ES2438989T3

ES2438989T3 - Dispositivos, sistemas y métodos accionadores de gotitas

Info

Publication number: ES2438989T3
Application number: ES09747457.1T
Authority: ES
Inventors: Michael Pollack; Zhishan Hua; Allen Eckhardt; Prasanna Thwar; Vijay Srinivasan; Vamsee Pamula
Original assignee: Advanced Liquid Logic Inc
Current assignee: Advanced Liquid Logic Inc
Priority date: 2008-05-13
Filing date: 2009-05-13
Publication date: 2014-01-21
Anticipated expiration: 2029-05-13
Also published as: US8137917B2; US20110256542A9; EP2279405A2; US8088578B2; EP2672260A1; US20100221713A1; EP2279405A4; DK2279405T3; US20090311713A1; EP2279405B1; JP5592355B2; EP2672259A1; JP2011520449A; WO2009140373A3; WO2009140373A2

Abstract

Un método de preparación de una muestra para análisis, el método comprende: (a) proporcionar un accionador de gotitas (4700) que comprende: (i) un sustrato de operaciones con gotitas (4710); (ii) electrodos (4720) dispuestos para llevar a cabo operaciones con gotitas en una superficie de operacionescon gotitas del sustrato de operaciones con gotitas (4710); (iii) un sustrato superior (4714) que es una cubierta adyacente a la superficie de operaciones con gotitas yseparada de la superficie de operaciones con gotitas para formar un espacio de operaciones con gotitas(4716) entre la superficie de operaciones con gotitas y la cubierta; (iv) un reservorio (4730) asociado con el sustrato superior (4714) y que contiene perlas magnéticamentesensibles (4734) que tienen una afinidad por uno o más analitos diana (4754) y/o sustancias que comprendenuno o más analitos diana (4754); (v) una ruta de líquido que se extiende desde el reservorio (4730) en el espacio de operaciones con gotitas(4716); (vi) una fuente de campo magnético (4740) asociada con el sustrato de operaciones con gotitas (4710) yconfigurada para producir un campo magnético suficiente para atraer las perlas magnéticamente sensibles(4734); (b) suministrar un fluido de muestra (4752) en el reservorio, la muestra comprende potencialmente uno o más delos analitos y/o sustancias diana (4754); (c) hacer fluir el fluido de muestra (4752) que comprende las perlas magnéticas (4734) a través de la ruta delíquido en el espacio de operaciones con gotitas (4716); (d) agregar las perlas magnéticas (4734) en la fuente de campo magnético (4740); (e) retirar el campo magnético o retirar las perlas (4734) del campo magnético para dar una gotita en el espaciode operaciones con gotitas (4716) que comprende perlas magnéticas (4734).

Description

Dispositivos, sistemas y métodos accionadores de gotitas

1 Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica prioridad para las solicitudes de patente de EE.UU. siguientes: 61/108.880, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 28 de octubre de 2008; 61/115.654, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 18 de noviembre de 2008; 61/153.598, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 18 de febrero de 2009; 61/052.885, titulada "Reducing Droplet Cross-contamination in a Droplet Actuator", presentada el 13 de mayo de 2008; 61/098.860, titulada "Reducing Droplet Cross-contamination in a Droplet Actuator", presentada el 22 de septiembre de 2008; 61/160.607, titulada "Reducing Droplet Crosscontamination in a Droplet Actuator", presentada el 16 de marzo de 2009; 61/103.332, titulada "Nucleic Acid Handling on a Droplet Actuator", presentada el 7 de octubre de 2008; 61/141.820, titulada "Sample Preparation and Assay Execution on a Droplet Actuator", presentada el 31 de diciembre de 2008.

2 Interés gubernamental

La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo AI065169-01 y AI066590-02 concedido por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

La declaración anterior con respecto al apoyo del gobierno bajo AI065169-01 se aplica solamente a aquellos aspectos de la invención descritos y reivindicados en la presente solicitud que surjan de las solicitudes de patente de EE.UU. nº 61/108.880, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 28 de octubre de 2008; 61/115.654, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 18 de noviembre de 2008; 61/153.598, titulada "Droplet Thermal Cycling Techniques", presentada el 18 de febrero de 2009; y con respecto al apoyo del gobierno bajo AI066590-02 se aplica solamente a aquellos aspectos de la invención descritos y reivindicados en la presente solicitud que surjan de las solicitudes de patente de EE.UU. nº 61/103.332, titulada "Nucleic Acid Handling on a Droplet Actuator", presentada el 7 de octubre de 2008; 61/141.820, titulada "Sample Preparation and Assay Execution on a Droplet Actuator", presentada el 31 de diciembre de 2008.

3. Antecedentes

Los accionadores de gotitas se usan para llevar a cabo una gran variedad de operaciones con gotitas. Un accionador de gotitas incluye por regla general dos sustratos separados por un espacio de operaciones con gotitas. Los sustratos incluyen electrodos para llevar a cabo operaciones con gotitas. El espacio de operaciones con gotitas entre los sustratos se rellena generalmente con un fluido de carga líquido que es inmiscible con el fluido que se somete a las operaciones con gotitas. Las operaciones con gotitas se controlan mediante electrodos asociados con uno o ambos sustratos. Los componentes de las gotitas pueden en algunos casos salir de las gotitas hacia el fluido de carga. Desde el fluido de carga, dichos componentes pueden contaminar otras gotitas. La invención se refiere a ciertas técnicas novedosas para reducir o eliminar el movimiento de contaminantes desde una gotita a otra en un accionador de gotitas a través del fluido de carga líquido. En una aplicación, los accionadores de gotitas se usan para llevar a cabo análisis genéticos usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Existe la necesidad de métodos mejorados de realización de PCR en un accionador de gotitas que proporcionen amplificación y detección óptimas de una muestra diana.

4. Breve descripción de la invención

La invención proporciona un método para amplificar y/o detectar un ácido nucleico diana en una muestra. El método puede incluir proporcionar un conjunto de gotitas de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos. Cada gotita puede incluir una parte de la muestra. El método puede incluir tratar dos o más subconjuntos de gotitas de la reacción de amplificación bajo condiciones de amplificación del ácido nucleico diana para proporcionar los correspondientes subconjuntos de gotitas amplificadas con el ácido nucleico amplificado. Cada subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación puede incluir una o más de las gotitas de reacción de amplificación. Cada subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación se puede tratar bajo diferentes condiciones para amplificar el ácido nucleico diana. El método puede incluir preparar las gotitas amplificadas para detección. El método puede incluir detectar una señal procedente de las gotitas amplificadas. El método puede incluir también determinar la cantidad y/o la identidad del ácido nucleico amplificado presente en las gotitas amplificadas y/o en la muestra. Proporcionar un conjunto de gotitas de la reacción de amplificación del ácido nucleico puede incluir dispensar el conjunto de gotitas de amplificación del ácido nucleico desde una gotita de muestra. La gotita de muestra se puede proporcionar en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas, y la dispensación puede ser mediada por un electrodo. La gotita de muestra se puede proporcionar en un reservorio de un accionador de gotitas. El accionador de gotitas puede incluir una ruta del líquido desde el reservorio hasta el espacio de operaciones con gotitas. La dispensación del conjunto de gotitas de amplificación del ácido nucleico puede incluir hacer fluir la gotitas de muestra a través de la ruta de líquido hacia el espacio de operaciones con gotitas, y usar electrodos para dispensar las gotitas de la reacción de amplificación en el espacio de operaciones con gotitas. Proporcionar un

conjunto de gotitas de la reacción de amplificación del ácido nucleico puede incluir proporcionar una gotita de muestra; dividir la gotita de muestra en múltiples subgotitas de muestra, y combinar cada una de las subgotitas de muestra con una o más gotitas puede incluir reactivos de amplificación para proporcionar las gotitas de la reacción de amplificación. Una o varias de las etapas de los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas que usa operaciones con gotitas mediadas por electrodos. Una o varias de las etapas de los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar usando operaciones con gotitas mediadas por electrodos. La gotita de muestra, las múltiples subgotitas y la una o varias gotitas pueden incluir reactivos de amplificación. Las gotitas de la reacción de amplificación se pueden colocar en el espacio de operaciones con gotitas, y se pueden rodear al menos parcialmente por un fluido de carga líquido. Proporcionar un conjunto de gotitas de la reacción de amplificación del ácido nucleico puede incluir: proporcionar una gotita de muestra; combinar la gotita de muestra con uno o varias gotitas puede incluir reactivos de amplificación para proporcionar una gotita preparada para la amplificación; y dividir la gotita preparada para la amplificación para proporcionar las gotitas de la reacción de amplificación. La gotita de muestra, las una o varias gotitas pueden incluir reactivos de amplificación, la gotita de la reacción de amplificación precursora, y las gotitas de la reacción de amplificación se pueden colocar en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas; y rodearse al menos parcialmente con un fluido de carga líquido. El método puede incluir tratar la gotita preparada para la amplificación bajo condiciones seleccionadas para proporcionar suficiente ácido nucleico amplificado en la gotita preparada para la amplificación para asegurar que cada gotita de la reacción de amplificación incluirá ácido nucleico diana si el ácido nucleico diana puede estar presente en la muestra. Tratar la gotita preparada para la amplificación puede incluir ciclado térmico de la gotita preparada para la amplificación durante 1-50 ciclos, 1-40 ciclos, 1-30 ciclos, 1-20 ciclos, o 1-10 ciclos, o 1-5 ciclos. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir ciclar las gotitas de la reacción de amplificación entre dos o más zonas térmicas transportando las gotitas a lo largo de una pluralidad de rutas de electrodos en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir ciclar subconjuntos de dos o más de las gotitas de la reacción de amplificación entre dos o más zonas térmicas transportando gotitas en cada subconjunto a lo largo de una ruta de electrodos común en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas. En algunos casos, la una o varias rutas de electrodos establecen una o más rutas bucle entre las dos o más zonas térmicas. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir transportar múltiples gotitas de la reacción de amplificación de una a otra ruta bucle de electrodos. El método puede incluir retirar cada gotita amplificada de la ruta bucle de electrodos cuando su número predeterminado de ciclos se ha completado. La retirada de cada gotita amplificada de la ruta bucle de electrodos puede incluir usar operaciones con gotitas mediadas por electrodos para transportar la gotita de la reacción de amplificación a otra zona del espacio de operaciones con gotitas. La zona del espacio de operaciones con gotitas puede incluir una zona de temperatura controlada que tiene una temperatura seleccionada para almacenar la gotita amplificada pendiente de detección. La retirada de cada gotita amplificada de la ruta bucle de electrodos puede incluir retirar cada gotita amplificada del espacio de operaciones con gotitas del accionador de gotitas. En otros casos, la ruta de electrodos serpentea entre dos o más zonas térmicas. El tiempo de transporte desde un electrodo en la ruta de electrodos a un electrodo adyacente en la ruta de electrodos puede ser básicamente uniforme para cada par de electrodos adyacentes, y el tiempo de residencia en una zona térmica se puede establecer por el número de electrodos en cada vuelta de la ruta de electrodos presente en la zona térmica. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir transportar en paralelo dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación entre zonas térmicas. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir secuencialmente transportar dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación a una zona térmica. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir transportar un primer subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación a una primera zona térmica mientras se transporta un segundo subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación a una segunda zona térmica, y transportar el primer subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación a la segunda zona térmica mientras se transporta el segundo subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación a la primera zona térmica. El subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación ciclado térmicamente de forma secuencial se puede ciclar térmicamente a lo largo de una ruta de electrodos común. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir amplificar dos o más subconjuntos en paralelo. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir el ciclado térmico térmicamente sincronizado para todas las gotitas de la reacción de amplificación. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir ciclado térmico que puede ser térmicamente no sincronizado para todas las gotitas de la reacción de amplificación. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana se puede realizar calentando y enfriando una zona de ciclado térmico de un accionador de gotitas. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana puede incluir variar los tiempos de residencia de las gotitas de la reacción de amplificación en zonas térmicas en uno o más número de ciclos del ciclado térmico. El tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas

de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana se puede completar para todos lo subconjuntos de gotitas de la reacción de amplificación antes de detectar una señal procedente de las gotitas amplificadas. La detección de una señal desde las gotitas amplificadas se puede completar en algunos casos para un primer subconjunto de gotitas antes de tratar dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana para un segundo conjunto de gotitas. La preparación para la detección de las gotitas amplificadas puede incluir transportar separado un conjunto de dos o más gotitas amplificadas desde una región de ciclado térmico del accionador de gotitas o desde una zona de ciclado térmico antes de tratar dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana con respecto al conjunto de dos o más gotitas amplificadas. La gotita amplificada se puede transportar a la zona térmica que tiene una temperatura apropiada para detectar una señal procedente de las gotitas amplificadas. La preparación para la detección de las gotitas amplificadas puede incluir disponer separado en una matriz al menos un subconjunto de las gotitas amplificadas desde una zona de ciclado térmico antes de detectar una señal procedente de las gotitas amplificadas con respecto al cada uno de dichos subconjuntos de gotitas amplificadas dispuestas en una matriz. La preparación para la detección de las gotitas amplificadas puede incluir separar del ácido nucleico amplificado el reactivo de detección no unido. La preparación para la detección de las gotitas amplificadas puede incluir detener básicamente la amplificación en la gotita amplificada. La preparación para la detección de las gotitas amplificadas puede incluir transferir las gotitas amplificadas desde un accionador de gotitas a otro accionador de gotitas. La detención de la amplificación en la gotita amplificada puede incluir básicamente ajustar la temperatura de la gotita o básicamente detener la reacción de amplificación. Detener básicamente la amplificación en la gotita amplificada puede incluir añadir un reactivo a la gotita amplificada para básicamente detener la reacción de amplificación. La adición de un reactivo a la gotita amplificada puede incluir combinar la gotita amplificada con una gotita de reactivo, gotita de reactivo que puede incluir un reactivo seleccionado básicamente para parar la reacción de amplificación. El reactivo seleccionado para parar básicamente la reacción de amplificación puede incluir un reactivo que básicamente detiene la reacción de amplificación interfiriendo con la actividad de la polimerasa, interfiriendo con la actividad del cofactor de la polimerasa, uniéndose ácidos nucleicos, y/o liberando iones hierro. En ciertas realizaciones, las gotitas de la reacción de amplificación carecen de un reactivo de detección. La preparación para la detección de las gotitas amplificadas puede incluir la adición de un reactivo de detección a las gotitas amplificadas. La adición de un reactivo de detección a las gotitas amplificadas puede incluir combinar cada gotita amplificada con una gotita que incluye un reactivo de detección. La preparación para la detección de las gotitas amplificadas puede incluir combinar cada una de las gotitas amplificadas con una gotita que incluye uno o más reactivos de detección. La detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas puede incluir detectar la amplificación basada en una señal mediada por el reactivo de detección. La detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas puede incluir detectar una señal procedente de cada gotita amplificada a que sigue al transporte de dicha gotita a una ventana de detección. La detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas puede incluir transportar conjuntos de uno o más de los subconjuntos de gotitas amplificadas a una ventana de detección para detección. En ciertas realizaciones, el tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana se puede conseguir en un espacio de operaciones con gotitas de una accionador de gotitas; y la preparación de las gotitas amplificadas para la detección y/o la detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas se puede conseguir fuera del espacio de operaciones con gotitas. Así, la preparación para la detección de las gotitas amplificadas puede incluir transportar una o más de las gotitas amplificadas fuera del espacio de operaciones con gotitas para detección. La detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas se puede realizar en algunos casos en un reservorio exterior al espacio de operaciones con gotitas del accionador de gotitas. La preparación para la detección de las gotitas amplificadas incluye transportar subconjuntos de gotitas amplificadas a una ventana de detección empezando con subconjuntos de menor número de ciclos y continuando con subconjuntos de mayor número de ciclos. La detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas puede incluir el barrido de una matriz de gotitas amplificadas. La detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas puede incluir la formación de una imagen de una matriz de gotitas amplificadas. En ciertas realizaciones, el tratamiento de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana comienzan en paralelo para múltiples subconjuntos; la preparación para la detección de las gotitas amplificadas comienza en serie, cada subconjunto empieza después del comienzo de un subconjunto previo; la detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas comienza en serie, cada subconjunto empieza después del comienzo del subconjunto previo. En algunos casos, la preparación para la detección de las gotitas amplificadas comienza en serie, cada subconjunto empieza después de completarse un subconjunto previo. En algunos casos, la detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas comienza en serie, cada subconjunto empieza después de completarse un subconjunto anterior. En algunos casos, la detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas se consigue usando un dispositivo formador de imágenes que realiza un seguimiento de las gotitas y mide la señal de las gotitas según se mueven a través del campo del dispositivo. En algunos casos, la preparación para la detección de las gotitas amplificadas comienza en paralelo, cada subconjunto empieza el proceso aproximadamente a la vez. En algunos casos, la detección de una señal procedente de las gotitas amplificadas comienza en paralelo, cada subconjunto comienza el proceso aproximadamente a la vez. El método puede incluir la determinación de la cantidad del ácido nucleico amplificado presente en las gotitas amplificadas determinando un aumento o disminución de la señal en un punto final de ciclado térmico para cada uno de los subconjuntos de gotitas amplificadas. La determinación de la cantidad del ácido nucleico amplificado presente en las gotitas amplificadas y/o en la muestra puede incluir usar la

cantidad de ácido nucleico amplificado presente en las gotitas amplificadas para determinar la cantidad del ácido nucleico diana presente en la gotita de muestra. La determinación de la cantidad del ácido nucleico amplificado presente en las gotitas amplificadas y/o en la muestra puede incluir usar la cantidad de ácido nucleico amplificado presente las gotitas amplificadas después de diferentes números de ciclado térmico para determinar la cantidad del ácido nucleico diana presente en la gotita de muestra. Las diferentes condiciones para amplificar el ácido nucleico diana pueden incluir diferentes números de ciclado térmico para cada subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación. Las gotitas de la reacción de amplificación pueden incluir un reactivo de detección. En otros casos, las gotitas de la reacción de amplificación pueden no incluir una cantidad significativa de un agente de reactivo de detección. La una o más gotitas que incluyen reactivos de amplificación pueden incluir adicionalmente un reactivo de detección. En otros casos, la una o más gotitas que incluyen reactivos de amplificación pueden no incluir una cantidad significativa de un reactivo de detección. El reactivo de detección puede incluir un agente de unión a ácido nucleico. El agente de unión a ácido nucleico puede, en algunos casos, inhibir significativamente la tasa de amplificación del ácido nucleico. El agente de unión a ácido nucleico puede incluir un agente de intercalado. El agente de intercalado puede incluir un tinte fluorescente. El ácido nucleico diana puede ser indicativo de un trastorno genético o enfermedad infecciosa. El ácido nucleico diana puede ser indicativo de identificación de un individuo o subgrupo de individuos de una población biológica. En algunas realizaciones, una o más de las gotitas de la reacción de amplificación del ácido nucleico pueden someterse a una etapa inicial de detección antes de tratarse dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana, y la determinación de la cantidad del ácido nucleico diana presente en las gotitas amplificadas y/o en la muestra puede incluir una comparación entre la señal detectada en la etapa inicial de detección y la señal detectada procedente de las gotitas amplificadas. El método de detección de un ácido nucleico diana en una muestra puede incluir detener el método cuando se han recogido datos suficientes para cuantificar el ácido nucleico diana presente en la muestran de partida dentro de un intervalo predeterminado de certeza estadística. El método puede incluir seleccionar un primer conjunto de números de ciclos que se espera proporcionen datos suficientes para determinar la cantidad del ácido nucleico amplificado presente en las gotitas amplificadas y/o o en la muestra, para cada uno de los números de ciclos seleccionados; someter un subconjunto de una o más gotitas de la reacción de amplificación a la amplificación, preparar, detectar, y determinar las etapas; y determinar si se han recogido datos suficientes para identificar o cuantificar el ácido nucleico diana presente en la muestran dentro de un intervalo predeterminado de certezas estadística. Las etapas se pueden repetir con nuevos conjuntos de números de ciclos hasta que se hayan recogido datos suficientes para identificar o cuantificar el ácido nucleico diana presente en la muestra de partida dentro de un intervalo predeterminado de certeza estadística, o hasta que se hayan recogido datos suficientes para determinar dentro de un intervalo predeterminado de certeza estadística que el ácido nucleico diana puede no estar presente en la muestra. La determinación de si se han recogido datos suficientes puede incluir determinar si se han recogido datos suficientes para identificar el ácido nucleico diana presente en la muestra dentro de un intervalo predeterminado de certeza estadística. La determinación de si se han recogido datos suficientes puede incluir determinar si se han recogido datos suficientes para cuantificar el ácido nucleico diana presente en la muestra dentro de un intervalo predeterminado de certeza estadística.

La invención proporciona un método para vigilar el aumento de ácido nucleico diana en una muestra. El método puede incluir proporcionar un conjunto de gotitas de la reacción de amplificación del ácido nucleico, cada gotita incluye una parte de la muestra. El método puede incluir ciclado térmico de dos o más subconjuntos de las gotitas de la reacción de amplificación en condiciones de amplificación del ácido nucleico diana para proporcionar gotitas amplificadas con ácido nucleico de doble cadena amplificado. Cada subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación puede incluir una o más de las gotitas de la reacción de amplificación. Cada subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación se puede ciclar térmicamente durante un número diferente de ciclos. Cada subconjunto de las gotitas de la reacción de amplificación puede no someterse a detección antes de haberse completado un número de ciclos predeterminado para cada subconjunto. El método puede incluir la ejecución de un protocolo de preparación para detección, que puede incluir combinar cada una de las gotitas amplificadas con un reactivo de detección para detección del ácido nucleico amplificado para proporcionar gotitas preparadas para la detección. El método puede incluir la detección de una señal procedente de las gotitas preparadas para la detección. El método puede incluir determinar, en base a la señal, la presencia y/o cantidad del ácido nucleico amplificado presente en las gotitas amplificadas y/o en la muestra.

La invención proporciona un cartucho accionador de gotitas precargado. El cartucho accionador de gotitas precargado puede incluir uno o más sustratos que forman un espacio de operaciones con gotitas, y electrodos asociados con el uno o más sustratos y dispuestos para mediar en las operaciones con gotitas en el espacio de operaciones con gotitas. El cartucho accionador de gotitas precargado puede incluir un primer reservorio que incluye una o más gotitas que incluyen reactivos de amplificación y que carecen de reactivos de detección, y un segundo reservorio que incluye uno o más reactivos de detección. El cartucho accionador de gotitas precargado puede incluir una o más rutas fluidas que conectan de forma fluida el primer reservorio y el segundo reservorio con el espacio de operaciones con gotitas. Por ejemplo, el cartucho accionador de gotitas precargado puede incluir una ruta fluida que conecta de forma fluida el primer reservorio con el espacio de operaciones con gotitas. De forma similar, el cartucho accionador de gotitas precargado puede incluir una ruta fluida que conecta de forma fluida el segundo reservorio con el espacio de operaciones con gotitas. El cartucho accionador de gotitas precargado puede incluir medios para cargar una muestra en el espacio de operaciones con gotitas. Los medios para cargar una muestra en el espacio de operaciones con gotitas pueden incluir, por ejemplo, un reservorio de carga demuestra y una ruta fluida que conecta

de forma fluida el reservorio de carga de muestra con el espacio de operaciones con gotitas. La invención proporciona un kit que incluye el cartucho accionador de gotitas precargado. El kit puede incluir también software para la ejecución de un protocolo de amplificación que usa el cartucho. Cualquiera de las realizaciones físicas de la invención se puede incluir en dicho kit que incluye la realización física y el software para controlar la realización física.

La invención proporciona un método para detectar un analito. El método puede incluir proporcionar una gotita en una ventana de detección. La gotita puede incluir una sustancia productora de señal indicativa de la presencia y/o cantidad de un analito. La gotita puede incluir una o más perlas con magnéticamente sensibles que pueden interferir con la señal producida por la sustancia productora de señal. El método puede incluir usar un campo magnético para retirar magnéticamente las perlas magnéticamente sensibles de la ventana de detección, y/o impedir magnéticamente la entrada de las perlas magnéticamente sensibles en la ventana de detección mientras se transporta y/o retiene la gotita en la ventana de detección. El método puede incluir detectar una señal producida por la sustancia productora de señal sin interferencias sustanciales de las perlas magnéticamente sensibles. De forma similar, la invención proporciona un método para detectar un analito, que incluye proporcionar una gotita en una ventana de detección, en la que la gotita incluye una sustancia productora de señal indicativa de la presencia y/o cantidad de un analito y una o más perlas que sustancialmente no son magnéticamente sensibles, y que pueden interferir con la señal producida por la sustancia productora de señal. El método puede incluir usar una barrera física para impedir la entrada de las perlas a la ventana de detección mientras se transporta y/o retiene la gotita en la ventana de detección. El método puede incluir detectar una señal producida por la sustancia productora de señal sin interferencias sustanciales de las perlas. Se apreciará que este planteamiento de barrera física se puede usar independientemente de que las perlas sean o no magnéticamente sensibles. En estos métodos de detección de un analito, se puede proporcionar la gotita en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas. La ventana de detección puede incluir una abertura o ventana en un sustrato del accionador de gotitas. Con respecto a la realización que hace uso de perlas sustancialmente no magnéticamente sensibles, el uso de un campo magnético puede incluir proporcionar un imán fijado en las cercanías de la ventana de detección. El transporte de la gotita a la ventana de detección puede suministrar las perlas magnéticamente sensibles con proximidad suficiente al imán fijo para que las perlas pueden ser empujadas lejos de la ventana de detección y/o impedida su entrada en ella. Con respecto a la realización que hace uso de barrera física, el transporte de la gotita a la ventana de detección se puede conseguir mientras se impide la progresión de las perlas hacia la ventana de detección mediante una barrera física. Este impedimento de entrada de las perlas en la ventana de detección se puede conseguir con o sin retirada de las perlas magnéticamente sensibles de la gotita. En estas y otras realizaciones de la invención que hacen uso de un campo magnético, el campo magnético se puede generar mediante cualquier fuente de campo magnético adecuada. Por ejemplo, la fuente del campo magnético puede incluir un imán permanente fijo, un imán permanente movible, y/o un electroimán. El campo magnético se puede disponer para agregar las perlas magnéticamente sensibles en un borde de la gotita. El campo magnético se puede disponer para agregar las perlas magnéticamente sensibles en una zona de la gotita que puede estar fuera de la ventana de detección. En algunos casos, el campo magnético se selecciona para romper la unión de las perlas magnéticamente sensibles con la gotita. Por ejemplo, el campo magnético puede romper la unión de las perlas magnéticamente sensibles con la gotita mientras se mantiene la gotita en su sitio y/o se mueve mediante fuerzas mediadas por electrodos. En algunos casos, el campo magnético atrae las perlas magnéticamente sensibles de forma que las empuja hacía un borde de la gotita mientras la gotita está al menos parcialmente en la ventana de detección. En algunos casos, el campo magnético empuja las perlas magnéticamente sensibles fuera de la gotita cuando la gotita pasa sobre el imán. En algunos casos, el campo magnético empuja las perlas magnéticamente sensibles fuera de la gotita cuando la gotita se acerca a las cercanías del imán. En algunos casos, el campo magnético empuja las perlas magnéticamente sensibles fuera de la gotita cuando la gotita se acerca a la ventana de detección. En algunos casos, el campo magnético atrae las perlas magnéticamente sensibles de forma que restringe sustancialmente la entrada o la reentrada de todas las perlas en la ventana de detección cuando la gotita puede ser transportada a la ventana de detección. La ventana de detección se puede proporcionar en un sustrato de un dispositivo accionador de gotitas. El accionador de gotitas puede incluir, por ejemplo, una pluralidad de rutas de electrodos asociados con el sustrato de operaciones con gotitas, cada ruta asociada con una ventana de detección, y un campo magnético en las cercanías de la ruta dispuesto para retirar magnéticamente las perlas magnéticamente sensibles de la correspondiente ventana de detección, y/o impedir magnéticamente la entrada de las perlas magnéticamente sensibles en la correspondiente ventana de detección mientras se transporta la gotita a la ventana de detección y/o se retiene en ella. La gotita puede emitir una señal indicativa de la presencia, ausencia y/o cantidad de uno más analitos. Por ejemplo, el uno o más analitos pueden incluir ácido nucleico amplificado. La ventana de detección puede estar localizada en un sustrato de un accionador de gotitas, y el accionador de gotitas puede incluir zonas de control de temperatura a lo largo de la ruta de electrodos para llevar a cabo una reacción de ciclado térmico. El método que usa dicho accionador de gotitas puede incluir ciclar térmicamente una gotita preparada para la amplificación para dar una gotita amplificada, y transportar la gotita amplificada a la ventana de detección. El método puede incluir transportar una gotita que puede incluir perlas magnéticamente sensibles a lo largo de la ruta de electrodos a la ruta de electrodos al menos parcialmente en la ventana de detección tras uno o más de los ciclados térmicos.

La invención también proporciona un método para el ciclado térmico de una gotita. El método puede incluir proporcionar una gotita rodeada al menos parcialmente por un fluido de carga. La gotita puede incluir potencialmente un ácido nucleico diana. La gotita puede incluir reactivos suficientes para causar amplificación en presencia del

ácido nucleico diana, los reactivos pueden incluir un fluoróforo que no se reparte significativamente en el fluido de carga durante la ejecución de un protocolo de ciclado térmico. El método puede incluir ajustar la temperatura de la gotita conforme a un protocolo de ciclado térmico para inducir amplificación en presencia del ácido nucleico diana. El fluoróforo puede incluir un fluoróforo polar. El fluoróforo puede ser sustancialmente impermeable para las membranas celulares. El fluoróforo puede ser completamente impermeable para las membranas celulares. El fluoróforo puede incluir el fluoróforo EVAGREEN®. El fluoróforo puede incluir el fluoróforo TOPRO1. El fluido de carga puede consistir esencialmente en aceite de silicona, opcionalmente dopado con uno o más aditivos. El fluido de carga puede consistir esencialmente en un aceite de 10 a 20 átomos de carbono, opcionalmente dopado con uno

o más aditivos. El fluido de carga puede consistir esencialmente en un aceite de 15 a 20 átomos de carbono, opcionalmente dopado con uno o más aditivos. El fluido de carga puede consistir esencialmente en aceite hexadecano, opcionalmente dopado con uno o más aditivos. El fluido de carga puede consistir esencialmente en aceite sustancialmente desgasificado, opcionalmente dopado con uno más aditivos. Proporcionar una gotita puede incluir proporcionar una gotita en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas. Ajustar la temperatura de la gotita conforme a un protocolo de ciclado térmico puede incluir calentar y/o enfriar la gotita en el espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas. Ajustar la temperatura de la gotita conforme a un protocolo de ciclado térmico puede incluir transportar la gotita entre zonas térmicas en el espacio de operaciones con gotitas usando operaciones con gotitas mediadas por electrodos.

