WO2013157666A1 - Ｄｎａ解析マイクロ流路チップ - Google Patents

Abstract

　検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析するために用いられるＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、シリコン（第１層）とプラスチック（第２層）が積層されたＤＮＡ解析マイクロ流路チップにおいて、前記第２層は、前記第１層の一部分の領域上に積層され、前記第２層は、試薬、送液機構およびセンサを具備し、前記第１層は、第２層が積層されていない部分の第１層の領域上にＰＣＲリアクタを具備する構造を用いる。

Description

ＤＮＡ解析マイクロ流路チップ

　本開示は、シリコンならびにプラスチックの積層基板上に形成されたマイクロ流路チップに関する。更に詳細には、本開示は、迅速・簡便に遺伝子を含む検体から所望のＤＮＡを抽出、増幅、またはその配列を検出するための機能を集積したマイクロ流路チップに関する。

　近年、ＤＮＡ解析技術の向上により、遺伝子の多様性解析や発現解析の進展が目覚しい。特に医療分野では、遺伝子と疾患の関係が注目されている。例えば、疾患に関連した個々の遺伝子情報（特定のＤＮＡ配列）を解析することで、患者個人毎に適切な治療や投薬を行うこと（テーラーメイド医療）が可能になってきた。テーラーメイド医療では、その場診断が最も望ましく、ＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　Ｃａｒｅ　Ｔｅｓｔｉｎｇ）性が高く、迅速、簡便な手法が求められる。そのため、血液など、採取した検体から解析対象の遺伝子のＤＮＡを抽出、増幅し、その配列の検出を迅速・簡便に行えるデバイスの実現が強く求められている。

　これらの要求に応える手段の１つとして、近年、マイクロ・トータル・アナリシス・システムズ（μＴＡＳ）（またはラブ・オン・チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ）と呼ばれる）が注目されている。μＴＡＳやＬａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐは、基板内にマイクロメートルオーダーの微細構造で構成されたマイクロ流路やポートを設け、その構造内で物質の混合、抽出、精製、化学反応及び／または分析など各種の操作を行うことができ、一部は実用化されている。各種の操作が微細構造内で行われるため、常用サイズの同種の装置に比べて、（１）サンプルおよび試薬の使用量が著しく少ない、（２）分析時間が短い、（３）感度が高い、（４）現場に携帯し、その場で分析できる、及び（５）使い捨てできるなどの特徴を有する。このような目的のために作製された、基板内にマイクロ流路およびポート等の微細構造を有する構造物は総称してマイクロ流路チップ又はマイクロ流体デバイスと呼ばれる。

　マイクロ流路チップを用いて短時間で検体中の遺伝子内のＤＮＡを解析するためには、チップ内に抽出・増幅の機能を組み込む必要があり、血球などの不純物を分離する微細なフィルタや高速で昇降温温度可能なＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）の実現が要求される。加えて、使用の簡便性が要求されるため、検体や試薬などをチップ内に安定して保持できることが望ましい。さらに、テーラーメイド医療用途では、血液から処理が可能である構成であることや、検出部でＤＮＡ中の一塩基多系（ＳＮＰ）をセンシングできることが望ましい。すなわち、使用状況に柔軟に対応できる汎用性の高いチップの実現が求められている。

米国特許第７８０７３６０号明細書

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　４３ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ（ＩＭＡＰＳ２０１０）００００３６

　しかしながら、マイクロ流路チップを構成する基板材料の性質の制約から、前述した要求に全て答えるマイクロ流路デバイスの実現は難しかった。その理由を以下に説明する。
マイクロ流路チップの基板材料は、プラスチックやシリコンが用いられる。プラスチック基板は、材料代が比較的安価、切削加工しやすい、生体・バイオ材料と比較的親和性が高くて試薬の保持がしやすいなどの特徴を持つ反面、サブマイクロメートルオーダーの微細構造の加工が難しいことや材料の熱伝導性が優れないため、血球などの不純物を分離するための微細なフィルタ構造や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）のように高速の昇降温が要求されるＰＣＲリアクタの形成に向かないことが課題であった。また、シリコン基板は、半導体リソグラフィ技術により微細構造を容易に形成でき、熱伝導率はプラスチックの２~３桁高いことから、微細なフィルタ構造やＰＣＲリアクタの形成に向く反面、材料単価がプラスチックと比較すると高価なことや、シリコンの表面と生体・バイオ材料との親和性が必ずしも高くないため、タンパク質やＤＮＡの非特異吸着が起り、試薬の保存に向かないことが課題であった。このように、プラスチックとシリコンはそれぞれ相反する利点と欠点が存在し、各々の基板のみを用いた構成ではＤＮＡ解析用途のマイクロ流路チップに要求される条件を十分に満たすことができなかった。

