçage.
7 - Procédé d' immunoseparation magnétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la préparation est aspirée dans le tube placé dans le gradient de champs magnétique, l'extrémité aval dudit tube étant reliée à une pompe peristaltique.
8 - Procédé d' immunoseparation magnétique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les aimants sont mobiles par rapport au tube, de préférence selon un mouvement alternatif.
9 - Procédé d' immunoseparation magnétique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les réactifs et les échantillons s'écoulent de façon continue dans le tube de séparation magnétique, à une vitesse comprise entre 0,1 cm/s et 10 cm/s . 10 - Procédé d' immunoseparation magnétique selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'on procède à une étape ultérieure de filtration à l'aide d'un filtre à membrane microporeuse dont la porosité est supérieure au diamètre des billes paramagnétiques et inférieure au diamètre des cellules fixées .
11 - Procédé d' immunoseparation magnétique selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'on procède à une étape ultérieure de filtration à l'aide d'un filtre à membrane microporeuse dont la porosité est supérieure au diamètre des billes paramagnétiques et de certaines des cellules excédentaires, et inférieure au diamètre des cellules fixées . 12 - Dispositif de filtration pour la mise en oeuvre du procédé d' immunoseparation magnétique selon la revendication 10 ou 11 caractérisé en ce qu'il est constitué par un filtre à membrane microporeuse dont la porosité est supérieure au diamètre des billes paramagnétiques et de certaines des cellules excédentaires, et inférieure au diamètre des cellules fixées.
13 - Installation pour 1 ' immuno-séparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de celles cancéreuses circulantes caractérisée en ce qu'elle est constituée par un tube dont la section est très inférieure à la longueur et par au moins un aimant disposé pour créer un champ magnétique dans l'espace traversé par ledit tube.
14 - Installation pour 1 ' immuno-séparation magnétique de cellules selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comporte en outre un réservoir disposé en amont du tube.
15 - Installation pour 1 ' immuno-séparation magnétique de cellules selon la revendication 13 ou 14 caractérisée en ce qu'elle comporte un tube présentant deux tronçons de section croissante, la deuxième section étant au moins 10 fois supérieure à la première section.
16 - Installation pour 1 ' immuno-séparation magnétique de cellules selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comporte deux plaques symétriques (15, 15') présentant une rainure formant une spirale, lesdites plaques supportant des aimants.
17 - Installation pour 1 ' immuno-séparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de cellules cancéreuses circulantes caractérisée en ce qu'elle est constituée par un tube dont la section est très inférieure à la longueur, ledit tube présentant une première extrémité pour l'aspiration de l'échantillon et une seconde extrémité reliée à une pompe peristaltique, le tube étant placé dans un gradient de champs magnétiques .
18 - Installation pour 1 ' immuno-séparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de celles cancéreuses circulantes selon la revendication 17 caractérisée en ce que les champs magnétiques alternés sont produits par des aimants permanents disposés en cage d'écureuil.
19 - Dispositif de filtration pour la mise en oeuvre du procédé de séparation selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il est constitué par un support relié de manière étanche à une source de dépression, et par un couvercle complémentaire présentant des moyens pour le raccordement de l'extrémité aval du tube de séparation cellulaire, la membrane de filtration interchangeable étant disposée entre le support et le couvercle .
20 - Dispositif de filtration selon la revendication 19 caractérisé en ce que le couvercle est constitué par une plaque perforée et par une pièce moulée présentant des zones perforables par l'extrémité d'un ou de plusieurs tubes de séparation cellulaire.
21 - Procédé de séparation de cellules foetales présentes dans le sang maternel caractérisé en ce que l'on fixe les cellules cibles sur des microbilles paramagnétiques à l'aide d'un ligand capable de se lier spécifiquement à une substance complémentaire libre ou présente à la surface de cellules et en ce que l'on fait circuler l'échantillon à travers une tubulure présentant une longueur très supérieure à la section, ladite tubulure traversant un champ magnétique non homogène. 22 - Procédé de détection précoce des cellules cancéreuses circulantes ou micro métastase caractérisé en ce que l'on fixe les cellules cibles sur des microbilles paramagnétiques à l'aide d'un ligand capable de se lier spécifiquement à une substance complémentaire libre ou présente à la surface de cellules et en ce que l'on fait circuler l'échantillon à travers une tubulure présentant une longueur très supérieure à la section, ladite tubulure traversant un champ magnétique non homogène.
23 - Procédé de préparation de cellules, notamment de souches de la moelle osseuse permettant de re-ensemencer des moelles détruites à la suite de traitement anticancéreux par chimiothérapie ou radiothérapie caractérisé en ce que l'on fixe les cellules cibles sur des microbilles paramagnétiques à l'aide d'un ligand capable de se lier spécifiquement à une substance complémentaire libre ou présente à la surface de cellules et en ce que l'on fait circuler 1 'échantillon à travers une tubulure présentant une longueur très supérieure à la section, ladite tubulure traversant un champ magnétique non homogène.
24 - Procédé de préparation de cellules, notamment de souches de la moelle osseuse permettant de re-ensemencer des moelles détruites à la suite de traitement anticancéreux par chimiothérapie ou radiothérapie selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'on procède à une filtration des cellules ressortant de la tubulure placée dans le champ magnétique, à l'aide d'un filtre à membrane présentant une porosité supérieure à la section des billes paramagnétiques, et inférieure aux cellules recherchées fixées .
PCT/FR1997/000794 1996-05-07 1997-05-05 Procede et installations de separation de particules magnetiques dans un fluide pour l'analyse biologique, et application dudit procede WO1997042503A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97923133A EP0855030A1 (fr) 1996-05-07 1997-05-05 Procede et installations de separation de particules magnetiques dans un fluide pour l'analyse biologique, et application dudit procede
JP9539592A JP2000500871A (ja) 1996-05-07 1997-05-05 生物学的分析用流体内の磁気粒子の分離方法及び設備ならびにその方法の応用
US08/952,493 US6143577A (en) 1996-05-07 1997-05-05 Process and installations for separation of magnetic particles in a fluid for biological analysis, and application of said process