La invención puede incluir un método para ejecutar un protocolo en un accionador de gotitas. El método puede incluir tratar una o más regiones del accionador de gotitas llevando a cabo operaciones con gotitas en uno o más electrodos dentro de las regiones con una gotita, puede incluir un agente de pasivación, y llevar a cabo el protocolo usando una o más de las regiones del accionador de gotitas tratadas. El protocolo puede incluir etapas en el análisis de un ácido nucleico diana, y el agente de pasivación puede incluir un ácido nucleico que puede no ser el ácido nucleico diana. El protocolo puede incluir un protocolo de amplificación del ácido nucleico. El protocolo puede incluir un protocolo de ciclado térmico. Por mencionar algunos ejemplos, el agente de pasivación puede incluir un ácido nucleico, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, un tensioactivo, un tampón, una albúmina, una albúmina sérica, albúmina sérica bovina, y/o un tinte. El agente de pasivación se puede seleccionar para absorberse sobre una superficie del accionador de gotitas. El agente de pasivación se puede seleccionar para absorberse en fluido de carga. La una o más gotitas pueden suministrar suficiente agente de pasivación para saturar los potenciales sitios de pasivación. El protocolo se puede llevar a cabo usando una gotita que incluye el reactivo de pasivación. Como un ejemplo, el protocolo puede incluir un protocolo de amplificación del ácido nucleico. El protocolo de amplificación del ácido nucleico y las etapas que trata se pueden llevar a cabo simultáneamente usando una gotita que incluye reactivos de amplificación del ácido nucleico y el agente de pasivación.

La invención también proporciona un accionador de gotitas para llevar a cabo operaciones con gotitas a temperaturas elevadas. El accionador de gotitas puede incluir un sustrato de operaciones con gotitas y una cobertura adyacente a la superficie de operaciones con gotitas y separada de la superficie de operaciones con gotitas para formar un espacio de operaciones con gotitas entre la superficie de operaciones con gotitas y la cobertura, el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura de al menos 250 μm. El accionador de gotitas puede incluir una ruta de electrodos asociada con el sustrato de operaciones con gotitas y/o la cobertura y dispuesto para transportar una gotita entre zonas térmicas conforme a un protocolo de ciclado térmico. El accionador de gotitas puede incluir elementos de control de la temperatura dispuestos para establecer una o más zonas térmicas en el espacio de operaciones con gotitas. En algunos casos, el espacio de operaciones con gotitas puede tener una altura seleccionada para volver de forma sustancialmente esférica una gotita de tamaño unitario. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, puede tener una altura en el intervalo de aproximadamente 250 μm a aproximadamente 500 μm, o de aproximadamente 275 μm a aproximadamente 450 μm, o de aproximadamente 300 μm a aproximadamente 400 μm, o de aproximadamente 320 μm a aproximadamente 375 μm, o de aproximadamente 320 μm a aproximadamente 350 μm. En ciertas realizaciones, los electrodos pueden tener una separación, y el espacio de operaciones con gotitas puede tener una altura que establece una relación separación:altura en el intervalo de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 2,8:1, o de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 3:1, o de aproximadamente 4,3:1 a aproximadamente 3,4:1. En ciertas realizaciones, el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura seleccionada para mantener la pérdida de volumen de una gotita que experimenta un protocolo de ciclado térmico en menos de 5% para un protocolo de ciclado térmico completo, o en menos de 1% para un protocolo de ciclado térmico completo, o en menos de 0,01% para un protocolo de ciclado térmico completo. En ciertas realizaciones, el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura seleccionada para mantener la pérdida de volumen de una gotita que experimenta un protocolo de ciclado térmico en menos de 0,1% por ciclado térmico, o en menos de 0,01% por ciclado térmico, o en menos de 0,001% por ciclado térmico. En algunos casos, el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura seleccionada para eliminar sustancialmente la pérdida de volumen durante un protocolo de ciclado térmico. La invención también proporciona un método para llevar a cabo una reacción de ciclado térmico, el método puede incluir proporcionar un accionador de gotitas de este aspecto de la invención; el transporte de una gotita puede incluir perlas magnéticamente sensibles a lo largo de la ruta de electrodos para la ruta de electrodos al menos parcialmente en la ventana de detección tal que el imán atrae las perlas magnéticamente sensibles de forma que restringe la entrada de una o más de las perlas en la ventana de detección; y el uso del sensor para detectar una señal procedente de la gotita.

La invención proporciona un método para preparar una muestra para análisis. El método puede incluir proporcionar

un accionador de gotitas que incluye un sustrato de operaciones con gotitas, electrodos dispuestos para llevar a cabo operaciones con gotitas en una superficie de operaciones con gotitas del sustrato, una cobertura adyacente a la superficie de operaciones con gotitas y separada de la superficie de operaciones con gotitas para formar un espacio de operaciones con gotitas entre la superficie de operaciones con gotitas y la cobertura, un reservorio asociado con el sustrato superior y puede incluir perlas que tienen una afinidad por uno o más analitos diana y/o sustancias pueden incluir uno o más analitos diana, una ruta líquida que se extiende desde el reservorio al espacio de operaciones con gotitas, y una fuente de campo magnético asociada con el sustrato de operaciones con gotitas y configurada para producir un campo magnético suficiente para atraer perlas magnéticamente sensibles. El método puede incluir suministrar una muestra en el reservorio. La muestra puede incluir una o más de las sustancias diana. El método puede incluir hacer fluir la muestra con las perlas magnéticamente sensibles a través de la ruta líquida en el espacio de operaciones con gotitas. El método puede incluir agregar las perlas magnéticamente sensibles en el imán. El método puede incluir retirar el campo magnético o retirar las perlas del campo magnético para dar una gotita de muestra en el espacio de operaciones con gotitas con perlas magnéticamente sensibles. En algunos casos, la ruta líquida puede ser una ruta líquida sustancialmente directa, tal como un agujero o abertura en un sustrato (en lugar de una ruta líquida más tortuosa). El imán puede tener una fuerza de campo magnético suficiente para atraer una o más perlas desde el reservorio en el espacio de operaciones con gotitas. El accionador de gotitas puede incluir un electrodo reservorio asociado con el sustrato de operaciones con gotitas y dispuesto para recibir el fluido que entra en el espacio de operaciones con gotitas a través de la ruta líquida. El imán se puede colocar en un lado opuesto al del electrodo reservorio con respecto a la ruta líquida. El imán puede ser cualquier elemento o combinación de elementos para generar un campo magnético adecuado, tal como un electroimán o un imán permanente. El imán se puede ajustar espacialmente. El imán se puede asociar con un campo magnético móvil capaz de bloquear o interferir con el campo magnético del imán permanente en el espacio de operaciones con gotitas en una primera posición, y no bloquear o interferir con el campo magnético del imán permanente en el espacio de operaciones con gotitas en una segunda posición. El accionador de gotitas puede incluir un agitador dispuesto para agitar un fluido muestra en el reservorio, y el método puede incluir agitar la muestra en el reservorio. El accionador de gotitas puede incluir un dispositivos de ultrasonidos dispuesto para aplicar energía sónica a un fluido muestra en el reservorio, y el método puede incluir sonicar la muestra en el reservorio. El accionador de gotitas puede incluir también un segundo imán asociado con uno o más de los electrodos. Las sustancias pueden incluir uno o más analitos diana por los que las perlas tengan afinidad. En una realización, el analito diana incluye células, y el método incluye el lisado de las células o su rotura de otra forma. Por ejemplo, el lisado de las células se puede conseguir añadiendo un reactivo de lisado a la gotita que incluye las células. Como un ejemplo, la adición de un reactivo del lisado puede incluir combinar la gotita de muestra en el espacio de operaciones con gotitas que incluye perlas magnéticamente sensibles, con una gotita de lisado que incluye un reactivo de lisado de células. La gotita combinada se puede sonicar o agitar de otra manera o sacudir para conseguir la mezcla. El método puede incluir en ocasiones volver aplicar el campo magnético para inmovilizar las perlas magnéticamente sensibles. El método puede incluir transportar la gotita lejos de las perlas magnéticamente sensibles inmovilizadas. El método puede incluir transportar una parte de la gotita lejos de las perlas magnéticamente sensibles. El método puede incluir combinar la gotita o parte de la gotita transportada lejos con una gotita que incluye perlas que tienen afinidad por uno o más analitos diana. El método puede incluir llevar a cabo un protocolo de lavado para lavar las perlas que tienen afinidad por el uno o más analitos diana para producir una gotita que tiene perlas con el analito diana sustancialmente purificado. El método puede incluir llevar a cabo un protocolo analítico que usa la gotita que tiene perlas con el analito diana sustancialmente purificado. La etapa de protocolo analítico se puede conseguir en el espacio de operaciones con gotitas o fuera del espacio de operaciones con gotitas. La etapa de protocolo analítico se puede conseguir en el accionador de gotitas, en otro accionador de gotitas o sin el uso de un accionador de gotitas. Por ejemplo, la gotita con perlas y el analito diana sustancialmente purificado se pueden retirar del espacio de operaciones con gotitas antes de llevar a cabo el protocolo analítico. El método puede incluir retirar las perlas con analito diana sustancialmente purificado del espacio de operaciones con gotitas. El método puede incluir eluir el uno

o más analitos diana de las perlas. La elución puede incluir combinar la gotita que incluye perlas con analitos diana sustancialmente purificado con una gotita que incluye un tampón de elución, lo que da una gotita con las perlas y el uno o más analitos diana eluidos. El método puede incluir retirar las perlas de la gotita con las perlas y el uno o más analitos diana eluidos para dar una gotita con analito diana sustancialmente purificado y que carece sustancialmente de perlas. La retirada puede realizarse, por ejemplo, usando un campo magnético y/o una barrera física. El método puede incluir retirar la gotita con analito diana sustancialmente purificado y que carece sustancialmente de perlas, del espacio de operaciones con gotitas. El método puede incluir llevar a cabo un protocolo analítico usando la gotita con analito diana sustancialmente purificado y que carecen de sustancialmente de perlas. El protocolo se puede realizar con o sin el accionador de gotitas, dentro o fuera del espacio de operaciones con gotitas. Cualquiera de los protocolos de ensayo descritos en la presente invención puede incluir proporcionar una salida de datos indicativos de los resultados del protocolo analítico. Una o más de las etapas del método se pueden ejecutar mediante un sistema que incluye el accionador de gotitas y un procesador programado para ejecutar la una o más etapas del método. El método puede incluir una salida de datos legible por el usuario, indicativa de los resultados del protocolo analítico. El analito diana puede incluir un ácido nucleico, proteína o péptido, anticuerpo, molécula orgánica pequeña, etc. El espacio de operaciones con gotitas se puede rellenar con un fluido de carga líquido.

La invención proporciona un método de manejo de un accionador de gotitas. El método puede incluir proporcionar un dispositivo accionador de gotitas con uno más sustratos configurados para formar un espacio de operaciones con

gotitas interior. El método puede incluir proporcionar un fluido de carga líquido en el espacio de operaciones con gotitas. El método puede incluir ejecutar un protocolo con gotitas en el fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas. El método puede incluir sustituir el fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas. Una vez que el fluido de carga se ha sustituido, el método puede incluir ejecutar otro protocolo con gotitas en el fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas. La invención proporciona múltiples protocolos con gotitas para ejecutarse en un accionador de gotitas común con sustitución del fluido de carga entre ejemplos de ejecuciones de protocolos con gotitas. Así, por ejemplo, la invención puede incluir un patrón de uso llenado-ejecución-rellenado, en el que la ejecución-rellenado se repite numerosas veces, por ejemplo, 2, 5, 10, 20, 50, 100 o más veces. De forma similar, la invención puede incluir un patrón de uso llenado-ejecución-ejecución-rellenado, en el que la ejecuciónejecución-rellenado se repite numerosas veces, por ejemplo, 2, 5, 10, 20, 50, 100 o más veces. La sustitución del fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas puede incluir purgar el fluido de carga a través del espacio de operaciones con gotitas. La purga del fluido de carga a través del espacio de operaciones con gotitas puede continuar hasta que se ha conseguido una cantidad de purga predeterminada. La pulga del fluido de carga a través del espacio de operaciones con gotitas puede continuar hasta que un indicador de limpieza (por ejemplo, un contaminante medido en el fluido de carga retirado) alcanza un nivel predeterminado. Se puede automatizar la cantidad de purga. El protocolo con gotitas puede incluir, por ejemplo, un protocolo para medir la presencia y/o cantidad de un analito diana. Por ejemplo, el protocolo puede ser un protocolo de diagnóstico. Por nombrar algunos ejemplos específicos, el protocolo con gotitas puede ser un protocolo de amplificación del ácido nucleico, protocolo de secuenciación del ácido nucleico, protocolo de inmunoensayo, y/o un protocolo de ensayo enzimático. En algunas realizaciones, se puede analizar contaminación en el fluido de carga líquido durante la sustitución del fluido de carga, y se puede llevar a cabo la ejecución de otro protocolo después de que se haya conseguido un nivel predeterminado de reducción de la contaminación. Este proceso se puede automatizar. La sustitución del fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas puede incluir hacer fluir el fluido de carga líquido desde una fuente de fluido de carga líquido, a través del espacio de operaciones con gotitas, y fuera del espacio de operaciones con gotitas. La sustitución de fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas puede incluir hacer fluir un fluido de limpieza a través del espacio de operaciones con gotitas antes de sustituir el fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas. La sustitución del fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas puede incluir hacer fluir el fluido de carga a través del espacio de operaciones con gotitas antes de sustituir el fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas. La sustitución del fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas puede incluir hacer fluir líquido de limpieza caliente a través del espacio de operaciones con gotitas antes de sustituir el fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas. El líquido de limpieza caliente puede tener una temperatura que se selecciona para degradar un contaminante. Por ejemplo, en varias realizaciones, la temperatura está en el intervalo de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C, o de aproximadamente 60°C a aproximadamente 115°C, o de aproximadamente 75°C a aproximadamente 105°C, o mayor de aproximadamente 90°C, o mayor de aproximadamente 100ºC, o mayor de aproximadamente 125°C, o mayor de aproximadamente 150°C. La temperatura será por regla general menor que una temperatura a la que uno o más componentes del accionador de gotitas soportarían un daño indebido, es decir, un daño que volvería el accionador de gotitas no apto para su uso pretendido. Un líquido de enfriamiento, tal como un fluido de carga, se puede hacer fluir a través del espacio del accionador de gotitas para establecer una temperatura apropiada u operacional a continuación de la limpieza en caliente. El líquido de limpieza caliente puede incluir, por ejemplo, fluido de carga, un aceite, un disolvente, y/o un líquido de limpieza acuoso. El líquido de limpieza puede incluir un componente en el que puedan ser solubles sustancias lipófilas y un componente en el que puedan ser solubles sustancias hidrófilas. La sustitución del fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas puede incluir hacer fluir un gas a través del espacio del accionador de gotitas para secar el espacio del accionador de gotitas antes de sustituir el fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas. El gas puede incluir aire u otro gas. El gas puede calentarse o enfriarse, con respecto a la temperatura del líquido de limpieza. El gas puede tener, por ejemplo, una temperatura mayor de aproximadamente 50°C, mayor de aproximadamente 75°C, mayor de aproximadamente 100ºC, mayor de aproximadamente 125°C o mayor de aproximadamente 150°C. La temperatura será por regla general menor que una temperatura a la que uno o más componentes del accionador de gotitas soportarían un daño indebido, es decir, un daño que volvería en accionador de gotitas no apto para su uso pretendido. La sustitución del fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas puede incluir hacer fluir un líquido de limpieza a través del espacio del accionador de gotitas antes de hacer fluir el gas a través del espacio del accionador de gotitas. La sustitución del fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas puede incluir sustituir al menos aproximadamente 50% del fluido de carga presente en el espacio de operaciones con gotitas, o al menos aproximadamente 75% del fluido de carga presente en el espacio de operaciones con gotitas, o al menos aproximadamente 90% del fluido de carga presente en el espacio de operaciones con gotitas, o al menos aproximadamente 95% del fluido de carga presente en el espacio de operaciones con gotitas, o al menos aproximadamente 99% del fluido de carga presente en el espacio de operaciones con gotitas, o al menos aproximadamente 99,9% del fluido de carga presente en el espacio de operaciones con gotitas, o sustancialmente todo el fluido de carga presente en el espacio de operaciones con gotitas. Una o más superficies del espacio de operaciones con gotitas pueden incluir un recubrimiento, y el líquido de limpieza se puede seleccionar para retirar una capa del recubrimiento. La sustitución del fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas puede incluir hacer fluir un líquido de refrigeración a través del espacio de operaciones con gotitas para establecer una temperatura predeterminada antes de sustituir el fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas. El fluido de limpieza puede incluir un disolvente. El fluido de limpieza puede incluir una disolución acuosa. El fluido de carga puede incluir uno o más componentes que disuelvan compuestos

lipófilos y uno o más componentes que disuelvan compuestos hidrófilos. La invención proporciona un medio legible por ordenador con un programa que tiene instrucciones para llevar a cabo los métodos de sustitución de fluido de carga de la invención. La invención proporciona un sistema con un dispositivo accionador de gotitas que incluye uno más sustratos configurados para formar un espacio de operaciones con gotitas interior, una abertura en el espacio de operaciones con gotitas acoplada con fluidez a una fuente de fluido de carga líquido, una o más válvulas y/o bombas configuradas para controlar el flujo del fluido de carga desde la fuente de fluido de carga a través de la abertura y en el espacio de operaciones con gotitas, y un procesador que controla uno o más de las bombas y/o válvulas y programado para ejecutar cualquiera de los métodos de sustitución del fluido de carga y/o limpieza de la invención.

La invención proporciona un accionador de gotitas con uno más sus tratos que forman un espacio de operaciones con gotitas. El espacio de operaciones con gotitas puede incluir una ruta de ciclado térmico y una o más barreras que establecen al menos dos reservorios de control de temperatura unidos con fluidez por una ruta líquida, y electrodos asociados con uno o ambos sustratos y configurados para transportar una gotita entre los reservorios de control de temperatura. El accionador de gotitas puede incluir dos o más de tales rutas de ciclado térmico.

La invención proporciona un método para inhibir la contaminación cruzada entre gotitas en un accionador de gotitas. El método puede incluir proporcionar un accionador de gotitas con uno o más sustratos que forman un espacio de operaciones con gotitas, electrodos asociados con el uno o más sustratos que establecen una pluralidad de rutas de transporte de gotitas sustancialmente paralelas, y un fluido de carga líquido que rellena sustancialmente el espacio de operaciones con gotitas. El método puede incluir el transporte de múltiples gotitas de ensayo en un primer subconjunto de la pluralidad de rutas de transporte de gotitas sustancialmente paralelas. El método puede incluir el transporte de una o más gotitas tampón en un segundo subconjunto de la pluralidad de rutas de transporte de gotitas sustancialmente paralelas, cada ruta de transporte de gotitas del segundo subconjunto puede estar entre dos rutas de transporte de gotitas del primer subconjunto. El transporte de gotitas de ensayo y de gotitas de lavado se puede sincronizar. Se pueden proporcionar/transportar dos o más gotitas de lavado en cada ruta de transporte de gotitas del segundo subconjunto. Se puede proporcionar la gotita de lavado en forma de una gotita o de una gotita con forma de torpedo (gotita alargada). El método puede incluir transportar una o más gotitas tampón en las rutas de transporte de gotitas del primer subconjunto. El método puede incluir transportar una o más gotitas tampón en las rutas de transporte de gotitas del primer subconjunto. El método puede incluir transportar una o más gotitas tampón en las rutas de transporte de gotitas del primer subconjunto en un lado opuesto de la gotita de ensayo con respecto a la primera gotita de lavado. La gotita de ensayo puede incluir una gotita de amplificación del ácido nucleico. El método puede incluir el transporte de la gotita de ensayo entre dos zonas térmicas para realizar la amplificación.

La invención también proporciona un accionador de gotitas con uno más sustratos dispuestos para proporcionar un espacio de operaciones con gotitas, electrodos asociados con el uno o más sustratos que establece una pluralidad de rutas de transporte de gotitas sustancialmente paralelas, un fluido de carga líquido que rellena sustancialmente el espacio de operaciones con gotitas, y barreras entre cada una de las rutas de transporte de gotitas y que evita que el fluido de carga asociado con una ruta de operaciones con gotitas entre en contacto con el fluido de carga asociado con otras rutas de operaciones con gotitas. El accionador de gotitas puede incluir una gotita de ensayo en dos o más de las rutas de transporte de gotitas. La gotita de ensayo puede incluir reactivos y muestra para la amplificación del ácido nucleico.

La invención proporciona un método para reducir la contaminación cruzada entre gotitas en un accionador de gotitas. El método puede incluir proporcionar un accionador de gotitas puede incluir un espacio de operaciones con gotitas interior y un fluido de carga basado en aceite en el espacio de operaciones con gotitas, y proporcionar una gotita acuosa en el espacio de operaciones con gotitas. La gotita puede estar rodeada al menos parcialmente por el fluido de carga basado en aceite. La gotita puede incluir un complejo de tensioactivo-enzima, el complejo puede incluir un tensioactivo acoplado a una enzima seleccionada para degradar una sustancia potencialmente contaminante. Por proporcionar algunos ejemplos no limitantes de enzimas adecuadas: nucleasas, endonucleasas, exonucleasas, y/o proteasas. Con respecto al tensioactivo, se puede usar cualquier tensioactivo adecuado. Ejemplos incluyen tensioactivo de polialcaleno (PAG)-alquilo, tal como tensioactivos de polietileno (PEG)-alquilo. El complejo de tensioactivo-enzima puede incluir un complejo enzima-PAG-alquilo. El tensioactivo puede acoplarse, por ejemplo, en un resto amino de la enzima. El complejo de tensioactivo-enzima puede estar presente en la gotita en una cantidad que puede ser suficientemente baja para volverlo sustancialmente inactivo en la gotita y suficientemente alta para ser activo en una minigotita, microgotita, o nanogotita, que se pueden formar a partir de la gotita. En algunos casos, la cantidad se selecciona para actividad en minigotitas que tiene un volumen promedio que puede ser menor de aproximadamente 10 μL, o menor de aproximadamente 1 μL, o menor de aproximadamente 0,01 μL, o menor de aproximadamente 0,001 μL. En algunos casos, la relación de tamaño promedio de la gotita a tamaño promedio de la minigotita puede ser aproximadamente 1.000 a menos de aproximadamente 1, o aproximadamente

1.000 a menos de aproximadamente 0,1, o aproximadamente 1.000 a menos de aproximadamente 0,01, o aproximadamente 1.000 a menos de aproximadamente 0,001. La sustancia potencialmente contaminante puede incluir, por ejemplo, una proteína, un ácido nucleico, o un reactivo. En ciertas realizaciones, sustancialmente todos los complejos tensioactivo-enzima se pueden atrapar en la superficie de la gotita. El fluido de carga puede incluir un aceite, tal como un aceite de silicona. La gotita puede estar rodeada parcialmente por el fluido de carga. La gotita puede estar sustancialmente rodeada por el fluido de carga. La gotita puede estar completamente rodeada por el

fluido de carga.

La invención proporciona un método de amplificación digital. El método puede incluir proporcionar una gotita de muestra con un ácido nucleico diana, e incluir opcionalmente reactivos de amplificación. El método puede incluir dispensar subgotitas procedentes de la gotita de muestra, y si los reactivos de amplificación pueden no estar presentes en la gotita de muestra, combinar cada subgotita con reactivos de amplificación para dar una gotita preparada para amplificación. El método puede incluir someter cada subgotita a un protocolo de ciclado térmico seleccionado para amplificar el ácido nucleico diana. El método puede incluir detectar producto amplificado en cada subgotita. El método puede incluir determinar el número de subgotitas que contienen una parte de la muestra a partir de las que se puede formar dicho producto amplificado. Por regla general, al menos una de dichas subgotitas incluye al menos una molécula de ácido nucleico diana. Los reactivos de amplificación pueden incluir al menos una sonda que se hibrida con moléculas diana amplificadas y que tiene una propiedad de fluorescencia que cambia tras la hibridación o como consecuencia de la hibridación. El método puede incluir la determinación del número de subgotitas que contienen una parte de la muestra a partir de las que se forma dicho producto amplificado. La determinación puede incluir, en algunos casos, la detección del cambio de fluorescencia consecuencia de la hibridación de al menos dicha sonda. La determinación del número de subgotitas que contienen una parte de la muestra a partir de las cuales se puede formar dicho producto amplificado puede incluir formar una imagen de todas la subgotitas juntas. La determinación del número de subgotitas que contienen una parte de la muestra a partir de las cuales se puede formar dicho producto amplificado puede incluir transportar gotitas, una cada vez o en subgrupos, a través de una ventana de detección. La subgotitas pueden tener volúmenes menores de aproximadamente 1 μL, o en el intervalo de más de aproximadamente 1 μL a aproximadamente 1.000 μL, o en el intervalo de más de aproximadamente 100 μL a aproximadamente 500 μL. Una más de las raíces de éste y otros métodos de la invención se pueden realizar en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas. La subgotitas se pueden comprimir en una conformación en forma de disco o aplastada entre dos sustratos en el espacio de operaciones con gotitas. El espacio de operaciones con gotitas puede tener una altura en el intervalo de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 1.000 μm, o de más de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 500 μm. El ciclado térmico se puede realizar transportando gotitas desde una zona térmica a otra. En ciertas realizaciones, el accionador de gotitas carece de cámaras de muestra. En ciertas realizaciones, el accionador de gotitas carece de un canal de flujo continuo. En ciertas realizaciones, la dispensación de subgotitas procedentes de la gotita de muestra se puede realizar sin un fluido de desplazamiento que desplace la muestra desde un canal de flujo continuo. En ciertas realizaciones, la gotita de muestra que incluye un ácido nucleico diana puede incluir también reactivos de amplificación. En ciertas realizaciones, los reactivos de amplificación pueden no estar presentes en la gotita de muestra, y el método puede incluir combinar cada subgotita con reactivos de amplificación para dar una gotita preparada para la amplificación. En ciertas realizaciones, la detección del producto amplificado en cada subgotita puede incluir combinar la gotita amplificada con una gotita que incluye uno o más reactivos de detección antes de someter la gotita a detección.

Estos aspectos de la invención y muchos otros serán evidentes a partir de las secciones restantes de la presente memoria y de las reivindicaciones adjuntas.

5. Definiciones

Como se usan en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados indicados.

“Activado” con referencia a uno o más electrodos significa realizar un cambio en el estado eléctrico del uno o más electrodos que, en presencia de una gotita, da como resultado una operación con la gotita.

“Perla”, con respecto a perlas en un accionador de gotitas, significa cualquier perla o partícula capaz de interactuar con una gotita sobre o en proximidad con un accionador de gotitas. Las perlas pueden tener cualquiera de una amplia variedad de formas, tales como esférica, generalmente esférica, forma de huevo, forma de disco, cúbica y otras formas tridimensionales. La perla puede ser capaz, por ejemplo, de ser transportada en una gotita en un accionador de gotitas o configurarse de otra forma con respecto a una accionador de gotitas de una manera que permita a una gotita en el accionador de gotitas ponerse en contacto con la perla, con el accionador de gotitas y/o sin el accionador de gotitas. Las perlas se pueden fabricar usando una amplia variedad de materiales, que incluyen por ejemplo resinas y polímeros. Las perlas pueden ser de cualquier tamaño adecuado, que incluye por ejemplo microperlas, micropartículas, nanoperlas y nanopartículas. En algunos casos las perlas son magnéticamente sensibles; en otros casos las perlas no son de forma significativa magnéticamente sensibles. Para perlas magnéticamente sensibles, el material magnéticamente sensible puede constituir sustancialmente toda una perla o sólo un componente de una perla. El resto de la perla puede incluir, entre otras cosas, material polimérico, recubrimientos, y restos que permite la unión de un reactivo de ensayo. Ejemplos de perlas magnéticamente sensibles adecuadas se describen en la publicación de patente de EE.UU. nº 2005-0260686, titulada "Multiplex flow assays preferably with magnetic particles as solid phase", publicada el 24 de noviembre de 2005. Los fluidos pueden incluir una o más perlas magnéticamente sensibles y/o no magnéticamente sensibles. Ejemplos de técnicas con accionadores de gotitas para inmovilizar perlas magnéticamente sensibles y/o perlas no magnéticamente sensibles y/o llevar a cabo protocolos de operaciones con gotitas usando perlas se describen en la solicitud de patente de EE.UU. nº 11/639.566, titulada "Droplet-Based Particle Sorting", presentada el 15 de diciembre de 2006; en la

solicitud de patente de EE.UU. nº 61/039.183, titulada "Multiplexing Bead Detection in a Single Droplet", presentada el 25 de marzo de 2008; en la solicitud de patente de EE.UU. nº 61/047.789, titulada "Droplet Actuator Devices and Droplet Operations Using Beads", presentada el 25 de abril de 2008; en la solicitud de patente de EE.UU. nº 61/086.183, titulada "Droplet Actuator Devices and Methods for Manipulating Beads", presentada el 5 de agosto de 2008; en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2008/053545, titulada "Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetic Beads", presentada el 11 de febrero de 2008; en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2008/058018, titulada "Bead-based Multiplexed Analytical Methods and Instrumentation", presentada el 24 de marzo de 2008; en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2008/058047, "Bead Sorting on a Droplet Actuator", presentada el 23 de marzo de 2008; y en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2006/047486, titulada "Droplet-based Biochemistry", presentada el 11 de diciembre de 2006.

