JP5583290B2 - Dna解析マイクロ流路チップ - Google Patents
Dna解析マイクロ流路チップ Download PDFInfo
- Publication number
- JP5583290B2 JP5583290B2 JP2013557966A JP2013557966A JP5583290B2 JP 5583290 B2 JP5583290 B2 JP 5583290B2 JP 2013557966 A JP2013557966 A JP 2013557966A JP 2013557966 A JP2013557966 A JP 2013557966A JP 5583290 B2 JP5583290 B2 JP 5583290B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pcr
- layer
- specimen
- openings
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 59
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 59
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 40
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 40
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 27
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 238000005530 etching Methods 0.000 claims description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 75
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 62
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 44
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 6
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 4
- 101150102573 PCR1 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 101710185492 Acetaldehyde dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 2
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 101710162682 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- -1 Potassium ferricyanide Chemical compound 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 1
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000017525 heat dissipation Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004377 microelectronic Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940048084 pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 229940005657 pyrophosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
- B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
- B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0681—Filter
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
- B01L2300/0883—Serpentine channels
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2400/00—Moving or stopping fluids
- B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
- B01L2400/084—Passive control of flow resistance
- B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
非特許文献1では、プラスチックとシリコンを積層し、マイクロ流路チップと送液部を分けて配置する構造が開示されている。しかしながら、この方法によると、サーマルリアクタがプラスチック材料で構成されている上、そのリアクタがガラス基板を挟んで加熱面であるシリコンから隔離されているため熱接触が非常に取りにくく、熱伝達が悪いため、高速な昇降温には対応できない。また、検体や試薬をチップ外部から供給する構造になっているため、簡便に使用できない。そのため、迅速・簡便な処理に向かないことが問題であった。
シリコンからなる第1層(101)および
プラスチックからなる第2層(102)
を具備し、ここで、
前記第2層(102)が前記検体の種類および解析される対象物に応じて可変的に選択されるように、前記第2層(102)は前記第1層(101)上に積層され、
前記第1層(101)は、
少なくとも4個の開口部(291、292、293、294)
2以上のPCRリアクタ(203、204、403、404)、および
前記開口部および各PCRリアクタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
前記第2層(102)は、
前記PCR法のために用いられる試薬(1、2)、
ポンプ(312)、
センサ(315)
を具備し、
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記試薬(1、2)は、前記複数の開口部の少なくとも1つの開口部に重なり合い、
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記ポンプ(312)は、前記複数の開口部の少なくとも2つの開口部に重なり合い、
前記ポンプにより、前記試薬は、前記マイクロ流路を介して前記PCRリアクタに供給され、
前記PCRリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記混合物は、前記PCRリアクタから前記センサに送られ、前記センサを用いて前記検体に含有されるDNAをPCR法により解析する。
