CN117770233A - 细胞产品的留样保存液 - Google Patents

Abstract

本申请公开一种细胞产品的留样保存液，包括以下组分：柠檬酸钠，浓度为0.01‑0.05M；乙二胺四乙酸乙酯，浓度为0.1‑0.5M；Tris‑醋酸盐，浓度为0.1‑0.2M；乙二胺四乙酸，浓度为1‑5mM；环磷酸腺苷，浓度为0.2‑0.5mM；聚乙烯亚胺，浓度为20‑100mg/mL；氯化铵，浓度为5‑10mg/mL；聚乙烯醇，浓度为5‑10mg/mL；蔗糖，浓度为0.01‑0.05mM；细胞色素C，浓度为0.01‑0.05mM。本申请的细胞产品的留样保存液，没有使用会干扰DNA检测的成分，含有留样保存液的细胞产品可直接作为检测样品，简化检测过程。

Description

细胞产品的留样保存液

技术领域

本申请涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞产品的留样保存液。

背景技术

广义的“细胞产品”可以理解为细胞的体外培养物所制备的制剂，以及应用在细胞免疫治疗过程中的细胞治疗产品。无论是前者还是后者，对细胞内的感染和污染情况都需要进行持续的关注，支原体感染和细菌污染在细胞培养的各个环节都需要进行预防，发生时候也需要进行处置，感染和污染的情况以及处置的效果都要求进行定期监控。现有技术中，在细胞治疗过程中进行留样是非常重要的，它可以为治疗过程的监测、质量控制和后续分析提供必要的样本。但现有技术中所使用的保存液大多数是关注如何保证细胞的活力与生理状态，现有的保存液未很好地实现留样的细胞产品中的支原体和细菌保持可检测状态，不利于对留样的细胞产品进行支原体和细菌的检测。

发明内容

本申请的目的是，为至少部分克服现有技术的不足，提供一种能够保证留样样品细菌和支原体DNA完整性的细胞产品的留样保存液。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

一种细胞产品的留样保存液，其包括以下组分：

柠檬酸钠，浓度为0.01-0.05M；

乙二胺四乙酸乙酯，浓度为0.1-0.5M；

Tris-醋酸盐，浓度为0.1-0.2M；

乙二胺四乙酸，浓度为1-5mM；

环磷酸腺苷，浓度为0.2-0.5mM；

聚乙烯亚胺，浓度为20-100mg/mL；

氯化铵，浓度为5-10mg/mL；

聚乙烯醇，浓度为5-10mg/mL；

蔗糖，浓度为0.01-0.05mM；

细胞色素C，浓度为0.01-0.05mM。

可选择地，所述留样保存液适用于常温条件。

进一步可选择地，所述留样保存液适用于低温条件，低温保存之前需利用所述留样保存液对留样的细胞产品进行4℃过夜渗透。

优选地，所述细胞产品包括以下至少一项：细胞培养物、细胞制剂、细胞上清液、细胞培养废液或血液。

进一步优选地，所述细胞产品包括干细胞产品、免疫细胞产品或体细胞产品。

优选地，所述留样保存液与留样的细胞产品等体积混合以实现保存。

进一步地，所述留样保存液能够保持细胞产品内支原体和细菌的DNA完整性。

优选地，混合了所述留样保存液的细胞产品适用于分别针对支原体和细菌进行定性分析或定量分析。

具体地，混合了所述留样保存液的细胞产品适用于进行定量PCR检测、琼脂糖电泳检测或荧光检测。

与现有技术相比较，本申请具有如下优势：

(1)本申请的细胞产品的留样保存液，没有使用会干扰DNA检测的成分，含有留样保存液的细胞产品可直接作为检测样品，简化检测过程；

(2)本申请的细胞产品的留样保存液，适用于多种样品类型，可根据不同的样品类型对各个组分的浓度进行优化；

(3)本申请的细胞产品的留样保存液，其本身可在常温保持稳定，不易变质变性，易于保存；

(4)本申请的细胞产品的留样保存液，可适于常温条件对留样细胞产品进行短时间保存，无需进行复杂的冷冻-解冻处理，减少细胞损伤，减少检测误差；也适用于低温条件对留样细胞产品进行中长期保存，扩大了本申请的应用范围；