　上記課題を解決する手段として、シリコン部にＰＣＲリアクタを配置し、プラスチック部に試薬を格納し、それらのシリコン層（第１層）とプラスチック層（第２層）とを積層したマイクロ流路チップが提案されている（非特許文献１）。

　非特許文献１では、第１層と第２層を積層したマイクロ流路チップであって、第１層にＰＣＲリアクタとセンサを具備し、第２層に試薬を具備し、それを第１層に供給しながら動作させる構造が開示されている。熱伝導性に優れるシリコンからなる第１層にＰＣＲリアクタを形成し、第２層に試薬を保持するため、高速な昇降温と同時に簡便な処理に対応できる。しかしながら、開示された方法によると、第１層に、ＰＣＲリアクタとセンサが一体形成されており、ＰＣＲリアクタとセンサ間の距離が狭い。そのため、センサ部へ熱が伝達しやすく、センサの機能を低下させること（−特にセンサ部に試薬を保持している場合に−）が問題であった。さらに、ヒートシンク等の排熱部の配置するときに制約が生じることが問題であった。すなわち、サイズの大きなヒートシンクが配置するスペースがないため、ＰＣＲリアクタを冷却動作させているときの放熱が不十分になり、ＰＣＲの昇降温速度の低下をもたらすことが問題であった。

　その上、開示されている方法によると、搭載されているＰＣＲリアクタは１基のみであり、検体は精製されたゲノムしか使えず、血液からの処理ができない構成になっている。血液から解析対象となるゲノム抽出することを目的としたＰＣＲと、その解析対象中のＳＮＰの有無によって選択的にＤＮＡを増幅することを目的したＰＣＲなど、ＰＣＲが２段階必要な用途には対応できない。ＰＣＲリアクタが２つ以上になるとヒートシンクの容量（すなわちサイズ）が理論上２倍必要なので、開示されている構造では、ヒートシンクを配置するスペースに限界があった。

　すなわち、従来構造では、目的とする用途に対して、ＰＣＲリアクタとセンサと試薬を保持する場所との配置関係が最適でないため、サーマルリアクタにおいて十分速い昇降温ができないことが、大きな課題であった。

　本開示は、上記課題を解決するためになされたものであり、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップにおいて、ＰＣＲリアクタとセンサと試薬を保持する場所の配置を最適化することで、十分な大きさのヒートシンクが配置できる場所を確保し、放熱性を高めることで、ＰＣＲの昇降温速度を十分に向上させ、ＤＮＡの抽出、増幅、またはその配列の検出を迅速・簡便に行うことを実現することを目的とする。

　上記目的を達成する本開示に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析するために用いられるＤＮＡ解析マイクロ流路チップであって、以下を具備する：
　シリコンからなる第１層、および
　プラスチックからなる第２層、ここで、
　前記第２層は、前記第１層の一部分の領域上に積層され、
　前記第２層は、試薬、送液機構およびセンサを具備し、
　前記第１層は、第２層が積層されていない部分の第１層の領域上にＰＣＲリアクタを具備する。

　こうすることによって、熱伝導性がシリコン（第１層）に比べて小さいプラスチック部（第２層）に試薬とセンサが格納されることから、ＰＣＲリアクタ動作時に、センサや試薬への熱伝導しやすい問題が解決される。すなわち、センサの機能を劣化させることなく動作させることができる。

　本開示によれば、ＰＣＲの放熱性を高めることで、その昇降温速度を十分に向上させ、ＤＮＡの抽出、増幅、またはその配列の検出を迅速・簡便に行えるＤＮＡ解析マイクロ流路チップを提供することができる。

［図１］本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの概念図。
［図２］本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの構成要素を示す断面模式図。
［図３］本開示のシリコンチップおよびプラスチック部に含まれる構成要素のレイアウト図。
［図４］本開示の方法を用いて得られたマイクロ流路チップ。
［図５］本開示のマイクロ流路チップと熱制御系との接続を示す模式図。
　（ａ）展開図　　　　（ｂ）完成図
［図６］本開示の実施例１で得られたＰＣＲリアクタにおける熱流に対する加熱時間の関係を示すグラフ。
［図７］本開示の実施例２で得られた遺伝子型解析の結果を示す。