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9605727A FR2748569B1 (fr) 1996-05-07 1996-05-07 Procede et installation de separation de particules magnetiques dans un fluide pour l'analyse biologique, et application dudit procede
FR96/05727 1996-05-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997042503A1 true WO1997042503A1 (fr) 1997-11-13

Family

ID=9491932

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1997/000794 WO1997042503A1 (fr) 1996-05-07 1997-05-05 Procede et installations de separation de particules magnetiques dans un fluide pour l'analyse biologique, et application dudit procede

Country Status (5)

Country Link
US (1) US6143577A (fr)
EP (1) EP0855030A1 (fr)
JP (1) JP2000500871A (fr)
FR (1) FR2748569B1 (fr)
WO (1) WO1997042503A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7651838B2 (en) 2001-04-30 2010-01-26 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Prenatal diagnosis method on isolated foetal cell of maternal blood

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3551293B2 (ja) 1998-02-02 2004-08-04 東洋紡績株式会社 核酸抽出装置
NZ515852A (en) * 1999-05-04 2002-12-20 Dan A Pankowsky Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells
US20030095897A1 (en) * 2001-08-31 2003-05-22 Grate Jay W. Flow-controlled magnetic particle manipulation
WO2005014796A2 (fr) 2003-08-08 2005-02-17 Invitrogen Corporation Methodes et compositions pour clonage direct de molecules d'acides nucleiques
FI20040159A0 (fi) * 2003-10-20 2004-02-02 Bio Mobile Oy Magneettinen siirtomenetelmä, mikropartikkelien siirtolaite, ja reaktioyksikkö
US7042322B2 (en) * 2004-04-02 2006-05-09 Chien-Hsing Li High-performance liquid magnetizer
US7781228B2 (en) * 2005-04-07 2010-08-24 Menon & Associates, Inc. Magnetic resonance system and method to detect and confirm analytes
FI20051248L (fi) 2005-12-02 2007-06-03 Bio Nobile Oy Biologisten komponenttien rikastusyksikkö ja rikastusmenetelmä
EP1954396B1 (fr) 2005-12-02 2018-06-06 Life Technologies AS Separateur magnetique et procede
US7985340B2 (en) * 2005-12-02 2011-07-26 Invitrogen Dynal As Magnetic separator
US20070166730A1 (en) 2006-01-19 2007-07-19 Menon & Associates, Inc. Magnetic resonance system and method to detect and confirm analytes
RU2010127266A (ru) * 2007-12-05 2012-01-10 Зиомикс, Инк. (Us) Набор для анализа клеток и способ
US20090321337A1 (en) * 2008-06-25 2009-12-31 Robert Kersten Water vitalizing system, apparatus, and method therefor
JP2012524885A (ja) * 2009-04-22 2012-10-18 クリニカル・ジェノミックス・プロプライエタリー・リミテッド 生物学的試料から標的バイオエンティティを分離する方法及び装置
CA2787135C (fr) 2010-01-21 2018-11-20 Biocep Ltd. Separation magnetique de cellules rares
DE102011088741B4 (de) 2011-12-15 2013-07-25 Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik e.V. Verfahren und Anordnung zum Markieren und Separieren von Zellen aus einer Zellsuspension
EP2955521A1 (fr) * 2014-06-11 2015-12-16 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) Procédés pour séparer des cellules