(5)本申请的细胞产品的留样保存液，能够保证留样细胞产品中的支原体和细菌的核酸完整性，这有助于应用于临床治疗监测和培养物污染监测；

(6)本申请的细胞产品的留样保存液，组成成分清楚，容易获取、价格相对低廉，不会大幅度提高本申请的应用成本。

附图说明

图1示出了采用本申请的细胞产品的留样保存液低温保存30d后的留样样品的细菌定量PCR检测结果，CT值用于表示细菌DNA扩增的指标。

图2示出了采用本申请的细胞产品的留样保存液低温保存30d后的留样样品的支原体DNA电泳结果，支原体DNA条带的位置和大小显著可见。

图3示出了采用本申请的细胞产品的留样保存液常温保存3d后的留样样品的支原体荧光染色检测结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。

本申请提供一种细胞产品的留样保存液，本申请的“留样保存液”主要适应于短时间留样的应用场景，留样时间由数小时至数个月不等，留样条件可以为常温条件(18℃～25℃)或低温条件(-20℃或-80℃)，区别于-196℃条件下的长期冷冻保存场景。

本申请的细胞产品的留样保存液包括以下组分：柠檬酸钠，乙二胺四乙酸乙酯，Tris-醋酸盐，乙二胺四乙酸，环磷酸腺苷，聚乙烯亚胺，氯化铵，聚乙烯醇，蔗糖，细胞色素C。

以上各组分在本申请中的特性和可能发挥的作用简述如下：

柠檬酸钠，具有良好的pH调节及缓冲性能，可以在细胞保存液中充当渗透压维持剂。柠檬酸钠在食品饮料工业中用作酸度调节剂，风味剂，稳定剂，在医药工业中用作抗血凝剂，化痰药和利尿药。

Tris-醋酸盐，常用作琼脂糖电泳的缓冲液的成分，本申请中成为主要的缓冲液成分；

乙二胺四乙酸，缩写为EDTA，属于金属离子螯合剂，可在细胞保存液中充当抗凝集剂，也有抑制DNase活化的效果，防止DNA降解；

乙二胺四乙酸乙酯，缩写为EGTA，也属于金属离子螯合剂，与EDTA相比较，EGTA对钙离子和镁离子之间的螯合选择性更高，但与其他金属离子结合所形成的配合物的稳定性较弱。有应用于心肌细胞的培养基、PCR反应缓冲液的实例，也有充当螯合剂或酶抑制剂的实例。

环磷酸腺苷，缩写为cAMP，是人体细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质，是生命信息传递的“第二信使”，是蛋白激酶致活剂，是最重要的细胞内信使之一。体内主要参与细胞分裂与分化、形态形成、类固醇生成、糖原和脂肪分解等多种生理生化过程，尤其在基因表达中发挥着至关重要的作用。常作为细胞培养基的专用添加成分。

聚乙烯亚胺，缩写为PEI，又称聚氮杂环丙烷，由单体链(-CH₂CH₂NH-)构成的一种水溶性高电荷高分子聚合物。PEI表面含有大量的氨基，在接近中性的溶液中富含正电荷，其表面可以通过化学修饰，如:乙酰化、羧化、羟基化和聚乙二醇(PEG)、低聚糖、靶向修饰或荧光标记等，实现其功能的多样化。PEI具有线性和支化两种结构，线性PEI只包含仲胺，通常来源于聚噁唑啉的酸性水解。所以获得低分子量的线性PEI有一定难度。伯胺和仲胺是活性胺，有很强的核酸结合能力，也是靶向试剂、药物等功能性组分，而叔胺的结合能力较弱，但在酸性条件中具有缓冲作用。PEI有应用于牛胚胎冷冻保存液的实例。

氯化铵，为用途广泛的化合物，有应用于红细胞保存液的实例。

聚乙烯醇，缩写为PVA，PVA可以看作是一种带有仲羟基的线性高分子聚合物。PVA分子中的羟基具有较高的活性，能够进行低醇类的典型化学反应，如酯化，醚化，缩醛化等，还可以与许多无机化合物或有机化合物反应；有应用于胎盘组织保存液的实例。

蔗糖，常在细胞保存液中充当非渗透性保护物质，降低脱水造成的胞内形成冰晶的风险。

细胞色素C，是生物氧化的一个非常重要的电子传递体，在线粒体嵴上与其它氧化酶排列成呼吸链，参与细胞呼吸过程；对组织中细胞的氧化、还原过程具有迅速的酶促作用。通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用。外源细胞色素C能对细胞起到保护作用。有应用于干细胞保存液的实例。