シリコンからなる第1層(101)および
プラスチックからなる第2層(102)
を具備し、ここで、
前記第2層(102)が前記検体の種類および解析される対象物に応じて可変的に選択されるように、前記第2層(102)は前記第1層(101)上に積層され、
前記第1層(101)は、
少なくとも4個の開口部(291、292、293、294)、
2以上のPCRリアクタ(203、204、403、404)、
前記PCRリアクタの間に設けられた少なくとも1つのフィルタ(206)、および
前記開口部、各PCRリアクタおよび前記少なくとも1つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
前記第2層(102)は、
前記PCR法のために用いられる試薬(1、2)、
ポンプ(312)、および
センサ(315)
を具備し、
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記試薬(1、2)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(291)に重なり合い、
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記ポンプ(312)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも2つの開口部(292、293)に重なり合い、
前記ポンプにより、前記試薬は、前記マイクロ流路を介して前記PCRリアクタに供給され、
前記PCRリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記混合物は、前記PCRリアクタから前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(294)を介して前記センサに送られ、前記センサを用いて前記検体に含有されるDNAを解析する。
上記のように、PCRリアクタの外周部を概ね掘り抜いて、周辺部と熱的に分離された構造とすることによって、リアクタ外周部への放熱、外周部からの吸熱を抑制できるため、より高速な昇降温が可能なPCRができるようになり、より迅速なDNA解析が行える。
上記のように、ピラー間の間隔を10μm以下、1μm以上とすることによって、検体に血液を用いたとき、PCRリアクタで破砕された不要な血球成分を、フィルタを目詰まりさせることなく、フィルタで効率的に取り除くことができる。
上記のように送液機構(例えば、ポンプ)にポリマーアクチュエータを用いることによって、送液を行うことに対して高い発生力が得られるため、フィルタでの検体由来物質の目詰まりを起こしにくい。さらに、送液機構(例えば、バルブ)にポリマーアクチュエータを用いることによって、送液を止めることに対して、高い耐圧性が得られるため、流路へのリークを抑制することができる。これらより、安定したチップ動作が行える。
第1層(101)および複数の第2層(102)を用意する工程(a)、ここで、
前記第1層(101)は、シリコンからなり、
前記第1層(101)は、
少なくとも4個の開口部(291、292、293、294)、
2以上のPCRリアクタ(203、204、403、404)、
前記PCRリアクタの間に設けられた少なくとも1つのフィルタ(206)、および
前記開口部、各PCRリアクタおよび前記少なくとも1つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
各第2層(102)は、プラスチックからなり、
各第2層(102)は、
前記PCR法のために用いられる試薬(1、2)、
ポンプ(312)、および
センサ(315)
を具備し、
前記複数の第2層(102)の中から、前記検体の種類および解析される対象物に応じて1つの第2層(102)を選択する工程(b)、
工程(b)において選択された第2層を前記第1層(101)上に積層し、DNA解析マイクロ流路チップを得る工程(c)、ここで、
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記試薬(1、2)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(291)に重なり合い、かつ
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記ポンプ(312)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも2つの開口部(292、293)に重なり合い、
前記DNA解析マイクロ流路チップの内部に、前記検体を供給する工程(d)、
前記ポンプにより、前記試薬を、前記マイクロ流路を介して前記PCRリアクタに供給する工程(e)、
ここで、前記PCRリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記PCRリアクタにおいて、前記PCR法を実施し、PCR生成物を得る工程(f)、
前記工程(f)において得られたPCR生成物を、前記PCRリアクタから前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(294)を介して前記センサに送る工程(g)、および
前記センサを用いて前記PCR生成物を感知して、前記検体に含有されるDNAを解析する工程(h)
を含む。
以下を具備するDNA解析マイクロ流路チップを用意する工程(a’)
シリコンからなる第1層(101)および
プラスチックからなる第2層(102)、ここで、
前記第2層(102)は前記第1層(101)上に積層され、
前記第1層(101)は、
少なくとも4個の開口部(291、292、293、294)、
2以上のPCRリアクタ(203、204、403、404)、
前記PCRリアクタの間に設けられた少なくとも1つのフィルタ(206)、および
前記開口部、各PCRリアクタおよび前記少なくとも1つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
前記第2層(102)は、
前記PCR法のために用いられる試薬(1、2)、
ポンプ(312)、および
センサ(315)
を具備し、
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記試薬(1、2)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(291)に重なり合い、かつ
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記ポンプ(312)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(292、293)に重なり合い、
前記DNA解析マイクロ流路チップの内部に、前記検体を供給する工程(d)、
前記ポンプにより、前記試薬を、前記マイクロ流路を介して前記PCRリアクタに供給する工程(e)、
ここで、前記PCRリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記PCRリアクタにおいて、前記PCR法を実施し、PCR生成物を得る工程(f)、