“Gotita” significa un volumen de líquido en un accionador de gotitas que está al menos parcialmente limitado por un fluido de carga. Por ejemplo, una gotita puede estar completamente rodeada por fluido de carga o puede estar limitada por fluido de carga y una o más superficies del accionador de gotitas. Las gotitas pueden ser, por ejemplo, acuosas o no acuosas o pueden ser mezclas o emulsiones que incluyen componentes acuosos y no acuosos. Las gotitas pueden adoptar una amplia variedad de formas; ejemplos no limitantes incluyen generalmente forma de disco, forma de torpedo, de esfera truncada, elipsoidal, esférica, de esfera parcialmente comprimida, semiesférica, ovoide, cilíndrica, y varias formas formadas durante las operaciones con gotitas, tales como la fusión o división o formadas como resultado de poner en contacto tales formas con una o más superficies de un accionador de gotitas. Para ejemplos de fluidos de gotitas que pueden someterse a operaciones con gotitas usando el planteamiento de la invención, véase la solicitud de patente internacional número PCT/US2006/47486, titulada “Droplet-based Biochemistry”, presentada el 11 de diciembre he de 2006. En varias realizaciones, una gotita puede incluir una muestra biológica, tal como sangre entera, líquido linfático, suero, plasma, sudor, lágrimas, saliva, esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido seminal, secreción vaginal, líquido seroso, líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, trasudados, exudados, líquido quístico, bilis, orina, jugo gástrico, líquido intestinal, muestras de heces, líquidos que contienen células individuales o múltiples, líquidos que contienen orgánulos, tejidos fluidizados, organismos fluidizados, líquidos que contienen organismos multicelulares, esponjas biológicas y lavados biológicos. Por otra parte, una gotita puede incluir un reactivo, tal como agua, agua desionizada, disoluciones salinas, disoluciones ácidas, disoluciones básicas, disoluciones detergentes y/o tampones. Otros ejemplos de contenidos de gotitas incluyen reactivos, tales como un reactivo para un protocolo bioquímico, tal como un protocolo de amplificación de ácido nucleico, un protocolo de ensayo basado en afinidad, un protocolo de ensayo enzimático, un protocolo de secuenciación, y/o un protocolo para el análisis de fluidos biológicos.

“Accionador de gotitas” significa un dispositivo para manipular gotitas. Para ejemplos de accionadores de gotitas, véase la patente de EE.UU. 6.911.132, titulada "Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques”, expedida el 28 de junio de 2005 para Pamula et al.; la solicitud de patente de EE.UU. nº 11/343.284, titulada "Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board”, presentada el 30 de enero de 2006; las patentes de EE.UU. 6.773.566, titulada "Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same”, expedida el 10 de agosto de 2004 y 6.565.727, titulada "Actuators for Microfluidics Without Moving Parts”, expedida el 24 de enero de 2000, ambas para Shenderov et al.; Pollack et al., solicitud de patente internacional nº PCT/US2006/047486, titulada "Droplet-Based Biochemistry”, presentada el 11 de diciembre de 2006; y Roux et al., publicación de patente de EE.UU. nº 20050179746, titulada "Device for Controlling the Displacement of a Drop Between two or Several Solid Substrates”, publicada el 18 de agosto de 2005. Ciertos accionadores de gotitas incluirán un sustrato, electrodos de operaciones con gotitas asociados con el sustrato, una o más capas dieléctricas y/o hidrófobas encima del substrato y/o electrodos que forman una superficie de operaciones con gotitas, y opcionalmente, un sustrato superior separado de la superficie de operaciones con gotitas por un espacio de operaciones con gotitas. Se pueden proporcionar uno o más electrodos de referencia en la parte superior y/o sustratos inferiores y/o en el espacio de operaciones con gotitas. En varias realizaciones, la manipulación de gotitas por un accionador de gotitas puede ser mediada por electrodos, por ejemplo, mediada por electrohumectación o mediada por dielectroforesis o mediada por fuerzas de Coulomb. Ejemplos de otros métodos de control del flujo de líquido que se pueden usar en los accionadores de gotitas de la invención incluyen dispositivos que inducen la presión de fluido hidrodinámico, tales como los que operan sobre la base de principios mecánicos (por ejemplo, bombas de jeringa externa, bombas de membrana neumática, bombas de membrana vibratoria, dispositivos de vacío, fuerzas centrífugas, bombas piezoeléctricas/de ultrasonidos y fuerzas acústicas); de principios eléctricos o magnéticos (por ejemplo, flujo electroosmótico, bombas electrocinéticas, enchufes ferrofluídicos, bombas electrohidrodinámicas, atracción o repulsión usando fuerzas magnéticas y bombas magnetohidrodinámicas); de principios termodinámicos (por ejemplo, generación de burbujas de gas/expansión de volumen inducido por el cambio de fase); de otros tipos de principios de humectación de superficies (por ejemplo electrohumectación, y optoelectrohumectación, así como gradientes de tensión superficial inducidos químicamente, térmicamente, estructuralmente y radiactivamente); gravedad; tensión superficial (por ejemplo, la capilaridad), fuerzas electrostáticas (por ejemplo, el flujo electroosmótico); flujo centrífugo (sustrato dispuesto en un disco compacto y que se hace girar), fuerzas magnéticas (por ejemplo, la oscilación de iones causa flujo); fuerzas magnetohidrodinámicas; y vacío o presión diferencial. En ciertas realizaciones, se pueden emplear combinaciones de dos o más de las técnicas anteriores en los accionadores de gotitas de la invención.

“Operación con gotitas” significa cualquier manipulación de una gotita en un accionador de gotitas. Una operación

con gotitas puede incluir, por ejemplo: cargar una gotita en el accionador de gotitas; dispensar una o más gotitas desde una fuente de gotitas; dividir o separar una gotita en dos o más gotitas; transportar una gotita de un lugar a otro en cualquier dirección; fundir o combinar dos o más gotitas en una sola gotita; diluir una gotita; mezclar una gotita; agitar una gotita; deformar una gotita; retener una gotita en su posición; incubar una gotita; calentar una gotita; vaporizar una gotita; enfriar una gotita; desechar una gotita; transportar una gotita fuera del accionador de gotitas; otras operaciones con gotitas descritas en la presente memoria; y/o cualquier combinación de lo anterior. Los términos "fundir", "fusión", "combinar", "combinación" y similares se utilizan para describir la creación de una gotita a partir de dos o más gotitas. Se debería entender que cuando dicho término se utiliza en referencia a dos o más gotitas, se puede usar cualquier combinación de las operaciones con gotitas que son suficientes para dar lugar a la combinación de las dos o más gotitas en una sola gotita. Por ejemplo, "la fusión de la gotita A con la gotita B", se puede lograr transportando la gotita A y poniéndola en contacto con una gotita B estacionaria, transportando la gotita B y poniéndola en contacto con una gotita A estacionaria, o transportando las gotitas A y B y poniéndolas en contacto una con otra. Los términos "dividir" y "separar" no pretenden dar a entender ningún resultado particular con respecto al volumen de las gotitas resultantes (es decir, el volumen de las gotitas resultantes puede ser el mismo o diferente) o al número de gotitas resultantes (el número de gotitas resultantes puede ser 2, 3, 4, 5 o más). El término "mezcla" se refiere a operaciones con gotitas que dan como resultado una distribución más homogénea de uno o más componentes dentro de una gotita. Ejemplos de operaciones de "carga" con gotitas incluyen la carga de microdiálisis, carga asistida por presión, carga robótica, carga pasiva, y carga con pipeta. Las operaciones con gotitas pueden ser mediadas por electrodos. En algunos casos, las operaciones con gotitas se facilitan aún más por el uso de regiones hidrófilas y/o hidrófobas en las superficies y/o por obstáculos físicos.

“Fluido de carga” significa un líquido asociado con un sustrato de las operaciones con gotitas de un accionador de gotitas, líquido que es suficientemente inmiscible con una fase gotita para hacer a la fase gotita objeto de operaciones con gotitas mediadas por electrodos. El fluido de carga puede ser, por ejemplo, un aceite de baja viscosidad, tal como aceite de silicona. Otros ejemplos de fluidos de carga se proporcionan en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2006/047486, titulada "Droplet-Based Biochemistry", presentada el 11 de diciembre de 2006; en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2008/072604, titulada "Use of additives for enhancing droplet actuation", presentada el 8 de agosto de 2008; y en la publicación de patente de EE.UU. nº 20080283414, titulada "Electrowetting Devices", presentada el 17 de mayo de 2007. El fluido de carga puede llenar todo el espacio del accionador de gotitas o puede cubrir una o más superficies del accionador de gotitas. El fluido de carga puede ser conductor o no conductor. Un "material de carga" es un fluido de carga solidificado o endurecido, tal como una cera, grasa o aceite solidificados o endurecidos.

“Inmovilizar" con respecto a las perlas magnéticamente sensibles, significa que a las perlas se les limita sustancialmente la posición en una gotita o en el fluido de carga en un accionador de gotitas. Por ejemplo, en una realización, la posición de las perlas inmovilizadas está suficientemente limitada para permitir la ejecución de una operación de división en una gotita, que produce una gotita con sustancialmente todas las perlas y una gotita que carece sustancialmente de las perlas.

"Ruta de líquido" significa una ruta adecuado para conducir o hacer fluir un líquido. Una ruta de líquido puede establecerse en un sustrato, tal como una ruta de lumen en un sustrato con forma de tubo (por ejemplo, un tubo capilar), o como un canal, conducto, orificio, abertura, surco o ranura en un sustrato sólido. Una ruta de líquido puede ser abierta (por ejemplo, un surco o ranura en una superficie a través de los puede fluir líquido) o cerrada (por ejemplo, un tubo). A menudo se establecerá una ruta de líquido para hacer fluir líquido desde una cámara a otra, tal como desde un reservorio de líquido a través de la ruta de líquido y en un espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas, o desde un reservorio de líquido, a través de una ruta de líquido, y en una segunda ruta de líquido.

"Magnéticamente sensible" significa que reacciona ante un campo magnético. Las "perlas magnéticamente sensibles" incluyen o están compuestas por materiales magnéticamente sensibles. Ejemplos de materiales magnéticamente sensibles incluyen materiales paramagnéticos, materiales ferromagnéticos, materiales ferrimagnéticos y materiales metamagnéticos. Ejemplos de materiales paramagnéticos adecuados incluyen hierro, níquel, y cobalto, así como óxidos metálicos, tales como Fe3O4, BaFe12O19, CoO, NiO, Mn2O3, Cr2O3, y CoMnP.

"Lavar" con relación a lavar una perla magnéticamente sensible significa reducir la cantidad y/o concentración de una o más sustancias en contacto con la perla magnéticamente sensible, o expuestas a la perla magnéticamente sensible, de una gotita en contacto con la perla magnéticamente sensible. La reducción en la cantidad y/o concentración de la sustancia puede ser parcial, sustancialmente completa, o incluso completa. La sustancia puede ser cualquiera de una amplia variedad de sustancias; ejemplos incluyen sustancias diana para su posterior análisis, y sustancias no deseadas, tales como componentes de una muestra, contaminantes, y/o reactivos en exceso. En algunas realizaciones, una operación de lavado comienza con una gotita de partida en contacto con una perla magnéticamente sensible, en la que la gotita incluye una cantidad inicial y una concentración inicial de una sustancia. La operación de lavado puede realizarse usando una variedad de operaciones con gotitas. La operación de lavado puede producir una gotita que incluye una perla magnéticamente sensible, en la que la gotita tiene una cantidad y/o concentración total de la sustancia que es menor que la cantidad y/o concentración inicial de la sustancia. Ejemplos de técnicas de lavado adecuadas se describen en Pamula et al., patente de EE.UU. 7.439.014,

titulada "Droplet-Based Surface Modification and Washing", concedida el 21 de octubre de 2008.

Los términos "arriba", "abajo", "sobre", "bajo", y "en" se utilizan a lo largo de la descripción con referencia a las posiciones relativas de los componentes del accionador de gotitas, tales como las posiciones relativas de arriba y debajo de los sustratos del accionador de gotitas. Se apreciará que el accionador de gotitas es funcional independientemente de su orientación en el espacio.

Cuando un líquido en cualquier forma (por ejemplo, una gotita o un cuerpo continuo, ya sea móvil o estacionario) se describe como que está "en", o "sobre" un electrodo, serie, matriz o superficie, tal líquido puede estar en contacto directo con el electrodo/serie/matriz/superficie, o puede estar en contacto con una o más capas o películas que estén interpuestas entre el líquido y el electrodo/serie/matriz/superficie.

Cuando una gotita se describe como "sobre" o "cargada sobre" un accionador de gotitas, debe entenderse que la gotita está dispuesta sobre el accionador de gotitas de manera que facilita el uso del accionador de gotitas para llevar a cabo una o más operaciones con gotitas en la gotita, la gotita está dispuesta sobre el accionador de gotitas de manera que facilita la detección de una propiedad o de una señal procedente de la gotita, y/o se ha sometido la gotita a una operación con en el accionador de gotitas.

6. Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra una ruta de ciclado térmico en un sustrato de un accionador de gotitas.

La figura 2 ilustra una serie de rutas de ciclado térmico establecidas en un sustrato de un accionador de gotitas.

La figura 3 ilustra otro diseño ciclado térmico para un accionador de gotitas.

La figura 4 ilustra una técnica para reducir o eliminar la contaminación cruzada entre gotitas.

La figura 5 ilustra una técnica sustancialmente similar a la técnica ilustrada en la figura 4, excepto que múltiples gotitas de lavado están interpuestas en las rutas entre gotitas de muestra.

La figura 6 ilustra una técnica sustancialmente similar a la técnica ilustrada en la figura 5, excepto que las gotitas de lavado se compensan con un electrodo en relación con las gotitas de muestra.

La figura 7 ilustra una técnica sustancialmente similar a la técnica ilustrada en las figuras 4 y 5, excepto que las gotitas de lavado se sustituyen por las gotitas de lavado alargadas con forma de torpedo.

La figura 8 ilustra una técnica sustancialmente similar a la técnica ilustrada en la figura 7, excepto que las gotitas de lavado alargadas con forma de torpedo se complementan adicionalmente con gotitas de lavado en la ruta de las gotitas de muestra antes y después de las gotitas de muestra.

La figura 9 ilustra una técnica sustancialmente similar a las técnicas anteriores, excepto que las gotitas de lavado se proporcionan como gotitas de lavado en forma horizontal antes y después de las gotitas de muestra.

La figura 10 ilustra una realización que es similar a la realización ilustrada en la figura 2, excepto que se incluyen barreras físicas alargadas entre las rutas de la muestra, que impiden el intercambio de fluido de carga o de los componentes de fluido de carga entre las rutas.

La figura 11 ilustra una realización en la que se proporciona el fluido de carga como una sustancia que solidifica sustancialmente a temperatura de almacenamiento y se funde en las proximidades de los calentadores a las temperaturas requeridas para la operación.

Las figuras 12A y 12B ilustran otra técnica para reducir o eliminar la contaminación cruzada entre las gotitas.

La figura 13 ilustra otra técnica para reducir o eliminar la contaminación cruzada entre las gotitas.

La figura 14 ilustra una realización que utiliza el principio de la relación de área superficial a volumen y complejos enzimáticos tensioactivos que se ilustran en las figuras 12A y 12B para iniciar una reacción en un accionador de gotitas.

La figura 15 ilustra una vista de una sección lateral de un accionador de gotitas configurado para la sustitución en continuo del fluido de carga.

La figura 16 muestra una vista superior (figura 16A) y una vista de una sección lateral (figura 16B) de un accionador de gotitas similar al ilustrado en la figura 15 configurado para la sustitución en continuo del fluido de carga.

La figura 17 ilustra una vista de una sección lateral de un accionador de gotitas configurado para la sustitución en continuo del fluido de carga.

La figura 18 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención que incluye las rutas de electrodos dispuestos para el ciclado de las gotitas entre zonas térmicas.

La figura 19 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención, que es similar a la configuración de electrodos que se muestra en la figura 18, excepto que ciertas rutas se extienden de manera que las gotitas se pueden estacionar lejos de los elementos de control de temperatura.

La figura 20 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención, que es como la configuración ilustrada en la figura 19, excepto que se proporciona una ventana de detección junto con una ruta de electrodos dispuestos para permitir el transporte de las gotitas en presencia de la ventana de detección.

La figura 21 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención que incluye una ruta sinuosa de electrodos que serpentea a través de dos o más zonas térmicas.

La figura 22 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención que incluye una ruta sinuosa de electrodos que serpentea a través de dos o más zonas térmicas con rutas de electrodos adicionales configurados para el transporte de gotitas fuera de una ruta sinuosa de electrodos.

La figura 23 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención, que muestra cómo la ruta sinuosa de electrodos dentro de cada zona térmica se puede alargar o acortar para alargar o acortar el tiempo de residencia de la gotita en esa zona.

La figura 24 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención que incluye una ruta sinuosa, en la que una o más de las curvas de la ruta sinuosa se asocia con una ruta de acceso.

La figura 25 ilustra una configuración de electrodos como la configuración de electrodos de la figura 25, pero que incluye también zonas de estacionamiento de gotitas para el almacenamiento de gotitas antes de la detección sin requerirse la activación del electrodo.

La figura 26 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención que incluye electrodos dispuestos para formar una ruta bucle de electrodos para el transporte de gotitas entre las zonas de control térmico.

La figura 27 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención que incluye múltiples rutas bucle de electrodos.

La figura 28 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención que incluye una ruta bucle de electrodos y una subruta bucle de electrodos.

La figura 29 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención ilustrativa de una configuración de ciclado térmico de flujo continuo en el que se separaron subgotitas de un gotita mayor para la detección.

La figura 30 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención que incluye un conjunto de electrodos y subgotitas de muestra dispuestas en el conjunto de electrodos.

La figura 31 ilustra una realización de la invención en la que se cicla térmicamente una gotitas de muestra, y después de cada n ciclos se dispensa y transporta lejos una subgotita de muestra para la detección.

La figura 32 ilustra una realización que muestra cómo se pueden transportar lejos y colocar subgotitas, seguidos del barrido de un detector.

La figura 33 ilustra una realización en la que se utiliza una configuración de electrodos para colocar las gotitas de reacción.

La figura 34 ilustra una configuración de electrodos de un accionador de gotitas de la invención en la que las rutas de ciclado térmico están dispuestas radialmente.

La figura 35 ilustra la configuración de electrodos que tiene múltiples elementos de control de temperatura conectados por un conjunto de electrodos que tiene múltiples conjuntos de rutas de transporte de gotitas.

La figura 36 ilustra una configuración de electrodos en la que se pegan electrodos y se utilizan para el transporte de una gotita entre elementos de control de temperatura.

La figura 37 es una fotografía de un sustrato inferior de un cartucho de un accionador de gotitas de la invención.

La figura 38 es un diagrama del diseño del sustrato inferior se muestra en la figura 37.

La figura 39 muestra los resultados primarios y los resultados normalizados para la amplificación en cartucho.

La figura 40 muestra los datos normalizados del cartucho de la invención en comparación con los datos normalizados de la BioRadIQ5.

La figura 41 muestra los resultados de 12 reacciones de amplificación simultáneas en un accionador de gotitas.

La figura 42 muestra los resultados de otro experimento de ciclado térmico usando el diseño de cartucho mostrado en las figuras 37 y 38.

La figura 44 muestra un protocolo con gotitas utilizado en un experimento en el que la amplificación se separa de la detección.

La figura 43 muestra los resultados del experimento descrito con respecto a la figura 44.

La figura 45 ilustra una realización de la invención en la que perlas magnéticamente sensibles se empujan a un lado dentro de una gotita alargada para que ninguna perla esté expuesta a la ventana de detección durante la detección.

Las figuras 46A, 46B, y 46C ilustran vistas superiores de una región de un accionador de gotitas y juntas muestran ciertas etapas de un método de manipulación de perlas magnéticamente sensibles con el fin de mejorar la detección de analito. La figura 46D muestra una representación de datos de PCR en tiempo real que se obtuvo a partir de reacciones de ciclado térmico.

Las figuras de la 47A a la 47I ilustran una vista lateral de una sección transversal de una región del accionador de gotitas y proporcionan un ejemplo de la utilización de perlas de captura magnéticamente sensibles en un proceso de concentración y recolección de ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra para la amplificación y análisis de ácidos nucleicos.

Las figuras 48A y 48B ilustran una vista lateral de una barra calentadora y la barra calentadora instalada.

7 Descripción

La invención proporciona dispositivos accionadores de gotitas, técnicas y sistemas para fabricar y usar los accionadores de gotitas. Las realizaciones de la invención son útiles para la realización de las operaciones con gotitas. Las realizaciones de la invención son útiles para la realización de ensayos que emplean el ciclado térmico de gotitas, tales como el ciclado térmico de gotitas para amplificar ácidos nucleicos. Los diversos protocolos de ciclado térmico de la invención tienen varias ventajas con relación al estado de la técnica. En algunos casos, los protocolos no requieren que los calentadores o el accionador de gotitas estén térmicamente ciclados. En otros casos, no es necesario para la amplificación del ácido nucleico ni para la detección que se produzcan al mismo tiempo o en la misma ubicación. En otros casos, puede no ser necesario que un reactivo de detección esté presente en la reacción durante el ciclado térmico, por ejemplo, el reactivo de detección se puede añadir después del ciclado térmico, tal como mediante la combinación de gotita ciclada térmicamente con una gotita que incluye el reactivo de detección. En algunas realizaciones, no es necesario que la detección se produzca durante el ciclado térmico, es decir, la detección puede ocurrir en cuanto se ha completado del ciclado térmico o después del ciclado térmico. En aún otros casos, no es necesario medir más de una vez la señal de una reacción individual. Además, puede no ser necesario determinar en ningún orden particular la señal asociada con cualquier número determinado de ciclos. Cualquier protocolo particular de ciclado térmico de la invención puede tener una o más de estas y otras ventajas.

La invención proporciona accionadores de gotitas y la mejora de los métodos de realización de análisis de ácidos nucleicos, tales como PCR, en un accionador de gotitas. Por ejemplo, la invención proporciona métodos de manipulación de perlas magnéticamente sensibles con el fin de mejorar la detección de una diana amplificada (por ejemplo, ácido nucleico). La invención también proporciona el uso de fluoróforos polares en protocolo de amplificación conducido en un accionador de gotitas con el fin de mejorar la detección de una diana amplificada. La invención también proporciona métodos (por ejemplo, la pasivación) para reducir sustancialmente y/o eliminar la pérdida de dianas de ácido nucleico y de reactivos de PCR durante las operaciones con gotitas. La invención también proporciona un accionador de gotitas con un espacio de tamaño aumentado para mejorar la estabilidad de la gotita durante las operaciones con gotitas. La invención también proporciona un método de reducción del arrastre y la contaminación cruzada entre las gotitas de la reacción de amplificación. La invención proporciona además métodos para concentrar y recoger el ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra.

En ciertas realizaciones, se puede someter a múltiples gotitas que incluyen composiciones sustancialmente idénticas, a protocolos de ciclado térmico en los que diferentes gotitas o diferentes conjuntos de gotitas son sometidas a diferentes números de ciclos. Cuando una gotita o un conjunto de gotitas han completado un número predeterminado de ciclos, la gotita puede ser sometida a detección para determinar la cantidad de producto amplificado presente en la gotita. Se puede generar una curva en base a la detección de gotitas en diferentes puntos finales de ciclado térmico y se puede usar para cuantificar una diana presente en una muestra original. Son posibles numerosas alternativas dentro del alcance de la invención a la luz de la invención como se describe en la presente memoria.

Los dispositivos, técnicas y sistemas de la invención tienen numerosas ventajas en relación con el estado de la técnica, incluyendo pero no limitadas a la reducción o eliminación de la contaminación cruzada entre las gotitas en un accionador de gotitas y en otras gotitas, fluidos de carga, y/o superficies del accionador de gotitas; limpieza de un accionador de gotitas entre usos para reducir o eliminar la contaminación.

7.1 Reducción de la contaminación cruzada

La invención proporciona dispositivos accionadores de gotitas y métodos para la realización de operaciones con gotitas. La invención puede reducir sustancialmente o eliminar la contaminación cruzada y el arrastre entre las gotitas en accionador de gotitas y en otras gotitas, fluidos de carga, y/o superficies del accionador de gotitas. La invención puede proporcionar limpieza de un accionador de gotitas entre usos para reducir o eliminar la contaminación. La invención se describe en general con referencia a las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos como la PCR, pero se apreciará que los métodos son adecuados para cualquier tipo de ensayo en el que la contaminación cruzada o el arrastre entre las gotitas es un problema.

La figura 1 ilustra una ruta de ciclado térmico 100 en un sustrato de un accionador de gotitas. La ruta de ciclado térmico 100 incluye una zona de operaciones con gotitas 105. La zona de operaciones con gotitas 105 se establece sobre un primer sustrato y también puede incluir un segundo sustrato dispuesto de una manera generalmente paralela con respecto al primer sustrato para crear un espacio de operaciones con gotitas entre ellos para la realización de las operaciones con gotitas. La zona de operaciones con gotitas 105 está limitada por la junta 110 para evitar que los contaminantes entren o salgan de la zona de operaciones con gotitas 105. Cuando están presentes los sustratos primero y segundo se puede proporcionar la junta 110 en el espacio de operaciones con gotitas. La junta 110 puede servir como un sello para retener fluido de carga en la zona de operaciones con gotitas 105 y/o como un espaciador para establecer una altura del espacio de operaciones con gotitas de la zona de operaciones con gotitas 105.

Cuando la junta 110 mantiene un fluido de carga líquido en la zona de operaciones con gotitas 105, la junta 110 evita que los contaminantes en el fluido de carga contaminen otras zonas de operaciones con gotitas en el sustrato del accionador de gotitas. Así, cuando los sustratos primero y segundo están presentes, la junta 110 se puede proporcionar en el espacio de operaciones con gotitas y disponer de tal manera que el fluido de carga en la zona de operaciones con gotitas 105 esté completamente delimitado por los sustratos primero y segundo y por la junta. Se pueden proporcionar varios puertos a lo largo de cualquier ruta desde el espacio de operaciones con gotitas al exterior del accionador de gotitas o a otra región del accionador de gotitas para la carga/descarga de fluidos en/desde la zona de operaciones con gotitas 105.

Como se ilustra, la zona de operaciones con gotitas 105 incluye dos zonas de control de temperatura 120A y 120B, así como una zona de transición 125. Las zonas de control de temperatura 120 están asociadas con los elementos de control de temperatura 130A y 130B. Los elementos de control de temperatura 130 son elementos que controlan la temperatura del fluido de carga en su vecindad. Los elementos de control de temperatura 130 pueden acoplarse eléctricamente a los contactos eléctricos 131 para el suministro de electricidad a los elementos de control de temperatura 130. Ejemplos de elementos de control de temperatura 130 adecuados incluyen calentadores y disipadores de calor. Como se ilustra, están presentes dos zonas de control de temperatura 120A y 120B; sin embargo, se apreciará que se puede incluir cualquier número de zonas de control de temperatura 120.

Las zonas de control de temperatura 120 están conectadas por la zona de transición 125. Los electrodos 115 en la zona de transición 125 se pueden utilizar para el transporte las gotitas entre las zonas de control de temperatura. La zona de transición 125 puede, en algunas realizaciones ser más estrecha que las zonas de control de temperatura 120 con el fin de minimizar la circulación de fluido entre las zonas de control de temperatura 120. Como se ilustra, una sola zona de transición 125 conecta dos zonas de control de temperatura 120; sin embargo, se apreciará que las zonas de control de temperatura 120 pueden tener múltiples de zonas de transición 125 de conexión. Además, cualquier número de zonas de control de temperatura 120 se puede conectar mediante cualquier número de zonas de transición 125.

La zona de operaciones con gotitas 105 incluye electrodos 115 asociados con uno o ambos de los sustratos primero y segundo. Los electrodos 115 están configurados para la realización de una o más operaciones con gotitas. Los electrodos 115 se pueden utilizar, por ejemplo, para transportar una gotita 140 de ida y vuelta entre las zonas de temperatura 120A y 120B, por ejemplo, en la dirección ilustrada por la flecha A.

La figura 2 ilustra una serie de rutas de ciclado térmico 100 establecidas en un sustrato de un accionador de gotitas. Los elementos de control de temperatura 130 se ilustran como una serie de calentadores en forma generalmente de disco acoplados eléctricamente juntos en una serie. Sin embargo, se apreciará que los elementos de control de temperatura 130 pueden estar acoplados en paralelo a una fuente de electricidad o para separar las fuentes de electricidad. Además, los elementos de control de temperatura 130 se pueden combinar. Por ejemplo, los elementos 130A se pueden sustituir por elementos de control de temperatura únicos 130 asociados con cada zona de control de temperatura 120A. De forma similar, los elementos 130B se pueden sustituir por elementos de control de temperatura 130 únicos asociados con cada zona de control de la temperatura 120B.

La figura 3 ilustra otro diseño de ciclado térmico 300 para un accionador de gotitas. El diseño de ciclado térmico 300 es similar al diseño que establece las rutas de ciclado térmico 100 en las figuras 1 y 2. Sin embargo, los elementos de control térmico 305 establecen las zonas de control de temperatura 320A y 320B a través de múltiples rutas de transporte de gotitas 310A-310B. Las rutas de transporte de gotitas 310 se componen de electrodos de operaciones con gotitas 315 configurados para llevar a cabo una o más operaciones con gotitas, generalmente como se describe con referencia a la figura 1. En particular, las rutas de transporte de gotitas 310 emplean electrodos de operaciones con 315 para transportar las gotitas 340 entre las zonas térmicas 320A y 320B en la dirección ilustrada por las flechas A. El diseño de ciclado térmico 300 puede incluir también barreras físicas configuradas para reducir la circulación de fluido de carga entre las zonas térmicas 320A y 320B.

La figura 4 ilustra una técnica para reducir o eliminar la contaminación cruzada entre las gotitas. Las rutas de transporte de gotitas 105A, 105B, 105C, 105D y 105E se proporcionan en un sustrato de un accionador de gotitas. Las gotitas son transportadas entre las zonas térmicas (no mostradas) en la dirección indicada por la flecha A. Las rutas 105A, 105C y 105E incluyen gotitas de muestra, ilustradas en la presente memoria en forma de gotitas de PCR. Se interponen gotitas de lavado W en las rutas 105B y 105D entre las rutas que incluyen las gotitas de muestra. Como las gotitas de muestra son transportadas entre las zonas de temperatura, las gotitas de lavado son transportadas entre las rutas de las gotitas de muestra. Las gotitas de lavado W puede incluir compuestos que degradan los contaminantes, tales como enzimas de degradación de ADN. Las gotitas de lavado W puede incluir componentes que se unen a los contaminantes, tales como perlas de unión a ADN. Las gotitas de lavado W pueden ser transportadas en la misma dirección o en direcciones opuestas con relación a las gotitas de muestra. Pueden ser transportadas a posiciones inmediatamente adyacentes a las gotitas de muestra y/o a posiciones que están desplazadas con respecto a las gotitas de muestra. Las gotitas de lavado W puede incluir opcionalmente reactivos de amplificación de ácidos nucleicos por lo que también funcionan como controles de reacción negativos cuando la detección de ácido nucleico amplificado dentro de una gotita de lavado proporciona una indicación de que la contaminación fue detectable dentro de una gotita de lavado.

La figura 5 ilustra una técnica sustancialmente similar a la técnica ilustrada en la figura 4, excepto que las múltiples gotitas de lavado están interpuestas en las rutas entre las gotitas de muestra. En una realización alternativa, múltiples rutas de gotitas de lavado están interpuestas entre las rutas de las gotitas de muestra, con una o más gotitas de lavado en cada ruta de gotitas de lavado.

La figura 6 ilustra una técnica sustancialmente similar a la técnica ilustrada en la figura 5, excepto que las gotitas de lavado se desplazan con respecto a las gotitas de muestra mediante un electrodo.

La figura 7 ilustra una técnica sustancialmente similar a la técnica ilustrada en las figuras 4 y 5, excepto que las gotitas de lavado se sustituyen por gotitas de lavado alargadas con forma de torpedo.

La figura 8 ilustra una técnica sustancialmente similar a la técnica ilustrada en la figura 7, excepto que las gotitas de lavado alargadas con forma de torpedo se complementan adicionalmente con gotitas de lavado en las rutas de las gotitas de muestra antes y después de las gotitas de muestra. De forma similar, las gotitas de lavado en las rutas de las gotitas de muestra antes y después de las gotitas de muestra pueden incluirse también en cualquiera de las figuras precedentes.

La figura 9 ilustra una técnica sustancialmente similar a las técnicas anteriores, excepto que las gotitas de lavado se proporcionan como gotitas de lavado de forma horizontal antes y después de las gotitas de muestra. En una realización similar, las gotitas de lavado alargadas con forma de torpedo se pueden sustituir por 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X o gotitas más grandes con cualquier forma.

La figura 10 ilustra una realización que es similar a la realización ilustrada en la figura 2, excepto que las barreras físicas alargadas 1010A, 1010B, 1010C y 1010D están incluidas entre las rutas de muestra 1005A, 1005B, 1005C, 1005D, y 1005E, evitando el intercambio de fluido de carga o de constituyentes del fluido de carga entre las rutas o regiones.

La figura 11 ilustra una realización en la que se proporciona el fluido de carga como una sustancia que solidifica sustancialmente a la temperatura de almacenamiento y se funde en las cercanías de los calentadores a las temperaturas requeridas para la operación. Se proporcionan los calentadores 1130 que tiene una forma que corresponde generalmente a la forma de las rutas de operaciones con gotitas 1105 deseadas. En la presente memoria se ilustran cuatro rutas de operaciones con gotitas 1105A, 1105B, 1105C y 1105D, pero se apreciará que se puede proporcionar cualquier número de rutas. En cuanto se calienta el material de relleno sustancialmente solidificado, una parte del material de relleno se funde para formar rutas de operaciones con gotitas llenas de fluido de carga 1105 rodeadas por material de carga que permanece sustancialmente sólido, sirviendo de este modo como una barrera 1120 para los contaminantes que pasan a través de fluido de carga líquido de una ruta de operaciones con gotitas 1105 a otra. En una realización, el material de carga se selecciona para permanecer sólido a temperaturas por debajo de las temperaturas requeridas para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos y para fundirse a las temperaturas requeridas para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos.

Las figuras 12A y 12B ilustran otra técnica para reducir o eliminar la contaminación cruzada entre las gotitas. Se

proporciona una ruta o serie de electrodos de operaciones con gotitas 1210 en un sustrato de un accionador de gotitas. Los electrodos de operaciones con gotitas 1210 están configurados para llevar a cabo una o más operaciones con gotitas. Como se muestra en la figura 12A, los electrodos de operaciones con gotitas 1210 pueden, por ejemplo, utilizarse para el transporte de una gotita de 1220. La gotita 1220 puede ser cualquier gotita que incluye potencialmente una sustancia contaminante, es decir, una sustancia puede contaminar otra gotita. Por ejemplo, la gotita 1220 puede ser una gotita de análisis, tal como una gotita utilizada en un inmunoensayo, ensayo de secuenciación, ensayo de amplificación de ácidos nucleicos, y/o ensayo enzimático. La sustancia contaminante puede ser, por ejemplo, ser una sustancia diana, tal como un ácido nucleico en una reacción de amplificación de ácido nucleico; una sustancia no diana, tal como una proteína no diana en una muestra de inmunoensayo, y/o un reactivo, tal como una enzima.

La gotita 1220 puede contener una cantidad de complejo tensioactivo-enzima 1224. En un ejemplo, complejo 1224 puede ser un complejo tensioactivo-DNasa (es decir, un complejo que degrada ADN). Debido al resto tensioactivo, sustancialmente la totalidad del complejo 1224 es atrapado en la superficie de la gotita 1220. Se puede seleccionar una cantidad de complejo 1224 de tal manera que la concentración del resto enzimático (por ejemplo, DNasa) sea suficientemente baja y, por lo tanto, sustancialmente inactiva en la gotita 1220.

El transporte de la gotita 1220 a lo largo de los electrodos de operaciones con gotitas 1210 puede dar como resultado la formación de una minigotita 1226 que puede ser dejada atrás en un cierto electrodo de operaciones con gotitas 1210, como se muestra en la figura 12B. La minigotita 1226 puede incluir todos los componentes de la gotita 1220, tal como ADN y complejo 1224. Como resultado, la minigotita 1226 puede convertirse en una fuente de contaminación de ADN en posteriores operaciones con gotitas que pueden producirse a lo largo de los electrodos de operaciones con gotitas 1210.

La minigotita 1226 puede tener, por ejemplo, de 1/100 del diámetro de gotita 1220. El diámetro más pequeño de la minigotita 1226 proporciona una sustancialmente mayor relación de área superficial a volumen, por ejemplo, 100X mayor. Un aumento de la relación de área superficial a volumen puede proporcionar una mayor concentración de complejo 1224 en la minigotita 1226 (por ejemplo, 100X mayor). Sin embargo, debido al aumento de la concentración del complejo 1224 en la minigotita 1226, se puede lograr una rápida degradación del ADN en la minigotita 1226, evitándose o reduciéndose sustancialmente la contaminación cruzada causada por la minigotita 1226.

Como un ejemplo, la enzima puede conjugarse con un resto de polialcalenglicol (PAG) (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, etc.) de un polímero PAG-alquilo. Se conocen en la técnica diversos métodos para conseguir tal conjugación: la patente de EE.UU. 4.088.538 describe un conjugado de polímero-enzima enzimáticamente activo de una enzima unida covalentemente a PEG; la patente de EE.UU. 4.496.689 describe un complejo de inhibidor α-1 de la proteasa unido covalentemente a un polímero tal como PEG o metoxipoli(etilenglicol); Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252: 3578 (1977) describe la unión covalente de mPEG a un grupo amino de albúmina de suero bovino; la patente de EE.UU. 4.414.147 describe la conjugación de un interferón con el anhídrido de un ácido dicarboxílico, tal como poli(anhídrido etilensuccínico); y la publicación de patente internacional nº WO/1987/00056 describe la conjugación de PEG y polioles poli(oxietilados) a proteínas tales como interferón-β, interleucina-2 e inmunotoxinas.

Otro modo de fijación de PEG a la enzima es por oxidación de los residuos de glicosilo en un péptido. El azúcar oxidado se utiliza como un locus para unir un resto PEG al péptido. Por ejemplo: la publicación de patente internacional nº WO/1994/05332 describe el uso de una hidrazina-o amino-PEG para añadir PEG a una glicoproteína. Los restos glicosilo se oxidan a los correspondientes aldehídos, que posteriormente se acoplan al amino-PEG; la publicación de patente internacional nº WO/1996/40731 describe el acoplamiento de PEG a una molécula de inmunoglobulina oxidando enzimáticamente de un glicano en la inmunoglobulina y luego poniendo en contacto el glicano con una molécula de amino-PEG. El tensioactivo se acopla a uno o más restos de la enzima en la que la conjugación no inhibe indebidamente la actividad de la enzima.

La figura 13 ilustra otra técnica para reducir o eliminar la contaminación cruzada entre las gotitas. En esta realización, se proporcionan las rutas de operaciones con gotitas 1310A, 1310B, y 1310C en un sustrato de un accionador de gotitas. En la presente invención se ilustran tres rutas de operaciones con gotitas 1310A, 1310B, y 1310C, pero se apreciará que se puede proporcionar cualquier número de rutas. Las rutas 1310A, 1310B, y 1310C incluyen gotitas de muestra, ilustradas en la presente invención como gotitas de PCR. Las gotitas son transportadas entre las zonas térmicas (no mostradas) en, por ejemplo, la dirección indicada por la flecha A. El transporte de las gotitas puede dar como resultado la formación de la minigotita 1314 que puede dispersarse en el líquido de carga 1316. La minigotita 1314 puede contener ADN y, por lo tanto, convertirse en una fuente de contaminación para otras rutas de operaciones con gotitas.

El fluido de carga 1316 incluye una cantidad de complejos tensioactivo-enzima 1320. En este ejemplo, los complejos 1320 pueden ser un complejo tensioactivo-DNasa utilizado para degradar el ADN. Los complejos 1320 proporcionan una barrera entre las rutas 1310A, 1310B, y 1310C tal que los complejos 1320 degradan el ADN en la minigotita 1314 y evitan o reducen sustancialmente la contaminación cruzada entre las rutas.

En una realización alternativa, se pueden aplicar los ejemplos ilustrados en las figuras 12A, 12B, y 13 para reducir la contaminación cruzada de otros materiales en un accionador de gotitas. Por ejemplo, se puede utilizar un complejo tensioactivo-proteasa para prevenir o reducir sustancialmente el arrastre de la proteína durante las operaciones con gotitas.

La figura 14 ilustra una realización que utiliza el principio de la relación de área superficial a volumen y los complejos enzimáticos tensioactivos que se ilustra en las figuras 12A y 12B para iniciar una reacción en un accionador de gotitas.

En este ejemplo se proporcionan, en un sustrato de un accionador de gotitas, un electrodo reservorio 1410 y una ruta o serie de electrodos de operaciones con gotitas 1412. Se proporciona una cantidad de fluido de muestra 1416 que contiene una cantidad de complejos enzimáticos tensioactivos 1418 en el electrodo reservorio 1410. Debido al resto tensioactivo, sustancialmente todo el complejo 1418 se encuentra atrapado en la superficie del fluido de muestra 1416. Se puede seleccionar una cantidad de complejo 1418 de tal manera que la concentración del resto enzimático sea suficientemente baja y, por lo tanto, sea sustancialmente inactivo en el fluido de muestra 1416.

El electrodo reservorio 1410 está configurado para dispensar gotitas de tamaño unitario 1420 sobre electrodos de operaciones con gotitas 1412. Los electrodos de operaciones con gotitas 1412 están configurados para llevar a cabo una o más operaciones con gotitas para procesar las gotitas de tamaño unitario 1420.

El volumen de fluido de muestra 1416 en el electrodo reservorio 1410 es sustancialmente mayor que el volumen de la gotita de tamaño unitario 1420. Por ejemplo, el volumen de fluido de muestra 1416 puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente 1.000 veces mayor que el volumen de gotita de tamaño unitario 1420. El menor volumen de gotita de tamaño unitario 1420, con respecto al fluido de muestra 1416, proporciona una relación de área superficial a volumen sustancialmente mayor. Un aumento de la relación de área superficial a volumen puede proporcionar una mayor concentración de complejo 1418 en la gotita de tamaño unitario 1420. El aumento de la concentración de complejo 1418 en la gotita de tamaño unitario 1420 es suficiente para iniciar una reacción.

En una realización alternativa, el electrodo reservorio 1410 se sustituye con otros electrodos de operaciones con gotitas 1412. En este ejemplo, una gotita de muestra que contiene una cantidad de complejos tensioactivo-enzima puede dividirse usando operaciones con gotitas para variar su relación de área superficial a volumen e iniciar una reacción.

En algunas realizaciones, el accionador de gotitas está configurado para el reemplazo del fluido de carga. En algunas aplicaciones, será útil proporcionar usos repetidos del accionador de gotitas. Cuando la contaminación del fluido de carga es un problema, puede ser útil reemplazar una parte o todo el fluido de carga en un accionador de gotitas entre ejecuciones del ensayo. La técnica puede ser útil con una amplia variedad de protocolos de gotitas, que incluyen, por ejemplo, protocolos para amplificación, secuenciación, inmunoensayos, ensayos enzimáticos, y otros. En una realización, el fluido de carga se sustituye sustancialmente de forma completa. El reemplazo se puede automatizar. El fluido de carga se puede analizar después de cada ejecución, y el fluido de carga se puede reemplazar cuando se detecta un nivel predeterminado de contaminación. El reemplazo puede ser automático. En algunos casos, el reemplazo puede producirse periódicamente, por ejemplo, después de cada 1, 2, 3, 4, 5 o más ejecuciones.

La figura 15 ilustra una vista de una sección lateral del accionador de gotitas 1500 configurado para la sustitución en continuo del fluido de carga. El accionador de gotitas 1500 incluye sustrato base 1505 que incluye electrodos 1510 configurados para la realización de una o más gotitas operaciones. El accionador de gotitas 1500 también incluye un sustrato superior 1515 separado de sustrato base 1505 para dar el espacio de operaciones con gotitas 1520. El accionador de gotitas 1500 incluye aberturas laterales 1525 para hacer fluir el fluido de carga a través del espacio de operaciones con gotitas 1520. Las aberturas laterales 1525 pueden incluir conexiones 1530 configuradas para aparearse con una o más conexiones correspondientes 1535 en una fuente de fluido de carga o destino del fluido de carga externos. Las conexiones 1535 pueden estar asociadas con un conducto 1540 que establece una ruta de líquido desde una fuente externa de fluido de carga (no mostrada), a través del conducto 1540, a través de las conexiones 1530 y 1535 y en el espacio de operaciones con gotitas 1520. Las conexiones 1535 pueden estar asociadas con un conducto que establece una ruta de líquido desde el espacio de operaciones con gotitas 1520, a través de las conexiones 1530 y 1535, a través del conducto 1540, y en un destino externo del fluido de carga (no mostrado).

La figura 16 muestra una vista superior (figura 16A) y una vista en sección lateral (figura 16B) de un accionador de gotitas similar, 1600 configurado para la sustitución en continuo del fluido de carga. El accionador de gotitas 1600 incluye sustrato base 1605 que incluye electrodos 1610 configurados para la realización de una o más operaciones con gotitas. El accionador de gotitas 1600 también incluye un sustrato superior 1615 separado del sustrato base 1605 para producir el espacio de operaciones con gotitas 1620. El accionador de gotitas 1600 incluye aberturas laterales 1625 para hacer fluir el fluido de carga a través del espacio de operaciones con gotitas. Las aberturas laterales 1625 pueden estar asociadas con un distribuidor 1660 configurado para hacer fluir el líquido desde el conducto 1640 al espacio de operaciones con gotitas y/o desde el espacio de operaciones con gotitas al conducto 1640. El distribuidor 1660 puede estar configurado con el conducto 1640 y una fuente de fluido de carga líquido (no

mostrada) para establecer una ruta de líquido desde la fuente externa de fluido de carga a través del conducto 1640, a través del distribuidor 1660, y hasta el espacio de operaciones con gotitas. El distribuidor 1660 puede estar configurado con el conducto 1640 y un destino del fluido de carga líquido (no mostrado) para establecer una ruta de líquido desde el espacio de operaciones con gotitas, a través del distribuidor 1660, a través del conducto 1640, y hasta un destino del fluido de carga líquido. El distribuidor 1660 puede incluir una abertura 1662 adecuada para el acoplamiento directo o indirecto al conducto 1640. El distribuidor 1660 puede incluir una abertura 1664 adecuada para el acoplamiento directo o indirecto el accionador de gotitas. Idealmente, la abertura 1664 y la abertura 1625 tienen una forma que es sustancialmente similar a una sección transversal del espacio de operaciones con gotitas 1620 con el fin de facilitar la sustitución completa del fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas 1620. Pueden estar presentes uno o más orificios de ventilación en un sustrato del accionador de gotitas 1600 y/o entre los sustratos (por ejemplo, en una junta) para permitir el escape de las burbujas de aire que se puede introducir en el espacio de operaciones con gotitas 1620 durante el rellenado. La flecha x indica la dirección del flujo a través del conducto 1640, el distribuidor 1660 y en el espacio de operaciones con gotitas 1620.

La figura 17 ilustra una vista en sección lateral del accionador de gotitas 1700 configurado para la sustitución del fluido de carga en flujo continuo. El accionador de gotitas 1700 es como el accionador de gotitas 1500 excepto que las aberturas para hacer fluir el fluido a través del accionador de gotitas están situadas en la parte inferior del accionador de gotitas. Esta disposición puede ser útil para montar fácilmente el accionador de gotitas en un sistema que incluya componentes para hacer fluir líquidos a través del espacio de operaciones con gotitas. El accionador de gotitas 1700 incluye el sustrato base 1705 que incluye electrodos 1710 configurados para la realización de una o más operaciones con gotitas. El accionador de gotitas 1700 también incluye el superior sustrato 1715 separado del sustrato base 1705 para producir el espacio de operaciones con gotitas 1720. La junta 1707 sella el espacio de operaciones con gotitas. El accionador de gotitas 1700 incluye aberturas inferiores 1725 para hacer fluir el fluido de carga a través del espacio de operaciones con gotitas 1720. Las aberturas inferiores 1725 pueden incluir conexiones 1730 configuradas para aparearse con una o más conexiones correspondientes 1735 asociadas con una ruta de líquido para una fuente externa de fluido de carga y/o con el destino de fluido de carga. A modo de ejemplo, conexiones de viruta a tubos adecuadas incluyen ensamblajes NANOPORT® (IDEX Corporation, Oak Harbor, WA). Una o más conexiones 1735 pueden estar asociadas con un conducto 1740 que establece una ruta de líquido desde una fuente externa de fluido de carga (no mostrada), a través del conducto 1740, a través de las conexiones 1730 y 1735 y en el espacio de operaciones con gotitas 1720. Una o más conexiones 1735 pueden estar asociadas con un conducto que establece una ruta de líquido desde el espacio de operaciones con gotitas 1720, a través de las conexiones 1730 y 1735, a través del conducto 1740, y en un destino externo del fluido de carga en (no mostrado).

En varios aspectos de la invención, el fluido de carga puede fluir así desde la fuente de fluido de carga a través de una ruta de líquido a través del espacio de operaciones con gotitas y fuera del espacio de operaciones con gotitas en una segunda ruta de líquido a un destino del fluido de carga líquido. De esta manera, el fluido de carga puede ser sustituido al menos parcialmente. Hacer fluir el fluido de carga a través de un espacio de operaciones con gotitas puede sustituir sustancialmente el fluido de carga presente originalmente en el espacio de operaciones con gotitas. En algunos casos, el fluido de carga se puede hacer fluir en el espacio de operaciones con gotitas en una cantidad que es suficiente para reemplazar el fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas. En otros casos, el fluido de carga se puede hacer fluir a través del espacio de operaciones con gotitas para purgar el espacio de operaciones con gotitas. Una vez finalizado el lavado, el espacio de operaciones con gotitas permanece lleno con el fluido de carga y listo para el funcionamiento. En ciertas realizaciones, el fluido de carga utilizado para purgar el espacio de operaciones con gotitas se puede calentar con el fin de mejorar la limpieza en el espacio de operaciones con gotitas. En otra realización, la contaminación en el espacio de operaciones con gotitas se puede controlar durante la purga del fluido de carga, y la purga se puede detener cuando se ha alcanzado un nivel adecuado de limpieza.

Los métodos de la invención se pueden utilizar para reemplazar al menos aproximadamente 50% del fluido de carga presente originalmente en el espacio de operaciones con gotitas. Los métodos de la invención se pueden utilizar para reemplazar al menos aproximadamente 75% del fluido de carga presente originalmente en el espacio de operaciones con gotitas. Los métodos de la invención se pueden utilizar para reemplazar al menos aproximadamente 90% del fluido de carga presente originalmente en el espacio de operaciones con gotitas. Los métodos de la invención se pueden utilizar para reemplazar al menos aproximadamente 95% del fluido de carga presente originalmente en el espacio de operaciones con gotitas. Los métodos de la invención se pueden utilizar para reemplazar al menos aproximadamente 99% del fluido de carga presente originalmente en el espacio de operaciones con gotitas.

En otros aspectos de la invención, se puede hacer fluir un fluido de limpieza a través del espacio de operaciones con gotitas para limpiar el accionador de gotitas. Después de la limpieza, se puede hacer fluir fluido de carga fresco en el espacio de operaciones con gotitas. Por ejemplo, se puede hacer fluir un disolvente a través del espacio de operaciones con gotitas para limpiar el accionador de gotitas antes de hacer fluir el fluido de carga fresco en el espacio de operaciones con gotitas. Se puede seleccionar un disolvente sea adecuado para retirar el fluido de carga sin dañar indebidamente las superficies del espacio de operaciones con gotitas. En algunos casos, puede ser deseable secar el espacio del accionador de gotitas antes de volver a cargar el espacio de operaciones con gotitas con fluido de carga. En algunos casos, se puede hacer fluir un gas, tal como aire, a través del espacio de

operaciones con gotitas con el fin de secar el espacio de operaciones con gotitas antes de la recarga del espacio de operaciones con gotitas con fluido de carga.

Se pueden usar diversos líquidos como fluidos de limpieza en los métodos de la invención. En un aspecto, se pueden seleccionar líquidos de limpieza en los que sean solubles tanto el aceite y el agua, con bajo punto de ebullición serían buenos agentes de limpieza. También se pueden utilizar fluidos de limpieza con elevado punto de ebullición o componentes del fluido de limpieza. En una realización, se utiliza un fluido de limpieza con un punto de ebullición, elevado, seguido por un enjuague de punto de ebullición menor. Se puede hacer fluir un fluido de enfriamiento a través del espacio de operaciones con gotitas antes de cargar el fluido de carga para devolver el accionador de gotitas a la temperatura de funcionamiento.

Ejemplos de líquidos de limpieza adecuados incluyen líquidos polares tales como acetona, alcohol isopropílico, etanol, metanol, tetrahidrofurano, acetonitrilo, y mezclas que incluyen uno o más de estos componentes. También se pueden usar mezclas de estos disolventes. También se pueden utilizar derivados hidrosolubles de aceite de silicona. También se pueden utilizar líquidos de limpieza a base de agua; el cartucho se seca preferentemente antes del rellenado que sigue al uso de líquidos de limpieza a base de agua. También se pueden utilizar mezclas multicomponente. En una realización, el líquido de limpieza incluye uno o más componentes que tienen solubilidad en agua y uno o más componentes deben presentar solubilidad en aceite. Los fluidos de limpieza pueden incluir también diversos catalizadores o enzimas. Por ejemplo se pueden incluir enzimas que degradan contaminantes específicos. En algunos casos, el aceite se desplaza con aire o agua y a continuación se vuelve a cargar el espacio de operaciones con gotitas con fluido de carga.

En los ensayos de destello, puede ser útil el uso de gotitas de lavado que incluyan la disolución desencadenante para limpiar los trayectos de transporte de gotitas. Los trayectos de electrodos que se han utilizado para transportar el sustrato se pueden lavar transportando una o más gotitas de lavado a través de una parte o la totalidad de la misma zona. Las gotitas de lavado pueden incluir la enzima de destello. Por ejemplo, la(s) gotita(s) de lavado puede(n) incluir luciferasa o luciferasa y ATP. Como un ejemplo, se puede usar éster de acridinio (AE, por sus siglas en inglés) como un marcador quimioluminiscente en un ensayo de destello de la invención. La señal del AE se eleva rápidamente a un valor alto, por regla general en menos de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 segundo una vez añadida la disolución desencadenante. La señal decae a valores muy bajos, por regla general en menos de aproximadamente 60, 30, 20 ó 10 segundos. Esto puede eliminar la contaminación en el bucle de detección y en el punto de detección. Sin embargo, la contaminación puede estar aún presente en las rutas de lavado y en la región de incubación debido a anticuerpos secundarios libres unidos a AE que pueden afectar potencialmente los ensayos posteriores realizados por la misma ruta. El transporte de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más gotitas de la solución de AE desencadenante sobre los electrodos que están contaminados con anticuerpo unido a AE produciría quimioluminiscencia que decaería rápidamente, eliminando sustancialmente la contaminación de AE.

Los fluidos de limpieza pueden ser en varios casos ácidos o básicos, por ejemplo, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio en etanol para pH alto, o ácido acético o HCl diluido para pH bajo. En una realización, se proporciona un procedimiento de lavado de múltiples etapas, que comienza con un disolvente soluble en agua seguido de un líquido que es soluble en el primer disolvente.

Se pueden utilizar disolventes calientes como fluidos de limpieza. La temperatura se puede seleccionar para mejorar la limpieza sin causar daños indebidos en el accionador de gotitas. Las temperaturas preferidas variarán dependiendo de los materiales utilizados. En algunos casos, la temperatura está en el intervalo de aproximadamente 30ºC a aproximadamente 125ºC, preferiblemente aproximadamente 60ºC a aproximadamente 115ºC, más preferiblemente aproximadamente 75ºC a aproximadamente 105ºC. Las temperaturas preferidas variarán dependiendo de los materiales utilizados. Cuando se utiliza un sustrato superior de policarbonato, las temperaturas máximas estarán cerca de 100ºC actualmente. Cuando se utiliza un sustrato superior de cristal, las temperaturas máximas pueden ser mucho mayores, por ejemplo, mayores de 150ºC.

En algunos casos, una o más superficies del accionador de gotitas incluyen un recubrimiento, y se selecciona el líquido de limpieza para eliminar una capa muy fina del recubrimiento durante la limpieza. Por ejemplo, una o más superficies del accionador de gotitas incluyen un recubrimiento hidrófobo, y se selecciona el líquido de limpieza para eliminar una capa muy fina del revestimiento hidrófobo durante la limpieza. Así, puede seleccionarse para su uso como un líquido de limpieza un líquido en el que el recubrimiento hidrófobo tiene una solubilidad muy pequeña. Por ejemplo, el revestimiento hidrófobo puede incluir un polímero fluorado. El líquido de limpieza puede incluir un disolvente fluorado, tal como un disolvente completamente fluorado o un disolvente parcialmente fluorado. El líquido de limpieza puede incluir un disolvente completamente fluorado dispersado en otro disolvente a muy baja concentración. El líquido de limpieza puede incluir un líquido parcialmente fluorado que tiene es soluble en otros disolventes orgánicos. El líquido de limpieza también se puede seleccionar para depositar un recubrimiento hidrófobo fino adicional sobre el recubrimiento hidrófobo existente. Ya sea que el líquido de limpieza modifique el revestimiento hidrófobo eliminando de una capa fina o depositando de una cantidad adicional de capa fina, el efecto en ambos casos es el de "renovar" el revestimiento hidrófobo a su situación original.

7.2 Flujo continuo paralelo

La figura 18 ilustra una configuración de electrodos 1800 de una parte de un accionador de gotitas de la invención. La configuración de electrodos 1800 incluye electrodos 1805, que están configurados para la realización de operaciones con gotitas sobre una superficie del accionador de gotitas. La configuración de electrodos 1800, al igual que todas las configuraciones de electrodos de la invención, se puede proporcionar como parte de una configuración de electrodos más extensa y/o una red más extensa de microfluidos. El accionador de gotitas se puede utilizar para dispensar y para llevar a cabo otras operaciones con gotitas en la superficie de operaciones con gotitas utilizando una serie de gotitas de reacción idénticas 1820, por ejemplo, dispensando subgotitas de muestra idénticas a partir de una sola gotita de muestra (no mostrada) u otra fuente de líquido. Los electrodos de operaciones con gotitas 1805 pueden estar configurados para proporcionar una serie de rutas de transporte de gotitas 1806. Los electrodos de operaciones con gotitas 1805 se pueden utilizar para el transporte de gotitas de reacción 1820 a una de las varias rutas de transporte de gotitas 1806.

La configuración de electrodos 1800 pueden estar asociada también con uno o más elementos de control de temperatura 1810, tales como calentadores y/o disipadores de calor. Los elementos de control de temperatura 1810 pueden configurarse de cualquier manera adecuada para la calentar y/o enfriar gotitas en la superficie de accionamiento de gotitas. Los elementos de control de temperatura 1810 pueden utilizarse para establecer zonas de temperatura en la superficie de operaciones con gotitas. Cuando el accionador de gotitas incluye dos sustratos separados para formar un espacio de operaciones con gotitas para realizar operaciones con gotitas, los elementos de control de temperatura 1810 pueden estar configurados para establecer zonas de temperatura en el espacio de operaciones con gotitas. Cuando el espacio de operaciones con gotitas está lleno de un fluido de carga líquido, los elementos de control de temperatura 1810 pueden estar configurados para establecer zonas de temperatura dentro de las diversas regiones del fluido de carga en el espacio de operaciones con gotitas. En las rutas de transporte de las operaciones con gotitas 1806, las gotitas se pueden transportar usando operaciones con gotitas mediadas por electrodos de operaciones con gotitas 1805, entre las zonas de temperatura establecidas por uno o más elementos de control de temperatura 1810.

Cualquier realización de la invención se puede configurar como parte de un sistema. Por ejemplo, un sistema puede incluir un ordenador que controla las operaciones con gotitas del accionador de gotitas controlando la activación de los electrodos de cualquiera de las configuraciones de electrodos de la invención. Un sistema que incluye el accionador de gotitas de la figura 18 se puede programar para ciclar gotitas en cada ruta durante un número predeterminado diferente de ciclos. La detección puede conseguirse en las propias rutas de ciclado térmico o se pueden transportar las gotitas a otros lugares para la detección. En la realización ilustrada, las gotitas se pueden estacionar en la ruta marcada como A, para la detección mediante el barrido de un sensor a través de las gotitas. La detección se puede realizar cuando el ciclado térmico en cada ruta se ha completado. Alternativamente, algunas o todas las gotitas se pueden estacionar después del ciclado térmico, y el sensor puede hacer un barrido de una gotitas tras otra a lo largo de la ruta marcada como A. En la presente memoria se describen otros métodos de detección adecuados.

La figura 19 ilustra una configuración de electrodos 1900 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración 1900 es similar a la configuración 1800 y a la figura 18, excepto que las rutas 1806 se prolongan de forma que las gotitas se pueden estacionar lejos de los elementos de control de temperatura 1810. En el ejemplo ilustrado, las gotitas en la ruta de la parte superior se someten a 5 ciclos, las gotitas en la siguiente ruta se someten a 10 ciclos, y así sucesivamente hasta la ruta de abajo, en la que las gotitas se someten a 35 ciclos. Se puede proporcionar cualquier número de rutas, y las gotitas 1820 en cada ruta 1806 pueden ser sometidas a cualquier número de ciclos de transporte entre las zonas de temperatura. Una vez completado un número predeterminado de ciclos, cada gotita puede ser transportada a una posición en su respectiva ruta 1806 a lo largo de la ruta marcada como A, en las que puede ser sometida a detección. La detección puede implicar, por ejemplo, la detección de una señal procedente de la gotita. La intensidad de la señal puede utilizarse para cuantificar ácido nucleico amplificado en gotita. Cada gotita puede ser sometida a detección inmediatamente después de la finalización de su número predeterminado de ciclos. Alternativamente, las gotitas pueden ser estacionadas y sometidas a un barrido en un momento posterior por un sensor para detección.

La figura 20 ilustra una configuración de electrodos 2000 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración de electrodos 2000 es generalmente idéntica a la configuración 1900 ilustrada en la figura 19, excepto que se proporciona una ventana de detección 2005 junto con una ruta de electrodos 2010 dispuesta para permitir el transporte de gotitas de cada ruta 1806 a la ventana de detección. La ventana de detección puede estar dispuesta en cualquiera de las rutas de electrodos o en cualquier ubicación a la que una gotita pueda ser transportada para la detección. La figura 20 también es ilustrativa de una realización que incluye tres elementos de control de la temperatura 1810. Por supuesto, se puede usar cualquier número de elementos de control de temperatura.

Durante el funcionamiento, cuando cada gotita completa su número predeterminado de ciclos, la gotita se transporta a la ventana de detección para la detección. En una realización similar, cuando cada gotita completa su número predeterminado de ciclos, la gotita se estaciona. El estacionamiento implica el transporte de la gotita a una ubicación y el almacenamiento de la gotita en la ubicación. La ubicación puede estar en una región separada del accionador de gotitas con respecto a la región del ciclado térmico. Posteriormente, cada gotita se transporta en la ventana de detección para la detección. Un sensor puede estar dispuesto para detectar la señal procedente de gotitas situados

en la ventana de detección. El sensor puede ser adecuado para la cuantificación de una o más señales de cada gotita. La ventana de detección no tiene que ser una ventana física. En su forma más simple, es simplemente una región en las proximidades de un sensor en la que una gotita situada parcialmente o completamente en la ventana es susceptible de detección por el sensor.

En un ejemplo, las zonas de temperatura se establecen para la realización de ciclado térmico de una mezcla de amplificación de ácido nucleico, tal como una mezcla de PCR. Las gotitas de amplificación incluyen una muestra de ácido nucleico junto con reactivos adecuados para la amplificación de un ácido nucleico diana potencialmente presentes en la muestra. Cada ruta se somete a ciclado térmico durante un número diferente de ciclos. Cuando la gotita ha alcanzado un número predeterminado de ciclos, la gotita puede ser sometida a la detección, por ejemplo, conforme a los diferentes esquemas que se describen en la presente memoria. Por ejemplo, las gotitas pueden ser transportadas en presencia de un sensor para la detección del producto de amplificación.

En algunos casos, conjuntos de gotitas son ciclados térmicamente de forma secuencial, un conjunto después de otro. En otros casos, las gotitas dentro de un conjunto se ciclan térmicamente de forma secuencial y gotitas fuera de un conjunto se ciclan térmicamente en paralelo. Cada conjunto puede incluir una o más gotitas. Las reacciones de ciclado térmico se finalizan cuando se han recogido datos adecuados para cuantificar el producto de amplificación presente en la muestra de partida, con un grado aceptable predeterminado de certeza. El ciclado térmico se puede detener cuando es estadísticamente seguro de que el ácido nucleico diana no está presente en la muestra o no está siendo amplificado. Se puede obtener un nuevo conjunto de subgotitas de muestra a partir de la muestra de manera que la reacción de amplificación se puede ejecutar de nuevo, por ejemplo, usando diferentes reactivos o un accionador de gotitas diferente. En otros casos, si un conjunto de puntos finales del ciclado térmico procedentes de un conjunto de gotitas de ciclado térmico indica una curva satisfactoria, pero muestra falta de producto en una o más subgotitas de muestra que deberían (de acuerdo con la curva) incluir productos, se pueden dispensar nuevas subgotitas de muestra, y se puede repetir el protocolo de ciclado térmico para algunos o todos los puntos de datos.

El ensayo como se ilustra en las figuras 18-20 es un ensayo en paralelo, en el que múltiples gotitas se ciclan térmicamente en paralelo. En otras palabras, todas las subgotitas de muestra de un grupo particular están en la misma zona térmica al mismo tiempo. Sin embargo, se apreciará que en una realización más simple, todos o uno o más subconjuntos de las gotitas se pueden ciclar térmicamente de forma secuencial. En algunos casos, cada miembro de un subconjunto se amplifica después de terminar la amplificación de un miembro anterior del subconjunto, mientras que diferentes subconjuntos se ciclan térmicamente en paralelo.

Por ejemplo, se puede proporcionar un termociclador de un solo paso. Se puede ciclar térmicamente una primera gotita en la ruta cinco veces, después se puede someter a detección; una segunda gotita se puede ciclar térmicamente 10 veces, después se puede someter a detección; etc. El proceso se puede repetir hasta que se obtiene un conjunto suficiente de puntos de datos para establecer una curva a partir la cual se puede calcular la cantidad de ácido nucleico diana en la muestra. Del mismo modo, una primera gotita se puede ciclar térmicamente 35 veces, una segunda gotita 30 veces, una tercera gotita 25 veces, y así sucesivamente a una primera gotita que se cicla cinco veces. Alternativamente, todas las gotita pueden estacionarse y someterse a detección en serie o simultánea en un momento posterior. Se puede crear una curva a partir de los puntos de datos, y la cantidad de nucleico diana en la muestra se puede calcular en base a la curva. En una realización, puede ser útil llevar a cabo los ciclos más prolongados primero, procediendo con las gotitas de ciclos reducidos sólo si se detecta el ácido nucleico diana en la primera gotita.

En una realización similar, se puede proporcionar un número de rutas de ciclado térmico que es menor que el número total de gotitas seleccionadas para ciclado térmico. Las subgotitas de muestra se pueden procesar en conjuntos. Cada gotita de un conjunto se puede ciclar térmicamente generalmente en paralelo, mientras que conjuntos múltiples se pueden ciclar térmicamente de forma secuencial. Por ejemplo, se puede usar un accionador de gotitas con cinco rutas para procesar 35 subgotitas de muestra, 1, 2, 3 ... 35, en conjuntos de cinco. Por ejemplo, un primer conjunto de cinco gotitas podría incluir subgotitas de muestra para un ciclo, 2 ciclos, 3 ciclos, 4 ciclos, y 5 ciclos; un segundo conjunto de cinco gotitas podría procesar subgotitas de muestra para 6 ciclos, 7 ciclos, 8 ciclos, 9 ciclos y 10 ciclos, y los conjuntos posteriores pueden procesar subgotitas de muestra para 11-15 ciclos, 16-20 ciclos, 21-25 ciclos, 26-30 ciclos, etc.

En una realización alternativa, un primer conjunto de cinco gotitas podría incluir subgotitas de muestra para 5, 15, 25, 35, y 40 ciclos; un segundo conjunto de cinco gotitas podría incluir subgotitas de muestra para 8, 10, 20, 30, y 38 muestras. Se pueden llenar otros grupos en números de ciclos entre los números realizados previamente. Además, los datos pueden ser analizados entre los conjuntos, y el ciclado se puede terminar cuando se han obtenido datos suficientes para cuantificar el ácido nucleico diana en un intervalo predeterminado de certeza estadística. Del mismo modo, el ciclado se puede terminar cuando se hace evidente que el ácido nucleico diana no está presente o no se está amplificando en las subgotitas de muestra. En este último caso se puede repetir el ciclado térmico utilizando, por ejemplo, un accionador de gotitas diferente y/o reactivos diferentes.

En las técnicas de ciclado térmico con flujo continuo en paralelo, todas las rutas se pueden cargar con subgotitas de muestra. Las gotitas se pueden mover al unísono, aunque no es necesario el movimiento exacto de las gotitas al

unísono. Algunas gotitas pueden moverse en direcciones opuestas, por ejemplo. Las reacciones de amplificación en las gotitas se detienen generalmente en momentos diferentes, aunque se apreciará que algunas gotitas pueden ser duplicados que se ciclan el mismo número de veces y se detienen simultáneamente. Las reacciones se pueden detener en una región de control de temperatura (por ejemplo, como se ilustra en la figura 18), o se pueden transportar lejos de las regiones de control de temperatura (por ejemplo, como se ilustra en las figuras 19 y 20). Cuando las gotitas se transportan a través de una zona de detección, puede ser útil transportar primero gotitas que experimentan números de ciclos menores, seguido por las gotitas que experimentan números de ciclos mayores. Este enfoque ayudará a prevenir o aliviar los resultados de la contaminación cruzada, que puede ser más probable que esté causada por las gotitas con concentraciones más altas de ácido nucleico diana.

En diversas realizaciones de la técnica de ciclado térmico con flujo continuo en paralelo, las gotitas se pueden cargar y estacionar. El ciclado térmico se puede iniciar simultáneamente y terminar en serie según cada gotita de cada subconjunto de gotitas termina su número predeterminado de ciclos. En otra realización, las gotitas se pueden cargar y estacionar, y el ciclado térmico para cada gotita o cada subconjunto de gotitas se pueden iniciar en serie y finalizar simultáneamente. También son posibles dentro del alcance de la invención los protocolos en el que uno o más subconjuntos de gotitas empezaron juntos como subconjuntos y terminaron en serie, mientras que otro(s) subconjunto(s) de las gotitas comenzaron en serie y completaron su(s) ciclado(s) térmico juntos como subconjunto(s). En aún otra realización, las gotitas o subconjuntos de gotitas se pueden cargar en serie y comenzar en serie según las gotitas se cargan y terminar según las gotitas completa el ciclado térmico, por ejemplo, en serie o en grupos. En aún otra realización, las gotitas se dispensan y se cargan en paralelo.

En otra realización, las gotitas pueden comenzar el ciclado térmico simultáneamente y completar diferentes números de ciclos simultáneamente. Este enfoque implica el ajuste de las velocidades de transporte y/o los tiempos de permanencia dentro de las zonas térmicas o entre zonas térmicas para que las gotitas completen sus diferentes números de ciclos simultáneamente. En una realización similar, varios subconjuntos de gotitas completan sus diferentes números de ciclos simultáneamente. Por ejemplo, los números de ciclos 1-5 se pueden completar simultáneamente; los números de ciclos 6-10 se pueden completar simultáneamente; etc.

En aún otra realización, los tiempos de permanencia pueden ser diferentes en diferentes números de ciclos dentro de un perfil de ciclado térmico de una gotita individual. Por ejemplo, los ciclos iniciales pueden ser más lentos, mientras que los ciclos posteriores pueden ser más rápidos, o viceversa. Para ilustración adicional, una gotita se puede ciclar 35 veces, y cada ciclo puede ser ligeramente más rápido que el ciclo precedente. O, como otro ejemplo, una gotita se puede ciclar 35 veces, y los ciclos 1-10 se pueden realizar a una primera velocidad, mientras que los ciclos 10-20 se pueden realizar a una segunda velocidad, etc.

En otra realización, se pueden distribuir ciclos múltiples entre las rutas para el uso eficaz de la ruta. Por ejemplo, en un ciclado térmico en un accionador de gotitas con cuatro rutas disponibles, las gotitas se pueden ciclar de la siguiente manera:

!: Ruta 1: 7

!: Ruta 2: 1, 6

!: Ruta 3: 2, 5

!: Ruta 4: 3, 4

Así, en la ruta 1 una sola gotita se cicla siete veces. En la ruta dos, una primera gotita se cicla una vez, seguida de una segunda gotita que se cicla seis veces. En la ruta tres, una primera gotita se cicla dos veces en la segunda gotita se cicla cinco veces. Por último, en la ruta cuatro, una primera gotita se cicla tres veces, en la segunda gotita se cicla cuatro veces. En cada ruta se realizan exactamente 7 ciclos, lo que hace un uso eficaz del espacio de las rutas y minimiza el tiempo total requerido para ciclar todas las gotitas. Además, en la ilustración, las gotitas que experimentan números de ciclo menores se procesan primero, seguidas por las gotitas que experimentan números de ciclos mayores. De esta manera, las gotitas con un número de copias menor preceden a las gotitas con número de copias mayor en el mismo accionador de gotitas en tiempo real. Este enfoque reduce la posibilidad de contaminación cruzada causada por el residuo dejado atrás por las primeras gotitas. Por supuesto, este es un ejemplo sencillo, y cualquier número de rutas se puede utilizar con cualquier número de gotitas y combinarse de manera similar, como se apreciarán los expertos en la técnica a la luz de la presente memoria descriptiva.

7.3 Flujo continuo sinuoso

La figura 21 ilustra la configuración de electrodos 2100 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración de electrodos 2100 incluye la ruta de electrodos 2105 que incluye electrodos 1805 configurados de una manera que permite que las gotitas 1815 procedentes de una fuente (no mostrada) sean transportadas a lo largo de las rutas de electrodos de ida y vuelta entre dos o más zonas de temperatura. Como en ejemplos anteriores, las zonas de temperatura se establecen mediante elementos de control de temperatura 1810, tales como calentadores o disipadores de calor. Las gotitas 1815 se deslizan serpenteando u ondeando por la ruta de electrodos 2105 de ida y

vuelta entre las zonas de temperatura establecidas por los elementos de control de temperatura 1810. Al igual que con otras realizaciones, el accionador de gotitas puede proporcionarse como parte del sistema que controla las operaciones con gotitas. El sistema se puede programar para transportar gotitas a través de la región de ciclado térmico y a la posición para detección.

La figura 22 ilustra la configuración de electrodos 2200 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración de electrodos 2200 es similar a la configuración de electrodos 2100 de la figura 21. Sin embargo, la configuración de electrodos 2200 incluye rutas de electrodos 2205 para transportar gotitas lejos de la zona de ciclado térmico para detección. Las rutas de electrodos 2205 están configuradas para transportar gotitas fuera de la ruta sinuosa de electrodos 2005.

Cada gotita se puede ciclar a través de zonas de temperatura durante un número predeterminado de ciclos, y después se puede transportar lejos para la detección. Las gotitas se pueden estacionar, y después someter a un barrido por un sensor. Por ejemplo, las gotitas se pueden estacionar a lo largo de la línea A, y un sensor puede hacer un barrido de las gotitas. Alternativamente, las gotitas se pueden transportar a una ventana de detección 2220 para la detección. Un sensor puede estar dispuesto para detectar gotitas posicionadas en la ventana de detección. El sensor puede ser adecuado para detectar señal procedente de cada gotita. En otra realización, se puede utilizar un detector de matriz, tal como una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD, por sus siglas en inglés) o una matriz de pares LED-fotodiodo, para detectar simultáneamente múltiples gotitas.

Así, en un ejemplo, las gotitas 1815 que incluyen una mezcla de amplificación de ácido nucleico, tal como una mezcla de PCR, y una muestra que incluye potencialmente un ácido nucleico diana, se pueden dispensar y transportar a lo largo de la ruta sinuosa 2205 establecida por los electrodos 1805. Las gotitas 1815 se pueden ciclar térmicamente transportando las gotitas 1815 lo largo la ruta sinuosa 2205, que pasa hacia atrás y adelante entre zonas de temperatura establecidas por los elementos de control de temperatura 1810.

Cada gotita se puede ciclar un número predeterminado de veces, y según cada gotita completa su número predeterminado de ciclos, se puede transportar fuera de las zonas de temperatura de ciclado térmico para detección. En otra realización, según cada gotita completa su número predeterminado de ciclos, se puede transportar a una de las zonas de temperatura de ciclado térmico o a otra zona de temperatura de ciclado térmico que tenga una temperatura adecuada para el mantenimiento de las gotitas para la detección. En diversas realizaciones, las gotitas se pueden estacionar y someter a un barrido por un sensor. En otra realización, cada gotita se puede transportar a una ventana de detección. El proceso produce un conjunto de gotitas, cada uno de los cuales ha sido ciclado térmicamente un número predeterminado de veces. Por ejemplo, una primera gotita se puede ciclar térmicamente cinco veces, una segunda gotita se puede ciclar térmicamente 10 veces, cuarta gotita se puede ciclar térmicamente 15 veces, etc. Al igual que con otros ejemplos, el proceso se puede detener cuando se han obtenido datos adecuados para cuantificar la sustancia diana.

La ruta sinuosa puede adoptar cualquiera de una variedad de formas que esencialmente serpentean u ondean de ida y vuelta o zigzaguean entre zonas de temperatura. Por ejemplo, la ruta de electrodos puede serpentear de ida y vuelta a lo largo de ángulos rectos, como se ilustra en las figuras 4 y 6. La ruta puede formar parte de un conjunto mayor de electrodos del que se puede seleccionar una ruta sinuosa o serpenteante. La ruta sinuosa puede tomar forma zigzagueante o una forma curvilínea. Cada giro en la ruta sinuosa puede ser generalmente el mismo, o los giros pueden ser de tamaños diferentes.

Las gotitas se pueden alimentar continuamente a la ruta sinuosa en un extremo de la ruta y pueden pasar a través del extremo opuesto. En algunas realizaciones, las rutas de electrodos pueden estar dispuestas para conducir las gotitas sobre o fuera de la ruta sinuosa. Por ejemplo, en una realización cada meandro o giro de la ruta incluye al menos una ruta de acceso de electrodos para retirar las gotitas de la ruta y/o introducir las gotitas en ella. En algunos casos, las gotitas pueden ser suministradas en la ruta en diferentes puntos a lo largo de la ruta a través de una ruta de acceso de electrodos. En algunos casos, las gotitas se pueden retirar de la ruta en diferentes puntos a lo largo de la ruta a través de una ruta de acceso de electrodos. En otras realizaciones, las gotitas pueden introducirse en y/o retirarse de la ruta a través de una abertura en cualquier sustrato del accionador de gotitas, tal como el sustrato superior, el sustrato inferior, y/o una abertura lateral en el espacio de operaciones con gotitas entre los sustratos superior e inferior.

En algunas realizaciones, puede ser útil sincronizar las reacciones. En tales realizaciones, las gotitas pueden ser suministradas a una velocidad igual al tiempo del ciclo de transporte. En esta realización, el número de reacciones en curso se incrementa en uno en cada ciclo de transporte. En esta realización, la sincronización significa que todas las gotitas están en la misma parte del ciclo térmico al mismo tiempo. La sincronización de las gotitas permite que la velocidad de transporte sea variable. Las gotitas se pueden detener e incubar en la misma parte del ciclo térmico al mismo tiempo.

En diversas realizaciones, puede ser útil asegurar que ninguna gotita atraviesa un electrodo que estaba ocupado previamente por una gotita con un número de ciclo mayor, es decir, una gotita que se puede esperar que tenga una mayor concentración de ácido nucleico diana.

En algunas realizaciones, la detección de gotitas se produce en su lugar en la ruta sinuosa. En otras realizaciones, las gotitas son transportadas a otros lugares para la detección. En algunas realizaciones, puede ser útil transportar las gotitas a lo largo de la ruta sinuosa a un punto de detección. En tales realizaciones, una vez se ha completado el ciclado térmico de todas las gotitas, se pueden ajustar los elementos de control de temperatura para permitir el transporte de las gotitas a lo largo de la ruta sinuosa de electrodos sin continuar el ciclado térmico. Por ejemplo, el calentador de desnaturalización de ácidos nucleicos puede reducir su temperatura hasta un punto por debajo de la temperatura de desnaturalización más baja posible del ácido nucleico. De esta manera, las gotitas pueden seguir deslizándose a lo largo de la ruta sinuosa sin continuar el proceso de amplificación. Si el arrastre es una preocupación, puede ser útil invertir la dirección de flujo de la gotita, es decir, retirar las gotitas que tienen números más bajos de ciclos primero, seguidas de las gotitas que tienen los números de ciclos más altos. De esta manera, ninguna gotita pasará sobre un electrodo que ha alojado previamente una gotita con un número de ciclos mayor.

En otra realización, las reacciones pueden inactivarse para que puedan seguir siendo transportadas a través de las temperaturas de ciclado térmico sin amplificación. Alternativamente, como se describió anteriormente, las gotitas pueden ser transportadas a través de rutas de electrodos de acceso a otra ubicación en el accionador de gotitas para la detección.

La figura 23 ilustra una configuración de electrodos 2300 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración de electrodos 2300 ilustra cómo la ruta sinuosa de electrodos establecida dentro de cada zona térmica por elementos de control de temperatura 1810 se puede alargar o acortar con el fin de alargar o acortar el tiempo de residencia de la gotita en esa zona.

Por ejemplo, en una realización, la longitud de las vueltas de las rutas sinuosas en las zonas térmicas (es decir, el número de electrodos en las zonas térmicas) puede llegar a ser progresivamente más pequeña en la dirección de la progresión de la gotita para que los ciclos se aceleren según la gotita es transportada a lo largo de la ruta a una velocidad constante de electrodo a electrodo. De forma similar, la longitud de las vueltas de las rutas sinuosas en las zonas térmicas (es decir, el número de electrodos en las zonas térmicas) puede llegar a ser progresivamente mayor en la dirección de la progresión de la gotita, para que los ciclos se ralenticen según la gotita es transportada a lo largo de la ruta a una velocidad constante de electrodo a electrodo. En otra realización, la longitud de las vueltas de las rutas sinuosas en la zona térmica (es decir, el número de electrodos en las zonas térmicas) puede variar para proporcionar tiempos de incubación más largos en números de ciclos específicos, tales como el primer ciclo.

Así, las gotitas se pueden alimentar continuamente en una ruta que serpentea entre las dos zonas de temperatura y ser transportadas a una velocidad fija y uniforme. El tiempo de residencia en las zonas de temperatura se puede determinar por el número de electrodos que la gotita debe atravesar para pasar a través de la zona de temperatura. En esta realización, las gotitas pueden no estar sincronizadas térmicamente en el sentido de que gotitas diferentes pueden estar en fases diferentes del ciclo de temperatura al mismo tiempo. Esta realización puede ser útil para reducir el tamaño del accionador de gotitas disponiendo de los electrodos en el accionador de gotitas de manera que ocupa menos espacio.

También hay que señalar que la configuración sinuosa de electrodos u otras configuraciones de flujo continuo descritas en la presente memoria, si bien se ilustraron en general con dos zonas de temperatura pueden tener cualquier número de zonas de temperatura.

La figura 24 ilustra una configuración de electrodos 2400 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración de electrodos 2400 ilustra una realización que incluye una ruta sinuosa 2425, en la que una o más de las vueltas de la ruta sinuosa 2425 incluyen una ruta de acceso 2420. En la realización ilustrada, las rutas de acceso 2420 se configuran para el transporte de gotitas desde rutas sinuosas 2425 a una zona de control de la temperatura establecida por el elemento de control de la temperatura 2405. El elemento de control de la temperatura 2405 puede estar configurado, por ejemplo, para mantener las gotitas amplificadas antes de la detección. Por ejemplo, las gotitas se pueden mantener a temperatura ambiente o a una temperatura seleccionada para preservar los componentes las gotitas antes de la detección. Así, durante el funcionamiento, una serie de gotitas puede ser transportada una larga ruta sinuosa 2425 para transportar las gotitas entre zonas térmicas 1810. Con respecto a cada gotita, cuando se ha realizado un número predeterminado de ciclos, la gotita puede ser transportada fuera de la ruta sinuosa 2425 a través de la ruta de acceso 2420 y transportada para la detección o a una zona de almacenamiento para mantenerla pendiente de detección.

La figura 25 ilustra una configuración de electrodos 2500 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración de electrodos 2500 es como la configuración de electrodos 2400 de la figura 24, excepto que la configuración 2500 incluye zonas de estacionamiento 2505 para almacenar las gotitas antes de la detección sin necesidad de activación del electrodo. Las zonas de estacionamiento 2505 se pueden establecer, por ejemplo, mediante una variedad de características físicas y/o químicas. Por ejemplo, las zonas de estacionamiento 2505 se pueden establecer mediante características físicas dentro del espacio de operaciones con gotitas o en el sustrato superior o en el sustrato inferior (por ejemplo, barreras, pocillos, indentaciones y/o protuberancias), así como mediante características químicas, tales como regiones hidrófilas. Las características físicas y/o químicas pueden cooperar para retener las gotitas 1815 en su lugar durante la detección y/o pendientes de ella. Así, durante el

funcionamiento, una serie de gotitas puede ser transportada una larga ruta sinuosa 2425 para transportar las gotitas entre zonas térmicas (no ilustrada). Con respecto a cada gotita 1815, cuando se ha realizado un número predeterminado de ciclos, la gotita 1815 puede ser transportado fuera de la ruta sinuosa 2425 a través de la ruta de acceso 2420 y transportada a una zona de estacionamiento 2505 para mantenerla pendiente de detección.

7.4 Bucle de flujo continuo

La figura 26 ilustra una configuración de electrodos 2600 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración de electrodos 2600 incluye electrodos 1805 dispuestos para formar un bucle de electrodos 2605. Las gotitas 1815 son transportadas a lo largo de una ruta de electrodos en un bucle a través de zonas térmicas para efectuar el ciclado térmico. Las gotitas pueden entrar en el bucle, pasar por el bucle un número predeterminado de veces, y después salir del bucle. La entrada y la salida pueden proporcionarse, por ejemplo, mediante rutas de electrodos de acceso (no mostradas) y/o a través de una o más aberturas de un exterior del accionador de gotitas (por ejemplo, a través de un sustrato superior o inferior o cualquier otra vía en el accionador de gotitas).

El transporte puede ser constante, es decir, las gotitas se mueven continuamente alrededor del bucle a una velocidad constante o las gotitas pueden moverse a diferentes velocidades pero a una velocidad promedio sustancialmente idéntica. Para realizaciones de transporte constante, la disposición de electrodos puede estar configurada para establecer el tiempo de residencia requerido en cada zona térmica. El transporte puede ser periódico, es decir, las gotitas pueden ser retenidas en una zona térmica durante un período de tiempo, entonces transportadas a la otra zona térmica a través del bucle.

Los bucles pueden acomodar de manera eficaz una gama de gotitas, y en caso necesario se pueden cargar con el número máximo de gotitas de una parte de un protocolo de ciclado térmico o para todo el protocolo. El transporte de gotitas alrededor de un bucle puede ser unidireccional o puede ser bidireccional (es decir, la dirección de transporte de las gotitas puede ser reversible). La detección puede llevarse a cabo en el mismo bucle, o las gotitas pueden ser transportadas lejos del bucle para la detección. Una circulación constante puede aumentar la mezcla y uniformidad térmica dentro de la gotita, y hacer circular cada gotita a través de la misma ruta puede reducir la variabilidad debido a las variaciones espaciales de temperatura dentro de la zona térmica.

La figura 27 ilustra una configuración de electrodos 2700 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración de electrodos 2700 incluye múltiples rutas bucle de electrodos 2705. La configuración de electrodos 2700 también incluye rutas de acceso de electrodos 2710 para el transporte de gotitas sobre y/o fuera de la ruta bucle de electrodos 2705. Un protocolo de ciclado térmico puede implicar uno o más de los bucles 2705. Por ejemplo, se puede utilizar una serie de cuatro bucles 2705 para llevar a cabo un protocolo de ciclado térmico en el que se ciclan múltiples gotitas en cada bucle. En términos generales, las gotitas deben estar separadas por 1 ó 2 posiciones de los electrodos vacías en los bucles, por lo que el número máximo de gotitas en cada bucle es igual a 1/2 n o 1/3 n, donde n es el número total de electrodos en el bucle, donde n es el número de electrodos en el bucle. La detección puede ser en tiempo real o se pueden usar los datos de punto final de cada uno de los ciclos para establecer una curva utilizada para cuantificar producto en la muestra.

La figura 28 ilustra una configuración de electrodos 2800 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración eléctrica 2800 incluye una ruta bucle de electrodos 2805 y subrutas bucle de electrodos 2810. Las subrutas bucle de electrodos 2810 están configuradas para proporcionar un área de espera para las gotitas en las zonas térmicas. En la configuración 2810 y configuraciones similares, se pueden ejecutar protocolos en los que una

o más gotitas tienen que mantenerse en una zona térmica durante un período de tiempo que es más largo que el tiempo de residencia eficaz basado únicamente en la velocidad de transporte. Se apreciará que las rutas bucle de electrodos 2810 pueden ser reemplazadas con estructuras ramificadas u otros tipos de bucles.

Cuando un bucle está presente, el almacenamiento puede llevarse a cabo haciendo girar las gotitas alrededor de un subbucle 2810 hasta que se accede a una gotita específica. La gotita específica puede entonces ser transportada a través de la ruta bucle de electrodos 2805 a la otra zona térmica. En la otra zona térmica, la gotita específica puede almacenarse en el bucle o hacerse pasar a través del bucle y dirigirse de nuevo a la zona térmica de partida. El movimiento alrededor de la ruta bucle de electrodos 2805 y alrededor de la subruta bucle de electrodos 2810 puede ser unidireccional o puede ser bidireccional. También se apreciará que otras realizaciones con rutas lineales de electrodos, tales como las ilustradas en las figuras 18-20, también pueden incluir rutas de electrodo en forma de bucle o rutas ramificadas de electrodos dentro de las zonas térmicas.

7.5 Dispensación de alícuotas en un ciclo de flujo continuo

La figura 29 ilustra una configuración de electrodos 2900 de un accionador de gotitas de la invención. La configuración de electrodos 2900 ilustra una configuración de ciclado térmico de flujo continuo en el que se separaron subgotitas de una gotita mayor para la detección. La configuración de electrodos 2900 incluye una primera ruta de electrodos 2905 que incluye electrodos 2907 configurados para el transporte de una gotita de ciclado térmico 2910 hacia atrás y hacia adelante entre zonas térmicas establecidas por los elementos de control térmico

110. Se apreciará que la ruta de electrodos 2905 puede ser sustituida por una o más rutas bucles de electrodos y/o por disposiciones sinuosas de flujo continuo, tales como los descritos en la presente memoria. La configuración de

electrodos 2900 también incluye una segunda ruta de electrodos 2915 que incluye electrodos 2917 configurados para dispensar una subgotita 2912 procedente de la gotita de ciclado térmico 2910. Los electrodos 2907 son generalmente más grandes que los electrodos 2917, y por lo tanto sustentan gotitas de volúmenes relativamente mayores 2910, desde las que se puede dispensar múltiples subgotitas de volúmenes menores 2912. La ruta de electrodos A ilustra la gotita 2910 durante el ciclado térmico que es transportada entre las zonas térmicas establecidas por los elementos de control térmico 1810. La ruta de electrodos B ilustra parte de una operación de dispensación en la que la gotita 2910 se coloca sobre un electrodo de la ruta de electrodos 2905 próxima a la ruta de electrodos 2915. Los electrodos 2917 en la ruta de electrodos 2915 se activan, provocando así la formación de una extensión alargada de la gotita 2910. La ruta de electrodos C ilustra la desactivación de uno o más electrodos intermedios 2917 para causar la formación de la subgotita 2912 en la ruta de electrodos 2915. La subgotita 2912 puede someterse a detección donde se forma y/o puede ser transportada lejos para la detección.

En términos generales, en un enfoque de dispensación de alícuotas en flujo continuo, el tamaño de la gotita de ciclado térmico 2910 es varias veces el tamaño de las subgotitas 2912 que se retiran para la detección. En algunas realizaciones, se puede añadir una nueva gotita a la gotita de ciclado térmico después de la retirada de una subgotita para la detección. La gotita añadida puede incluir, por ejemplo, tampón o uno o más reactivos adicionales para la reacción de ciclado térmico. De esta manera, la gotita de ciclado térmico se puede mantener en un volumen constante. En la realización ilustrada en la figura 29, los electrodos 2917 utilizados para dispensar una subgotita desde la gotita de ciclado térmico 2910 son más pequeños que los electrodos de ciclado térmico 2907 para acomodar subgotitas 2912 más pequeñas. Sin embargo, en una configuración alternativa, las gotitas usadas para dispensar subgotitas pueden ser del mismo tamaño que las gotitas utilizadas para el transporte de las gotitas de ciclado térmico. En algunos casos, las gotitas de ciclado térmico pueden ser transportadas como gotitas alargadas en forma de torpedo, y las subgotitas pueden ser dispensadas del final de las gotitas en forma de torpedo, por ejemplo, mediante la desactivación de un electrodo intermedio que subyace a la gotita alargada.

En un enfoque relacionado, un conjunto de gotitas de muestra se cicla térmicamente, y se retira una subgotita de un miembro del conjunto después de cada ciclo. En este enfoque, si existen n gotitas de muestra en el conjunto, entonces se puede retirar una subgotita a partir de una gotita cada n ciclos. Este enfoque tiene la ventaja de que apoya un protocolo de ciclado térmico que usa un intervalo más pequeño de tamaños de gotita. Por ejemplo, se pueden usar 10 reacciones en paralelo de gotitas 4X para proporcionar 40 puntos finales de ciclado térmico.

En otra realización relacionada, una gotita más grande se puede ciclar térmicamente varias veces, antes de ser dividida en gotitas más pequeñas, que se pueden ciclar térmicamente como se ha descrito anteriormente. Este enfoque puede ser útil en cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria que implican ciclado térmico de múltiples subgotitas. De esta manera, se puede establecer una concentración inicial de producto (por ejemplo, producto de ácido nucleico), de modo que cada subgotita incluirá producto suficiente para asegurar la amplificación en la subgotita. Así, la invención incluye varias realizaciones en las que múltiples rutas de electrodos están asociadas unas con otras de una manera similar a la asociación de las rutas de electrodos 2905 y 2915 ilustrada en la figura 29. Por ejemplo, en una realización se incluyen tres rutas de electrodos, un primer paso que tiene electrodos grandes, una segunda ruta tenía los electrodos de tamaño intermedio, y un tercer paso que tiene electrodos de tamaño pequeño. Como otro ejemplo, un diseño puede incluir una primera ruta de electrodos que tiene electrodos de tamaño grande. Esta primera ruta de electrodos puede estar asociada con dos o más segundas rutas de electrodos que tienen electrodos de tamaño más pequeño. Cada una de las segundas rutas de electrodos puede estar asociada con una o más terceras rutas de electrodos que tiene electrodos de tamaño aún más pequeño. Una primera gotita grande se puede ciclar térmicamente en la primera ruta de electrodos, y a continuación dispensarse en las dos o más segundas rutas de electrodos. A partir de las dos o más segundas rutas de electrodos una gotita se puede dispensar en las una o más de las terceras rutas de electrodos para la detección. Las gotitas en las segundas rutas de electrodos se pueden ciclar térmicamente, y después de cada número predeterminado de ciclos térmicos, las subgotitas se pueden dispensar en las una o más terceras rutas de electrodos para la detección.

7.6 Ciclado por lotes

En una realización, la invención proporciona una técnica de ciclado térmico por lotes de detección en serie. En este enfoque, se pueden generar subgotitas de muestra a partir de una muestra y disponer en una zona de control de la temperatura. Un elemento de control de la temperatura puede ciclar temperaturas en la zona de control de la temperatura de acuerdo con un protocolo de ciclado térmico predeterminado. Una gotita se puede detectar después de cada número predeterminado de ciclos. Así, por ejemplo, en una realización, se detecta una gotita diferente después de cada ciclo. De esta manera, cada gotita se somete a la detección una sola vez. Los datos se pueden utilizar para generar una curva adecuada para cuantificar la sustancia diana presente en la muestra.

La figura 30 ilustra una configuración de electrodos 3000 de un accionador de gotitas de la invención. El accionador de gotitas 3000 incluye un conjunto de electrodos 3005 y subgotitas de muestra 3010 dispuestas sobre la matriz de electrodos 3005. Las subgotitas de muestra 3010 se pueden dispensar a partir de una sola gotita de muestra (no mostrada). Las subgotitas de muestra 3010 se pueden cargar sobre el conjunto de electrodos 3005 a través de una ruta de electrodos (no mostrada) o a través de una o más aberturas (no mostradas) a un exterior de un espacio de operaciones con gotitas (cuando está presente).

Uno o más elementos de control de temperatura del ciclado térmico 3015 se asocian con la matriz 3005, por ejemplo, subyace y/o se superpone a la matriz. El elemento de control de temperatura del ciclado térmico 3015 se calienta y se enfría activa o pasivamente a las gotitas de ciclado térmico 3010 en la matriz de electrodos 3005. Durante el ciclado térmico, un sensor se hace pasar sobre las gotitas 3010 para detectar la señal procedente de las gotitas 3010. Por ejemplo, un sensor se puede hacer pasar sobre las gotitas 3010 a una velocidad suficiente para detectar una única gotita después de cada ciclo. En términos generales, un sensor se puede hacer pasar sobre las gotitas 3010 a una velocidad suficiente para detectar una única gotita cada n ciclos, donde n es el número seleccionado para conseguir puntos finales suficientes para generar una curva útil para cuantificar producto diana en las gotitas a un nivel predeterminado de significación estadística. En una realización alternativa, se pueden utilizar dos o más sensores. En todavía otra realización, se puede utilizar una matriz de detectores, tal como una cámara CCD o una matriz de pares LED-fotodiodo, para detectar múltiples gotitas simultáneamente.

En una realización similar, se pueden generar subgotitas de muestra a partir de una muestra dispuesta en una zona de control de la temperatura. Un elemento de control de la temperatura puede ciclar temperaturas en la zona de control de la temperatura de acuerdo con un protocolo de ciclado térmico predeterminado. Después de cada n rondas de ciclado térmico, se pueden transportar una o más gotitas lejos de la zona de control de la temperatura para la detección. Por ejemplo, el transporte puede ser llevado a cabo mediante operaciones con gotitas a lo largo de una ruta de electrodos. Las gotitas pueden ser detectadas según dejan la zona de control de temperatura, o pueden ser estacionadas para el análisis en un momento posterior.

En un enfoque relacionado, las gotitas pueden ser transportadas secuencialmente sobre una unidad de ciclado térmico, una o más a la vez cada n ciclos térmicos. Entonces, la detección puede llevarse a cabo a continuación del ciclo final. Por ejemplo, se puede formar una imagen de la matriz de gotitas secuencialmente, simultáneamente o en subconjuntos tras el ciclo final, y los datos de la detección pueden utilizarse para generar una curva para cuantificar producto diana en la muestra original.

La figura 31 ilustra otra configuración de electrodos 3100 de la invención en la que se cicla térmicamente una gotita de muestra, y después de cada n ciclos, una subgotita de muestra se dispensa y se transporta lejos para la detección. En la realización ilustrada, se establece un reservorio 3105 mediante una junta 3110. Un elemento de control de la temperatura 3115 subyace al reservorio 3105. Una abertura 3120 en junta 3110 proporciona una ruta de líquido para transportar subgotitas de muestra 3130 lejos del reservorio 3105. Una ruta de electrodos 3125 proporciona un medio para dispensar subgotitas de muestra 3130 procedentes de la gotita de muestra 3135. Las subgotitas de muestra 3130 dispensadas se pueden someter a detección. Por ejemplo, se pueden someter a detección inmediatamente después de la formación, o se pueden transportar lejos para detección en un momento posterior.

En una realización similar, se puede proporcionar la gotita 3135 en un reservorio exterior al espacio de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas. La gotita 3135 se puede ciclar térmicamente en el reservorio, y las subgotitas 3130 se pueden dispensar desde el reservorio hacia el espacio de operaciones con gotitas usando cualquiera de una variedad técnicas de dispensación de gotitas. Por ejemplo, el reservorio puede estar asociado con una ruta de líquido que se extiende desde el reservorio al espacio de operaciones con gotitas en la proximidad de uno o más electrodos. Los electrodos pueden ser utilizados para dispensar gotitas en el espacio de operaciones con gotitas después de cada n ciclos de ciclado térmico. Las gotitas dispensadas se pueden someter entonces a etapas de ensayo y/o detección adicionales.

La figura 32 ilustra una realización que es similar a la configuración de electrodos 3100 de la figura 31. La configuración de electrodos 3200 ilustra cómo subgotitas 3130 pueden transportarse lejos y disponer en una matriz, seguido de barrido por un detector. Por ejemplo, el detector puede detectar cada gotita de forma secuencial a lo largo de una ruta, tal como la ruta marcada como A. Alternativamente, en esta y otras realizaciones descritas en la presente memoria, se puede formar una imagen de todas las gotitas juntas, usando un detector de matriz, tal como una cámara CCD o un matriz de pares LED-fotodiodo, por ejemplo.

7.7 Técnicas de detención de la reacción

La figura 33 ilustra una realización en la que se utiliza una configuración de electrodos 3300 para disponer en una matriz las gotitas de reacción 3305. Las gotitas de reacción 3305 pueden ser gotitas de ciclado térmico (por ejemplo, gotitas preparadas para la amplificación), como se ilustra en otros ciertos ejemplos de la presente memoria, o pueden ser de alguna otra reacción en la que una reacción se está produciendo con el tiempo. Se puede proporcionar un elemento de control de la temperatura 3310 para ciclado térmico o si no controlar la temperatura de las gotitas de reacción 3305. Las gotitas de detención de la reacción 3315 se pueden transportar en contacto con las gotitas de reacción 3305. Las gotitas de detención de la reacción 3315 pueden incluir uno o más reactivos para detener o detener sustancialmente la reacción que se produce en las gotitas de reacción 3305. En una realización, las reacciones en las gotitas de reacción 3305 se inician de forma sustancialmente simultánea, y las gotitas de reacción 3305 se combinan con las gotitas de detención de la reacción 3315 secuencialmente. Después de la detención, las gotitas combinadas pueden ser objeto de otras etapas de ensayo y/o detección adicionales para el desarrollo de una curva indicativa de la cinética de la reacción. En otra realización, las reacciones en las gotitas de

reacción 3305 se inician de forma secuencial, y las gotitas de reacción 3305 se combinan con las gotitas de detención de la reacción 3315 de forma sustancialmente simultánea. Del mismo modo, después de la detención, las gotitas combinadas pueden ser objeto de etapas de ensayo y/o detección adicionales para el desarrollo de una curva indicativa de la cinética de la reacción. En un proceso intermedio, las reacciones se inician secuencialmente y se detienen secuencialmente.

Obsérvese que en cualquiera de las diversas realizaciones de la invención en las que gotitas de reacción se combinan con gotitas de detención de la reacción, las gotitas de reacción pueden transportarse en contacto con las gotitas de detención de la reacción, las gotitas de detención de la reacción pueden transportarse en contacto con las gotitas de reacción, y/o las gotitas de reacción y las gotitas de detención de la reacción pueden transportarse una sobre otra. Las gotitas de detención de la reacción pueden entregarse según sea necesario o pueden disponerse en una matriz con las gotitas de reacción y combinarse de acuerdo con un protocolo de cadencia predeterminado.

Una ventaja de este enfoque en un protocolo de amplificación de ciclado térmico es que tras la detención, las gotitas pueden continuar siendo sometidas a ciclado térmico, pero la amplificación cesará como resultado de la combinación con las gotitas de detención.

En una realización relacionada, los solicitantes han descubierto que ciertas reacciones, tales como la amplificación de ácido nucleico, pueden detenerse utilizando campos electrostáticos. Por ejemplo, una reacción puede ser detenida mediante la aplicación de una señal de voltaje al electrodo subyacente o a otro electrodo en las proximidades de la gotita. La señal de voltaje aplicada puede ser seleccionada para que sea suficiente para detener

o detener sustancialmente la reacción. Por ejemplo, la señal de voltaje requerida para detener la reacción de amplificación puede ser simplemente una señal de voltaje sostenido con relación a la señal de voltaje requerido para llevar a cabo el transporte de la gotita desde un electrodo al siguiente. Así, por ejemplo, una reacción de amplificación de ácido nucleico puede ser detenida deteniendo el transporte de la gotita de amplificación del ácido nucleico y reteniendo la gotita en un electrodo activado durante un período de tiempo que es suficiente para detener la reacción. El nivel de voltaje, ciclo, y/o tipo de voltaje también se pueden ajustar hasta que se detiene sustancialmente la reacción de amplificación. En algunos casos, una configuración de electrodos puede incluir un sitio de desactivación especializada en el que está presente un electrodo que tienen características seleccionadas para desactivar una reacción en el sitio. Además, en realizaciones en las que la amplificación se lleva a cabo usando gotitas dispuestas en los electrodos, puede ser útil en algunos casos desactivar o si no controlar el voltaje en el electrodo subyacente a la gotita preparada para la amplificación durante la amplificación, de manera que el electrodo no cause una interferencia indebida en la amplificación continua de la gotita.

En otra realización relacionada, un accionador de gotitas puede incluir uno o más inhibidores situados en las proximidades de los electrodos de operaciones con gotitas. Por ejemplo, los inhibidores pueden ser reactivos inhibidores secos secados en la superficie del accionador de gotitas. Como otro ejemplo, un inhibidor puede ser un material tal como platino o nitruro que se sabe inhiben la PCR. Por ejemplo, el inhibidor puede ser una almohadilla de platino expuesta o alambre dispuesto de manera que una gotita pueda ser transportada en contacto con la almohadilla o el alambre con el fin de detener la reacción. Los inhibidores pueden, en algunas realizaciones, disponerse en varias localizaciones de los electrodos en el accionador de gotitas.

Durante el funcionamiento, las gotitas de reacción pueden ser transportadas de forma secuencial en contacto con los inhibidores, y las gotitas pueden ser posteriormente sometidas a etapas de análisis y/o detección adicionales para desarrollar una curva indicativa del punto final de la reacción en el momento en que se detuvo la reacción. De forma similar, las reacciones se pueden iniciar de forma secuencial, y transportarse simultáneamente en contacto con una matriz de inhibidores. En otra realización, las reacciones se pueden iniciar de forma secuencial, y las gotitas pueden ser transportadas secuencialmente en contacto con los inhibidores. En cualquier caso, las gotitas incluirán gotitas que han experimentado períodos de reacción o ciclos térmicos diferentes, y los productos de reacción en las gotitas pueden ser sometidos a etapas de ensayo y/o pasos de detección adicionales con el fin de desarrollar una curva indicativa del progreso de la reacción con respecto al tiempo o a los ciclos.

7.8 Muestreo del progreso de una reacción

La invención proporciona una realización relacionada, en la que se proporciona un accionador de gotitas y se proporciona una gotita de reacción en el accionador de gotitas. La gotita de reacción se caracteriza por que una o más reacciones están teniendo lugar en la gotita de reacción. Por ejemplo, las reacciones pueden incluir reacciones químicas, reacciones bioquímicas y/o reacciones biológicas. A medida que las reacciones progresan, se dispensan una o más subgotitas desde la gotita de reacción. Cada una de estas subgotitas puede ser tratada de una manera que detiene la reacción. Por ejemplo, la temperatura de una subgotita se puede ajustar a la temperatura en la que la reacción se detiene o se detiene sustancialmente. Como otro ejemplo, cada subgotita se puede combinar con una gotita de reactivo que incluye un reactivo que detiene la reacción. Cada subgotita puede ser retirada de la gotita de reacción original en un momento diferente, y las subgotitas pueden ser sometidas a análisis adicional para desarrollar una curva que indica el progreso de la reacción. En una realización relacionada, las reacciones en las subgotitas no se detienen, pero cada subgotita se somete a detección inmediatamente después de ser dispensada desde la gotita de reacción original. En todavía otra realización, una gotita original puede subdividirse en numerosas

subgotitas, y las subgotitas pueden ser sometidas a un protocolo de detección en el que cada subgotita se somete a la detección en un momento diferente. Los datos recogidos pueden ser utilizados para desarrollar una curva indicativa de la cinética de la reacción. En una realización, la dispensación de subgotitas está mediada por electrodos, por ejemplo, dispensación de gotitas mediada por electrohumectación mediada por dielectroforesis.

En una realización relacionada, la cinética de reacción se miden combinando gotitas en un accionador de gotitas para iniciar una serie de reacciones en diferentes momentos, seguido por formación de imágenes de las gotitas, al mismo tiempo, y el uso de los datos para desarrollar una curva indicativa de la cinética de la reacción. En todavía otra realización relacionada, la cinética de la reacción se midió combinando gotitas de reactivo en el accionador de gotitas para iniciar una serie de reacciones en diferentes momentos, seguido del barrido de las gotitas de reacción con un sensor en diferentes momentos, y el desarrollo de una curva basada en los diferentes períodos de reacción indicativa de la cinética de la reacción. En cualquiera de estas realizaciones, la reacción puede o no puede ser detenida antes de la detección, dependiendo de los requisitos de la reacción particular de que se trate.

7.9 Realizaciones adicionales de ciclado térmico

Son posibles una amplia variedad de realizaciones adicionales con varios atributos dentro del alcance de la invención. Algunos ejemplos son los siguientes:

La figura 34 ilustra una configuración de electrodos 3400 de un accionador de gotitas de la invención en la que las rutas de ciclado térmico 3425 están dispuestas radialmente. Un elemento central de control de la temperatura 3410 tiene forma de anillo. El elemento de control de la temperatura 3410 puede tener una amplia variedad de formas alternativas, tales como forma de disco, hexagonal, octogonal, etc. En la realización ilustrada, las rutas de ciclado térmico 3405 irradian hacia fuera desde el elemento de control de la temperatura 3410. También se proporcionan los elementos exteriores de control de temperatura 3415. Las rutas de electrodos 3425 se extienden desde el elemento central de control de temperatura 3410 a los elementos exteriores de control de temperatura 3415. La configuración de electrodos 3400 se puede proporcionar como parte de una configuración de electrodos más grande. Las gotitas pueden introducirse a las rutas de electrodos 3425 a través de aberturas hacia el exterior del accionador de gotitas y/o a través de otras rutas de electrodos (no mostradas), o en un sistema abierto que carece de un sustrato superior, las gotitas pueden simplemente depositarse en la superficie de operaciones con gotitas. Los elementos exteriores de control de temperatura 3415 se ilustran como elementos de control de temperatura individuales conectados mediante el cable 3416. Sin embargo, se apreciará que los elementos exteriores de control de temperatura 3415 pueden tener forma diferente; por ejemplo, los elementos exteriores de control de temperatura 3415 pueden sustituirse por un solo elemento exterior de control de temperatura en forma de anillo, por ejemplo, un anillo que tiene una configuración de anillo circular, hexagonal, octogonal, u otra.

La figura 35 ilustra la configuración de electrodos 3500 que tiene múltiples elementos de control de temperatura 3510 conectados por un conjunto de electrodos que tiene múltiples conjuntos de rutas de transporte de gotitas 3515. Los electrodos reservorio 3520 se proporcionan también adyacentes a rutas de transporte de gotitas 3515. Los elementos de control de temperatura 3510 pueden ser iguales o diferentes. Los elementos de control de temperatura 3510 pueden utilizarse para establecer zonas de control de temperatura. Las temperaturas en las zonas de control de temperatura pueden ser iguales o diferentes.

La figura 36 ilustra una configuración de electrodos 3600 en la que los electrodos (por ejemplo, triangulares alargados o en forma de cuña alargada) adheridos 3610 y 3615 se utilizan para transportar una gotita entre los elementos de control de temperatura 3620 y 3625. La activación del electrodo 3610 mientras que el electrodo 3615 está desactivado transportará una gotita hacia el elemento de control de la temperatura 3620. La activación del electrodo 3615 y la desactivación del electrodo 3610 transportarán la gotita desde el elemento de control de temperatura 3620 de vuelta al elemento de control de temperatura 3625. También se puede utilizar este tipo de configuración de electrodos u otros tipos de configuraciones que hacen uso de gradientes de campo eléctrico, tales como los descritos en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2008/80275, titulada "Droplet Actuator Structures" presentada el 17 de octubre de 2008.

La figura 37 es una fotografía de un sustrato inferior 3700 de un cartucho de un accionador de gotitas de la invención. El diseño (de cobre sobre una placa de circuito impreso), incluye electrodos reservorio 3710 para la dispensación de muestra y reactivos. El diseño incluye bucles de electrodos 3716 para hacer circular gotitas entre las zonas de temperatura 3740. El diseño incluye rutas de transporte 3720 para realizar operaciones con gotitas utilizando reactivos y/o gotitas de muestra. Por ejemplo, las rutas de transporte 3720 pueden utilizarse para el transporte de reactivos y/o gotitas de muestra entre electrodos reservorio 3710 y bucles de electrodos 3716 y/o operaciones de preparación de muestra o y/o otras operaciones con gotitas. El diseño incluye electrodos de detección 3718. Los electrodos de detección 3718 son más grandes que los electrodos de operaciones con gotitas que constituyen los bucles de electrodos 3716 y las rutas de transporte 3720. El cartucho del accionador de gotitas puede incluir un sustrato superior (no mostrado) que cubre la disposición de electrodos y separado del sustrato inferior para formar un espacio de operaciones con gotitas adecuado para realizar operaciones con gotitas. El sustrato superior puede incluir un electrodo de referencia o electrodo de tierra eléctricamente expuesto a gotitas en el espacio de operaciones con gotitas. Ejemplos de sustratos superiores adecuados incluyen los descritos en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2008/075160, titulada "Droplet Actuator with Improved top Sustrate", presentada el 4 de septiembre de 3708. El espacio de operaciones con gotitas se puede llenar con un fluido de carga líquido, tal como un fluido de carga líquido que sea inmiscible con las gotitas que están siendo sometidas a operaciones con gotitas.

5 La figura 38 es un diagrama del diseño del sustrato inferior 3700 mostrado en la figura 37. El diagrama ilustra el posicionamiento de barras calentadoras 3808 que se utilizan para la creación de zonas de temperatura de ciclado térmico en el cartucho.

Las figuras 39 a 43 muestran los resultados de la ejecución de un experimento de ciclado térmico usando el diseño de cartucho mostrado en las figuras 37 y 38. Los detalles experimentales son los siguientes: 10 ! SARM/sistema EvaGreen: ∀ Diana: fragmento de 176 bp del gen mecA (8-10 copias por genoma). ∀ Muestra: gADN de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) (ATCC#700699D-5) en tampón. ! Experimentos de cuantificación: 15 ∀ 100.000 - 1 copias de genoma de SARM (300 pg - 3 fg de ADNg en la reacción). ∀ Se añadió la misma cantidad de ADN a 660 nL de reacción en el accionador de gotitas y a 50 μL de reacción en el BioRad (75X de diferencia de concentración). ! Mezcla para PCR: ∀ Colorante Eva Green. 20 ∀ Platinum Taq. ! Fluido de carga: ∀ Hexadecano. ! Programa térmico (típicamente): ∀ Hotstart: 60 s a 95.

25 ∀ 40 ciclos (10 s 95 C, 20 s a 60 C). Se ejecutó un experimento de comparación en el accionador de gotitas y en un sistema comercial de PCR en tiempo real (BioRad IQ5). La cantidad de ADN genómico de entrada se varió para corresponder a la cantidad de ADN en 1 a 100.000 células de SARM. Los valores de CT fueron los siguientes:

: 100.000 87.000 10.000 1.000 100 10 1 0

Cartucho: - 14,3 16,4 20,1 23,2 27,1 29,2 -

Bio-Rad: 20,4 - 23,5 27,1 30,4 34,2 35,5 38,3

30 La figura 39 muestra los datos primarios y los datos normalizados para la amplificación en el cartucho.

La figura 40 muestra los datos normalizados del cartucho de la invención en comparación con los datos normalizados de la BioRadIQ5. La figura 41 muestra los resultados de 12 reacciones simultáneas (3 réplicas cada uno de 4 concentraciones) en un

accionador de gotitas. Cada conjunto de réplicas se amplificó en un único bucle.

35 La figura 42 muestra los resultados de otro experimento de ciclado térmico usando el diseño de cartucho mostrado en las figuras 37 y 38. Los detalles experimentales son los siguientes: ! Candida albicans/sistema Taq Man:

∀ Diana: fragmento de 172 bp del gen 18S de ARN ribosómico (70-100 copias por genoma). ∀ Muestra: ADNg de Candida albicans (ATCC#10232D-5).

! Mezcla para PCR:

∀ Sonda TaqMan (FAM-BHQ).

∀ iTaq Bio-Rad.

! Fluido de carga:

∀ Aceite de silicona.

! Programa térmico:

∀ Hotstart: 120 s a 95 C.

∀ 40 ciclos (15 s 95 C, 60 s a 60 C).

La cuantificación en la figura 42 es por el número de organismos o equivalentes de genoma de la cantidad de entrada de ADNg.

La figura 43 muestra el protocolo con gotitas utilizado en un experimento en el que la amplificación se separó de la detección. Se cicló sin tinte una población de gotitas idénticas. Periódicamente se retiró una gotita, se combinó con una gotita de colorante, se sometió a detección y a continuación se transportó a un reservorio de residuos. Se utilizó el sistema de SARM descrito anteriormente, con 87.000 copias y 5 ciclos de separación. En el paso 1, se dispensaron seis gotitas y se transportaron a un bucle de ciclado térmico del accionador de gotitas ilustrado en las figuras 37 y 38. Las gotitas incluían reactivos de amplificación, pero carecían de reactivos de detección. En el paso 2, se dispusieron tres de las gotitas en cada zona de control de la temperatura. En el paso 3, las gotitas se hicieron girar en el bucle para realizar el ciclado térmico. En el paso 4, después de n ciclos térmicos, se retiró una gotita del bucle de ciclado térmico. En el paso 5, la gotita retirada fue transportada lejos de las zonas térmicas. En el paso 6, la gotita retirada se combinó con una gotita de detección, se sometió a detección, y se desechó. Los pasos 4, 5, y 6 se repitieron para gotitas posteriores.

La figura 44 muestra los resultados del experimento descrito con respecto a la figura 43. Los resultados muestran que una curva de amplificación se puede generar usando un protocolo en el que la amplificación se separa de la detección y en el que un conjunto de subgotitas individuales de muestra son cicladas térmicamente de forma diferencial para producir una sola curva de amplificación en tiempo real.

7.10 Reacciones de Detención

En varias realizaciones de la presente memoria se desea detener o de otra manera detener sustancialmente una reacción de amplificación de ácido nucleico, se puede utilizar una variedad de reactivos conocidos para detener las reacciones de amplificación. Por ejemplo, los reactivos pueden interferir con la actividad de la polimerasa, por ejemplo, uniéndose a, desnaturalizando y/o degradando la polimerasa. Se proporcionan ejemplos adicionales en la tabla siguiente:

Inhibidor: Mecanismo propuesto Referencia

Iones calcio: Competición con el Mg++ como cofactor de la polimerasa Bickley et al. (1996)

EDTA: Quelación de iones Mg++ Rossen et al. (1992)

Exopolisacáridos: Unión a la ADN polimerasa Monteiro et al. (1997)

Heparina: Unión a ácidos nucleicos Satsangi et al. (1994)

IgG: Unión a ácidos nucleicos Abu Al-Soud et al. (2000)

Lactoferrina: Liberación de iones hierro Abu Al-Soud y Rådström (2001)

Fenol: Desnaturalización de la ADN polimerasa Katcher y Schwartz (1994)

Proteasas: Degradación de la ADN polimerasa Powell et al. (1994)

7.11 PCR Digital

Se ha informado de la PCR digital como una forma sumamente cuantitativa para medir el número exacto de copias de plantillas en una muestra. Una gotita de muestra se puede dispensar o dividir en múltiples subunidades con tamaño de nanolitros. La mayoría de las gotitas hija incluirán cero o una copia (algunas podrían tener 2 o más copias debido a la distribución de Poisson). La invención proporciona técnicas para la realización de PCR digital en un accionador de gotitas. Son preferibles electrodos unitarios de tamaño pequeño. En una realización, los electrodos

son electrodos de aproximadamente 200x200 μm. La altura del espacio de operaciones con gotitas también se puede ajustar. Una altura del espacio de operaciones con gotitas de aproximadamente 100 μm con los electrodos de 200x200 μm establecerá gotitas que tienen un volumen de aproximadamente 4 nL. Se pueden generar numerosas de tales gotitas utilizando diversas técnicas de dispensación de gotitas. En un ejemplo, una serie de electrodos se activan para producir una cadena alargada, a continuación, un grupo intercalado de los electrodos activados se desactiva, produciendo gotitas hija con tamaño de nanolitros en los electrodos activados. También se pueden usar técnicas tradicionales de dosificación y de transporte para formar una serie de gotitas hija. Todo el accionador de gotitas puede ser ciclado térmicamente para llevar a cabo la amplificación o se puede ciclar las gotitas individuales a través de zonas de control térmico con el fin de efectuar el ciclado térmico. Las gotitas se pueden mantener en posición durante toda la reacción por voltaje, patronaje químico o físico en la superficie del accionador de gotitas. Se puede detectar la presencia de ácido nucleico amplificado en las gotitas, y se puede determinar la cantidad de ácido nucleico diana.

Así, por ejemplo, la invención proporciona un método que incluye proporcionar una gotita de muestra que comprende un ácido nucleico diana, y que comprende opcionalmente reactivos de amplificación; dispensar subgotitas de la gotita de muestra, y si los reactivos de amplificación no están presentes en la gotita de muestra, combinar cada subgotita con reactivos de amplificación para producir una gotita preparada para la amplificación; someter cada subgotita a un protocolo de ciclado térmico seleccionado para amplificar el ácido nucleico diana; detectar el producto amplificado en cada subgotita; y la determinar del número de subgotitas que contienen una porción de muestra a partir la que se forma dicho producto amplificado. En algunas realizaciones, al menos una de dichas subgotitas incluye al menos una molécula de ácido nucleico diana. Los reactivos de amplificación pueden incluir cualquier reactivo adecuado para amplificar la diana. En algunos casos, los reactivos de amplificación incluyen al menos una sonda que se hibrida con moléculas diana amplificadas y tiene una propiedad de fluorescencia que cambia tras la hibridación o como consecuencia de la hibridación. La determinación del número de subgotitas que contienen una porción de muestra a partir de la que se forma dicho producto amplificado puede incluir detectar el cambio en la fluorescencia consecuencia de la hibridación de dicha al menos una sonda. La determinación del número de subgotitas que contienen una porción de muestra a partir de la que se forma dicho producto amplificado puede incluir la formación de imágenes de todas los subgotitas juntas, o la formación de imágenes de gotitas individuales o de grupos de gotitas de forma secuencial, por ejemplo, transportando gotitas de una en una o en subgrupos a través de una ventana de detección. Las subgotitas pueden tener volúmenes menores de aproximadamente 1 μL. En otras realizaciones, las subgotitas tienen volúmenes en el intervalo de más de aproximadamente 1 μL a aproximadamente 1.000 μL, o de más de aproximadamente 100 μL a aproximadamente 500 μL. Se pueden realizar varios pasos del método en un espacio de operaciones con gotitas o en una superficie de operaciones con gotitas de un accionador de gotitas. En algunos casos, las subgotitas se comprimen en una conformación aplanada o en forma de disco entre dos sustratos en el espacio de operaciones con gotitas. Cuando se proporciona un espacio de operaciones con gotitas, puede tener cualquier altura adecuada para la realización de las operaciones con gotitas requeridas. En algunos casos, el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura en el intervalo de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 1.000 μm, o de más de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 500 μm. En ciertas realizaciones, el ciclado térmico se lleva a cabo mediante el transporte de gotitas desde una zona térmica a otra. En ciertas realizaciones, el accionador de gotitas carece de cámaras de muestra y/o carece de un canal de flujo continuo. En ciertas realizaciones, la dispensación de subgotitas a partir de la gotita de muestra se efectúa sin un fluido de desplazamiento que desplace la muestra desde el canal de flujo continuo. La gotita de muestra puede estar provista de reactivos de amplificación, o los reactivos de amplificación se pueden añadir usando operaciones con gotitas, por ejemplo, combinando cada subgotita con reactivos de amplificación para producir una gotita preparada para la amplificación. La gotita de muestra puede estar provista de reactivos de detección, o los reactivos de detección se pueden añadir usando operaciones con gotitas, por ejemplo, combinando cada subgotita con reactivos de detección para producir una gotita preparada para la detección. Los reactivos de detección pueden añadirse antes o después de la amplificación.

En una realización relacionada, después de que una gotita de muestra se ha dividido en un conjunto de gotitas hija de nanolitros, un conjunto diferente de cebadores se puede mezclar con cada gotita hija para llevar a cabo la PCR para una secuencia específica de ácidos nucleicos. Este enfoque facilita la evaluación de los niveles de expresión de múltiples ácidos nucleicos simultáneamente en un accionador de gotitas.

7.12 Manipulación de perlas magnéticamente sensibles para detección

En un accionador de gotitas basado en PCR (por ejemplo, PCR cuantitativo en tiempo real (QRT-PCR, por sus siglas en inglés)), se pueden inmovilizar ácidos nucleicos diana para reacciones de amplificación en perlas magnéticamente sensibles. Para cuantificar los productos amplificados, las gotitas de reacción que incluyen las perlas magnéticamente sensibles se pueden transportar a una ventana de detección en un accionador de gotitas, usando operaciones con gotitas. En algunos ejemplos (por ejemplo, QRT-PCR), la detección del producto amplificado puede emplear colorantes fluorescente, tales como SybrGreeen, para cuantificar la cantidad de producto amplificado. Sin embargo, las perlas magnéticamente sensibles que se dispersan en la gotita de muestra pueden interferir con la detección de los colorantes fluorescentes bloqueando la luz fluorescente procedente del dispositivo de detección (por ejemplo un fluorímetro).

Se puede utilizar un campo magnético para (a) retirar las perlas magnéticas de una gotita de amplificación para la detección de nucleótidos marcados no incorporados, o (b) tirar de las gotitas hacia un lado en una gotita de amplificación para detección de nucleótidos marcados no incorporados.

La figura 45 ilustra una realización de la invención en la que se tira de las perlas hacia un lado dentro de una gotita alargada de manera que ninguna perla está expuesta a la ventana de detección durante la detección. El imán puede proporcionarse, por supuesto, en una variedad de disposiciones respecto a la superficie de las operaciones con gotitas o a las operaciones con gotitas. Por ejemplo, como se ilustra en la figura 45, el imán está situado debajo de la superficie de operaciones con gotitas. Sin embargo, el imán puede estar situado alternativamente encima del accionador de gotitas, lateralmente adyacente al accionador de gotitas, en el espacio de operaciones con gotitas, y/o en o parcialmente en uno o más de los sustratos que forman el accionador de gotitas. En resumen, el imán puede proporcionarse en cualquier posición que atraiga a las perlas a una región de la gotita que está fuera de, o al menos sustancialmente fuera de, la ventana de detección.

En una realización alternativa, el imán puede tirar de las perlas completamente fuera de la gotita que está siendo sometida a detección. Por ejemplo, un accionador de gotitas puede incluir un imán potente en una región del accionador de gotitas establecida para la retirada de las perlas. La potencia del imán puede seleccionarse para tirar de perlas magnéticas fuera de cualquier gotita que se mueva en la región de retirada de las perlas del accionador de gotitas. En algunos casos, la retirada de las perlas puede ser efectivamente irreversible.

Las figuras 46A, 46B, y 46C ilustran vistas desde arriba de una región de un accionador de gotitas y muestran un método y los resultados de la manipulación de perlas magnéticamente sensibles para mejorar la detección de analito. El accionador de gotitas 4600 puede incluir una ruta o una matriz de electrodos de operaciones con gotitas 4610 (por ejemplo, electrodos de electrohumectación) que están configurados para la realización de las operaciones con gotitas necesarias para un ensayo basado en ácido nucleico, tal como una reacción de amplificación, tal como PCR. En particular, se proporciona una ventana de detección 4612 en la superficie de operaciones con gotitas. La ventana de detección 4612 puede estar situada en un cierto electrodo de operaciones con gotitas 4610D, o puede ser una región a la que una gotita puede ser transportada utilizando electrodos de operaciones con gotitas, opcionalmente con otros mecanismos de transporte, tales como superficies hidrófilas o variaciones en la topografía del sustrato superior y/o inferior. El accionador de gotitas 4600 puede incluir una gotita de muestra 4620 que puede ser transportada a lo largo de los electrodos de operaciones con gotitas 4610 mediante operaciones con gotitas. La gotita de muestra 4620 puede incluir una cantidad de perlas, tales como perlas magnéticamente sensibles 4624 que tienen una afinidad por un ácido nucleico diana a analizar.

Como se muestra en la figura 46A, la gotita de muestra 4620 que tiene perlas 4624 en ella está posicionada en el electrodo de operaciones con gotitas 4610D, que se encuentra dentro del rango de ventana de detección 4612. La ventana de detección 4612 tiene un diámetro por regla general más pequeño que la gotita de muestra 4620. Las perlas magnéticamente sensibles 4624 se dispersan dentro de la gotita de muestra 4620 que incluye el área ocupada por la ventana de detección 4612 y pueden interferir con la detección de la señal de amplificación, por ejemplo, colorantes fluorescentes, bloqueando la luz fluorescente procedente del dispositivo de detección (es decir, un fluorímetro), lo que resulta en lecturas dispersas y ruido de fondo.

Como se muestra en la figura 46B, un imán 4630 se coloca en las cercanías de la gotita de muestra 4620. El imán 4630 puede ser un imán permanente o un electroimán. El imán 4630 se coloca a una distancia del electrodo de operaciones 4610D y de la gotita de muestra 4620 para proporcionar un campo magnético suficiente para atraer y agregar las perlas magnéticamente sensibles 4624 sustancialmente hasta el borde de la gotita de muestra 4620 y sustancialmente lejos de la ventana de detección 4612. En algunos casos, la fuerza del campo magnético proporcionado por el imán 4630 es tal que las perlas 4624 no forman un agregado apretado y se pueden redistribuir fácilmente en posteriores operaciones con gotitas. En otros casos, la agregación no es un problema, ya que la retirada de las perlas pretende ser esencialmente permanente.

Como se muestra en la figura 46C, el imán 4630 se puede usar para separar perlas magnéticamente sensibles 4624 de la gotita de muestra 4620. Después de un número suficiente de reacciones de ciclo térmico (por ejemplo, aproximadamente 10 ciclos), la cantidad de ácido nucleico amplificado en la fase líquida de una gotita de PCR puede ser una cantidad suficiente para ser detectada con precisión en ausencia de perlas magnéticamente sensibles. El uso de operaciones con gotitas permite que la gotita de muestra 4620 pueda ser transportado mediante operaciones con gotitas dentro y fuera del campo magnético del imán 4630. Como la gotita de muestra 4620 se transporta lejos del imán 4630, una concentración de perlas 4626 se deja atrás en el electrodo de operaciones con gotitas 4610M. El volumen de gotita con perlas 4626 puede ser justo lo suficientemente grande para encapsular las perlas 4624. La gotita de muestra 4620 está ahora lo suficientemente desprovista de perlas magnéticamente sensibles y la detección de fluorescencia puede avanzar en ausencia de la interferencia de las perlas.

La figura 46D muestra una representación gráfica de los datos de PCR en tiempo real que se obtuvieron a partir de reacciones de ciclado térmico utilizando los métodos de la figura 46B (es decir, perlas magnéticamente sensibles agregadas por un imán) y la figura 46C (gotita de PCR desprovista de perlas magnéticamente sensibles). La figura 46D muestra la inestabilidad y el ruido de fondo en la señal de detección que pueden resultar de la interferencia de

las perlas magnéticamente sensibles durante la detección de una señal fluorescente. Cuando se retiran las perlas magnéticamente sensibles, por ejemplo, en el ciclo térmico 11 (indicado por una flecha) la señal de detección está suficientemente estabilizada.

7.13 Fluoróforos polares

Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos utilizan el ciclado térmico, es decir, calentar y enfriar alternativamente una gotita que incluye muestra y reactivos de amplificación a través de una serie definida de cambios de temperatura. En amplificaciones basadas en accionadores de gotitas (por ejemplo, PCR realizada usando operaciones con gotitas, tales como operaciones con gotitas mediadas por electrodos), se pueden usar elementos de control de temperatura (por ejemplo, unidades Peltier, bloques de calentamiento, unidades de refrigeración, etc.) para controlar la temperatura del fluido de carga en la en superficie de un accionador de gotitas o en un espacio de operaciones con gotitas. Sin embargo, la elevada temperatura requerida para el ciclado térmico puede provocar la pérdida de una señal de detección cuando se utiliza un aumento en la fluorescencia como método de detección y se usa un colorante fluorescente (es decir, fluoróforo), tal como SybrGreen, como colorante de detección. Los fluoróforos permeables a las células, tales como el colorante SYBR® Green, pueden tener suficiente solubilidad en una fase hidrófoba (por ejemplo, fluido de carga oleoso) y se pueden repartir desde una gotita de PCR acuosa al fluido de carga, particularmente a elevadas temperaturas, como las que se producen durante el ciclado térmico.

Como una alternativa a los fluoróforos que penetran en las células, se pueden usar fluoróforos polares o impermeable a las células. Por ejemplo, el fluoróforo polar EvaGreen® puede utilizarse en la PCR sin pérdida significativa de una señal de detección de fluorescencia. Se puede utilizar una serie de diferentes fluoróforos polares, tales como el fluoróforo polar EvaGreen® (disponible de Biotium, Hayward, CA) y TO-PRO1, en la PCR para detectar los productos de amplificación.

7.14 Pasivación

La amplificación de ácidos nucleicos requiere varios pasos que incluyen una serie de diferentes componentes de reacción, tales como la plantilla de ácido nucleico, cebadores de oligonucleótidos, reactivos y enzimas, que se incluyen dentro de una gotita de reacción. Muchos de estos componentes de una gotita de amplificación, tales como ácidos nucleicos, proteínas (es decir, enzimas), y/o colorante (por ejemplo, colorante fluorescente), pueden absorberse potencialmente sobre superficies de sustrato (por ejemplo, electrodos de operaciones con gotitas) y/o distribuirse en el fluido de carga (por ejemplo, fluido de carga oleoso) de un accionador de gotitas. La pérdida de estos componentes críticos en la superficie del sustrato y/o en el fluido de carga de un accionador de gotitas puede dar como resultado la reducción de la eficacia de una reacción de PCR y/o el fracaso de una reacción de PCR. En una realización, la invención proporciona una técnica de pasivación de superficies, en la que los materiales se vuelven "pasivos" con relación a otros materiales antes de utilizar los materiales juntos. Las técnicas de pasivación de superficies de la invención pueden reducir y/o eliminar la pérdida de componentes críticos desde una gotita de amplificación a la superficie de un accionador de gotitas.

Los reactivos de pasivación (es decir, agentes de bloqueo) se puede seleccionar para reducir y/o evitar la unión de plantillas de ácido nucleico y/o cebadores de oligonucleótidos a superficies de sustrato y/o pérdidas al fluido de carga. Ejemplos incluyen otras moléculas de ácidos nucleicos, tales como moléculas de ADN no diana y/o cantidades adicionales de cebadores de oligonucleótidos.

Los reactivos de pasivación (es decir, agentes de bloqueo) se puede seleccionar para reducir y/o evitar la unión de proteínas a superficies de sustrato y/o pérdida al fluido de carga. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, diversos polímeros tales como polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG); tensioactivos, tales como Tween, y albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés).

En un ejemplo, la superficie de un accionador de gotitas se pretrata con una cantidad de agente(s) de pasivación incluida dentro de una gotita de pretratamiento. La gotita de pretratamiento se puede transportar a lo largo de una o más rutas de PCR de un accionador de gotitas a través de uno o más ciclos de reacción. A medida que gotita de pretratamiento se cicla en las rutas de PCR, los agentes de pasivación, tales como ácidos nucleicos, proteínas (es decir, enzimas), y/o colorante (por ejemplo, colorante fluorescente), puede absorberse sobre superficies de sustrato (por ejemplo, electrodos de operaciones con gotitas) y/o distribuirse en el fluido de carga (por ejemplo, fluido de carga oleoso) y saturar de forma eficaz los sitios de absorción potenciales para la unión posterior de componentes en una gotita de PCR. En otro ejemplo, se puede añadir directamente una cantidad de agente(s) de pasivación en una gotita de PCR (es decir, pasivación dinámica). En este ejemplo, los agentes de pasivación dentro de una gotita de PCR pueden competir eficazmente con componentes de la reacción por los sitios de absorción disponibles sobre superficies de sustrato y/o el fluido de carga de un accionador de gotitas.

7.15 Altura del espacio

Los accionadores de gotitas que se utilizan para llevar a cabo la PCR pueden incluir un sustrato inferior y un sustrato superior separados por un espacio de operaciones con gotitas. Debido a que la tensión superficial disminuye con el

aumento de la temperatura, si la tensión superficial es demasiado baja, la gotita puede dividirse o fragmentarse a una temperatura elevada. Por lo tanto, una configuración de altura del espacio que puede funcionar bien a temperatura ambiente puede no funcionar a temperaturas elevadas debido a que la tensión superficial se reduce de forma eficaz. Los inventores han descubierto que este efecto puede ser compensado mediante el uso de un espacio más grande. La tensión superficial (energía) es la misma para un espacio más grande, pero la zona es más grande por lo que es necesaria más energía total para que la gotita se fragmente. Por regla general, la altura del espacio de operaciones con gotitas en un accionador de gotitas que se utiliza para realizar ciclado térmico puede ser de aproximadamente 200 μm. Sin embargo, una altura del espacio demasiado pequeña puede dar lugar a la fragmentación de una gotita de amplificación durante las operaciones con gotitas, tal como cuando se transporta una gotita entre las zonas de ciclado térmico. Fragmentación de una gotita de PCR puede dar como resultado la pérdida de los ácidos nucleicos diana y de los componentes reactivos. La pérdida de estos componentes críticos puede dar lugar a una reducción suficiente de la eficacia de una reacción de amplificación y/o al fracaso de una reacción de amplificación.

La altura del espacio de operaciones con gotitas se puede seleccionar con relación al electrodo de tamaño unitario y al volumen de la gotita de tamaño unitario tal que la gotita sea de forma sustancialmente esférica. Las gotitas con una menor relación de aspecto están más cerca del tamaño esférico y las gotitas con la relación de aspecto mayor tienen más forma de disco. Los inventores han descubierto que las gotitas en forma de disco requieren menos voltaje para las operaciones con gotitas tales como transporte, dispensación, y división de gotitas, pero que también tienden a formar microgotitas con más facilidad que las gotitas más esféricas. Las gotitas sustancialmente esféricas requieren un voltaje más alto para las mismas operaciones con gotitas, pero tienen una menor tendencia a formar microgotitas durante las operaciones con gotitas. En los ensayos que requieren que las gotitas estén sometidas a temperaturas elevadas, se potencia la formación de microgotitas. En un ejemplo, los inventores encontraron que relaciones de separación entre electrodos:altura del espacio de 4:1 ó 3:1 (equivalentes a una separación del electrodo de aproximadamente 1.200 μm y una altura del espacio de operaciones con gotitas de aproximadamente 300 o aproximadamente 400 μm) reducían sustancialmente la formación de microgotitas.

La invención proporciona un accionador de gotitas con una mayor altura del espacio a fin de mejorar la estabilidad de la gotita (por ejemplo, reducir suficientemente la fragmentación de una gotita de PCR) durante las operaciones con gotitas. Por ejemplo, una altura del espacio de operaciones con gotitas de aproximadamente 320 μm a aproximadamente 350 μm proporciona una mejora de la estabilidad de una gotita de PCR transportada mediante operaciones con gotitas.

En una realización, la separación entre electrodos del electrodo de operaciones con gotitas de tamaño unitario es de aproximadamente 1.200 μm, y el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura mayor de aproximadamente 250 μm. En otra realización, la separación entre electrodos del electrodo de operaciones con gotitas de tamaño unitario es de aproximadamente 1.200 μm, y el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura en el intervalo de aproximadamente 250 μm a aproximadamente 500 μm. En otra realización, la separación entre electrodos del electrodo de operaciones con gotitas de tamaño unitario es de aproximadamente 1.200 μm, y el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura en el intervalo de aproximadamente 275 μm a aproximadamente 450 μm. En otra realización, la separación entre electrodos del electrodo de operaciones con gotitas de tamaño unitario es de aproximadamente 1.200 μm, y el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura en el intervalo de aproximadamente 300 μm a aproximadamente 400 μm. En otra realización, la separación entre electrodos del electrodo de operaciones con gotitas de tamaño unitario es de aproximadamente 1.200 μm, y el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura en el intervalo de aproximadamente 320 μm a aproximadamente 375 μm. En otra realización, la separación entre electrodos del electrodo de operaciones con gotitas de tamaño unitario es de aproximadamente 1.200 μm, y el espacio de operaciones con gotitas tiene una altura en el intervalo de aproximadamente 320 μm a aproximadamente 350 μm.

En una realización, la invención proporciona un accionador de gotitas que tiene una relación de separación entre electrodos:altura del espacio en el intervalo de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 2,8:1. En otra realización, la invención proporciona un accionador de gotitas que tiene una relación de separación entre electrodos:altura del espacio en el intervalo de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 3:1. En aún otra realización, la invención proporciona un accionador de gotitas que tiene una relación de separación entre electrodos:altura del espacio en el intervalo de aproximadamente 4,3:1 a aproximadamente 3,4:1.

En otra realización, la invención proporciona un accionador de gotitas que tiene una separación entre electrodos de aproximadamente 1.200 μm y una altura del espacio de operaciones con gotitas en el intervalo de aproximadamente 175 μm (relación de aspecto de ~ 7:1) a aproximadamente 450 μm (relación de aspecto de ~ 2,8:1). En aún otra realización, la invención proporciona un accionador de gotitas que tiene una separación entre electrodos de aproximadamente 1.200 μm y una altura del espacio de operaciones con gotitas en el intervalo de aproximadamente 200 μm (relación de aspecto de ~ 6:1) a aproximadamente 400 μm (relación de aspecto de ~ 3:1). En aún otra realización, la invención proporciona un accionador de gotitas que tiene una separación entre electrodos de aproximadamente 1.200 μm y una altura del espacio de operaciones con gotitas en el intervalo de aproximadamente 280 μm (4,3:1) a aproximadamente 350 μm (3,4:1).

La altura del espacio en un accionador de gotitas se puede controlar, por ejemplo, mediante un "sandwich", un material espaciador de espesor adecuado entre las superficies inferior y superior del accionador de gotitas. Alternativamente, se puede adherir una capa de material a la superficie interior del sustrato, ya sea superior o inferior, para proporcionar un aislante para establecer un espacio de separación de espesor adecuado entre al menos una parte de los dos sustratos. Alternativamente, el aislante puede ser una parte integral de uno o ambos de los sustratos, como por ejemplo, un saliente u otra estructura moldeada o conformada en el sustrato durante un moldeo por inyección u otro procedimiento de formación. Será fácilmente evidente para los expertos en la técnica una variedad de medios adicionales de control de la altura del espacio para lograr el aumento deseado de la relación de aspecto.

7.16 Reducción de la contaminación por arrastre

La amplificación de ácido nucleico basada en gotitas en un accionador de gotitas incluye una secuencia de operaciones con gotitas en las que gotitas preparadas para la amplificación son transportadas de ida y vuelta, usando operaciones con gotitas mediadas por electrodos, entre las zonas térmicas de reacción y un detector. Cuando este proceso implica múltiples gotitas que viajan a lo largo de una ruta común o de rutas cercanas, los componentes residuales de una gotita de amplificación pueden llevarse de una gotita a otra, contaminando las gotitas de amplificación posteriores en la secuencia de operaciones con gotitas. La invención proporciona un accionador de gotitas y un método para la reducción de la contaminación cruzada entre gotitas de amplificación que utiliza gotitas de amplificación protegidas con aceite.

El accionador de gotitas de la invención puede incluir un sustrato inferior y un sustrato superior que están separados por un espacio de operaciones con gotitas. En las zonas designadas del accionador de gotitas, el espacio de operaciones con gotitas puede incluir un fluido de carga líquido, tal como un fluido de carga oleoso. En otras áreas designadas del accionador de gotitas, el espacio de operaciones con gotitas se puede llenar con un fluido de carga gaseoso, tal como aire.

Una gotita protegida con aceite puede formarse, por ejemplo, llenando un reservorio de muestra con un aceite, cargando posteriormente el reservorio con una muestra acuosa, por ejemplo, una muestra de PCR, y usando operaciones con gotitas para dispensar o "pellizcar" una gotita acuosa de PCR que está rodeada por una capa de aceite. Para facilitar la formación de las gotitas de PCR protegidas con aceite, se pueden utilizar aceites de elevada viscosidad que tienen una elevada tensión superficial. Ejemplos de aceites adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceites heptadecano u octadecano. A medida que se dispensa una gotita de PCR protegida con aceite, puede ser transportada usando operaciones con gotitas en un área del accionador de gotitas que está desprovista de aceite (es decir, el espacio se llena con aire) para reacciones de PCR posteriores.

Los aceites de alta viscosidad pueden ser parcialmente sólidos o sólidos a temperatura ambiente (es decir, de aproximadamente 22ºC a 28ºC). Por ejemplo los puntos de fusión de los aceites heptadecano, octadecano, nonadecano, y eicosano son 20-22ºC, 26-29ºC, 30-34ºC, y 35-37ºC, respectivamente. Para la amplificación basada en un accionador de gotitas se puede seleccionar un aceite en base a su temperatura de fusión para diferentes aplicaciones. Por ejemplo, desde el punto de vista de la fabricación, en la que se requiere el envío de un accionador de gotitas, se puede llenar un reservorio con aceite a una temperatura por encima del punto de fusión del aceite seleccionado y después dejarlo enfriar y solidificar en el accionador de gotitas. Debido a que el accionador de gotitas basado en PCR normalmente funciona a aproximadamente 60ºC o más, el aceite seleccionado estaría en fase líquida y disponible para la formación de las gotitas de PCR protegidas con aceite.

7.17 Concentración y recogida de ácidos nucleicos diana

En algunas aplicaciones de amplificación de ácido nucleico basadas en accionadores de gotitas, puede ser necesario concentrar un analito (por ejemplo, bacterias, virus, hongos, y/o ácido nucleico) en un fluido de muestra antes del análisis de PCR. Por ejemplo, el volumen de un fluido de muestra puede ser demasiado grande y/o la concentración de un analito demasiado baja para proporcionar para el análisis óptimo.

Las figuras de la 47A a la 47I ilustran una vista lateral en sección transversal de una región de un accionador de gotitas 4700 e ilustran el uso de perlas de captura magnéticamente sensibles en un proceso de concentración y recogida de ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra para la amplificación y análisis del ácido nucleico.

Como se ilustra en la figura 47A, el accionador de gotitas 4700 puede incluir un sustrato inferior 4710. El sustrato inferior 4710 puede estar separado de un sustrato superior 4714 por un espacio de operaciones con gotitas 4716. Un electrodo reservorio 4718 puede estar dispuesto sobre el sustrato inferior 4710. El electrodo reservorio 4718 puede estar dispuesto en asociación con una ruta o una matriz de electrodos de operaciones con gotitas 4720 (por ejemplo, electrodos de electrohumectación), de tal manera que se puede dispensar una gotita desde el electrodo reservorio 4718 en la ruta o una matriz de electrodos de operaciones con gotitas 4720. Un dieléctrico puede revestir los electrodos. Una capa hidrófoba puede revestir el dieléctrico (o se puede seleccionar un dieléctrico hidrófobo). Se proporciona un reservorio 4730 en el sustrato superior 4714, que establece de una ruta de líquido desde el reservorio 4730 al espacio 4716 y en proximidad suficiente al electrodo reservorio 4718 con el fin de permitir que el electrodo interactúe con un líquido que fluye a través de la ruta de líquido. El reservorio 4730 puede ser de tamaño

suficiente para incluir, por ejemplo, aproximadamente 1 mililitro (mL) o más de un fluido de muestra. El reservorio 4730 incluye una cantidad de perlas de captura magnéticamente sensibles 4734. Las perlas de captura magnéticamente sensibles 4734 pueden ser, por ejemplo, perlas que incluyen un anticuerpo primario de captura, o secuencia de oligonucleótidos, o cualquier proteína de unión que tenga afinidad por un analito diana específico que proporcione un evento de unión y captura. El reservorio 4730 está sellado por un tabique 4738. El tabique 4738 proporciona una barrera contra la contaminación del reservorio 4730 por material no deseado.

Se asocia un imán 4740 con el accionador de gotitas 4700. El imán está dispuesto de tal manera que el electrodo reservorio 4718 está dentro del campo magnético del imán 4740. Imán 4740 puede ser, por ejemplo, un imán permanente o un electroimán. En un ejemplo, el imán 4740 es un imán permanente, cuya posición es ajustable de tal manera que se puede mover en la proximidad del electrodo reservorio 4718 o lejos del electrodo reservorio 4718. El imán 4740 puede utilizarse, por ejemplo, para atraer y/o inmovilizar las perlas de captura magnéticamente sensibles 4734. En funcionamiento, el imán 4740 se puede utilizar para ayudar en un proceso de concentración de un analito diana que está unido a perlas de captura magnéticamente sensibles 4734.

Se asocia un aparato de ultrasonidos 4742 con el accionador de gotitas 4700. El aparato de ultrasonidos 4742 puede usarse para aplicar la energía sónica (por ejemplo, ultrasonidos) a un fluido de muestra en el reservorio 4730 con el fin de agitar las partículas en el fluido. En un ejemplo, el aparato de ultrasonidos 4742 puede utilizarse para agitar suavemente y resuspender las partículas en un fluido de muestra. En otro ejemplo, el aparato de ultrasonidos 4742 puede utilizarse para agitar vigorosamente las partículas en un fluido de muestra. En algunas aplicaciones, el sonicado vigoroso puede utilizarse para romper las membranas celulares y liberar el contenido celular. Además, la posición del aparato de ultrasonidos 4742 con respecto al reservorio 4730 puede variar.

Se asocia un segundo imán 4744 con el accionador de gotitas 4700. El imán 4744 puede ser, por ejemplo, un imán permanente o un electroimán. El imán 4744 está dispuesto de tal manera que uno o más electrodos de operaciones con gotitas 4720 están dentro del campo magnético del imán 4744. El imán 4744 puede utilizarse, por ejemplo, para proporcionar un campo magnético para un segundo evento de captura que usa perlas magnéticamente sensibles con el fin de concentrar más y purificar un ácido nucleico diana.

Un ejemplo de un proceso de utilización de perlas de captura magnéticamente sensibles con el fin de concentrar y recoger el ácido nucleico diana procedente de un fluido de muestra puede incluir, pero no se limita a, los siguientes pasos:

La figura 47B muestra un primer paso en un proceso de concentración y recolección de ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra. En este paso se utiliza un dispositivo de carga 4750 (por ejemplo, jeringa y la aguja, micropipeta) para depositar una cantidad de fluido de muestra 4752 en el reservorio 4730. El fluido de muestra 4752 puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de lavado nasal, faríngeo de alrededor de 1 mL o más en volumen. El fluido de muestra 4752 puede incluir una cantidad de analitos diana 4754. Los analitos diana 4754 pueden ser, por ejemplo, dianas bacterianas, virales, y/o fúngicas que tengan afinidad por las perlas de captura magnéticamente sensibles 4734. Debido a que el electrodo reservorio 4718 no está activado y debido a que la posición del imán 4740 es tal que no hay sustancialmente ningún campo magnético presente en el electrodo reservorio 4718, el fluido de muestra 4752 se mantiene en el reservorio 4730.

La figura 47C muestra otro paso en un proceso de concentración y recogida de un ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra. En este paso se activa el aparato de ultrasonidos 4742 (por ejemplo, operación de bajo consumo de energía) y se utiliza para agitar suavemente y resuspender las perlas de captura magnéticamente sensibles 4734 en el líquido de muestra 4752. El aparato de ultrasonidos 4742 se puede activar durante un período de tiempo suficientes para proporcionar una mezcla y unión óptimas (es decir, la captura primaria) de analitos diana 4754 a perlas de captura magnéticamente sensible 4734.

La figura 47D muestra otro paso en un proceso de concentración y recogida de un ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra. En este paso, el aparato de ultrasonidos 4742 está apagado, la posición del imán 4740 es tal que hay un cierto campo magnético presente en el electrodo reservorio 4718 del accionador de gotitas 4700, y el electrodo reservorio 4718 está activado. Como resultado del campo magnético y la activación del electrodo reservorio 4718, las perlas de captura magnéticamente sensibles 4734 que incluyen analito diana 4754 unido, se asientan en el electrodo reservorio 4718 y se concentran eficazmente en el fluido de muestra 4752.

La figura 47E muestra otro paso en un proceso de concentración y recogida de un ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra. En este paso, el imán 4740 se mueve físicamente lejos del accionador de gotitas 4700 de tal manera que no hay sustancialmente ningún campo magnético presente en el electrodo reservorio 4718. Como resultado de la eliminación del campo magnético, las perlas de captura magnéticamente sensibles 4734 ya no están inmovilizadas sobre la superficie del electrodo reservorio 4718 y se distribuyen en un volumen de muestra dentro del espacio 4716. En este ejemplo, en el que el analito diana 4754 puede ser, por ejemplo, bacteriano, viral, y/o fúngico, la gotita del reactivo de lisis 4756 se transporta y se fusiona con el volumen de la muestra dentro del espacio 4716 usando operaciones con gotitas. Pueden usarse una o más gotitas de reactivo de lisis 4756 para proporcionar lisis suficiente del analito diana 4754 y liberar el ácido nucleico diana.

La figura 47F muestra otro paso en un proceso de concentración y recogida de un ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra. En este paso, el aparato de ultrasonidos 4742 se desplaza físicamente en la proximidad del electrodo de reservorio 4718, que se activa. El aparato de ultrasonidos 4742 se activa (por ejemplo, operación de alta energía) y se utiliza para agitar vigorosamente y mezclar el fluido de muestra 4752. El aparato de ultrasonidos 4742 puede activarse durante un período de tiempo que es suficiente para proporcionar lisis óptima del analito diana 4754 y liberación del ácido nucleico. En otra realización, un único aparato de ultrasonidos puede ser colocado estratégicamente de una manera que permite el sonicado simultáneo de una gotita en el espacio de operaciones con gotitas y del fluido en el reservorio. En aún otra realización, se puede proporcionar más de un aparato de ultrasonidos.

En un ejemplo, el sonicado vigoroso en combinación con un reactivo de lisis química y/o enzimática (es decir, la gotita de reactivo de lisis 4756) pueden ser útiles para muestras biológicas que incluyen patógenos fúngicos.

La figura 47G muestra otro paso en un proceso de concentración y recogida de un ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra. En este paso, la posición del imán 4740 es tal que existe un cierto campo magnético presente en el electrodo reservorio 4718 del accionador de gotitas 4700. Como resultado del campo magnético, las perlas de captura magnéticamente sensibles 4734 que tienen analito diana 4754 unido a ellas, se asientan sobre el electrodo reservorio 4718. Debido a que el analito diana 4754 ha sido lisado, el ácido nucleico se libera en el líquido de muestra 4752. Una o más gotitas de lisado 4758 que incluyen una cantidad de ácido nucleico diana 4760 (por ejemplo, ADN o ARN) se transportan usando operaciones con gotitas, lejos de electrodo de reservorio 4718 a lo largo de una ruta de electrodos de operaciones con gotitas 4720 hacia el imán 4744.

La figura 47H muestra otro paso en un proceso de concentración y recogida de un ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra. En este paso, una gotita de captura 4762 que incluye una cantidad de perlas de captura magnéticamente sensibles 4764 se posiciona en el segundo imán 4744 usando operaciones con gotitas. Las perlas de captura 4764 incluyen una cantidad de secuencias de oligonucleótidos que se utilizan para hibridarse con y capturar el ácido nucleico diana 4760 en la gotita de lisado 4758. Usando operaciones con gotitas, una o más gotitas de lisado 4758 son transportadas a y fusionadas con las gotitas de captura 4762. En este paso, el ácido nucleico diana 4760 se concentra y se purifica aún más.

La figura 47I muestra otro paso en un proceso de concentración y recogida de un ácido nucleico diana a partir de un fluido de muestra. En este paso, la gotita captura 4762 se lava usando una serie de operaciones con gotitas con el fin de retirar el material no unido. El ácido nucleico unido 4760 en la gotita de captura 4762 está ahora listo para la PCR.

En otra realización, en la que el analito diana 4754 es un ácido nucleico, las etapas de lisis (es decir, las figuras 47E y 47F) pueden no ser necesarias.

7.18 Muestra

En diversas realizaciones de la invención, la invención hace uso de una muestra de ácido nucleico. La muestra de ácido nucleico es una muestra que contiene potencialmente al menos un ácido nucleico diana o un ácido nucleico acoplado directa o indirectamente a una sustancia diana, tal como una molécula, célula u organismo diana. En ciertas realizaciones, una muestra de ácido nucleico puede subdividirse en submuestras. Por ejemplo, las subgotitas de muestra se pueden dispensar usando operaciones con gotitas a partir de una gotita de muestra.

Las submuestras individuales se pueden amplificar durante un número predeterminado de ciclos para generar una serie de medidas de punto final. Las medidas de punto final pueden incluir medidas de cada una de las submuestras (y/o de conjuntos de submuestras) tomadas después de, o al final de un cierto número predeterminado de ciclos de amplificación. Las medidas de punto final de diferentes submuestras se pueden utilizar para generar una curva que se puede usar para cuantificar el ácido nucleico diana presente en la muestra original. Por ejemplo, las medidas de punto final de diferentes subgotitas de muestra se pueden utilizar para generar una curva que se puede usar para cuantificar el ácido nucleico diana presente en la gotita de muestra, o la muestra original a partir de la que la gotita de muestra se deriva.

Una muestra de ácido nucleico puede ser una muestra procedente de un sujeto, un control, un patrón o una repetición. El ácido nucleico puede estar acoplado a otra sustancia, tal como una molécula diana, que es el analito de interés real. En diversas realizaciones, un protocolo puede implicar la amplificación de material procedente de una o más muestras de sujetos, así como amplificación de uno o más controles y/o repeticiones. En ciertas realizaciones, una submuestra particular, se utiliza para producir sólo un único punto de datos. En otras realizaciones se puede amplificar de forma diferencial múltiples subgotitas de muestra idénticas para producir una serie de puntos de datos que indican la cantidad de señal de amplificación detectada como una función del número de ciclos de amplificación.

Las muestras de ácido nucleico pueden, por ejemplo, derivar de muestras medioambientales, tales como muestras de aire, muestras de agua, muestras de suelo; muestras forenses, tales como muestras de cabello, células epiteliales, y otros residuos forenses; y otras muestras biológicas, tales como sangre completa, líquido linfático,

suero, plasma, sudor, lágrimas, saliva, esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido seminal, secreción vaginal, líquido seroso, líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, transudados, exudados, líquido quístico, bilis, orina, líquido gástrico, líquido intestinal, muestras de heces, líquidos que contienen células individuales o múltiples, líquidos que contienen orgánulos, tejidos fluidizados, organismos fluidizado, líquidos que contienen organismos multicelulares, hisopos biológicos y lavados biológicos.

7.19 Detección

En la práctica de la invención se pueden usar diversos enfoques para detectar la amplificación. Por ejemplo, en una realización cada subgotita de muestra se somete a una medida de la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda predeterminada. En una realización, la detección consigue simultáneamente con la reacción de amplificación. En otras palabras, mientras múltiples subgotitas de muestra se pueden amplificar, según cada subgotita de muestra completa su número predeterminado de ciclos, puede ser sometida a detección. Mientras que una gotita se somete a la detección, otras gotitas pueden continuar para ser amplificadas. En ciertas realizaciones, un grupo de gotitas se amplifican en general, al mismo tiempo, y después de cada n ciclos, al menos una gotita se somete a detección. El número de ciclos entre cada etapa de detección se puede seleccionar en base a los datos necesarios de un ensayo particular. En general, una cuantificación más precisa requerirá detección con un número o fracciones mayores de los ciclos totales de amplificación.

La detección se puede conseguir generalmente según las subgotitas de muestras se vuelven disponibles, es decir, según el número predeterminado de ciclos se completa. Las subgotitas de muestra se pueden analizar en su sitio o pueden transportarse o moverse a cualquier otro sitio para una detección posterior. Este último enfoque puede ser útil para separar las funciones de amplificación y detección. Por ejemplo, las subgotitas de muestra se pueden transportar a cualquier parte en el accionador de gotitas y estacionarse mientras esperan la detección. Cuando las subgotitas de muestra están preparadas para la detección, un sensor puede realizar un barrido de la región en la que las gotitas de muestra están estacionadas para tomar una medida de cada gotita. Alternativamente, las subgotitas de muestra se pueden transportar una o más al mismo tiempo en presencia de un sensor para detección. Por ejemplo, cada subgotita de muestra se puede transportar a través de una ventana de detección y se puede tomar una medida mediante un sensor para cada gotita mientras está presente en la ventana de detección.

Las gotitas se pueden someter a detección usando varias técnicas. En una realización, las gotitas se pueden transportar en presencia del detector. En esta realización, se pueden usar uno o más sensores fijos para conseguir la detección. Dicha configuración reduce el coste y complejidad del instrumento. En otra realización, el sensor se mueve en presencia de las gotitas para detección. Las gotitas se pueden disponer dentro o fuera del accionador de gotitas para detección en un momento posterior. Las gotitas colocadas se pueden someter a un barrido o se puede formar una imagen de ellas mediante un sensor. Por ejemplo, se puede formar una imagen de las gotitas colocadas mediante un detector matriz, tal como un CCD o matriz de LED/fotodiodos. Las gotitas se pueden mover en presencia del CCD o de la matriz de LED/fotodiodos y/o el CCD o la matriz de LED/fotodiodos se pueden mover en presencia de las gotitas.

Como ya se ha mencionado, en ciertas realizaciones se puede separar la amplificación en la detección. Esta ventaja se ve facilitada por el uso de múltiples reacciones de punto final, más que por múltiples medidas de la misma reacción con el tiempo. Este enfoque facilita también la adición de reactivo de detección después de la amplificación pero antes de la detección. La separación del ciclado térmico y la detección proporciona una mayor flexibilidad de diseño cuando se diseñan un accionador de gotitas capaz de realizar la aplicación con ácidos nucleicos.

En varias realizaciones, el reactivo de detección se añade a cada subgotita de muestra después de la amplificación pero antes o durante la detección. Por ejemplo, se pueden añadir gotita que incluyen colorantes de intercalado (tales con SYBR Green) y/o sondas fluorescibles a una subgotita de muestra después de la amplificación. Esta realización facilita el uso de reactivos que pueden inhibir la amplificación, ya que los reactivos se deberían añadir después de que la amplificación se ha completado. El reactivo se puede añadir antes o durante la detección. En otra realización, alguna parte de los ciclos de amplificación se puede realizar antes de la adición del reactivo de detección. En otras palabras, el reactivo de detección se puede añadir durante o antes de uno o más ciclos finales. Este enfoque puede ser útil para la química de detección que requiere que el reactivo de detección esté presente durante la polimerización, tal como los reactivos Taqman®.

Como se ha indicado, la separación de amplificación y detección mejora la flexibilidad de diseño para el accionador de gotitas y la instrumentación requerida para manejar el accionador de gotitas. Por ejemplo, un módulo detector y un módulo calentador pueden intercambiar sus posiciones cuando realizan sus respectivas funciones. Este enfoque permitiría que los calentadores se dispusiesen en ambos lado del accionador de gotitas sin interferir con la detección. En otro ejemplo se puede proporcionar una superficie separada para ciclado térmico y detección.

La detección se puede conseguir en cuestión de segundos, mientras que el ciclado térmico puede requerir desde minutos hasta una hora. Por consiguiente, un instrumento de detección se puede usar para apoyar múltiples termocicladores o un banco de termocicladores en un instrumento usado para controlar el ciclado térmico en múltiples accionadores de gotitas. Por ejemplo, se puede proporcionar un instrumento que tenga múltiples ranuras para ciclado térmico, y sólo una o unas pocas ranuras para detección. Los accionadores de gotitas pueden ser

movidos desde las ranuras de ciclado térmico a las ranuras de detección por un usuario, por medios robóticos o por otros medios.

Cuando los accionadores de gotitas están preparados para la detección, se pueden disponer de cualquier manera adecuada para la forma de detección a usar. Por ejemplo, se pueden alinear en una única fila o empaquetar en un conjunto denso. El espaciado y la disposición para la detección no están limitados por los requerimientos del ciclado térmico. La capacidad de disponer las gotitas en conjuntos 1-D ajustados reduce el coste y complejidad de un detector de barrido. El viaje total para el sensor se puede reducir a una detección lineal, sólo en la dirección de un eje. De forma similar, se puede usar un CCD o una matriz de LED/fotodiodos más pequeños.

Surgirán otras ventajas de diseño de los diferentes requisitos para el ciclado térmico y la detección. Por ejemplo, se puede requerir transparencia óptica para algunas formas de detección, pero puede no ser necesaria para ciertas configuraciones de ciclado térmico. Las propiedades térmicas se pueden optimizar para zonas de ciclado térmico de un accionador de gotitas, mientras se pueden optimizar propiedades ópticas para zonas de detección del accionador de gotitas. Además, los accionadores de gotitas de la invención se pueden emplear para almacenar conjuntos de gotitas para reanálisis en un momento posterior.

Entre otras ventajas, las técnicas de ciclado térmico de la invención facilitan la amplificación de una gotita sin requerir que un agente de detección, tal como un agente de unión, esté presente en la gotita durante la amplificación. Como se ha indicado, en algunos casos se pueden dispensar subgotitas procedentes de una gotita que experimenta ciclado térmico. Las subgotitas pueden salir del proceso de ciclado térmico y combinarse con un agente de detección apropiado, después someterse a detección. Los esquemas de detección de punto final como se han descrito en la presente memoria pueden emplear también esta técnica. Cada subgotita se puede combinar con una gotita que incluye un agente de unión después de que se ha completado el proceso de ciclado térmico.

En ciertas realizaciones, los métodos de la invención omiten el ciclado térmico de una mezcla de reacción de amplificación que incluye muestra y un agente de unión juntos. Las técnicas de la invención pueden, en ciertas realizaciones, excluir específicamente un detector que funciona para detectar una señal óptica de fluorescencia mientras la reacción de amplificación está en curso.

En varias realizaciones, en las que el agente de detección se añade después del ciclado térmico, se pueden emplear agentes que si no interferirían con la amplificación del ácido nucleico. Por ejemplo, se puede emplear un agente de unión, que inhibiría el ciclado térmico si estuviera presente durante la amplificación, en las técnicas de la invención en las que el agente de unión se añade después de la amplificación. Así, en ciertas realizaciones, la invención emplea agentes de unión que inhiben significativamente la tasa de amplificación de ácido nucleico, y reactivos para amplificación.

En otras realizaciones, la detección se puede conseguir usando nucleótidos marcados. Las plantillas se pueden unir a perlas y amplificarse usando un nucleótido marcado, tal como un nucleótido fluorescente. El nucleótido marcado se puede incorporar en las cadenas amplificadas, y la detección puede basarse en (a) la disminución del ácido nucleico marcado procedente de la gotita, y/o (b) la incorporación del ácido nucleico marcado en las cadenas amplificadas. Las técnicas de lavado de perlas, tal como las descritas en la patente de EE.UU. nº 7.439.014, titulada “Droplet-based Surface Modification and Washing”, pueden usarse, en ciertas realizaciones, para lavar y retirar el nucleótido marcado no unido para detección del nucleótido marcado incorporado en las cadenas amplificadas. Esta técnica se puede mejorar usando nucleótidos fluorescentes con perlas de captura con fluorescencia interna; las perlas amplificarán la fluorescencia de los nucleótidos fluorescentes.

En aún otra realización, la síntesis de ADN se puede medir en base a la producción de pirofosfato. En cada ciclo, la incorporación de un desoxitrinucleótido liberará una molécula de pirofosfato. La cantidad de pirofosfato liberada será proporcional a la longitud del amplímero menos la longitud de los cebadores. Al final de cada ciclo se pueden utilizar métodos químicos para detectar el pirofosfato. En algunos casos se pueden dispensar subgotitas procedentes de una gotita que experimenta un ciclado térmico y someterse a análisis de liberación de pirofosfato. Las subgotitas pueden salir del proceso de ciclado térmico y someterse a un protocolo de detección de pirofosfato.

Los esquemas de detección de punto final como se han descrito en la presente memoria pueden emplear también esta técnica. Las gotitas se pueden someter a un protocolo de detección de pirofosfato después de haberse completado el proceso de ciclado térmico. En cualquier caso, el protocolo de detección de pirofosfato se puede realizar usando operaciones con gotitas, tales como las descritas en la publicación de patente internacional nº WO/2007/120240, titulada “Droplet-Based Pyrosequencing”, publicada el 25 de octubre de 2007.

Se apreciará que los diversos planteamientos de detección descritos en la presente memoria se pueden usar en general con cualquiera de las realizaciones descritas en lo sucesivo.

7.20 Barra calentadora

Como se describe en la presente memoria y se muestra en las figuras 48A y 48B, una barra calentadora puede estar hecha de aluminio, tal como la barra de aluminio 4802, para una buena conductividad térmica. Las dos resistencias

4804 (15Ω cada una) se instalan en los dos extremos en el lado inferior para proporcionar un calentamiento uniforme. Se puede insertar una sonda termopar 4806 en el centro de la barra calentadora para proporcionar una medida de temperatura para el controlador PID del calentador. La barra calentadora se coloca en la cubierta del cartucho 4808 usando tornillos de posicionamiento 4810 y soportada debajo por muelles 4812. La fuerza de los muelles asegura un contacto ajustado entre la superficie de la barra calentadora y el cartucho de circuito impreso 4814 a calentar. La barra calentadora suspendida con muelles no entra en contacto con la cubierta del cartucho de forma se minimiza la transferencia de calor no deseado a la cubierta.

7.21 Sistemas

Como apreciará un experto en la técnica, la invención se puede incorporar como un método, sistema, o producto computarizado. Por consiguiente, varios aspectos de la invención pueden tomar la forma de realizaciones de equipos informáticos, realizaciones de programas informáticos (que incluyen microprogramas, programas informáticos residentes, microcódigo, etc.), o realizaciones que combinan aspectos de programas informáticos y equipos informáticos que en la presente memoria se pueden denominar todos en general “circuito”, “módulo” o “sistema”. Además, los métodos de la invención pueden tomar la forma de un producto de programa de ordenador en un medio de almacenamiento usable en un ordenador que tiene un código de programa usable en un computador incorporado en el medio.

Se puede utilizar cualquier medio adecuado usable en un ordenador para aspectos de programas informáticos de la invención. El medio usable en un ordenador o legible por un ordenador puede ser, por ejemplo pero no limitado a, electrónico, magnético, óptico, electromagnético, infrarrojo, o sistema semiconductor, aparato, dispositivo o medio de propagación. Ejemplos más específicos (una lista no exhaustiva) de los medios legibles por un ordenador incluirían algunos de o todos los siguientes: una conexión eléctrica que tiene uno o más cables, un disquete de ordenador portátil, un disco duro, una memoria de acceso aleatorio (RAM, por sus siglas en inglés), una memoria de sólo lectura (ROM, por sus siglas en inglés), una memoria de sólo lectura, programable y borrable (EPROM, por sus siglas en inglés, o “Flash”), una fibra óptica, una memoria de sólo lectura en un disco compacto portátil (CD-ROM, por sus siglas en inglés), un dispositivo de almacenamiento óptico, un medio de transmisión tal como los que soportan Internet o una intranet, o un dispositivo de almacenamiento magnético. Se apreciará que el medio usable en un ordenador o legible por un ordenador puede ser incluso papel u otro medio adecuado sobre el que el programa se imprime, ya que el programa puede ser capturado electrónicamente, a través, por ejemplo, de un barrido óptico del papel o del otro medio, después compilado, interpretado o procesado de otra forma de manera adecuada, si es necesario, y después almacenado en la memoria de un ordenador. En el contexto de este documento, un medio usable en un ordenador o legible por un ordenador puede ser cualquier medio que pueda contener, almacenar, comunicar, propagar, o transportar el programa para su uso por o en conexión con el sistema, aparato o dispositivo de ejecución de instrucciones.

El código del programa de ordenador para realizar operaciones de la invención se puede escribir en un lenguaje de programación orientado en un objeto tal como Java, Smalltalk, C++ o similares. Sin embargo, el código de programa de ordenador para realizar operaciones de la invención se puede escribir también en lenguajes de programación procesal convencional, tal como el lenguaje de programación “C” o lenguajes de programación similares. El código de programa se puede ejecutar completamente en el ordenador del usuario, parcialmente en el ordenador del usuario, como un paquete de programas informáticos autoejecutables, parcialmente en el ordenador del usuario y parcialmente en un ordenador remoto o completamente en un ordenador remoto o servidor. En este último caso, el ordenador remoto se puede conectar al ordenador del usuario a través de una red de área local (LAN, por sus siglas en inglés) o de una red de área amplia (WAN, por sus siglas en inglés), o la conexión se puede realizar con un ordenador externo (por ejemplo, a través de Internet usando un proveedor de servicios de Internet).

Ciertos aspectos de la invención se describen con referencia a varios métodos y etapas de métodos. Se entenderá que cada etapa de un método se puede implementar mediante instrucciones de programas para ordenador. Estas instrucciones de programas para ordenador se pueden proporcionar a un procesador de un ordenador con un propósito general, un ordenador con un propósito especial, u otro aparato de procesamiento de datos programable para producir una máquina, tal que las instrucciones, que se ejecutan a través de procesador del ordenador o de otro aparato de procesamiento de datos programable, creen medios para implementar las funciones/actos especificados en los métodos.

Las instrucciones del programa de ordenador se pueden almacenar también en una memoria legible por el ordenador que se puede dirigir a un ordenador o a otro aparato de procesamiento de datos programable para funcionar de una forma particular, tal que las instrucciones almacenadas en la memoria legible por ordenador producen un artículo o manufacturado que incluye medios de instrucciones que implementan varios aspectos de las etapas de los métodos.

Las instrucciones del programa de ordenador se pueden cargar también en un ordenador o en otro aparato de procesamiento de datos programable para causar la realización de una serie de etapas operacionales en el ordenador o en el otro aparato programable para producir un proceso implementado por ordenador tal que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador o en el otro aparato programable proporcionan etapas para

implementar varias funciones/actos especificados en los métodos de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de preparación de una muestra para análisis, el método comprende:

(a)

proporcionar un accionador de gotitas (4700) que comprende:

(i)

un sustrato de operaciones con gotitas (4710);

(ii)

electrodos (4720) dispuestos para llevar a cabo operaciones con gotitas en una superficie de operaciones con gotitas del sustrato de operaciones con gotitas (4710);

(iii) un sustrato superior (4714) que es una cubierta adyacente a la superficie de operaciones con gotitas y separada de la superficie de operaciones con gotitas para formar un espacio de operaciones con gotitas (4716) entre la superficie de operaciones con gotitas y la cubierta;

(iv)

un reservorio (4730) asociado con el sustrato superior (4714) y que contiene perlas magnéticamente sensibles (4734) que tienen una afinidad por uno o más analitos diana (4754) y/o sustancias que comprenden uno o más analitos diana (4754);

(v)

una ruta de líquido que se extiende desde el reservorio (4730) en el espacio de operaciones con gotitas (4716);

(vi)

una fuente de campo magnético (4740) asociada con el sustrato de operaciones con gotitas (4710) y configurada para producir un campo magnético suficiente para atraer las perlas magnéticamente sensibles (4734);

(b)

suministrar un fluido de muestra (4752) en el reservorio, la muestra comprende potencialmente uno o más de los analitos y/o sustancias diana (4754);

(c)

hacer fluir el fluido de muestra (4752) que comprende las perlas magnéticas (4734) a través de la ruta de líquido en el espacio de operaciones con gotitas (4716);

(d)

agregar las perlas magnéticas (4734) en la fuente de campo magnético (4740);

(e)

retirar el campo magnético o retirar las perlas (4734) del campo magnético para dar una gotita en el espacio de operaciones con gotitas (4716) que comprende perlas magnéticas (4734).
2.

El método de la reivindicación 1, en el que el accionador de gotitas comprende un electrodo reservorio (4718) asociado con el sustrato de operaciones con gotitas (4710) y dispuesto para recibir el fluido que entra en el espacio de operaciones con gotitas (4716) a través de la ruta de líquido, y en el que la fuente del campo magnético (4740) se coloca en un lado opuesto del electrodo reservorio (4718) con respecto a la ruta de líquido.
3.

El método de la reivindicación 1, en el que el accionador de gotitas comprende un aparato de ultrasonidos (4742) dispuesto para aplicar energía sónica a un fluido de muestra (4752) en el reservorio (4730) y que comprende además sonicar la muestra (4752) en el reservorio (4730).
4.

El método de la reivindicación 1, en el que:

(a)

los analitos y/o sustancias comprenden uno o más analitos diana comprenden una célula por la que las perlas (4734) tienen afinidad;

(b)

el método comprende además combinar la gotita de muestra en el espacio de operaciones con gotitas (4716) que comprende perlas magnéticas (4734) producidas mediante la etapa 1(e) con una gotita de lisis (4756) que comprende un reactivo de lisis celular; y

que comprende además volver a aplicar el campo magnético para inmovilizar las perlas magnéticas (4734).
5.

El método de la reivindicación 4, que comprende además transportar una gotita (4758) lejos de las perlas magnéticas (4734).
6.

El método de la reivindicación 4, que comprende además transportar un porción (4758) de la gotita de muestra lejos de las perlas magnéticas (4734).
7.

El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que comprende además combinar la gotita o porción de la gotita de muestra (4758) transportada lejos con una gotita (4762) que comprende perlas (4764) que tienen afinidad por el uno o más analitos diana.
8.

El método de la reivindicación 7, que comprende además realizar un protocolo de lavado para lavar las perlas (4764) que tienen afinidad por el uno o más analitos diana lo que produce una gotita que comprende perlas (4764) que comprende analito diana sustancialmente purificado.
9. El método de la reivindicación 8, que comprende además realizar un protocolo de análisis que utiliza la gotita que5 comprende las perlas (4764) que comprende el analito diana sustancialmente purificado.
10.

El método de la reivindicación 9, en el que la realización de una etapa del protocolo de análisis se lleva a cabo en el espacio de operaciones con gotitas (4716).
11.

El método de la reivindicación 9, en el que la gotita que comprende perlas (4764) que comprende el analito diana

sustancialmente purificado se retira del espacio de operaciones con gotitas (4716) antes de realizar el protocolo de 10 análisis.
12.

El método de la reivindicación 9, que comprende además proporcionar una salida indicativa de los resultados del protocolo de análisis.
13.

El método de la reivindicación 8, que comprende además retirar la gotita (4762) que comprende perlas (4764) que comprende analito diana sustancialmente purificado del espacio de operaciones con gotitas (4716).
15 .

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

Figura 11

Figura 12A

Figura 12B

Figura 13

Figura 14

Figura 15

Figura 16

Figura 17

Figura 18

Figura 19

Figura 20

Figura 21

Figura 22

Figura 23

Figura 24

Figura 25

Figura 26

Figura 27

Figura 28

Figura 29

Figura 30

Figura 31

Figura 32

Figura 33

Figura 34

Figura 35

Figura 36

Figura 37

Figura 38

Figura 39

Figura 40

Figura 41

Figura 42

Figura 43

Figura 44

Figura 45

Figura 47A

Figura 47B

Figura 47C

Figura 47D

Figura 47E

Figura 47F

Figura 47G

Figura 47H

Figura 47I

Figura 48A

Figura 48B