CN105624035A (zh) * 2016-02-04 2016-06-01 关节动力安达（天津）生物科技有限公司 基于螺旋状毛细管的细胞磁分选装置及细胞磁分选装置方法
US10251990B2 (en) 2016-04-29 2019-04-09 Fenwal, Inc. System and method for processing, incubating, and/or selecting biological cells
EP3238760B1 (fr) 2016-04-29 2019-10-02 Fenwal, Inc. Système et procédé de sélection et de culture de cellules
EP3338823B1 (fr) 2016-12-21 2021-06-16 Fenwal, Inc. Système et procédé pour séparer des cellules incorporant une séparation magnétique
JP2019049455A (ja) * 2017-09-08 2019-03-28 東芝テック株式会社 試料調製装置及び試料調製方法
JP2019158766A (ja) * 2018-03-15 2019-09-19 東芝テック株式会社 濾材及び試料調製装置

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0206077A2 (fr) * 1985-06-22 1986-12-30 Bayer Ag Appareil de séparation pour particules magnétiques en phase liquide
EP0339980A1 (fr) * 1988-04-26 1989-11-02 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Microparticules, méthode et appareil pour assembler des spécimens utiles pour étiqueter des réactions immunologiques et méthode et dispositif pour préparer des spécimens
WO1994019690A1 (fr) * 1993-02-17 1994-09-01 Cardiovascular Diagnostics, Inc. Dosage immunologique et dosage par affinite en cascade par voie seche
EP0687501A2 (fr) * 1994-06-15 1995-12-20 Precision System Science Co., Ltd. Méthode de séparation de matière magnétique, utilisant une pipette, et appareils d'analyses cliniques utilisant cette méthode

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4239494A (en) * 1977-10-25 1980-12-16 Technicon Instruments Corporation Phase separator for continuous-flow analytical systems
DE3070333D1 (en) * 1979-11-13 1985-04-25 Technicon Instr Test-tube assembly, kit for making it and method of manual immunoassay
US5076950A (en) * 1985-12-20 1991-12-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Magnetic composition for particle separation
DE3764390D1 (de) * 1986-04-21 1990-09-27 Siemens Ag Verfahren zur kontinuierlichen separation magnetisierbarer partikel und einrichtung zu seiner durchfuehrung.
FR2654836B1 (fr) * 1989-11-17 1994-01-28 Biotrol Sa Laboratoires Appareil d'execution automatique d'un immunodosage en plusieurs etapes successives d'au moins une substance biologique dans une pluralite d'echantillons biologiques, procede et reactif mettant en óoeuvre ledit appareil.
US5541072A (en) * 1994-04-18 1996-07-30 Immunivest Corporation Method for magnetic separation featuring magnetic particles in a multi-phase system
US5186827A (en) * 1991-03-25 1993-02-16 Immunicon Corporation Apparatus for magnetic separation featuring external magnetic means
US5466574A (en) * 1991-03-25 1995-11-14 Immunivest Corporation Apparatus and methods for magnetic separation featuring external magnetic means
ATE190727T1 (de) * 1994-05-11 2000-04-15 Genera Tech Ltd Verfahren zum einfangen von einem ligand aus einer flüssigkeit und vorrichtung zur dessen ausführung
US5837144A (en) * 1994-06-16 1998-11-17 Boehringer Mannheim Gmbh Method of magnetically separating liquid components