前記工程(f)において得られたPCR生成物を、前記PCRリアクタから前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(294)を介して前記センサに送る工程(g)、および
前記センサを用いて前記PCR生成物を感知して、前記検体に含有されるDNAを解析する工程(h)、
を含む。
図1は、本開示のマイクロ流路チップの全般的概念図である。本開示におけるDNA解析マイクロ流路チップは、シリコン層101(チップA)とプラスチック層102(チップB)が積層された構造を有する。前記チップAは、マイクロ流路中に少なくとも2つ以上直列に接続されたPCRリアクタと、前記PCRリアクタ間に複数本のシリコンピラーで構成される少なくとも1つのフィルタを具備し、前記チップBは、マイクロ流路中に試薬、送液機構およびセンサを具備し、かつ前記試薬、送液機構およびセンサは、検体の種類および検出対象によって可変できることを特徴とする。検体や試薬の投入や各処理は図1の矢印の順番に進む。
図3(a)は、試薬、ポンプ、バルブを含む断面図である。ポンプ310は、バルブ311は、プラスチック部に埋め込まれ、脱着が容易にできるようになっている。ポンプの駆動部のアクチュエータ312は、ピエゾ素子やポリマーアクチュエータを用いるとよく、メンブレン313を上下できるように配置される。チップが使い捨てで使われることを想定すると、ポリマーアクチュエータを用いることが特に好ましい。図に示す通り、これらは下面のシリコンで形成されたポートと流路に接続され、シリコン層内での送液が行うことができる。シリコン層のマイクロ流路は、下面から、フォトリソグラフィとRIEによってパターニングされる。また、パターニングされた流路を密閉させるために、パイレックスガラス314を蓋として用いる。パイレックスガラス314は、陽極酸化法でシリコン面に対して接合されている。また、プラスチックとシリコンのマイクロ流路を接続するために、プラスチック層を接合する前に上面から貫通穴を形成している。
シリコン基板の厚さは500〜800μm程度が好ましい。2枚のマスクを用いて上面および下面からそれぞれのパーツがエッチングされる。PCR1の403、PCR2の404の周りは概ねRIEにより上面および下面の両面からエッチングされ、完全に掘り抜かれ、熱的に孤立している。一方で、流路およびミキサー405、マイクロシーブ406は、RIEによって下面より約300μmの深さをエッチングして形成され、パイレックスガラスを陽極酸化接合し、表面がふさがれている。孔407,408,409とプラスチック部との接続部の貫通穴は、RIEによって上面より約300μmの深さをエッチングして形成されている。
(A)タカラバイオ製のTaq−ポリメラーゼ:0.2・L、PCR mix:3・L、水:2μL、2mMdNTP:1・L、10・M Primer1:1・L、10・M Primer2:1・L(それぞれのPrimer配列は※に記載)
(B)東洋紡製KOD−FXポリメラーゼ:0.2・L、2×KOD−Buffer:5・L、2mMdNTP: 1・L、10・M Primer3:1・L、10・M Primer4:1・L (それぞれのPrimer配列は※に記載)
(C)タカラバイオ製のTaq−ポリメラーゼ:0.2・L、PCR mix:3・L、Primer3‘:2・L、Primer4:2・L、蒸留水10.8・L (それぞれのPrimer配列は※に記載)
(D) トリシン緩衝液(pH8.8) 1.8μL 45mM
酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド 0.2μL 1mM
塩化マグネシウム 0.4μL 1.7mM
フェリシアン化カリウム 2μL 10mM
グリセルアルデヒド−3−リン酸 0.66μL 10mM
ジアホラーゼ 1μL 10U/mL
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ 1μL 32U/mL
ピロホスファターゼ 0.5μL 5U/mL
※Primer1(5‘−ACGGGCTGCAGGCATACACT−3‘:配列番号1)、Primer2(5’−GGC AGG TCC TGA ACC TC−3’:配列番号2)、Primer3(5‘−TAGGAAGGATGTCCTCG−3’:配列番号3)、Primer3‘(5’−TAGGAAGGATGTCCTCGTGACG−3’:配列番号4)、およびPrimer4(5’−TTCTTGATGGCAAACACAGTTAAC−3’:配列番号5)
本開示の一実施の形態に係るDNA解析マイクロ流路チップを用いて、ヒトゲノム検体からアセトアルデヒド脱水素酵素2(ALDH2)遺伝子の第12エクソンの114番目の塩基を含む所望のDNA断片の抽出・増幅を行った。プライマーは、前述したPrimer1およびPrimer2を用い、断片長141bpのDNA断片の抽出・増幅を試みた。
本開示の一実施の形態に係るDNA解析マイクロ流路チップを用いて、血液検体からDNA増幅を行った。DNA増幅のモデルとして、テンプレートとしてAB型とO型それぞれの血液を用いた。ヒト血液のゲノム中の第6エクソンの261番目の塩基を含む、DNA断片の抽出・増幅行った。プライマーとして、プライマーは前述したPrimer3およびPrimer4を用い、断片長134又は135bpのDNA断片の抽出・増幅を試みた。
本開示の一実施の形態に係るDNA解析マイクロ流路チップを用いて、血液検体からアレル特異DNA増幅を行った。アレル特異DNA増幅のモデルとして、テンプレートとしてAB型とO型それぞれの血液を用いた。ヒトゲノムの第六エクソンの261番目の塩基(SNP部位)を含むDNA断片を増幅するプライマーとして、前述したPrimer3およびPrimer4を用いた。第六エクソンの261番目の塩基(SNP部位)の違いを見分けるアレル特異性プライマーとして、Primer3‘、Primer4を用いて測定を行った。このアレル特異性プライマーはAB型の血液に対してのみ特異的に伸長反応を起こす。
本開示の一実施の形態に係るDNA解析マイクロ流路チップを用いて、血液検体からSNP検出を行った実施例について説明する。
例3と同様、SNP検出のモデルとして、テンプレートとしてAB型とO型それぞれの血液を用いた。用いたプライマーの種類は例3と同様である。
102 プラスチック基板
203 PCR1
204 PCR2
205 ミキサー
206 フィルタ
207 孔(検体)
208 孔(試薬1)
209 孔(試薬2)
210、310 ポンプ
211、311 バルブ
312 アクチュエータ
313 メンブレン
314 パイレックスガラス
315 センサチップ
316 検出面
317 試薬3
318 キャビティ
319 スペーサ
320 空気穴
[配列表]
Claims (6)
- 検体に含有されるDNAをPCR法により解析するために用いられるDNA解析マイクロ流路チップであって、
シリコンからなる第1層(101)および
プラスチックからなる第2層(102)
を具備し、ここで、
前記第2層(102)が前記検体の種類および解析される対象物に応じて可変的に選択されるように、前記第2層(102)は前記第1層(101)上に積層され、
