CN102939525A - 用于组织保存的产品和方法 - Google Patents

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CN102939525A CN2011800184832A CN201180018483A CN102939525A CN 102939525 A CN102939525 A CN 102939525A CN 2011800184832 A CN2011800184832 A CN 2011800184832A CN 201180018483 A CN201180018483 A CN 201180018483A CN 102939525 A CN102939525 A CN 102939525A
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Abstract

本申请涉及用于提高福尔马林固定的、任选地石蜡包埋的生物材料的稳定性的方法。在一个实例中，在固定时或之前不久，将DNA酶抑制剂和/或RNA酶抑制剂与生物材料或福尔马林合并。

Description

用于组织保存的产品和方法
交叉引用
本申请要求于2010年4月12日提交的美国临时申请号61/323,185的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及例如在用于病理学分析或用于组织研究应用的组织处理过程中稳定大分子或保持组织完整性。本发明提供了一组用于组织保存的小分子或溶质。
背景技术
甲醛水溶液(福尔马林)组织固定是目前医学病理学的黄金标准。在20世纪早期，福尔马林固定技术经高度优化得以支持染料和金属染色剂的使用。20世纪中期，由于大部分蛋白质表位稳定并且尺寸小，发现同样的福尔马林固定技术支持抗体在免疫组织化学中的应用。
病理学中的固体组织固定(FFPE)标准是10％的磷酸盐缓冲的福尔马林，在25℃下温育8-24小时，然后在乙醇中脱水，将溶剂更换成二甲苯，然后用熔化温度(Tm)约为56℃的石蜡聚合物共混物包埋。该过程提供高度可重现的染料染色，但产生已断裂的并且被化学损伤内部修饰的DNA和RNA互补物。
在完全脱水、石蜡包埋的组织中，DNA和RNA在长储存期内并不稳定。数据让人想起所有核酸在环境温度下在诸如滤纸的基质中干燥储存时所见的情况。这种时间依赖性的核酸损伤可能是由于残余水污染所造成的(缓慢)水解，或者甚至更可能地，是由于核酸与已经渗透进FFPE组织块的分子氧的扩散相互作用所造成的核酸碱基(尤其是G)的缓慢氧化。
在甲醛水溶液处理过程中导致的并发核酸损伤，由于核酸的不稳定性和基因组测试所需要的大片段核酸靶标-通常至少500个碱基，极大地限制了基因组学的应用。已经证明，如果通过使用有机溶剂混合物来完全取代福尔马林进行固定，能够获得高度稳定的DNA和RNA。然而，这些“非福尔马林”方法尚未被病理学界接受，因为它们产生的组织形态学变化虽然少但非常显著，并且基于溶剂的固定剂需要对一个世纪以来的实验室标准操作程序进行显著的改变。
发明内容
本发明提供在样品固定过程中使用降解抑制剂来增加/维持样品内容物(例如，样品核酸、蛋白质等)的完整性。例如，在一个实施方式中，此处所述的组合物、方法和试剂盒可用于抑制蛋白质的翻译后磷酸化修饰(即磷-蛋白质)的完整性的损失。在另一个实施方式中，此处所述的组合物、方法和试剂盒可用于抑制以下材料的降解或维持其完整性：纯化或未纯化的多核苷酸，包括例如DNA(dsDNA和ssDNA)、甲基化DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、DNA-RNA杂合体、RNA、mRNA、rRNA或其混合物，例如微生物如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人类的生物材料的基因、染色体、质粒和基因组及其片段。因此，降解抑制剂可以是多核苷酸降解抑制剂或蛋白质降解抑制剂。
可以进一步分析此处所述的样品以用于体外诊断应用或研究应用。在一些实例中，采用核酸分析法分析此处所述的样品。
可以在根据本发明的方法固定后对样品核酸进行的核酸分析的例子包括但不限于：扩增，如单链扩增、指数式扩增、PCR、数字PCR、定量PCR、实时PCR，测序，包括焦磷酸测序、单链延伸测序、单分子测序、连接测序、杂交测序，RFLP，SNP分析，微阵列分析等。
可以进一步分析此处固定的样品以检测或诊断病症，包括但不限于：癌症、胎儿异常、自身免疫病和其他遗传性疾病。
核酸降解抑制剂的例子包括，例如核酸酶抑制剂。优选地，本发明使用的核酸降解抑制剂是具有透过细胞或组织的能力的小分子。与不存在抑制剂的条件下的降解相比，核酸降解抑制剂优选地抑制多核苷酸降解达至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.5％。所用的抑制剂的浓度可以变化。在一些实例中，可以加入此处所述的抑制剂以达到＜0.05、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM或10mM的单独或最终集合浓度。
在一些实例中，核酸降解抑制剂是DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂。
在一些实例中，在“固定”过程中将多种组织渗透性的、广谱核酸酶抑制剂加入固定剂(如福尔马林)中。固定步骤中广谱核酸酶抑制剂的加入导致更好的DNA和/或RNA完整性。例如，采用本发明的方法，DNA可以保持大于约1.0、5.0或10kb的长度超过一周、一个月、一年或十年。同样地，采用本发明的方法，RNA可以保持大于约0.1、0.5、1.0或10kb的长度超过一周、一个月、一年或十年。
表1在此描述了示例性的核酸酶抑制剂。
表2描述了示例性的ROS清除剂。
在一些实施方式中，降解抑制剂是磷酰基转移酶超家族的抑制剂。
在一些实施方式中，降解抑制剂是小分子。然而，它也可以是酶或抗体或其他化合物。优选地，抑制剂具有高组织渗透性。例如，本发明的抑制剂可以以＞1mm/hr、5mm/hr、10mm/hr、20mm/hr、100mm/hr的速率渗透组织。在一些实例中，本发明的降解抑制剂以50％的抑制剂在4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟、20分钟、10分钟或1分钟内渗透组织的速率渗透组织。