为了验证本申请的细胞产品的留样保存液的效果，调整各组分的浓度以配制为不同的实施例，并验证各自对细胞的影响。体外培养细胞以肾脏上皮细胞(vero)为例。在其他的实施方式中，本申请适用的细胞产品还可以是细胞免疫治疗中所应用的干细胞产品或免疫细胞产品，但上述各个组分的适配浓度需要进行适应性调整。

实施例1：

本申请的细胞产品的留样保存液各组分及浓度分别为:

柠檬酸钠，浓度为0.02M；

乙二胺四乙酸乙酯(EGTA)，浓度为0.3M；

Tris-醋酸盐，浓度为0.1M；

乙二胺四乙酸(EDTA)，浓度为0.1M；

环磷酸腺苷(cAMP)，浓度为0.2mM；

聚乙烯亚胺，浓度为20mg/mL；

氯化铵，浓度为5mg/mL；

聚乙烯醇(PVA),浓度为5mg/mL；

蔗糖，浓度为0.03mM；

细胞色素C，浓度为0.03mM。

配制时，按照上述配方称量后，用超纯水定容；过滤灭菌后得到所述保存液，滤灭菌器孔径优选为0.1μm或0.22μm。

在相同的实验条件下，以白色念球菌为阳性菌样品和阴性样品作为对照，按照样品的体积等体积添加入本申请的留样保存液，含有留样保存液的留样样品后续的保存步骤如下：在4℃条件下过夜渗透，后放入﹣20℃或﹣80℃保存30d。冻存后的留样样品解冻后可直接进行细菌定量核酸检测。

图1示出了利用本申请的留样保存液对留样样品保存30d后，细菌定量PCR检测结果，CT值用于表示细菌DNA扩增的指标。CT值越低表明细菌量越高，如果没有CT值，或者CT值很高，则意味着样本中没有检出细菌核酸或污染。结果显示：阳性样品可被正常检出CT值，阴性样品在长期保存中未被交叉污染其CT值仍然高于阳性样品。

本实施例证明了本申请的留样保存液适用于低温条件的短时间保存，含有留样保存液的留样样品能够直接进行定量PCR检测。

实施例2：

本申请的细胞产品的留样保存液各组分及浓度分别为：

柠檬酸钠，浓度为0.04M；

乙二胺四乙酸乙酯(EGTA)，浓度为0.5M；

Tris-醋酸盐，浓度为0.1M；

乙二胺四乙酸(EDTA)，浓度为0.1M；

环磷酸腺苷(cAMP)，浓度为0.4mM；

聚乙烯亚胺，浓度为50mg/mL；

氯化铵，浓度为8mg/mL；

聚乙烯醇(PVA)，浓度为7mg/mL；

蔗糖，浓度为0.05mM；

细胞色素C，浓度为0.05mM。

配制时，按照上述配方称量后，用超纯水定容；过滤灭菌后得到所述保存液，滤灭菌器孔径优选为0.1μm或0.22μm。

在相同的实验条件下，以口腔支原体为阳性样品和阴性样品作为对照，按照样品的体积等体积添加入本申请的留样保存液，含有留样保存液的留样样品后续的保存步骤如下：在4℃条件下过夜渗透，后放入﹣20℃或﹣80℃保存30d。冻存后的留样样品解冻后可直接进行支原体的常规PCR核酸检测。

图2示出了利用本申请的留样保存液对留样样品保存30d前后，支原体DNA电泳结果，阳性对照中的支原体DNA条带的位置和大小显著可见，样品1显示出与阳性对照条带处于处于同一水平线的荧光条带，样品2和样品3未显示任何条带。由此表明，经过本申请的留样保存液处理的含支原体的留样样品能够在低温条件保存30d之后保持支原体DNA的完整性，且不受交叉污染。

本实施例证明了本申请的留样保存液适用于低温条件的短时间保存，含有留样保存液的留样样品能够直接进行PCR扩增，之后进行电泳检测。

实施例3：

本申请的细胞产品的留样保存液各组分及浓度分别为：

柠檬酸钠，浓度为0.04M；

乙二胺四乙酸乙酯(EGTA)，浓度为0.5M；

Tris-醋酸盐，浓度为0.1M；

乙二胺四乙酸(EDTA)，浓度为0.1M；

环磷酸腺苷(cAMP)，浓度为0.4mM；

聚乙烯亚胺，浓度为50mg/mL；

氯化铵，浓度为8mg/mL；

聚乙烯醇(PVA),浓度为7mg/mL；

蔗糖，浓度为0.05mM；

细胞色素C，浓度为0.05mM。

配制时，按照上述配方称量后，用超纯水定容；过滤灭菌后得到所述保存液，滤灭菌器孔径优选为0.1μm或0.22μm。

收集样本：收集细胞治疗产品样品(包括细胞，上清和注射液等)，确保在操作过程中保持无菌环境，以避免污染。

加入留样保存液：按照样品的体积等体积添加入本申请的留样保存液，轻轻颠倒试管，使保存液和样本彻底混合，避免产生气泡，以确保留样保存液与留样样品充分混合。

保存：试管密封保存在室温条件，避免光照直射，存放3d。

检测：将含有留样保存液的留样样品直接进行支原体荧光检测。利用荧光试剂Hoechst33258标记细胞和支原体DNA，在紫外光(波长630nm)激发下产生黄绿色荧光。利用荧光显微镜观察支原体是否存在。正常细胞核区见边缘整齐清晰的荧光，胞质区无荧光。支原体污染细胞集中于胞质一级，可见荧光。荧光法的另一种方法是利用针对支原体的荧光标记抗体，与待检细胞孵育后，抗体与支原体结合，荧光显微镜下观察，支原体出现荧光亮点。

图3示出了利用本申请的留样保存液对留样样品室温保存3d后，支原体DNA荧光染色检测结果，荧光显微镜下支原体阳性细胞周围或细胞膜表面可见不规则的蓝色荧光小点和丝状点。无支原体的样品只见边缘清晰的细胞核荧光。

本实施例证明了本申请的留样保存液适用于常温条件的短时间保存，还可以直接进行支原体DNA的荧光检测。

综上所述，本申请的细胞产品的留样保存液，包括以下组分：柠檬酸钠，浓度为0.01-0.05M；乙二胺四乙酸乙酯，浓度为0.1-0.5M；Tris-醋酸盐，浓度为0.1-0.2M；乙二胺四乙酸，浓度为1-5mM；环磷酸腺苷，浓度为0.2-0.5mM；聚乙烯亚胺，浓度为20-100mg/mL；氯化铵，浓度为5-10mg/mL；聚乙烯醇，浓度为5-10mg/mL；蔗糖，浓度为0.01-0.05mM；细胞色素C，浓度为0.01-0.05mM。本申请的细胞产品的留样保存液，没有使用会干扰DNA检测的成分，含有留样保存液的细胞产品可直接作为检测样品，简化检测过程。

上述实施例为本申请较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种细胞产品的留样保存液，其特征在于，其包括以下组分：

柠檬酸钠，浓度为0.01-0.05M；

乙二胺四乙酸乙酯，浓度为0.1-0.5M；

Tris-醋酸盐，浓度为0.1-0.2M；

乙二胺四乙酸，浓度为1-5mM；

环磷酸腺苷，浓度为0.2-0.5mM；

聚乙烯亚胺，浓度为20-100mg/mL；

氯化铵，浓度为5-10mg/mL；

聚乙烯醇，浓度为5-10mg/mL；

蔗糖，浓度为0.01-0.05mM；

细胞色素C，浓度为0.01-0.05mM。

2.如权利要求1所述的细胞产品的留样保存液，其特征在于，所述留样保存液适用于常温条件。

3.如权利要求1所述的细胞产品的留样保存液，其特征在于，所述留样保存液适用于低温条件，低温保存之前需利用所述留样保存液对留样的细胞产品进行4℃过夜渗透。

4.如权利要求1所述的细胞产品的留样保存液，其特征在于，所述细胞产品包括以下至少一项：细胞培养物、细胞制剂、细胞上清液、细胞培养废液或血液。

5.如权利要求1所述的细胞产品的留样保存液，其特征在于，所述细胞产品包括干细胞产品、免疫细胞产品或体细胞产品。

6.如权利要求1所述的细胞产品的留样保存液，其特征在于，所述留样保存液与留样的细胞产品等体积混合以实现保存。

7.如权利要求1所述的细胞产品的留样保存液，其特征在于，所述留样保存液能够保持细胞产品内支原体和细菌的DNA完整性。

8.如权利要求7所述的细胞产品的留样保存液，其特征在于，混合了所述留样保存液的细胞产品适用于分别针对支原体和细菌进行定性分析或定量分析。

9.如权利要求8所述的细胞产品的留样保存液，其特征在于，混合了所述留样保存液的细胞产品适用于进行定量PCR检测、琼脂糖电泳检测或荧光检测。