前記第1層(101)は、
少なくとも4個の開口部(291、292、293、294)、
2以上のPCRリアクタ(203、204、403、404)、
前記PCRリアクタの間に設けられた少なくとも1つのフィルタ(206)、および
前記開口部、各PCRリアクタおよび前記少なくとも1つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
前記第2層(102)は、
前記PCR法のために用いられる試薬(1、2)、
ポンプ(312)、および
センサ(315)
を具備し、
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記試薬(1、2)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(291)に重なり合い、
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記ポンプ(312)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも2つの開口部(292、293)に重なり合い、
前記ポンプにより、前記試薬は、前記マイクロ流路を介して前記PCRリアクタに供給され、
前記PCRリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記混合物は、前記PCRリアクタから前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(294)を介して前記センサに送られ、前記センサを用いて前記検体に含有されるDNAを解析する、DNA解析マイクロ流路チップ。 - 請求項1記載のDNA解析マイクロ流路チップにおいて、前記PCRリアクタの周辺部のうち、マイクロ流路と接続されている付近以外のシリコン領域が掘り抜かれていることを特徴とする、DNA解析マイクロ流路チップ。
- 請求項1記載のDNA解析マイクロ流路チップにおいて、前記フィルタは、シリコンのエッチングで形成された円柱形状のピラーにより構成され、前記ピラー間の間隔が10μm以下、1μm以上であることを特徴とする、DNA解析マイクロ流路チップ。
- 請求項1記載のDNA解析マイクロ流路チップにおいて、前記ポンプにポリマーアクチュエータを用いることを特徴とする、DNA解析マイクロ流路チップ。
- 検体に含有されるDNAをPCR法により解析する方法であって、
第1層(101)および複数の第2層(102)を用意する工程(a)、ここで、
前記第1層(101)は、シリコンからなり、
前記第1層(101)は、
少なくとも4個の開口部(291、292、293、294)、
2以上のPCRリアクタ(203、204、403、404)、
前記PCRリアクタの間に設けられた少なくとも1つのフィルタ(206)、および
前記開口部、各PCRリアクタおよび前記少なくとも1つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
各第2層(102)は、プラスチックからなり、
各第2層(102)は、
前記PCR法のために用いられる試薬(1、2)、
ポンプ(312)、および
センサ(315)
を具備し、
前記複数の第2層(102)の中から、前記検体の種類および解析される対象物に応じて1つの第2層(102)を選択する工程(b)、
工程(b)において選択された第2層を前記第1層(101)上に積層し、DNA解析マイクロ流路チップを得る工程(c)、ここで、
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記試薬(1、2)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(291)に重なり合い、かつ
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記ポンプ(312)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも2つの開口部(292、293)に重なり合い、
前記DNA解析マイクロ流路チップの内部に、前記検体を供給する工程(d)、
前記ポンプにより、前記試薬を、前記マイクロ流路を介して前記PCRリアクタに供給する工程(e)、
ここで、前記PCRリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記PCRリアクタにおいて、前記PCR法を実施し、PCR生成物を得る工程(f)、
前記工程(f)において得られたPCR生成物を、前記PCRリアクタから前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(294)を介して前記センサに送る工程(g)、および
前記センサを用いて前記PCR生成物を感知して、前記検体に含有されるDNAを解析する工程(h)
を含む、検体に含有されるDNAをPCR法により解析する方法。 - 検体に含有されるDNAをPCR法によりDNA解析マイクロ流路チップを用いて解析する方法であって、
以下を具備するDNA解析マイクロ流路チップを用意する工程(a’)
シリコンからなる第1層(101)および
プラスチックからなる第2層(102)、ここで、
前記第2層(102)は前記第1層(101)上に積層され、
前記第1層(101)は、
少なくとも4個の開口部(291、292、293、294)、
2以上のPCRリアクタ(203、204、403、404)、
前記PCRリアクタの間に設けられた少なくとも1つのフィルタ(206)、および
前記開口部、各PCRリアクタおよび前記少なくとも1つのフィルタの間と連通するマイクロ流路
を具備し、
前記第2層(102)は、
前記PCR法のために用いられる試薬(1、2)、
ポンプ(312)、および
センサ(315)
を具備し、
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記試薬(1、2)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(291)に重なり合い、かつ
第1層(101)の法線方向から見たときに、前記ポンプ(312)は、前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(292、293)に重なり合い、
前記DNA解析マイクロ流路チップの内部に、前記検体を供給する工程(d)、
前記ポンプにより、前記試薬を、前記マイクロ流路を介して前記PCRリアクタに供給する工程(e)、
ここで、前記PCRリアクタには、前記試薬および前記検体の混合物が供給され、
前記PCRリアクタにおいて、前記PCR法を実施し、PCR生成物を得る工程(f)、
前記工程(f)において得られたPCR生成物を、前記PCRリアクタから前記少なくとも4個の開口部に含まれる少なくとも1つの開口部(294)を介して前記センサに送る工程(g)、および
前記センサを用いて前記PCR生成物を感知して、前記検体に含有されるDNAを解析する工程(h)、