在一些实例中，降解抑制剂包含螯合剂。螯合剂可以是Mg2+螯合剂，或更优选EDTA。在一些方面，螯合剂与RNA酶抑制剂或DNA酶抑制剂联合使用。
优选地，降解抑制剂小到足以容易地扩散到直径小于40nm的孔内。
降解抑制剂可以单独使用或联合使用。在一些实例中，在固定步骤中至少加入2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的核酸降解抑制剂，例如通过加入到固定剂中或乙醇的醇清洗液中。例如，核酸酶抑制剂、ROS清除剂和/或磷酰基转移酶超家族抑制剂的组合可以一起加入。
如上面所提供的，抑制剂可以加入到固定剂中。或者备选地或额外地，它们也可以加入到醇清洗液(例如，在组织处理过程中使用的第一水-乙醇清洗液)中。
因此，在一些实例中，本发明涉及含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种不同的降解抑制剂的组合物，这些降解抑制剂或者都在一个容器中或者在不同的容器中但在一个试剂盒中。在一些实例中，本发明涉及含有固定剂(如福尔马林)的容器和在同一溶液或容器中或者在不同溶液或容器中但在同一试剂盒中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种不同的降解抑制剂。在又一实施方式中，本发明涉及含有醇清洗液(如乙醇清洗液)的容器和在同一溶液或容器中或者在不同溶液或容器中但在同一试剂盒中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种不同的降解抑制剂。因此，在一个实施方式中，本发明涉及含有福尔马林和降解抑制剂的溶液。优选地，降解抑制剂是分离的或合成的。优选地，降解抑制剂是小分子。溶液可以进一步含有样品。在一些实施方式中，溶液由或基本由福尔马林或其他固定剂和降解抑制剂组成。
降解抑制剂优选地在37℃下一个月后在福尔马林固定的组织中以下述水平保持不受损伤的DNA链长度和不受损伤的RNA链长度，其与完成固定后立即获得的水平相当或与该水平相差在90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、3％或1％内。
可在福尔马林固定过程之前或期间加入核酸降解抑制剂。
因此，本发明提供包含以下成分、由以下成分组成或基本由以下成分组成的组合物：(i)一种或多种降解抑制剂，和(ii)福尔马林或醇清洗液。
在本发明的任何实施方式中，福尔马林可以是磷酸盐缓冲的1-37质量％的福尔马林。
本发明的任何组合物可进一步含有生物样品。该生物样品优选地是组织样品。该样品优选地来自哺乳动物或人类。
援引并入
所有在本说明书中提到的出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度等同于具体且单独地指明每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文。
具体实施方式
本文所用的术语“样品”或“生物样品”是指组织样品、器官样品、个体细胞或以上任意一种的一部分。优选的样品的例子包括组织样品，如用于检测癌症突变(如与独特的预后或治疗选择有关的EGFR或HER2突变)或癌症基因异常表达的活检组织。样品的其他例子包括含有颊内细胞、口颊细胞、毛发样品、血液样品和粘液样品的颊拭子。
本文所用的术语“抑制”和“抑制剂”也指活性降低或降低活性的化合物，例如，其中降低至少50％、40％、30％、20％的活性。
背景
本发明提供用于在保存期间，例如，在用于病理学分析或用于组织研究应用的组织处理期间，稳定大分子的试剂、方法和试剂盒。特别地，本发明涉及向福尔马林溶液中或向与福尔马林溶液接触之前的样品中加入降解抑制剂，优选核酸酶抑制剂，以提高样品中生物分子(如DNA、RNA或蛋白质)的完整性。
甲醛是一种气体，其在水中饱和时水合，形成在组织渗透过程中为活性剂的甲二醇(也称作“福尔马林”)。水合是缓慢可逆的，并且产生的游离COH2(在平衡状态下可得到)造成所观察到的蛋白质和核酸的化学修饰。在水合的COH2和组织之间所期望的化学反应是蛋白质上非常紧密间隔排列的胺基团的交联，从而形成所谓的甲醛交联或(-R1-NH-CH2-NH-R2-)，其中，例如，R1和R2可以是在相邻蛋白质上或在同一蛋白质内紧密相间排列的赖氨酸或天冬酰胺侧链。如果两个反应物在0.1-0.2nm内，以平均时间算，这样的交联非常迅速地发生，而且与相对较小的、正的生成焓有关(即，甚至在低温下该过程也能迅速进行)。这些迅速形成的甲醛交联是为显微镜检查提供所期望的组织形态学稳定性的化学连接。正如所预期的，所生成的双-烷基-氨基交联对于酸或碱中的水解是非常稳定的。在没有胺基因接近时，反应停止于单氨基加成物(-R1-NH-CH2-OH)的形成，该加成物在低温下也容易形成，但是在酸和碱中容易逆转。不受理论的约束，本发明的一些实施方式阻止或限制多核苷酸的降解，同时对交联没有或只有有限的影响。
福尔马林和核酸之间的相应反应纯粹是组织副反应，对于组织保存来说是不希望的。稳定的反应产物伴随环外碱性胺，大致反应性顺序为A＞C＞G。至于蛋白质-蛋白质交联，将要形成的唯一稳定的复合物为(-R1-NH-CH2-NH-R2-)，其中最常见地，R1是环外胺且R2是染色体蛋白质(对于DNA)或RNP(对于RNA)。在不存在这种双官能连接时，单官能(-R1-NH-CH2-OH)加成物在接近中性时容易逆转，尤其是在加热至约70℃时。在单纯的核酸溶液中，单官能产物或交联产物都不会诱导DNA或RNA链断裂。在染色质免疫沉淀(Chip)技术领域中，在大鼠肝脏模型中，Masuda等人针对RNA以及Tokuda等人针对DNA都已经证实了这一发现。因此，在固体组织的福尔马林固定期间观察到的核酸断裂并不是由于甲醛化学。相反，这是组织浸泡在磷酸缓冲液中几个小时期间内源性组织核酸酶活性的结果。因此，不受理论的束缚，本发明的实施方式旨在在组织浸泡在磷酸缓冲液中几个小时期间防止内源性组织核酸酶活性。
降解抑制剂及其应用
本发明涉及减少样品固定期间的多核苷酸降解和/或蛋白质降解的方法。虽然通常采用福尔马林进行固定，但本发明考虑使用降解抑制剂加上任意固定剂。非福尔马林固定剂的例子包括但不限于醛类、汞制剂、醇类、氧化剂、苦味酸盐和醇固定剂。不受理论的束缚，内源性组织核酸酶活性可能是由于样品中水的存在引起的。在一个实施方式中，本发明进一步提供了用于在初始固定步骤中消除水以便消除内源性组织核酸酶活性的试剂和方法。例如，醇固定剂或用醇-氯仿或醇-PEG固定可以用来消除样品中的水并产生高分子量组织补充物的保留。
无论使用哪种固定剂，本发明考虑向样品和/或固定剂中加入一种或多种降解抑制剂。例如，降解抑制剂可以是多核苷酸降解抑制剂和/或蛋白质降解抑制剂。优选地，固定剂是福尔马林且降解抑制剂不是福尔马林。降解抑制剂可以是分离的、天然存在的试剂或非天然存在的试剂。
降解抑制剂可以包括任何减少或抑制核酸或蛋白质降解或断裂的化合物。因此，术语“抑制”或“抑制剂”或“将...抑制”分别与“减少”、“减少剂”或“使...减少”同义。涉及降解时，减少优选地是在一段时间内与不存在抑制剂时的降解相比，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的减少。然而，任何核酸降解的减少或完整性都被认为是降解的抑制。
降解抑制剂包括但不限于磷酰基转移酶超家族的抑制剂，如螯合剂、DNA酶抑制剂、RNA酶抑制剂，以及活性氧(ROS)的清除剂或抑制剂。在一些情况下，降解抑制剂是酶。在一些情况下，降解抑制剂是小分子。优选地，它是水溶性的。优选地，它难溶于醇或二甲苯，因此在组织转移至无水溶剂时，它永久性地嵌入脱水的组织块基质中。
螯合剂可用作磷酰基转移酶超家族的抑制剂。螯合剂的非限制性例子包括：(2-羟丙基)-β-环糊精溶液；一水合2，3-二巯基-1-丙磺酸钠盐；3-羟基-2-(5-羟基戊基)苯并吡喃-4-酮；(+)-(18-冠-6)-2，3，11，12-四甲酸；氨基己酸次氮基三乙酸；α-环糊精；氨基己酸次氮基三乙酸三叔丁酯；酒石酸二铵；BAPTA-四甲酯；BAPTA，游离酸；甲磺酸去铁胺；丁二酮肟；DMSA(间-2，3-二巯基琥珀酸)；EDTA二钠盐二水合物；EGTA；EGTA/AM；乙二胺四(亚甲基膦酸)；sc-300682；乙二胺四乙酸二铵盐；乙二胺四乙酸二钠盐溶液；FLUO 3，五铵盐；HBED；七(6-O叔丁基二甲基甲硅烷基-2，3-二-O-乙酰基)-β-环糊精；INDO 1五钾盐；铁DOTA钠盐；MAPTAM；N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰基甲基)亚氨基二乙酸；N，N-二甲基癸胺N-氧化物；N，N-二甲基十二烷基胺N-氧化物；N4，Nα，Nα，Nε，Nε-[五(羧甲基)]-N4-(羧甲基)-2，6-二氨基-4-氮杂己酸酰肼；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；亚苯基乙烯三胺五乙酸；植酸六钡盐；吡哆醛异烟酰腙；柠檬酸二氢钾；D-酒石酸二氢钾；一水合草酸钾；四水合酒石酸钠钾；二水合四草酸钾；外消旋(溴乙酰氨基苯基甲基)乙二胺四酸；RHOD 2三铵盐；RHOD2/AM；[S-甲硫代磺酰基半胱胺基]乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸；(S)-1-(对-溴乙酰氨基苄基)乙二胺四乙酸；一水合酒石酸氢钠；酒石酸二钠溶液；柠檬酸钠；叔-Boc-氨基己酸次氮基三乙酸；四乙酰氧甲基双(2-氨基乙基)醚N，N，N′，N′-四乙酸；X-206；Zinpyr-1；或Zinpyr-4。不受理论所束缚，可以认为，由于DNA酶需要游离Mg2+以实现其功能，因此二价阳离子螯合剂，特别是Mg2+螯合剂，例如EDTA，在抑制DNA酶方面有效。
RNA酶抑制剂的例子包括但不限于核糖核酸酶抑制因子(RI)。RI是一种大的(约450个残基，约49kDa)、酸性的(PI约4.7)、富含亮氨酸的重复蛋白质，它与某些核糖核酸酶形成极其紧密的复合体。RI对氧化作用敏感。在一些实施方式中，ROS清除剂可以用来保护RI免于氧化。在这样的实施方式中，RI和ROS清除剂在共同溶液中使用。有几种市售的RI形式可以在本发明的方法、组合物和试剂盒中使用。它们的非穷尽的清单包括：SUPERase·InTM、RNA酶cureTM、Ambion
Figure BDA00002241461100081
RNAlater
Figure BDA00002241461100082
、RNAlater
Figure BDA00002241461100083
-ICE、核糖核苷-氧钒基络合物、RNasin
Figure BDA00002241461100084
+RNA酶抑制剂和RNAlater
Figure BDA00002241461100085
。抗氧化的核糖核酸酶抑制剂(在US 7,650,248中描述)是可在本发明中使用的RNA酶抑制剂的另一个例子。
DNA酶抑制剂的例子包括但不限于脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II和微球菌核酸酶的抑制剂。DNA酶的非限制性例子包括：N 2-巯基乙醇；2-硝基-5-氰硫基苯甲酸；肌动蛋白；黄曲霉毒素B2a、G2、G2a和M1(非竞争性)；Ca2+；EGTA和EDTA；十二烷基硫酸钠；小牛脾抑制剂蛋白质；和碳二亚胺和胆固醇硫酸盐。其他的核酸酶抑制剂包括美国2005/0214839中公开的化合物，其通过引用并入本文。
表I总结了几种磷酸盐拮抗剂。
表I.用于固体组织的广谱核酸酶抑制剂
Figure BDA00002241461100091
如表I中所指出的，磷酰基转移酶家族中存在许多广谱小分子抑制剂，其大小和扩散系数与EDTA相当。不受理论所束缚，固体组织扩散动力学提示，与表1中的分子一样小的分子应该能够在组织固定的前1-4小时内扩散进入组织间隙。优选地，这类添加到固定步骤中的抑制剂比福尔马林具有更快的核酸酶抑制速率。在一个实例中，本发明的降解抑制剂在相同的浓度下单独使用时，比单独使用福尔马林抑制核酸酶的速率大至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。因此，在一个实施方式中，降解抑制剂包含一组广义的核酸酶抑制剂，它们具备与福尔马林共同扩散到组织内的能力，同时抑制组织核酸酶，具备在福尔马林固定的最早阶段阻止DNA和RNA断裂的能力。
降解抑制剂的其他例子包括ROS清除剂。活性氧(ROS)是在外电子层结构中具有单个未成对电子的化学物质。ROS具有化学反应性且能够通过加成到核酸结构的一个或多个位点上而损伤多核苷酸。氧离子是ROS的一个例子。氧损伤是通过常态(基态)三重态O2的热转换介导的，以形成激发的单态O2自由基和随后的过氧化物和水合电子等价物，后者可以在与基质中的残留水进行电子交换后形成。这种混合类别的激发态O2被称为活性氧(ROS)。
降解抑制剂可包括ROS清除剂。ROS清除剂的非限制性例子包括：Tiron、SOD(超氧化物歧化酶)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、超氧化物还原酶、维生素E、维生素C、类黄酮、维生素-B、类胡萝卜素、硫辛酸、铜、锌和硒。
表II列出了几种得到充分研究的水溶性小分子ROS清除剂及其一些有用的化学性质。
表II：活性氧清除剂
Figure BDA00002241461100101
在一个实施方式中，本发明在紧接福尔马林固定后的第一50％乙醇-水醇清洗液中提供水溶性ROS清除剂。在另一实施方式中，水溶性ROS是可以与水和乙醇一起容易地扩散到多孔组织间隙内的小分子。在各种实施方式中，水溶性ROS清除剂可包含在水清洗液中。在各种实施方式中，水溶性ROS清除剂可包含在低于10％、低于20％、低于30％、低于40％、低于50％、低于60％、低于70％、低于80％、低于90％或低于95％的醇清洗液中。不受理论束缚，相信在随后的乙醇-水浸泡步骤中将ROS清除剂引入到组织块中，接着在随后的富含乙醇的清洗步骤期间其被捕获到组织中，从而永久地在组织块中截留清除剂，以便当在组织块长期储存过程中产生ROS时将其猝灭。
在其他实施方式中，可以在组织样品固定和保存过程中将ROS清除剂加入一种或多种溶液中。可将ROS清除剂加入缓冲液、福尔马林、醇清洗液或一些或所有这些溶液中。然后通过这些可能含有ROS清除剂的溶液转移样品。
降解抑制剂通常小到足以扩散到组织内。可以与福尔马林一起扩散或在乙醇清洗期间扩散。当样品在石蜡中时也可以发生扩散。在特定实施方式中，降解抑制剂可以容易地通过小于50nm、40nm、30nm或20nm的孔扩散。因此，降解抑制剂的直径优选地小于50nm、40nm、30nm或20nm。
降解抑制剂可通过使其与诸如福尔马林的固定剂接触或在固定剂固定之前与生物样品接触而单独使用或联合使用(即，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同抑制剂)。例如，RNA酶抑制剂可以与螯合剂如EDTA一起使用。可在固定剂与生物样品接触之前、同时或之后，将两种抑制剂加入福尔马林或其他固定剂中。
在某些实施方式中，降解抑制剂抑制DNA酶和RNA酶两者。
在一些实施方式中，降解抑制剂在仅含福尔马林和磷酸缓冲液的溶液中。在一些实施方式中，本发明的溶液基本由降解抑制剂、福尔马林和磷酸缓冲液组成。在一些实施方式中，本发明的溶液基本由降解抑制剂、水和醇组成。在一些实施方式中，本发明的溶液由降解抑制剂、水和醇组成。
在一些实施方式中，此处的降解抑制剂是水溶性活性氧清除剂，或选自表2公开的化合物的活性氧清除剂。
在一些实施方式中，本发明的组合物进一步包含螯合剂。
在一些实施方式中，降解抑制剂是一种或多种磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂和一种或多种水溶性活性氧清除剂的组合。在一些实施方式中，降解抑制剂选自表1和表2列举的化合物。
如上所述，本发明的降解抑制剂可用于保存和/或储存来自生物样品的多核苷酸。这样的方法包括：使生物样品与福尔马林接触，和使生物样品与降解抑制剂接触。福尔马林的pH可在3-10或6-8的范围内。降解抑制剂可储存于缓冲溶液中或者福尔马林可被缓冲。在一个实例中，缓冲溶液为磷酸缓冲液。降解抑制剂，尤其是非水溶性降解抑制剂如非水溶性ROS抑制剂，在一些实施方式中可加至石蜡中。在一些实施方式中，降解抑制剂在多种溶液中，例如降解抑制剂在含有福尔马林的缓冲溶液中以及在用于脱水的一系列乙醇清洗液中。然后用这些溶液相继处理组织样品。在一些实施方式中，控制在该方法所使用的一些或所有溶液的温度。在一些实施方式中，生物样品与福尔马林的接触在1℃和6℃之间的温度下进行。
在一些实施方式中，本发明提供用于分析多核苷酸的方法，该方法包括：用降解抑制剂和固定剂固定所述多核苷酸(任选地包埋，和储存固定的多核苷酸)，然后纯化多核苷酸，并对其进行分析。
在一些实例中，利用以下提供的任何实施例纯化被固定和包埋的多核苷酸。
对回收的多核苷酸的分析可以包括以下任意步骤：扩增，如单链扩增、指数式扩增、PCR、数字PCR、定量PCR、实时PCR，测序，包括焦磷酸测序、单链延伸测序、单分子测序、连接测序、杂交测序，RFLP，SNP分析，FISH，质谱分析，放射性标记，RNA表达分析，全转录组分析等。
分析所得的数据可用于检测或诊断病症，包括但不限于：癌症、胎儿异常、自身免疫病和其他遗传性疾病。数据分析可以通过互联网或经由无线连接从一台计算机终端传送到另一终端(包括移动电话)。通过提高DNA和RNA(例如)的稳定性，样品可以离岸运输至国外进行分析，而分析/诊断可以传送回本国。
生物样品与降解抑制剂接触的步骤可以在降解抑制剂含在固定剂溶液、醇清洗液或两者中时实施。
在一些实例中，可以加入此处的抑制剂，使得它们在固定剂溶液中的单独或总的终浓度为＜0.05、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM或10mM。在另一些实例中，它们在固定剂溶液中的单独或总的终浓度为至少0.05、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM或10mM。
在一些实施方式中，本发明公开了福尔马林固定的、任选地石蜡包埋的含有多种多核苷酸的生物样品或组织，其中样品中至少5％的多核苷酸链大于100、200、300、400或500个碱基对。在一些实施方式中，本发明公开了福尔马林固定的、石蜡包埋的含有多种多核苷酸链的组织，其中样品中至少1％的多核苷酸链为大于100、200、300、400或500个碱基对。在一些实施方式中，本发明公开了福尔马林固定的、石蜡包埋的含有多种多核苷酸的组织，其中样品中至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的多核苷酸链为大于100、200、300、400或500个碱基对。
在一些实施方式中，本发明公开了福尔马林固定的、石蜡包埋的含有多种脱氧核苷酸的组织，其中至少5％的脱氧核苷酸链为大于500，100、200、300、400或500，或1000个碱基对。在一些实施方式中，样品中至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的脱氧核苷酸链为大于500、100、200、300、400或500、1000、5000或10000个碱基对。在一些实施方式中，样品中至少10％的脱氧核苷酸链为大于100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或10000个碱基对。
在一些实施方式中，本发明公开了福尔马林固定的、石蜡包埋的含有多种核糖核苷酸的组织，其中至少5％的核糖核苷酸为大于500，100、200、300、400或500，或1000个碱基对。在一些实施方式中，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核糖核苷酸为大于500，100、200、300、400或500，或1000个碱基对。在一些实施方式中，至少10％的核糖核苷酸为大于1000个碱基对。
在一些实施方式中，福尔马林固定的、石蜡包埋的含有多种未降解多核苷酸的组织储存超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。在一些实施方式中，福尔马林固定的、石蜡包埋的含有多种未降解多核苷酸的组织储存超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年。在一些实施方式中，与没有用降解抑制剂处理的福尔马林固定的石蜡包埋的组织相比，用降解抑制剂处理的福尔马林固定石蜡包埋的组织多核苷酸降解具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％以上的减少。可以在固定后超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月后进行样品间的对比。可以在固定后超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年后进行样品间的对比。因此，本发明涉及用于减少被固定的样品中多核苷酸的降解的方法，该方法包括：使所述样品与固定剂接触，和使所述样品与一种或多种多核苷酸降解抑制剂接触。然后可以任选地，例如用石蜡包埋固定的样品。
在一些实施方式中，本发明提供了从固定的样品中回收的多核苷酸，其中(i)任选地，多核苷酸是至少500个碱基对，或者样品中至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的多核苷酸的长度为至少500个碱基对，(ii)样品在含有一种或多种降解抑制剂的固定剂中固定，和(iii)任选地，将固定的样品包埋在石蜡中。或者，可以从固定的样品中回收本发明的多核苷酸，其中(i)任选地，多核苷酸是至少500个碱基对，或者样品中至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的多核苷酸的长度为至少500个碱基对，(ii)样品在固定剂(例如，福尔马林)中固定，(iii)然后在含有一种或多种降解抑制剂的醇清洗液如乙醇-水清洗液中清洗样品，和(iv)任选地，将固定的样品包埋在石蜡中。
在本发明的一些实施方式中，福尔马林具有在3-10、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10范围内的pH。
在一些实施方式中，降解抑制剂是小分子。然而，它也可以是酶或抗体或其他化合物。优选地，抑制剂具有高组织渗透性。例如，本发明的抑制剂可以以＞1mm/hr、5mm/hr、10mm/hr、20mm/hr、100mm/hr的速率渗透组织。在一些实例中，本发明的降解抑制剂以使得50％的抑制剂在4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟、20分钟、10分钟或1分钟内渗透组织的速率渗透组织。
温度
在一些实施方式中，本发明方法提供在约4℃(在冰桶中)至约25℃(室温)范围内的温度下针对福尔马林组织固定的优化。不受理论束缚，认为对于双链DNA而言，甲醛加合物形成的能量转换是非常不利的，因为环外碱性平面胺(甲醛加合物形成的位置)仅在双螺旋瞬时热破坏(即螺旋“呼吸”)后可用于化学反应。同样，对于部分结构化的RNA链，或对于通过与核糖核蛋白复合而被遮蔽的RNA链，分子内或分子间RNA复合物也倾向于阻断与溶剂化甲醛的相互作用，并且它们在热破坏后可用性才增加。因此，特别是在低温下，在组织晶格中紧密相间的结构蛋白质的化学交联(所期望的与甲醛的反应)的发生将比相同组织中(不期望的)核酸加合物的形成更快。在25℃下，福尔马林每小时渗透穿过约1mm的组织块：因此1cm的组织块至少需要12小时。在大部分孵育期期间，组织不交联，因此，认为这些组织中的DNA酶和RNA酶活性将完全保持，就像组织块在常用磷酸盐缓冲盐水中在室温(RT)下保存5小时一样。已证明，在这未保护的12小时、25℃室温“分析前”组织孵育期间，rRNA几乎完全降解。
在一些实施方式中，在样品暴露于降解抑制剂的同时控制温度。在一些实施方式中，在样品暴露于降解抑制剂的同时温度在1℃至6℃之间。在一些实施方式中，在样品与降解抑制剂接触之前的步骤中控制温度。例如，样品可在1℃至6℃的福尔马林中固定，随后暴露于后续的醇清洗液中的降解抑制剂。
在本发明的一些实施方式中，福尔马林在低于25℃、在0℃至6℃之间、在接触样品前在冰上冷却、或在1℃至3℃之间的温度下接触生物样品。接触生物样品的醇溶液可在低于25℃、在0℃至6℃之间、在接触样品前在冰上冷却、或在1℃至3℃之间的温度下。优选地，在室温下发生固定。在一些实例中，在4-40℃、10-30℃或约25℃下发生固定。
低氧环境
另一种减少储存期间对多核苷酸的损伤的方法是限制样品储存期间存在的氧的量。因此，本发明的一些实施方式涉及在氧减少的环境中使用本发明的化合物或执行本发明的方法。在一个实施方式中，在低氧、高氮环境中进行储存。例如，使用具有高精度氧传感器的O2系统的多气体控制系统可用来调节氧气和向培养箱中增加氮气。在一些实施方式中，氧气水平低于15％、低于10％、低于5％或低于1％。
Mg2+减少的试剂
在一些实施方式中，与本发明的化合物一起使用的或用于本发明的方法或试剂盒的试剂使用已经过处理从而减少了Mg2+的水。例如，使用蒸馏水或用离子交换树脂或通过离子交换层析法制备的“软化水”。
试剂盒
本发明的试剂盒可包括以下的一种或多种：用于储存生物样品的容器、一种或多种降解抑制剂、福尔马林溶液、乙醇溶液和用于包埋样品的石蜡或其他材料。降解抑制剂可以是磷酰基转移酶超家族的抑制剂、表1所述的任何化合物、活性氧清除剂、表2所述的任何化合物、任何其他DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂。优选地，降解抑制剂是水溶性的。优选地，降解抑制剂是小分子。
虽然本文已经表明和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员将会明白，这些实施方式仅以实例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变更、变化和替换。应当理解，本文描述的本发明实施方式的许多备选方案可用于实践本发明。下面的权利要求书旨在限定本发明的范围并且因此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构以及它们的等同物。
实施例
实施例1
样品的固定
使用本文所公开的不同化合物和方法固定多种样品。这些样品将用于比较本发明的不同的抗多核苷酸降解特征。
固定是为了组织学研究而保存组织的任何程序中的第一步。利用常用的固定剂杀死组织、存在于组织中的任何细菌，以及交联样品蛋白质。常用的固定剂包括：缓冲的福尔马林、含4％甲醛的缓冲的等渗盐水、布安液(Bouin’s fluid)、苦味酸和卡诺依固定剂(Carnoy’sfixative)。这些固定剂将与本文所述的试剂联合使用以防止样品中多核苷酸的降解。
接下来将进行脱水，或从组织中移除水并用乙醇替代。将使用一系列不同等级的水和乙醇的混合物，通常是从50％-70％到100％的乙醇。这也用来移除固定剂。在一些实例中，使用蒸馏水或软化水并与含有更多Mg2+的水源进行比较。在一些实例中，将本文所公开的化合物加入到乙醇清洗液中。例如在一些实例中将加入ROS清除剂。
接下来进行澄清，其中用可与包埋介质混溶的溶剂替代100％的乙醇。当使用石蜡时溶剂通常为二甲苯。由于组织被二甲苯浸润，它将变得更加透明(澄清)。首先使用50％乙醇和50％二甲苯的混合物，接着使用100％的二甲苯，各1小时。
接下来进行浸润。浸润是用石蜡替换二甲苯的过程。首先使用二甲苯和石蜡的50∶50混合物(30分钟)，接着更换2次100％石蜡。浸润通常在58-60℃下在烘箱中进行。
接下来对组织进行定向并包埋在石蜡块中。该块将置于冰水中固化。
实施例2
将包埋的组织放置于显微镜载玻片上：
将来自实施例1的石蜡包埋的组织修整为梯形形状，然后置于切片机的卡盘中。切片机是这样的机械装置：当其上下移动组织块时将组织推进固定的量(1-10mm)以使得该组织块通过刀片，该刀片将石蜡和组织切为薄切片。当正确进行时，连续的(系列)切片形成带状。
然后将石蜡带转移至储存箱或直接转移至已经借助于小刷涂有卵白蛋白的显微镜载玻片上。白蛋白起粘合剂的作用并将切片粘附在载玻片上。可以向粘合剂中加入本发明的化合物以防止多核苷酸在载玻片上的降解。
然后将载玻片置于加温的托盘上，加入蒸馏水浮起石蜡切片，然后使之膨胀和清理。移除过量的水，干燥载玻片，并将切片粘附到载玻片上。
实施例3
使用来自Sigma-Aldrich的GenEluteTM哺乳动物基因组DNA小量制备试剂盒(产品号G1N10)从福尔马林固定的、石蜡包埋的组织中提取DNA
将如本文所述处理的石蜡包埋组织的小切片(约20mg)置于2ml的微量离心管中。加入1200μl二甲苯。将样品涡旋30秒。在室温下以全速离心样品5分钟。接下来通过移液移除上清液而不移除任何沉淀物。向沉淀物中加入1200μl乙醇以去除残余的二甲苯。接下来通过涡旋混合样品并在室温下以全速离心5分钟。通过移液小心地移除乙醇而不移除任何沉淀物。进行第二次乙醇清洗。然后在37℃下将开口的微量离心管孵育10-15分钟以通过蒸发除去任何残余的乙醇。通过将组织沉淀物再悬浮于180μl裂解溶液T中将组织消化。加入20μl蛋白酶K并通过涡旋将溶液混合。然后将该溶液于55℃下孵育过夜或直至组织在孵育过程中通过偶尔的涡旋完全裂解。通过涡旋15秒裂解细胞，将200μl裂解溶液C加入到样品中，并充分涡旋，因为均质混合物对有效的裂解是至关重要的。然后将该溶液在70℃下孵育10分钟。将500μl柱制备溶液加入预组装的GenElute小型制备结合柱并将样品以12,000×g离心1分钟。将200μl乙醇加入到裂解的样品中并通过涡旋混合。将样品管中的全部内容物转移到处理后的结合柱并在≥6500×g下离心1分钟。弃去含有流通液的收集管并将结合柱置于新的2ml收集管中。在第一次使用之前，进行清洗。用乙醇稀释清洗液浓缩液。将500μl清洗液加入到结合柱并在≥6500×g下离心1分钟，接着弃去含有流通液的收集管并将结合柱置于新的2ml收集管中。然后进行第二次清洗。将500μl清洗液加入结合柱并以最大速度(12,000-18,000×g)离心3分钟以便干燥结合柱，接着弃去含有流通液的收集管并将结合柱置于新的2ml收集管中。下一步通过将200μl洗脱液直接移液到结合柱的中心，在室温下孵育5分钟，并在≥6500×g下离心1分钟来洗脱DNA。DNA样品在-20℃下储存。
实施例4
使用BiOstic
Figure BDA00002241461100191
FFPE组织DNA分离试剂盒(目录号12250-50；MO BIO Laboratories)从福尔马林固定的、石蜡包埋的组织中提取DNA
将FP1和FP2溶液加入到含有多达15mg的根据本发明方法和组合物固定的FFPE组织样品的管中。加入FP3溶液并在55℃下加热1小时接着在90℃下加热1小时。为了从消化的裂解物中分离碎片并转移至干净的管中，离心样品。加入FP4溶液和FP5溶液并混合。然后将混合物加载在旋转过滤器上并离心以使DNA结合至二氧化硅膜上。清洗过滤器并用FP6溶液旋转，倒出流通液并用FP7溶液清洗。然后弃去流通液并将过滤器离心2分钟以便干燥该膜。然后将溶液转移至最终的洗脱管，并在FP8溶液中洗脱纯化的DNA。于是DNA准备好用于qPCR或PCR应用。
实施例5
从福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织样品中提取总RNA以供SOLiDTM SAGETM试剂盒(产品编号4452811)或带条形码适配器模块的SOLiDTM SAGETM试剂盒(产品编号4443475)使用。该方法使用用于FFPE的RecoverAllTM总核酸分离试剂盒(产品编号AM1975)。所有这些均来自Applied BiosystemsTM。
将在根据本发明的方法和组合物固定的样品上进行下面的RecoverAllTM程序。
用二甲苯处理以去除石蜡：
1.向每个样品中加入1mL 100％的二甲苯。
2.短暂地涡旋以便混合。
3.短暂地离心以将任何粘附在管侧的组织向下带入二甲苯中。
4.在50℃下加热样品3分钟以融化石蜡。
5.在室温下以最大速度离心样品2分钟以沉淀该组织。
6.任选的：如果样品没有形成紧密的沉淀物，则额外地再离心2分钟。如果仍然没有形成紧密的沉淀物，则小心地继续进行下面的步骤。
7.在不干扰沉淀物的情况下移除二甲苯。按照适用的规定丢弃二甲苯。
乙醇清洗
8.将1mL 100％的乙醇(室温)加入到样品中并涡旋混合。组织应变得不透明。
9.在室温下以最大速度离心样品2分钟以沉淀该组织。
10.在不干扰沉淀物的情况下移除并弃去乙醇。乙醇中将含有痕量的二甲苯，因此必须丢弃。
11.重复以上步骤8-10，以用1mL 100％的乙醇进行第二次清洗。
12.再次短暂地离心以收集任何剩余的乙醇滴。在不干扰沉淀物的情况下尽可能多地移除残余的乙醇。
13.在离心真空浓缩器中在40-45℃下干燥≤20分钟或在37-40℃下干燥20-40分钟。也可以在室温下风干沉淀物45分钟，虽然较大的组织切片可能无法完全干燥。
蛋白酶消化
14.向每个样品中加入200μL消化缓冲液。
15.向每个样品中加入4μL蛋白酶。
16.轻轻地旋动试管以混合并浸渍组织。如果组织粘附在管侧，则用吸管端将其推入溶液中，或者短暂地离心以将组织向下带入溶液中。
17.在加热块中于50℃孵育样品15分钟，然后于80℃下15分钟以使样品澄清。
18.在一个单独的管中，将2.3mL 100％的乙醇与1mL分离添加剂混合(足够四个样品使用，加上多出的量)
19.向每个样品中加入790μL分离添加剂/乙醇混合物并上下吸液。
20.对于每个样品，在试剂盒提供的收集管之一中放置滤筒。
21.将多达700μL的每个样品混合物移液到滤筒上并盖上盖子。避免将大片的未消化组织移取到滤筒上。
22.在10,000×g(通常10,000rpm)下离心30秒以使混合物通过过滤器。
23.弃去流通液，并将滤筒再插入同一收集管中。
24.重复步骤20-23直到所有的样品混合物都通过过滤器。
清洗
25.向滤筒中加入700μL清洗液1。
26.在10,000×g下离心30秒以使混合物通过过滤器。
27.弃去流通液，并将滤筒再插入同一收集管中。
28.向滤芯中加入500μL清洗液2/3。
29.在10,000×g下离心30秒以使混合物通过过滤器。
30.弃去流通液，并将滤筒再插入同一收集管中。
31.将组件旋转额外的30秒以从过滤器中移除残余的流体。
DNA酶处理
32.在一个单独的管中，混合27μL 10X DNA酶缓冲液、18μL DNA酶和225μL无核酸酶的水(足够四个样品使用，加上多出的量)。
33.向每个滤芯的中心加入60μL DNA酶混合物。
34.给试管盖上盖并在室温(22-25℃)下孵育30分钟。
最终清洗
35.向滤芯中加入700μL清洗液1。
36.在室温下孵育30-60秒。
37.在10,000×g下离心30秒。
38.弃去流通液，并将滤筒再插入同一收集管中。
39.向滤芯中加入500μL清洗液2/3。
40.在10,000×g下离心30秒。
41.弃去流通液，并将滤筒再插入同一收集管中。
42.重复步骤39-41以用500μL清洗液2/3进行第二次清洗。
43.将组件在10,000×g下离心1分钟以从过滤器中移除残余的流体。
洗脱
44.将滤芯转移至新的收集管。
45.将60μL室温洗脱液或无核酸酶的水应用到过滤器的中心并盖上帽子。
46.让样品在室温下放置1分钟。
47.以最大速度离心1分钟以使混合物通过过滤器。洗脱液含有RNA。
48.将洗脱物合并到一个管中。储存于-20℃或更低温度下。为了较长时间地储存样品，将洗出液转移到不粘管中以防止核酸的损失。

Claims (55)

1.一种组合物，其包含：
a.降解抑制剂，和
b.福尔马林。
2.权利要求1的组合物，其中所述福尔马林在1-37质量％之间用磷酸盐缓冲。
3.权利要求1的组合物，其进一步包含固体组织样品。
4.权利要求3的组合物，其中所述降解抑制剂小到足以容易地扩散到小于40nm的孔内。
5.权利要求1的组合物，其中所述降解抑制剂包含磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂。
6.权利要求5的组合物，其中所述小分子抑制剂为RNA酶活性抑制剂。
7.权利要求5的组合物，其中所述小分子抑制剂为DNA酶活性抑制剂。
8.权利要求5的组合物，其中所述小分子抑制剂包括表1中的一种或多种。
9.权利要求5的组合物，其中所述降解抑制剂进一步包括Mg2+螯合剂。
10.权利要求9的组合物，其中所述Mg2+螯合剂为EDTA。
11.权利要求5的组合物，其中所述降解抑制剂进一步包括水溶性活性氧清除剂。
12.权利要求11的组合物，其中所述水溶性活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
13.权利要求1的组合物，其中所述降解抑制剂为活性氧清除剂。
14.权利要求13的组合物，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
15.权利要求12的组合物，其中所述降解抑制剂进一步包括Mg2+螯合剂。
16.权利要求15的组合物，其中所述螯合剂为EDTA。
17.一种组合物，其包含：
a.磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂，和
b.活性氧清除剂。
18.权利要求16的组合物，其中所述小分子抑制剂包括表1，并且其中所述活性氧清除剂为表2。
19.权利要求17的组合物，其进一步包含螯合剂。
20.权利要求18的组合物，其中所述螯合剂为EDTA。
21.一种用于保存生物样品中的多核苷酸的方法，该方法包括：
a.使所述生物样品与福尔马林接触，
b.使所述生物样品与降解抑制剂接触。
22.权利要求21的方法，其中所述生物样品与福尔马林的接触在1℃与6℃之间的温度或室温下进行。
23.权利要求21的方法，其中所述福尔马林具有在3-10范围内的pH。
24.权利要求21的方法，其中所述降解抑制剂包括磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂。
25.权利要求24的方法，其中所述小分子抑制剂包括表1中的一种或多种。
26.权利要求21的方法，其中所述降解抑制剂包括水溶性活性氧清除剂。
27.权利要求26的方法，其中所述水溶性活性氧清除剂包括表2)中的一种或多种。
28.权利要求21的方法，其中所述降解抑制剂包括磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂和水溶性活性氧清除剂。
29.权利要求28的方法，其中所述小分子抑制剂包括表1中的一种或多种，并且其中所述水溶性活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
30.一种用于分析多核苷酸的方法，包括：
a.获得生物样品，其中该样品已经与福尔马林溶液接触、与降解抑制剂接触、脱水、包埋并储存；
b.纯化所述多核苷酸，和
c.分析所述多核苷酸。
31.权利要求30的方法，其中所述分析包括进行扩增反应、测序反应、微阵列分析或表达分析。
32.权利要求31的方法，其中所述小分子抑制剂包括表1中的一种或多种。
33.权利要求30的方法，其中所述降解抑制剂包括活性氧清除剂。
34.权利要求33的方法，其中所述水溶性活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
35.权利要求30的方法，其中所述降解抑制剂包括磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂和活性氧清除剂。
36.权利要求35的方法，其中所述小分子抑制剂包括表1中的一种或多种，并且所述水溶性活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
37.权利要求21或30的方法，其中在降解抑制剂在福尔马林溶液中时进行生物样品与降解抑制剂的接触。
38.权利要求21或30的方法，其中在降解抑制剂在乙醇-水清洗液中时进行生物样品与降解抑制剂的接触。
39.权利要求38的方法，其中所述降解抑制剂是水溶性活性氧清除剂。
40.权利要求39的方法，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
41.一种用于储存生物样品的试剂盒，包括福尔马林溶液和降解抑制剂。
42.权利要求41的试剂盒，其中所述降解抑制剂包括磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂。
43.权利要求42的试剂盒，其中所述小分子抑制剂包括表1中的一种或多种。
44.权利要求41的试剂盒，其中所述降解抑制剂包括水溶性活性氧清除剂。
45.权利要求44的试剂盒，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
46.一种含有多种多核苷酸的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织，其中至少5％的多核苷酸链为超过300个碱基对。
47.一种从固定的组织中回收的多核苷酸：
a.其中所述多核苷酸链为至少300个碱基对，
b.其中所述组织在福尔马林中固定，
c.其中所述福尔马林包含降解抑制剂，
d.其中所述固定的组织包埋在石蜡中。
48.权利要求47的多核苷酸，其中所述降解抑制剂包括磷酰基转移酶超家族的小分子抑制剂。
49.权利要求48的多核苷酸，其中所述小分子抑制剂包括表1中的一种或多种。
50.权利要求48的多核苷酸，其中所述小分子抑制剂进一步包括水溶性活性氧清除剂。
51.权利要求50的多核苷酸，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
52.权利要求47的多核苷酸，其中所述降解抑制剂包括活性氧清除剂。
53.权利要求52的多核苷酸，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
54.一种从固定的组织中回收的多核苷酸：
a.其中所述多核苷酸链为至少300个碱基对，
b.其中所述组织在福尔马林中固定，
c.其中在含有水溶性活性氧清除剂的乙醇-水清洗液中清洗所述组织，且
d.其中所述固定的组织包埋在石蜡中。
55.权利要求54的多核苷酸，其中所述活性氧清除剂包括表2中的一种或多种。
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