　本開示の第１態様に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析するために用いられるＤＮＡ解析マイクロ流路チップであって、以下を具備する：
　シリコンからなる第１層、および
　プラスチックからなる第２層、ここで、
　前記第２層は、前記第１層の一部分の領域上に積層され、
　前記第２層は、試薬、送液機構およびセンサを具備し、
　前記第１層は、第２層が積層されていない部分の第１層の領域上にＰＣＲリアクタを具備する。

　本開示の第２態様に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、上記第１態様において、前記ＰＣＲリアクタは、前記第１層の中心部よりも端部の近くに配置されていてもよい。

　こうすることによって、ＰＣＲリアクタは、チップ外周部に配置され、かつセンサ部と距離が離れることから、十分な冷却能をもつサイズの大きなヒートシンクを配置することができる。すなわち、ＰＣＲリアクタを冷却動作させているときの放熱を十分にでき、ＰＣＲの昇降温速度の向上させることができるようになる。

　本開示の第３態様に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップは、上記第２態様において、２以上の前記ＰＣＲリアクタが第１層に設けられ、
　前記２以上のＰＣＲリアクタは、互いに連通していてもよい。

　こうすることによって、ＰＣＲが２段階必要な用途、すなわち血液からのＰＣＲ、ＳＮＰ解析等の用途に使用できるようになり、かつその場合も十分な冷却能を持つサイズの大きなヒートシンクを配置することができる。すなわち、２つ以上のＰＣＲリアクタを有する系においても、ＰＣＲリアクタを冷却動作させているときの放熱を十分にでき、ＰＣＲの昇降温速度の向上させることができるようになる。

　（実施の形態１）
　以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
　図１は、本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの概念図である。チップＡ：１０１は、シリコンであり（以降、第１層と記載）、共通プラットフォームとして機能させる部分として、ＰＣＲリアクタ（１）１０３とＰＣＲリアクタ（２）１０４の他にミキサー１０５およびマイクロシーブ１０６を図のように接続する。なお、ＰＣＲリアクタ（１）１０３、（２）１０４は、第１層の中心部よりも端部に近い側に配置される。

　チップＢ：１０２は、プラスチックであり（以降、第２層と記載）、ＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル樹脂）やＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキ酸）を用いることが好ましい。また、第１層との接続部は、接着剤やエラストマーを用いるのが好ましく、第１層のＰＣＲリアクタ（１）１０３、（２）１０４と重ならないように接続される。試薬は、それぞれのＰＣＲリアクタ反応に用いるプライマーやポリメラーゼなどの試薬（１）、（２）の他に、センサに用いる試薬（３）を配置する。検体は、孔１０７、試薬（１）、試薬（２）は、それぞれ孔１０８、孔１０９から注入する。試薬は、フリーズドライ化させておき、使用するときにバッファ液を注ぎ込んで溶かして使ってもよい。第２層の送液機構には、ポンプ１１０およびバルブ１１１を配置し、試薬を第１層側へ注ぎ、ＰＣＲリアクタへの投入量、タイミングを制御する。

　図２は、本開示のＤＮＡ解析マイクロ流路チップの構成要素を示す断面模式図である。（ａ）は、試薬、ポンプを含む断面図である。ポンプ２１０は、第２層に埋め込まれ、脱着が容易にできるようになっている。ポンプ２１０の駆動部のアクチュエータ２１２は、ピエゾ素子やポリマーアクチュエータを用いるとよく、メンブレン２１３を駆動できるように配置する。また、チップが使い捨てで使われることを想定すると、安価なポリマーアクチュエータを用いることが特に好ましい。また、第１層中にはマイクロ流路が具備され、それは、下面からフォトリソグラフィとＲＩＥ（リアクティブイオンガスエッチング）によってパターニングされる。また、パターニングされた流路を密閉させるために、パイレックスガラス２１４を蓋として用いる。パイレックスガラス２１４は、陽極酸化法で第１層の下面に対して接合されている。また、第２層に具備された部品と第１層のマイクロ流路を接続するために、第２層を接合する前に上面から貫通穴を形成している。さらに、前述したとおり、第２層は、ＰＣＲリアクタ２０３が配置されている領域と重ならないように接続される。