を含む、検体に含有されるDNAをPCR法によりDNA解析マイクロ流路チップを用いて解析する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013557966A JP5583290B2 (ja) | 2012-04-20 | 2013-04-19 | Dna解析マイクロ流路チップ |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012096885 | 2012-04-20 | ||
JP2012096885 | 2012-04-20 | ||
JP2013557966A JP5583290B2 (ja) | 2012-04-20 | 2013-04-19 | Dna解析マイクロ流路チップ |
PCT/JP2013/062310 WO2013157667A1 (ja) | 2012-04-20 | 2013-04-19 | Dna解析マイクロ流路チップ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP5583290B2 true JP5583290B2 (ja) | 2014-09-03 |
JPWO2013157667A1 JPWO2013157667A1 (ja) | 2015-12-21 |
Family
ID=49383605
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013557966A Expired - Fee Related JP5583290B2 (ja) | 2012-04-20 | 2013-04-19 | Dna解析マイクロ流路チップ |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10100352B2 (ja) |
EP (1) | EP2840129B1 (ja) |
JP (1) | JP5583290B2 (ja) |
WO (1) | WO2013157667A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106195321B (zh) | 2016-08-30 | 2017-09-22 | 博奥颐和健康科学技术(北京)有限公司 | 一种液体存储和释放组件及液体存储和释放芯片 |
CN109844111A (zh) * | 2016-12-13 | 2019-06-04 | 荣研化学株式会社 | 微芯片 |
CN106701556B (zh) * | 2017-01-06 | 2019-02-12 | 广东顺德永诺生物科技有限公司 | 数字pcr检测装置及其液路系统 |
WO2019203727A1 (en) * | 2018-04-19 | 2019-10-24 | Nanyang Technological University | Microfluidic board and method of forming the same |
CN110849868B (zh) * | 2019-10-21 | 2022-09-13 | 江苏大学 | 基于微流控芯片的面粉中溴酸钾智能检测装置与方法 |
CN110791422B (zh) * | 2019-11-08 | 2021-07-20 | 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司 | 一种核酸扩增仪的调控方法 |
WO2021092801A1 (zh) * | 2019-11-13 | 2021-05-20 | 京东方科技集团股份有限公司 | 检测芯片 |
CN116134124A (zh) * | 2020-08-11 | 2023-05-16 | 杏林制药株式会社 | 核酸扩增芯片 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011522219A (ja) * | 2008-04-10 | 2011-07-28 | ヴァルティオン・テクニッリネン・トゥトキムスケスクス | マイクロ流体チップ装置およびその使用 |
US20130078155A1 (en) * | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Imec | Method and Device for Thermal Insulation of Micro-Reactors |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2501857A1 (en) * | 2002-10-09 | 2004-04-22 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Microfluidic systems and components |
US20050142565A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-06-30 | Agency For Science, Technology And Research | Nucleic acid purification chip |
JP2007536504A (ja) * | 2004-03-26 | 2007-12-13 | インフェクシオ・リシェルシェ・インコーポレーテッド | 取り外し可能マイクロ流体フローセル |
KR100773563B1 (ko) * | 2006-11-14 | 2007-11-07 | 삼성전자주식회사 | 미세유체 처리 소자를 포함한 미세유체 처리 장치 및 이의제조방법 |
US20090227476A1 (en) * | 2008-03-07 | 2009-09-10 | Applied Microarrays, Inc. | Amplification and microarray detection apparatus and methods of making |
-
2013
- 2013-04-19 EP EP13778172.0A patent/EP2840129B1/en active Active
- 2013-04-19 WO PCT/JP2013/062310 patent/WO2013157667A1/ja active Application Filing
- 2013-04-19 JP JP2013557966A patent/JP5583290B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-03-04 US US14/196,293 patent/US10100352B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011522219A (ja) * | 2008-04-10 | 2011-07-28 | ヴァルティオン・テクニッリネン・トゥトキムスケスクス | マイクロ流体チップ装置およびその使用 |
US20130078155A1 (en) * | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Imec | Method and Device for Thermal Insulation of Micro-Reactors |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