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0206077A2 (fr) * 1985-06-22 1986-12-30 Bayer Ag Appareil de séparation pour particules magnétiques en phase liquide
EP0339980A1 (fr) * 1988-04-26 1989-11-02 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Microparticules, méthode et appareil pour assembler des spécimens utiles pour étiqueter des réactions immunologiques et méthode et dispositif pour préparer des spécimens
WO1994019690A1 (fr) * 1993-02-17 1994-09-01 Cardiovascular Diagnostics, Inc. Dosage immunologique et dosage par affinite en cascade par voie seche
EP0687501A2 (fr) * 1994-06-15 1995-12-20 Precision System Science Co., Ltd. Méthode de séparation de matière magnétique, utilisant une pipette, et appareils d'analyses cliniques utilisant cette méthode

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7651838B2 (en) 2001-04-30 2010-01-26 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Prenatal diagnosis method on isolated foetal cell of maternal blood

Also Published As

Publication number Publication date
JP2000500871A (ja) 2000-01-25
FR2748569A1 (fr) 1997-11-14
US6143577A (en) 2000-11-07
FR2748569B1 (fr) 1998-08-07
EP0855030A1 (fr) 1998-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1997042503A1 (fr) Procede et installations de separation de particules magnetiques dans un fluide pour l'analyse biologique, et application dudit procede
EP1866091B1 (fr) Procede et dispositif pour separer par filtration verticale des particules biologiques contenues dans un liquide
US11883821B2 (en) Fluidic device for the detection, capture, or removal of a disease material
US20150079677A1 (en) Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples
TWI373617B (en) Compact disk based system for separating immunomagnetic bead labeled particulates and method thereof
WO2016062975A1 (fr) Methode et dispositifs de traitement d'echantillons biologiques
JP2004503745A (ja) 生物試料の調製と分析のための装置及び方法
FR2826882A1 (fr) Procede de traitement de particules magnetiques et configurations d'aimants permettant la mise en oeuvre de ce procede
JP2011163830A (ja) サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた循環腫瘍細胞の検出
EP2178646A1 (fr) Système pour piégeage et triage magnétique pour des espèces cibles
FR2917095A1 (fr) Dispositif de lyse de microorganismes presents dans un echantillon environnemental ou clinique et d'extraction des acides nucleiques desdits microorganismes aux fins d'analyse.
EP1343586A1 (fr) Procedes et dispositifs de transport et de concentration d'un analyte present dans un echantillon
EP3210022B1 (fr) Procédé de détection d'organismes dans un échantillon dilué
US11180750B2 (en) Sample preparation device and methods of use
EP3218111A1 (fr) Procédé et dispositif de tri sélectif, spécifique et simultané de cellules rares cibles dans un échantillon biologique
EP2872867B1 (fr) Systeme automatise de lyse de microorganismes presents dans un echantillon, d'extraction et de purification des acides nucleiques desdites microorganismes aux fins d'analyse
EP3209792B1 (fr) Méthode de traitement d'échantillons biologiques, notamment d'échantillons alimentaires
JP6059718B2 (ja) 生物試料成分の処理
EP0248690A1 (fr) Procédé et dispositif pour la détection de génomes viraux à ADN et ARN dans les milieux biologiques, notamment dans le sérum sanguin
WO2023200777A1 (fr) Dispositif et procédé d'isolement et de détection de cibles dans un échantillon
EP3523624A1 (fr) Procédé et dispositif de préparation d'échantillons
WO2010084273A1 (fr) Dispositif microfluidique, systeme et procede de mise en oeuvre
FR2848224A1 (fr) Procede de detection de microorganismes a l'aide d'un dispositif de filtration par flux tangentiel
FR2674632A1 (fr) Procede et dispositif de detection rapide de micro-organismes indesirables dans un produit du domaine agro-alimentaire ou medico-veterinaire.

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1997923133

Country of ref document: EP

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 1997 539592

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08952493

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1997923133

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1997923133

Country of ref document: EP