　図３は、本開示の実施の形態に用いた第１層および第２層に含まれる構成要素のレイアウト図を示す。第１層の厚さは、５００~８００μｍ程度が好ましい。２枚のマスクを用いて上面および下面からそれぞれのパーツがエッチングされる。ＰＣＲリアクタ１の３０３、ＰＣＲリアクタ２の３０４の周りは、概ねＲＩＥにより上面および下面の両面からエッチングされ、完全に掘り抜かれ、熱的に孤立している。一方で、流路およびミキサー３０５、マイクロシーブ３０６は、ＲＩＥによって下面より約３００μｍの深さをエッチングして形成され、パイレックスガラスを陽極酸化接合し表面がふさがれている。孔３０７，３０８，３０９と第２層との接続部の貫通穴は、ＲＩＥによって上面より約３００μｍの深さをエッチングして形成されている。

　一方で、第２層に含まれる構成要素については、符号３１０の箇所にポリマーアクチュエータのポンプ、符号３１１の箇所にはポリマーアクチュエータのバルブが取りつけられる。また、符号３１５にはセンサが取りつけられる。

　図４は、実施の形態によって実際に作製されたＤＮＡ解析マイクロ流路チップの第２層とそれに接合された第１層の写真である。

　図５は、本開示で得られたＤＮＡ解析マイクロ流路チップとヒートシンク５２１との接続について示した模式図である。前記第１層の中心部より端部に近い側に集まるように前記ＰＣＲリアクタを配置し、かつ前記ＰＣＲリアクタを含む第１層のシリコン面（上面）が第２層に覆われず露出させることで、２つのＰＣＲに対して、効率がよくサイズが大きいヒートシンク５２１を取り付けることができた。

　その結果、投入した熱量に対して、加熱（または冷却）にかかる時間について、図６のような関係を得ることができた。図６は、実線が今回得られた曲線で、点線はヒートシンクがない場合の曲線である。図６に示されるように、加熱時間が１ケタ以上向上することを確認した。

　本開示の一実施の形態に係るＤＮＡ解析マイクロ流路チップを用いて、ヒトゲノム検体からＤＮＡ増幅を行った。ＤＮＡ増幅のモデルとして、テンプレートとしてヒトゲノムを用いた。ヒトゲノムの第六エクソンから、ＤＮＡ断片を増幅するプライマーとして、Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｐｒｉｍｅｒ１（５’−ＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣＧ−３’　：配列番号１）およびＰｒｉｍｅｒ３（５’−ＴＴＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＡＣ−３’　：配列番号２）を用いた。

　試薬１には、（Ａ）を用い、ミキサーで検体と撹拌した後に、ＰＣＲ１リアクタでの反応を９８℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃３０秒の条件で３５サイクル（４５分）ＰＣＲを行った。その後、マイクロシーブで不純物を除去した。この試料液のうち３μＬ採取し、電気泳動により、ＤＮＡ増幅の有無を確かめた。図７の第２レーンがサンプルから採取したＤＮＡフラグメントの増幅有無の結果である。図７のレーン６に示すように、わずか４５分で所望のＤＮＡ断片が増幅したことが確認された。

　本開示によれば、ＰＣＲの放熱性を高めることで、その昇降温速度を十分に向上させ、ＤＮＡの抽出、増幅、またはその配列の検出を迅速・簡便に行えるＤＮＡ解析マイクロ流路チップを提供することができる。

　１０１　シリコン基板
　１０２　プラスチック基板
　１０３　ＰＣＲリアクタ１
　１０４　ＰＣＲリアクタ２
　１０５　ミキサー
　１０６　マイクロシーブ
　１０７　孔（検体）
　１０８　孔（試薬１）
　１０９　孔（試薬２）
　１１０、２１０　ポンプ
　１１１　バルブ
　２１２　アクチュエータ
　２１３　メンブレン
　２１４　パイレックスガラス
　５２１　ヒートシンク

Claims (3)

1. 　検体に含有されるＤＮＡをＰＣＲ法により解析するために用いられるＤＮＡ解析マイクロ流路チップであって、以下を具備する：
   　シリコンからなる第１層、および
   　プラスチックからなる第２層、ここで、
   　前記第２層は、前記第１層の一部分の領域上に積層され、
   　前記第２層は、試薬、送液機構およびセンサを具備し、
   　前記第１層は、第２層が積層されていない部分の第１層の領域上にＰＣＲリアクタを具備する、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップ。
2. 　請求項１に記載のＤＮＡ解析マイクロ流路チップにおいて、
   　前記ＰＣＲリアクタは、前記第１層の中心部よりも端部の近くに配置されている、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップ。
3. 　請求項２記載のＤＮＡ解析マイクロ流路チップにおいて、
   　２以上の前記ＰＣＲリアクタが第１層に設けられ、
   　前記２以上のＰＣＲリアクタは、互いに連通している、ＤＮＡ解析マイクロ流路チップ。

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