JPN6013036177; MAN, P.F. et al.: 'Microfluidic plastic capillaries on silicon substrates: a new inexpensive technology for bioanalysis' Micro Electro Mechanical Systems, 1997. MEMS '97, Proceedings, IEEE., Tenth Annual International Wor , 19970126, p.311-316 * |
JPN6013036179; PALMIERI, M. et al.: 'Advanced Microfluidic Packaging for Molecular Diagnostics' 43rd International Symposium on Microelectronics 2010, (IMAPS 2010) , 2010, p.36-41 * |
JPN6013036180; LEE, D.S. et al.: 'Bulk-micromachined submicroliter-volume PCR chip with very rapid thermal response and low power cons' Lab on a Chip Vol.4, No.4, 20040329, p.401-407 * |
JPN6013036182; MAJEED, B. et al.: 'Silicon Based System for Single-Nucleotide-Polymorphism Detection: Chip Fabrication and Thermal Char' Japanese Journal of Applied Physics Vol.51, 20120420 * |
JPN6013036183; MAJEED, B. et al.: 'Silicon micro-pillar filter fabrication for DNA separation in Lab-on-chip system' Electronics Packaging Technology Conference (EPTC), 2012 IEEE 14th , 20121205, p.52-56 * |
JPN6013036184; 山下一郎他: '一塩基多型センシングチップ-その場遺伝子情報解析の実現-' パナソニック技報 Vol.57, No.3, 20111015, p.21-26 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2013157667A1 (ja) | 2015-12-21 |
US20140186846A1 (en) | 2014-07-03 |
EP2840129B1 (en) | 2017-07-05 |
WO2013157667A1 (ja) | 2013-10-24 |
EP2840129A4 (en) | 2015-12-30 |
EP2840129A1 (en) | 2015-02-25 |
US10100352B2 (en) | 2018-10-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5583290B2 (ja) | Dna解析マイクロ流路チップ | |
Chen et al. | Present status of microfluidic PCR chip in nucleic acid detection and future perspective | |
Cao et al. | Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications | |
JP5523327B2 (ja) | 統合型マイクロ流体デバイスおよび方法 | |
EP2610007B1 (en) | Assays | |
Li et al. | Recent advancements in nucleic acid detection with microfluidic chip for molecular diagnostics | |
CN111979092A (zh) | 蜂窝管 | |
Lien et al. | Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform | |
Yin et al. | Digital Recombinase Polymerase Amplification, Digital Loop‐Mediated Isothermal Amplification, and Digital CRISPR‐Cas Assisted Assay: Current Status, Challenges, and Perspectives | |
Li et al. | Recent progress in CRISPR-based microfluidic assays and applications | |
JP5521126B2 (ja) | Dna解析マイクロ流路チップ | |
Jakaratanopas et al. | Integrated microfluidic systems for genetic analysis | |
JP2015192603A (ja) | マイクロ流路チップおよびその駆動方法 | |
Marasso et al. | APEX protocol implementation on a lab-on-a-chip for SNPs detection | |
JP2008017779A (ja) | ラボオンチップ | |
US20130096035A1 (en) | Self-sustained fluidic droplet cassette and system for biochemical assays | |
Becker et al. | Continuous-flow PCR using segmented flow and integrating sample preparation | |
Chen | Fully integrated microsystem for bacterial genotyping | |
Chabert | Gene Expression Analysis on Microchips |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140617 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140715 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5583290 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |