JP2021525095A

JP2021525095A - Ｄｎａ−ポア−ポリメラーゼ複合体の酵素的濃縮

Info

Publication number: JP2021525095A
Application number: JP2020566216A
Authority: JP
Inventors: フランクリン，ヘレン; ディマン，キルティ; ワーン，アレクサンドラ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2021-09-24
Also published as: WO2019228995A1; CN112204154A; EP3802875A1; US20210381041A1

Abstract

本発明は、シーケンシング複合体を単離するための方法を提供する。該方法は、ポリメラーゼに共有結合的に連結されたナノポアと精製部分に結合したオリゴヌクレオチドとの間に複合体を形成することと、精製部分に結合することができる固体支持体を使用して複合体から任意の非結合／非複合ナノポア及びオリゴヌクレオチドを分離することと、酵素組成物を用いて固体支持体から結合複合体を切断することと、を含む。【選択図】図２

Description

ポリメラーゼ複合体を単離し、続いて、ポリヌクレオチドのナノポアシーケンシングを可能にするためポリメラーゼ複合体がバイオチップの膜に組み込まれる方法が開示される。また、活性ポリメラーゼ複合体を単離するための核酸アダプター、核酸アダプターを含むポリメラーゼ複合体、及び核酸アダプターを用いて活性ポリメラーゼ複合体を単離するための方法が開示される。

ナノポアは核酸の配列及び構造を調べるためのラベルフリーのプラットフォームとして最近出現した。データは、典型的には、電圧クランプ増幅器によって制御される単一のポアを通る電場を印加することによって決定されるように、ＤＮＡ配列に相関するイオン電流変化の時系列として報告される。数百から数千の分子を高帯域幅及び空間分解能で調べることができる。

信頼できるＤＮＡ分析ツールとしてのナノポアの成功に対する障害は、バイオチップ上のウェルの大部分の使用を可能にする充分な数の機能的シーケンシング複合体を得ること、及びキロベース長以上（一本鎖ゲノムＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又は小分子（例えば、ヌクレオシド）のような長いポリマーのシーケンシングが増幅又は標識を必要とすることである。

したがって、改良されたシーケンシング収率（例えば、バイオチップ上の改良された数の機能的シーケンシング複合体）、及び鋳型ポリヌクレオチドの増幅又は標識を伴わないシーケンシング又は同定を可能にする、シーケンシング複合体が必要とされている。

本開示は、シーケンシング複合体を単離するための方法を提供する。該方法は、ポリメラーゼに共有結合的に連結されたナノポアと精製部分に結合したオリゴヌクレオチドとの間に複合体を形成することと、精製部分に結合することができる固体支持体を使用して複合体から任意の非結合／非複合ナノポア及びオリゴヌクレオチドを分離することと、酵素組成物を用いて固体支持体から結合複合体を切断することと、を含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）試料ＤＮＡに濃縮プライマーをアニーリングして、アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドを形成すること；と、（ｂ）該アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドの精製；と、（ｃ）コンジュゲートを該アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドと組み合わせて、１ポット（Ｅｉｎｔｏｐｆ）を形成すること；と、（ｄ）該１ポットを、該精製部分に結合することができる固体支持体と組み合わせて、濃縮１ポットを生成すること；と、（ｄ）該１ポットを、該精製部分に結合することができる固体支持体と組み合わせて、濃縮１ポットを生成すること；と、（ｅ）リンカーを酵素組成物で切断して該精製部分を放出し、それによってシーケンシング複合体を放出して、濃縮シーケンシング複合体溶液を提供することと、を含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）コンジュゲートと精製部分を含むアニーリング鋳型オリゴヌクレオチドと組み合わせて１ポットを形成することで、該コンジュゲートが該アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドに結合してシーケンシング複合体を形成することを可能にすること；と、（ｂ）該１ポットを、該精製部分に結合することができる固体支持体と組み合わせて、該アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドを生成すること；と、（ｃ）結合したシーケンシング複合体から結合していない複合体成分を分離すること；と、（ｄ）該リンカーを酵素組成物で切断して該精製部分を放出することであって、ここで、該精製部分が該固体支持体と結合したままであり、それによって該シーケンシング複合体を放出すること；と、（ｅ）該シーケンシング複合体から該固体支持体を分離して、濃縮シーケンシング複合体溶液を提供することと、を含む。

全ての実施形態では、該濃縮プライマーは、アダプターの一部に相補的なオリゴヌクレオチド、酵素的に切断可能なリンカー、及び精製部分を含む。全ての実施形態では、該リンカーは、非塩基部位又は少なくとも１つのウラシル残基を含む。

全ての実施形態では、該試料ＤＮＡは、直鎖、環状、又は自己プライミングのいずれかである。いくつかの実施形態では、該試料ＤＮＡは、少なくとも１つのアダプターに連結されている。いくつかの実施形態では、アダプターは、該試料ＤＮＡの各末端に連結されている。いくつかの実施形態では、アダプターは、ダンベル型アダプターである。全ての実施形態では、該アダプターは、該濃縮プライマーに結合することができるプライマー認識配列を含む。

いくつかの実施形態では、該アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドを精製することは、二本鎖ＤＮＡに選択的に結合する固体支持体への結合を含む。いくつかの実施形態では、アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドは、コンジュゲートと複合体化される前に精製されない。全ての実施形態では、二本鎖ＤＮＡは、長さが１００塩基対より長い、長さが５００ｂｐより長い、又は長さが１０００ｂｐより長い。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡは、複数のＤＮＡ断片のコンカテマである。全ての実施形態では、試料ＤＮＡは、試料識別子及び／又は患者識別子を含むバーコードを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズを含む。いくつかの実施形態では、ビーズは、常磁性ビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは、カルボキシル部分を含む。

いくつかの実施形態では、該精製部分に結合することができる該固体支持体は、ビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは、ストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、ビーズは、常磁性ビーズである。

全ての実施形態では、溶液中のシーケンシング複合体の濃度は、７０％より大きく、７５％より大きく、８０％より大きい。

全ての実施形態では、酵素組成物は、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、リアーゼ、グリコリアーゼ、又はそれらの組合せを含む。

一実施形態では、バイオチップを調製するための方法であって、（ａ）シーケンシング複合体の単離；と、（ｂ）シーケンシング複合体を該バイオチップの脂質二重層上に流すこと；と、（ｃ）該脂質二重層にシーケンシング複合体を挿入するのに充分な電圧をチップに印加することと、を含む、方法。いくつかの実施形態では、該バイオチップは、少なくとも５００，０００個のナノポアシーケンシング複合体１ｍｍ^２の該ナノポアシーケンシング複合体の密度を有する。いくつかの実施形態では、シーケンシング複合体の少なくとも７０％は、機能性ナノポア−ポリメラーゼ複合体である。

図１は、本開示に記載され、本方法において使用される種々の構成成分の図案である。図２は、本明細書に記載される方法の図案画である。図３は、ナノポア検出方法において使用されるｐＵＣ１９ダンベル型ＤＮＡ鋳型の５４６６ｂｐ配列を図示する。図３は、ナノポア検出方法において使用されるｐＵＣ１９ダンベル型ＤＮＡ鋳型の５４６６ｂｐ配列を図示する。図４は、直鎖アダプター（上）及びＨＥＧアダプター（下）を図示する。図面は、配列番号１１、１２、１１、及び１２を、それぞれ外観順に開示している。

本明細書及び添付の特許請求の説明では、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は複数のタンパク質を含み、「化合物」への言及は複数の化合物を指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、交換可能であり、限定することを意図しない。様々な実施形態の説明が用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、当業者であれば、いくつかの特定の例において、実施形態は、語「から本質的になる」又は「からなる」を用いて代替的に説明することができるということを理解するであろうことを、更に理解されたい。

値の範囲が提供される場合、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、値の各介在整数及び値の各介在整数の各１０分の１は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、その範囲の上限と下限との間、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値は、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内のいずれかの具体的に除外された制限に従うことを条件として、本発明内に包含される。記載された範囲が制限の一方又は両方を含む場合は、包含された制限の（ｉ）一方又は（ｉｉ）両方を除いた範囲もまた、本発明に含まれる。例えば、「１〜５０」は、「２〜２５」、「５〜２０」、「２５〜５０」、「１〜１０」等を含む。

図面を含む前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はどちらも、例示的及び説明的だけであり、本開示を制限するものではないことを理解されたい。

定義
「核酸」とは、本明細書で用いる場合、核酸塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、又はそれらのバリアントの１つを含む、１つ以上の核酸サブユニットの分子を指す。核酸は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドとも呼ばれるヌクレオチド（例えば、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ）のポリマーを指すことができ、一本鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらのハイブリッドを含む。

「ヌクレオチド」とは、本明細書で用いる場合、核酸ポリメラーゼの基質又は阻害剤として作用することができるヌクレオシド−５’−オリゴホスフェート化合物又はヌクレオシド−５’−オリゴホスフェートの構造類似体を指す。例示的なヌクレオチドとしては、これらに限定されないが、ヌクレオシド−５’−トリホスフェート（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰ）；長さが４以上のホスフェート（例えば、５’−テトラホスホスフェート（５’−ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５’−ペンタホスホスフェート、５’−ヘキサホスホスフェート、５’−ヘプタホスホスフェート、５’−オクタホスホスフェート）である５’−オリゴホスフェート鎖を有するヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、及びｄＵ）；並びに、修飾核酸塩基部分（例えば、置換プリン又はピリミジン核酸塩基）、修飾糖部分（例えば、Ｏ−アルキル化糖）、及び／又は修飾オリゴホスフェート部分（例えば、チオ−ホスフェート、メチレン、及び／又はホスフェート間の他の架橋を含む、オリゴホスフェート）を有し得るヌクレオシド−５’−トリホスフェートの構造類似体が挙げられる。

「ヌクレオシド」は、本明細書で用いる場合、糖部分（例えば、リボース又はデオキシリボース）に結合した天然又は非天然の核酸塩基を含む分子部分を指す。

「ポリメラーゼ」は、本明細書で用いる場合、核酸ポリマーを形成するためのヌクレオチド単量体の重合のような、重合反応を触媒することができる任意の天然又は非天然の酵素又は他の触媒を指す。本開示の組成物及び方法において使用され得る例示的ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．６又はＥＣ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ２．７．７．４９の酵素）、及びＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ６．５．１．１の酵素）などの核酸ポリメラーゼを含む。

「部分」とは、本明細書で用いる場合、分子の一部を指す。

「リンカー」とは、本明細書で用いる場合、２つ以上の分子、分子基、及び／又は分子部分の間のいくらかの空間との結合付着を提供する任意の分子部分を指す。

「タグ」とは、本明細書で用いる場合、タグにカップリングされた分子又は分子複合体を直接的又は間接的に検出及び／又は同定する能力を可能にするか又は増強する部分又は分子の一部を指す。例えば、タグは、立体的なバルク又は体積、静電荷、電気化学ポテンシャル、光学的、及び／又は分光学的特徴などの検出可能な性質又は特徴を提供することができる。

「ナノポア」とは、本明細書で用いる場合、約１オングストローム〜約１０，０００オングストロームの特徴的な幅又は直径を有する膜又は他の障壁材料内に形成されるか、又は他の方法で提供される、ポア、チャネル、又は通路を指す。ナノポアは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のα−溶血素といった天然に存在するポア形成タンパク質、又はα−ＨＬ−Ｃ４６といったような非天然か（すなわち、操作された）若しくは天然に存在するかのいずれかである、野生型ポア形成タンパク質の変異体若しくはバリアントから作ることができる。膜は、脂質二重層のような有機膜、又は天然に存在しないポリマー材料から作られた合成膜であり得る。ナノポアは、センサ、センシング回路、又は例えば相補型金属酸化膜半導体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｍｅｔａｌ−ｏｘｉｄｅｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ＣＭＯＳ）回路若しくは電界効果トランジスタ（ｆｉｅｌｄｅｆｆｅｃｔｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ：ＦＥＴ）回路のようなセンシング回路に結合された電極に隣接して、又は近接して、配置することができる。

「ナノポア検出性タグ」とは、本明細書で用いる場合、ナノポアに入り、ナノポアに位置付けられ、ナノポアに捕捉され、ナノポアを通って移動し、及び／又はナノポアを横切り、これにより、ナノポアを通じて電流の検出可能な変化をもたらすことができるタグを指す。例示的なナノポア検出性タグとしては、天然又は合成ポリマー、例えばポリエチレングリコール、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、ペプチド核酸ポリマー、ロックド核酸ポリマーが挙げられる、これらに限定されず、これらのいずれも、検出可能なナノコア電流の変化をもたらすことができる、色素部分又はフルオロフォアなどの化学基で任意に修飾又は連結されてもよい。

「イオン流」とは、本明細書で用いる場合、アノードとカソードとの間の電位などの起電力に起因する、典型的には溶液中でのイオンの移動を指す。イオン流は、典型的には、電流又は静電ポテンシャルの減衰として測定することができる。

「イオン流変化」とは、ナノポア検出に関連して本明細書で用いる場合、その「開口チャネル」（ｏｐｅｎｃｈａｎｎｅｌ：Ｏ．Ｃ．）状態でナノポアを通るイオン流に対して、ナノポアを通るイオン流の減少又は増加をもたらす特徴を指す。

「開口チャネル電流」、「Ｏ．Ｃ．電流」、又は「バックグラウンド電流」とは、本明細書で用いる場合、電位が印加され、ナノポアが開いている際に（例えば、ナノポア中にタグは存在しない）、ナノポアを横切って測定される電流レベルを指す。

「タグ電流」とは、本明細書で用いる場合、電位が印加され、タグがナノポアに存在する場合、ナノポアを横切って測定される電流レベルを指す。例えば、タグの特定の特徴（例えば、全体的な電荷、構造等）に応じて、ナノポア内のタグの存在は、ナノポアを通るイオン流を減少させることができ、それによって、測定されたタグ電流レベルの減少をもたらす。

「複合体成分」とは、本明細書で用いる場合、シーケンシング複合体を形成するのに必要な非結合成分を指す。構成成分は、精製部分と結合したポリヌクレオチド鋳型、及びポリメラーゼ−ナノポア複合体を含む。ポリヌクレオチド鋳型は、ポリヌクレオチド鋳型又はアダプターが自己プライミングでない場合、オリゴヌクレオチドプライマーにアニーリングされてもよく、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーは精製部分を含む。オリゴヌクレオチドプライマー、又は自己プライミング鋳型若しくは自己プライミングアダプターは、精製部分を更に含む。

「１ポット（Ｅｉｎｔｏｐｆ）」とは、本明細書で用いる場合、シーケンシング複合体、すなわちアニーリング鋳型（例えば、鋳型−プライマーハイブリッド）、及びコンジュゲートのための要素を含むか、又は該要素からなる複合体を指す。溶液中でアニーリング鋳型及びコンジュゲートが結合すると、次いでシーケンシング複合体をそこから単離して、濃縮シーケンシング複合体を得ることができる。

「ポリメラーゼ複合体」とは、本明細書で用いる場合、ポリメラーゼ酵素とポリヌクレオチド鋳型基質との結合によって形成される複合体を指す。自己プライミングでないポリヌクレオチド鋳型は、鎖伸長を開始するためにオリゴヌクレオチドプライマーを必要とする。したがって、自己プライミングポリヌクレオチドが存在しない場合、ポリメラーゼ複合体は、精製部分を含み得るオリゴヌクレオチドプライマーを更に含むことができる。

「濃縮シーケンシング複合体」とは、本明細書で用いる場合、シーケンシング複合体を形成するように結合していない複合体成分が除去されて、少なくとも７０％、７５％、８０％、又は８５重量％のシーケンシング複合体である溶液を生じるように、１ポットを含む（ｃｏｍｐｒｉｎｓｉｎｇ）溶液から濃縮されているシーケンシング複合体を含む溶液を指す。

「コンジュゲート」とは、本明細書で用いる場合、ポリメラーゼに共有結合しているナノポアを指す。

「捕捉複合体」とは、本明細書で用いる場合、ポリメラーゼ酵素、ポリヌクレオチド鋳型、及び捕捉オリゴヌクレオチドの結合によって形成される複合体を指す。

「捕捉オリゴヌクレオチド」又は「濃縮プライマー」は、交換可能に使用され、本明細書で用いる場合、固体支持体に結合しているシーケンシング複合体を固定化するのに役立つ精製部分を含む、オリゴヌクレオチドを指す。好ましくは、精製部分は、固体支持体上の精製部分結合パートナー、例えばストレプトアビジン又は修飾ストレプトアビジンに結合する、ビオチン又は修飾ビオチンであり得る。鋳型オリゴヌクレオチドが自己プライミングである場合、精製部分は自己プライミング鋳型に組み込まれ（下記の通り）、したがって、コンジュゲートと結合した場合、捕捉オリゴヌクレオチドである。

「ポリヌクレオチド鋳型」及び「ポリヌクレオチド基質鋳型」とは、本明細書で用いる場合、相補的核酸鎖がポリヌクレオチドポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼによって合成されるポリヌクレオチド分子を指す。ポリヌクレオチド鋳型は、直鎖状、ヘアピン状、又は連続的であり得る。連続鋳型は、環状又はダンベル型であり得る。ヘアピン状鋳型は自己プライミング鋳型であり得るか、又は普遍的なプライミング配列を含み得る。

使用されるような「プライミング鋳型」及び「アニーリング鋳型」とは、精製部分と結合している鋳型オリゴヌクレオチドを指す。したがって、鋳型オリゴヌクレオチドが自己プライミングである場合、精製部分は自己プライミング鋳型に組み込まれる。加えて、アダプターが鋳型オリゴヌクレオチドに連結され、該アダプターが自己プライミングである場合、精製部分は自己プライミングアダプターに組み込まれる。最後に、鋳型オリゴヌクレオチドがプライマーにアニーリングされている場合、プライマーは精製部分を含む。

「精製部分」とは、本明細書で用いる場合、シーケンシング複合体の精製を助ける部分を指す。

「シーケンシング複合体」とは、本明細書で用いる場合、プライミング鋳型、例えばアニーリング鋳型に結合しているＤＮＡポリメラーゼに共有結合的に連結されたポアを指す。

「濃縮」とは、本明細書で用いる場合、それが含まれる試料の少なくとも７５重量％又は少なくとも８０重量％の濃度で試料中に存在する分子を指す。

「ビオチン化された」とは、本明細書で用いる場合、修飾された分子、例えば、核酸分子（一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ分子、核酸アナログ、及び、ヌクレオチド配列、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）若しくはそれらの任意の修飾を含むか又は組み込んだ任意の分子を含む）、タンパク質（糖タンパク質、酵素、ペプチドライブラリ又はディスプレイ製品、及びそれらの抗体又は誘導体を含む）、ペプチド、炭水化物、又は多糖類、脂質等を指し、ここで、該分子は、ビオチン又はビオチン類似体に共有結合している。多くのビオチン化リガンドは市販されているか、又は標準的な方法によって調製することができる。生体分子、例えば核酸分子又はタンパク質分子をビオチンにカップリングする方法は、当該技術分野において周知である（Ｂａｙｅｒ及びＷｉｌｃｈｅｋ、「Ａｖｉｄｉｎ−ＢｉｏｔｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄＰｒｏｂｅｓ」、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１０巻第１３７〜１４８頁（１９９２年））。

使用されるような「結合パートナー」とは、別の生物学的分子との特異的若しくは非特異的結合又は相互作用が可能な任意の生物学的分子又は他の有機分子を指し、この結合又は相互作用は、「リガンド」結合又は相互作用と称され、抗体／抗原、抗体／ハプテン、酵素／基質、酵素／阻害剤、酵素／補因子、結合タンパク質／基質、担体タンパク質／基質、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エフェクタ、又は抑制因子／誘導因子結合又は相互作用によって例示されるが、これらに限定されない。本明細書における用語「結合パートナー」とは、本明細書に記載される単離方法において使用される親和性複合体のパートナー、例えばビオチン−ビオチン結合パートナーを指す。

「ビオチン結合」化合物は、本明細書で用いる場合、ビオチン又は任意のビオチン化合物に緊密に、しかし非共有結合的に結合することができる、任意の化合物を包含することが意図される。好ましいビオチン結合化合物には、修飾ストレプトアビジン及びアビジン、並びにその誘導体及び類似体、例えばニトロストレプトアビジンが含まれる。

「アビジン」とは、本明細書で用いる場合、天然卵白糖タンパク質アビジン、及びその誘導体又は等価物、例えばＮ−アシルアビジンの脱グリコシル化又は組換え形態、例えば、Ｎ−アセチル、Ｎ−フタリル、及びＮ−スクシニルアビジン、並びに市販のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ、ＮｅｕｔｒａｌｉｔｅＡｖｉｄｉｎ、及びＣａｐｔＡｖｉｄｉｎを指す。

「ストレプトアビジン」とは、本明細書で用いる場合、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの選択された株、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｉｄｉｎｉｉによって産生される細菌性ストレプトアビジン、並びに、例えば「コア」ストレプトアビジンのような組換え及び切断ストレプトアビジンといったその誘導体又は等価物を指す。

鋳型ポリヌクレオチド
本明細書に提供される方法及び組成物は、一本鎖ＤＮＡ；二本鎖ＤＮＡ；一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド；修飾ヌクレオシド、ミッシング（ｍｉｓｓｉｎｇ）ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、合成ヌクレオシド、及び／又は希少ヌクレオシドを含む核酸；並びにその誘導体、模倣物、及び／又は組合せを含む、種々の異なる種類の核酸鋳型、新生鎖、及び二本鎖生成物に適用可能である。

本発明の鋳型核酸は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡヘアピン、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、重合剤の結合のための認識部位を有するＲＮＡ、及びＲＮＡヘアピンを含む、任意の好適なポリヌクレオチドを含むことができる。更に、標的ポリヌクレオチドは、イントロン、調節領域、対立遺伝子、バリアント、若しくは変異体；全ゲノム；又はそれの任意の一部といった、細胞のゲノムの特定の部分であり得る他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、又はＲＮＡｉであってもよく、又はこれらに由来してもよい。

鋳型核酸（例えば、ポリヌクレオチド）は、ＰＮＡなどの非天然核酸、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、２４０−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド修飾リン酸主鎖などの生物学的ＲＮＡ又はＤＮＡに典型的でないヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド）を含むことができる。核酸は、例えば、一本鎖又は二本鎖であり得る。

本明細書中の方法において鋳型核酸を産生するために使用される核酸（すなわち、標的核酸）は、本質的に、本明細書中に提示される方法に修正することができる任意の種類の核酸であり得る。いくつかの場合において、標的核酸自体が、鋳型核酸として直接使用することができる断片を含む。典型的には、標的核酸は断片化され、鋳型としての使用のために更に処理される（例えば、アダプターで連結されるか、又は環状化される）。例えば、標的核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ等）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、ｃＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、増幅された核酸（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、又は全ゲノム増幅（ＷＧＡ）による）、断片化及び／若しくはライゲーション修飾に供された核酸、全ゲノムＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの誘導体（例えば、化学的に修飾され、標識され、記録され、タンパク質結合され、又は他の方法で改変された誘導体）であり得る。

鋳型核酸は、直鎖、環状（循環重複性シーケンシング（ｃｉｒｃｕｌａｒｒｅｄｕｎｄａｎｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＣＲＳ）用の鋳型を含む）、一本鎖若しくは二本鎖、及び／又は一本鎖領域を有する二本鎖（例えば、ステム・アンド・ループ構造）であり得る。鋳型核酸は、環境試料（例えば、海水、氷コア、土壌試料等）、培養試料（例えば、初代培養細胞若しくは細胞株）、病原体に感染した試料（例えば、ウイルス若しくは細菌）、組織若しくは生検試料、法医学試料、血液試料、又は生物、例えば、動物、植物、細菌、真菌、ウイルス等由来の別の試料から精製又は単離することができる。そのような試料は、タンパク質、脂質、及び非標的核酸などの様々な他の構成成分を含んでもよい。ある特定の実施形態では、鋳型核酸は、生物由来の完全なゲノム試料である。他の実施形態では、鋳型核酸は、生物学的試料又はｃＤＮＡライブラリから抽出された全ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、血液又は血漿試料から得られた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料である。いくつかの実施形態では、血液試料は、胎児ＤＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、アダプターに連結される。アダプターは、直鎖アダプター、ダンベル型アダプター、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）アダプター等であってもよい。いくつかの実施形態では、アダプターは、捕捉オリゴヌクレオチドでアニーリングすることができる配列を含む。ＨＥＧアダプターは、ポリメラーゼ活性をブロックする１８原子スペーサを含む。したがって、ポリメラーゼは従来のダンベル型アダプターのように両方の鎖を読み取るわけではない。ダンベル型アダプターは当技術分野で周知であり、他の箇所で説明されている。例えば、米国特許第ＵＳ８１５３３７５号（ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を参照されたい。

ポリメラーゼ
シーケンシング複合体のポリメラーゼは、シーケンシングに使用される条件下でポリメラーゼ活性を保持する野生型又はバリアントポリメラーゼであり得る。本明細書に記載される組成物及び方法における使用を見出すポリメラーゼの例としては、ｐｈｉ２９、ｐｏｌ６、及びエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼなどのそのバリアント、及び／又は動力学的特徴が変化したバリアントポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、配列番号３と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、Ｐｏｌ６ポリメラーゼである。
配列番号３（野生型Ｐｏｌ６（ＤＮＡポリメラーゼ［クロストリジウムファージｐｈｉＣＰＶ４］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＨ２７１１３．１）
１ｍｄｋｈｔｑｙｖｋｅｈｓｆｎｙｄｅｙｋｋａｎｆｄｋｉｅｃｌｉｆｄｔｅｓｃｔｎｙｅｎｄｎｔｇａｒｖｙｇｗｇｌｇｖｔｒｎｈｎ
０６１ｍｉｙｇｑｎｌｎｑｆｗｅｖｃｑｎｉｆｎｄｗｙｈｄｎｋｈｔｉｋｉｔｋｔｋｋｇｆｐｋｒｋｙｉｋｆｐｉａｖｈｎｌｇｗｄｖｅｆｌ
１２１ｋｙｓｌｖｅｎｇｆｎｙｄｋｇｌｌｋｔｖｆｓｋｇａｐｙｑｔｖｔｄｖｅｅｐｋｔｆｈｉｖｑｎｎｎｉｖｙｇｃｎｖｙｍｄｋｆｆｅｖ
１８１ｅｎｋｄｇｓｔｔｅｉｇｌｃｌｄｆｆｄｓｙｋｉｉｔｃａｅｓｑｆｈｎｙｖｈｄｖｄｐｍｆｙｋｍｇｅｅｙｄｙｄｔｗｒｓｐｔｈｋｑ
２４１ｔｔｌｅｌｒｙｑｙｎｄｉｙｍｌｒｅｖｉｅｑｆｙｉｄｇｌｃｇｇｅｌｐｌｔｇｍｒｔａｓｓｉａｆｎｖｌｋｋｍｔｆｇｅｅｋｔｅｅ
３０１ｇｙｉｎｙｆｅｌｄｋｋｔｋｆｅｆｌｒｋｒｉｅｍｅｓｙｔｇｇｙｔｈａｎｈｋａｖｇｋｔｉｎｋｉｇｃｓｌｄｉｎｓｓｙｐｓｑｍａ
３６１ｙｋｖｆｐｙｇｋｐｖｒｋｔｗｇｒｋｐｋｔｅｋｎｅｖｙｌｉｅｖｇｆｄｆｖｅｐｋｈｅｅｙａｌｄｉｆｋｉｇａｖｎｓｋａｌｓｐｉ
４２１ｔｇａｖｓｇｑｅｙｆｃｔｎｉｋｄｇｋａｉｐｖｙｋｅｌｋｄｔｋｌｔｔｎｙｎｖｖｌｔｓｖｅｙｅｆｗｉｋｈｆｎｆｇｖｆｋｋｄｅ
４８１ｙｄｃｆｅｖｄｎｌｅｆｔｇｌｋｉｇｓｉｌｙｙｋａｅｋｇｋｆｋｐｙｖｄｈｆｔｋｍｋｖｅｎｋｋｌｇｎｋｐｌｔｎｑａｋｌｉｌｎ
５４１ｇａｙｇｋｆｇｔｋｑｎｋｅｅｋｄｌｉｍｄｋｎｇｌｌｔｆｔｇｓｖｔｅｙｅｇｋｅｆｙｒｐｙａｓｆｖｔａｙｇｒｌｑｌｗｎａｉｉ
６０１ｙａｖｇｖｅｎｆｌｙｃｄｔｄｓｉｙｃｎｒｅｖｎｓｌｉｅｄｍｎａｉｇｅｔｉｄｋｔｉｌｇｋｗｄｖｅｈｖｆｄｋｆｋｖｌｇｑｋｋ
６６１ｙｍｙｈｄｃｋｅｄｋｔｄｌｋｃｃｇｌｐｓｄａｒｋｉｉｉｇｑｇｆｄｅｆｙｌｇｋｎｖｅｇｋｋｑｒｋｋｖｉｇｇｃｌｌｌｄｔｌｆ
７２１ｔｉｋｋｉｍｆ

ナノポア
天然及び非天然（例えば、操作又は組換え）ポア形成タンパク質両方によって生成されたナノポアは、本明細書中での使用が見出される。本開示のイオン流改変タグのナノポア検出に有用なナノポアを生成するために使用することができる、広範囲のポア形成タンパク質が当技術分野で公知である。生物学的ナノポアには、Ｅ．ｃｏｌｉ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種由来のＯｍｐＧ、並びにＳ．ａｕｒｅｕｓ種由来のα溶血素、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ種由来のＭｓｐＡが挙げられる。代表的なポア形成タンパク質としては、α−溶血素、β−溶血素、γ−溶血素、エアロリジン、細胞溶解素、ロイコシジン、メリチン、ＭｓｐＡポリン、及びポリンＡが挙げられるが、これらに限定されない。ナノポアは、野生型ナノポア、バリアントナノポア、又は修飾ナノポアあってもよい。

バリアントナノポアは、親酵素の特徴に対して変化する特徴を保有するように操作することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１５年１０月２８日出願の米国特許出願第１４／９２４，８６１号、名称「ａｌｐｈａ−ＨｅｍｏｌｙｓｉｎＶａｒｉａｎｔｓｗｉｔｈＡｌｔｅｒｅｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、及び２０１７年４月２０日出願の米国特許出願第１５／４９２，２１４号、名称「ａｌｐｈａ−ＨｅｍｏｌｙｓｉｎｖａｒｉａｎｔｓａｎｄＵｓｅｓＴｈｅｒｅｏｆ」を参照されたい。

他のバリアントナノポアは、例えば、２０１７年６月２９日に出願された米国特許出願第１５／６３８，２７３号、名称「ＬｏｎｇＬｉｆｅｔｉｍｅＡｌｐｈａ−ＨｅｍｏｌｙｓｉｎＮａｎｏｐｏｒｅｓ」に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。他の例示的な実施形態では、α−溶結素ナノポアのα−溶結素は、２０１７年３月２９日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５７４３３号、名称「ＮａｎｏｐｏｒｅＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｊｕｇａｔｅｓａｎｄＵｓｅｓＴｈｅｒｅｏｆ」に記載されているように修飾することができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ポア形成タンパク質であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓａｕｒｅｕｓ由来のα−溶血素（本明細書では「α−ＨＬ」とも称する）は、ポア形成タンパク質のクラスの最も研究されたメンバの１つであり、ナノポア装置の作製に広く使用されている。（例えば、米国特許公開第２０１５／０１１９２５９号、同第２０１４／０１３４６１６号、同第２０１３／０２６４２０７号、及び同第２０１３／０２４４３４０号を参照されたい。）α−ＨＬはまた、部位特異的突然変異誘発及び化学標識を含む広範囲の技術を用いて、シーケンシングされ、クローン化され、構造的及び機能的に広範に特徴付けられている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１年）及びそこで引用されている参考文献を参照）。

天然に存在する（すなわち、野生型）α−ＨＬポア形成タンパク質サブユニットのアミノ酸配列を以下に示す。

野生型α−ＨＬアミノ酸配列（配列番号４）
ＡＤＳＤＩＮＩＫＴＧＴＴＤＩＧＳＮＴＴＶＫＴＧＤＬＶＴＹＤＫＥＮＧＭＨＫＫＶＦＹＳＦＩＤＤＫＮＨＮＫＫＬＬＶＩＲＴＫＧＴ６０
ＩＡＧＱＹＲＶＹＳＥＥＧＡＮＫＳＧＬＡＷＰＳＡＦＫＶＱＬＱＬＰＤＮＥＶＡＱＩＳＤＹＹＰＲＮＳＩＤＴＫＥＹＭＳＴＬＴＹＧＦ１２０
ＮＧＮＶＴＧＤＤＴＧＫＩＧＧＬＩＧＡＮＶＳＩＧＨＴＬＫＹＶＱＰＤＦＫＴＩＬＥＳＰＴＤＫＫＶＧＷＫＶＩＦＮＮＭＶＮＱＮＷＧ１８０
ＰＹＤＲＤＳＷＮＰＶＹＧＮＱＬＦＭＫＴＲＮＧＳＭＫＡＡＤＮＦＬＤＰＮＫＡＳＳＬＬＳＳＧＦＳＰＤＦＡＴＶＩＴＭＤＲＫＡＳＫ２４０
ＱＱＴＮＩＤＶＩＹＥＲＶＲＤＤＹＱＬＨＷＴＳＴＮＷＫＧＴＮＴＫＤＫＷＴＤＲＳＳＥＲＹＫＩＤＷＥＫＥＥＭＴＮＧＬＳＡＷＳＨ３００
ＰＱＦＥＫ３０５

上記の野生型α−ＨＬアミノ酸配列は、置換の位置を決定するのに適した成熟配列であり、したがって、最初のメチオニン残基を含まない。いくつかの実施形態では、α−ＨＬのサブユニットはアミノ酸Ｇ２９４で切断され、任意に、以下に開示されるようなＣ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合を含む。

種々の非天然α−ＨＬポア形成タンパク質が製造されており、これには、以下の置換の１つ以上を含むバリアントα−ＨＬサブユニットが含まれるが、これらに限定されない：Ｈ３５Ｇ、Ｈ１４４Ａ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａ、Ｄ１２７Ｇ、Ｄ１２８Ｇ、Ｔ１２９Ｇ、Ｋ１３１Ｇ、Ｋ１４７Ｎ、及びＶ１４９Ｋ。これらの種々の操作されたα−ＨＬポアポリペプチドの特性は、例えば、米国公開特許出願第２０１７／００８８５８８号、同第２０１７／００８８８９０号、同第２０１７／０３０６３９７号、及び同第２０１８／０００２７５０号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

ナノポアへのポリメラーゼの結合
α−ＨＬ単量体の七量体複合体は、脂質二重層膜に埋め込まれ、脂質二重層膜によりポアを形成するナノポアを、自発的に形成することはよく知られている。天然型α−ＨＬと変異型α−ＨＬとの比が６：１であるα−ＨＬの七量体は、ナノポアを形成できることが示されている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１年）「Ｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｅｐｔａｍｅｒｉｃｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎｐｏｒｅ−Ａｄｏｍｉｎｏ−ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｔｈａｔｉｓａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙｍｏｄｕｌａｔｅｄｂｙｔｈｅｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ」、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、第２７６巻第１８号第１４８３５〜１４８４１頁、及びそこで引用される参考文献を参照のこと）。七量体ポアの１つのα−ＨＬ単量体単位は、国際公開第ＷＯ２０１５／１４８４０２号に記載されているようなＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーション法を用いてＤＮＡ−ポリメラーゼと共有結合させることができ、これは、参照により本明細書に組み込まれる（また、Ｚａｋｅｒｉ及びＨｏｗａｒｔｈ（２０１０年）「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」第１３２巻第４５２６〜７頁も参照）。簡単に説明すると、ＳｐｙＴａｇペプチドをα−ＨＬの１倍サブユニットのＣ末端に組換え融合物としてα結合させ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質断片を鎖伸長酵素、例えばＰｏｌ６ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端に組換え融合物として結合させる。ＳｐｙＴａｇペプチド及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質断片は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質のリジン残基とＳｐｙＴａｇペプチドのアスパラギン酸残基との反応を受け、２つのα−ＨＬサブユニットを酵素に結合させる共有結合を生じる。

概して、α−ＨＬサブユニットは、野生型で又は当該技術分野で公知の他の操作されたα−ＨＬタンパク質で使用されるのと同じ方法で、七量体α−ＨＬナノポアを調製するために使用される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、ナノポア装置と共に使用することができる。七量体α−ＨＬナノポアは、各々がポリメラーゼを結合するリンカーを有しない６つのサブユニットと、ＳｐｙＴａｇペプチドであるＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫ（配列番号５）を含むＣ末端融合（切断された野生型配列の２９４位から始まる）を有する１つのサブユニットと、を有する。ＳｐｙＴａｇペプチドは、Ｐｏｌ６ＤＮＡポリメラーゼなどのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ修飾鎖伸長酵素へのナノポアのコンジュゲーションを可能にする。

いくつかの実施形態では、突然変異体のＣ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合は、リンカーペプチド（例えば、ＧＳＳＧＧＳＳＧＧ（配列番号６））、ＳｐｙＴａｇペプチド（例えば、ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号７））、及び末端Ｈｉｓタグ（例えば、ＫＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号８））を含む。したがって、Ｃ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合体は、次のアミノ酸配列を含む：ＧＳＳＧＧＳＳＧＧＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫＫＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号９）。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合は、野生型α−ＨＬサブユニット配列に対して切断された、１つのサブユニットの２９４位において結合される。（例えば、参照により本明細書に組み込まれている国際公開第ＷＯ２０１７１２５５６５Ａ１号に開示されているような、配列番号２のＣ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合を参照されたい）。

ポリメラーゼをナノポアに結合させるための例示的な方法は、リンカー分子をナノポアに結合させること、又は結合部位を有するようにナノポアを変異させ、次いで、ポリメラーゼを結合部位又は結合リンカーに結合させることを含む。ポリメラーゼは、ナノポアが膜に挿入される前に、結合部位又は結合リンカーに結合される。いくつかの場合において、コンジュゲートは、バイオチップのウェル及び／又は電極上に配置された脂質膜に挿入される。

いくつかの例では、ポリメラーゼは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドを含む融合タンパク質として発現され、これは、ＳｐｙＴａｇペプチドを含むナノポアに共有結合することができる（Ｚａｋｅｒｉら、ＰＮＡＳ１０９、第Ｅ６９０〜Ｅ６９７頁（２０１２年））。

コンジュゲート、例えば、ポリメラーゼ−ナノポア複合体は、任意の好適な方法で形成することができる。ポリメラーゼのナノポアへの結合は、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチド系（Ｚａｋｅｒｉら、ＰＮＡＳ１０９：Ｅ６９０−Ｅ６９７（２０１２年））天然化学ライゲーション（Ｔｈａｐａら、「Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」第１９巻第１４４６１−１４４８３頁（２０１４年）、ソルターゼ系（Ｗｕ及びＧｕｏ、「ＪＣａｒｂｏｈｙｄｒＣｈｅｍ」、第３１巻第４８〜６６頁（２０１２年）；Ｈｅｃｋら、「ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」、第９７巻第４６１〜４７５頁（２０１３年））、トランスグルタミナーゼ系（Ｄｅｎｎｌｅｒら、「ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ」、第２５巻第５６９〜５７８頁（２０１４年））、ホルミルグリシン連結（Ｒａｓｈｉｄｉａｎら、「ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ」、第２４巻第１２７７〜１２９４頁（２０１３年））、又は当該技術分野で公知の他の化学的ライゲーション技術を用いて、達成することができる。

いくつかの例では、ポリメラーゼは、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）ケミストリを用いてナノポアに連結される。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）はＨｙＮｉｃ（６−ヒドラジノ−ニコチン酸、芳香族ヒドラジン）と４ＦＢ（芳香族アルデヒドである４−ホルミルベンゾエート）との反応であり得る。いくつかの例では、ポリメラーゼは、クリックケミストリ（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手可能）を用いてナノポアに連結される。

いくつかの場合において、ジンクフィンガ突然変異をナノポア分子に導入し、次いで、分子（例えば、ＤＮＡ中間分子）を使用して、Ｐｏｌ６ポリメラーゼをナノポア、例えばα−溶血素上のジンクフィンガ部位に連結する。

その上、ポリメラーゼは、結合部位においてナノポアに結合したリンカー分子によって、ナノポア、例えば、ａＨＬ、ＯｍｐＧに結合することができる。いくつかの場合において、ポリメラーゼは、分子ステープルを用いてナノポアに結合される。いくつかの例では、分子ステープルは、３つのアミノ酸配列（リンカーＡ、Ｂ、及びＣと称する）を含む。リンカーＡはナノポア単量体から伸長することができ、リンカーＢはポリメラーゼから伸長することができ、そして、リンカーＣはリンカーＡとＢとを結合する（例えば、リンカーＡ及びＢの両方をラップすることによって）ことができ、したがってポリメラーゼをナノポアに連結することができる。リンカーＣはまた、リンカーＡ又はリンカーＢの一部であるように構築することができ、これにより、リンカー分子の数を減少させる。

ポリメラーゼをナノポアに結合させる際の使用を見出すことができる他のリンカーは、直接的遺伝的連結（例えば、（ＧＧＧＧＳ）_１−３アミノ酸リンカー（配列番号１））、トランスグルタミナーゼ媒介連結（例えば、ＲＳＫＬＧ（配列番号２））、ソルターゼ媒介連結、及びシステイン修飾を介する化学的連結である。本明細書において有用であると考えられる特異的リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_１−３（配列番号１）、Ｎ末端上のＫタグ（ＲＳＫＬＧ（配列番号２））、ΔＴＥＶ部位（１２−２５）、ΔＴＥＶ部位＋ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＮ末端（１２−４９）である。

あるいは、α−ＨＬ単量体は、多数の位置に挿入されたシステイン残基置換を用いて操作することができ、マレイミド・リンカー・ケミストリを介してタンパク質の共有結合修飾を可能にする（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１年）を参照）。例えば、単一のα−ＨＬサブユニットはＫ４６Ｃ変異で修飾することができ、次いで、この変異は、テトラジン−トランス−シクロオクテン・クリック・ケミストリーの使用を可能にするリンカーで容易に修飾されて、ＤＮＡポリメラーゼのＢｓｔ２．０バリアントを七量体６：１ナノポアに共有結合的に結合させることができる。そのような実施形態は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月２２日に出願された米国特許出願第１５／４３９，１７３号、名称「Ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｊｕｇａｔｅＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ」に記載されている。

鎖伸長酵素をナノポアに結合する他の方法には天然化学ライゲーション（Ｔｈａｐａら、「Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」第１９巻第１４４６１−１４４８３頁（２０１４年）、ソルターゼ系（Ｗｕ及びＧｕｏ、「ＪＣａｒｂｏｈｙｄｒＣｈｅｍ」、第３１巻第４８〜６６頁（２０１２年）；Ｈｅｃｋら、「ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」、第９７巻第４６１〜４７５頁（２０１３年））、トランスグルタミナーゼ系（Ｄｅｎｎｌｅｒら、「ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ」、第２５巻第５６９〜５７８頁（２０１４年））、ホルミルグリシン連結（Ｒａｓｈｉｄｉａｎら、「ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ」、第２４巻第１２７７〜１２９４頁（２０１３年））、又は当該技術分野で公知の他の化学的ライゲーション技術を挙げることができる。ポリメラーゼはまた、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５７００２号（国際公開第ＷＯ２０１７／１６２８２８として公開；ＧｅｎｉａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．及びＦ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅＡＧ）、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７号（国際公開第ＷＯ２０１４／０７４７２７号として公開；ＧｅｎｉａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、同第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２号（国際公開第ＷＯ２００６／０２８５０８号として公開；ＰｒｅｓｉｄｅｎｔａｎｄＦｅｌｌｏｗｓｏｆＨａｒｖａｒｄＣｏｌｌｅｇｅ）、及び同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０号（国際公開第ＷＯ２０１２／０８３２４９号として公開；ＣｏｌｕｍｂｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に記載の方法を用いてナノポアと結合することもできる。

ポリメラーゼの助けによるナノポアシーケンシングは、コンジュゲート（すなわち、ポリメラーゼ−ナノポア複合体）へのプライミング鋳型（例えば、精製部分と結合した標的ポリヌクレオチド）の結合によって形成される複合体をシーケンシングすることによって、達成される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−ポア複合体は、続いて鋳型に連結されてシーケンシング複合体を形成し、その後脂質二重層に挿入される。

ナノポアを通るイオン電流の流れの測定は、脂質膜に挿入（例えば、電気穿孔によって）されたナノポアを通じて行われる。ナノポアは、電気刺激、圧力刺激、液体流刺激、ガスバブル刺激、超音波処理、音、振動、又はそれらの任意の組合せなどの刺激シグナルによって挿入することができる。いくつかの場合において、膜は気泡の助けを借りて形成され、ナノポアは電気刺激の助けを借りて膜に挿入される。他の実施形態では、ナノポアは、それ自体を膜に挿入する。脂質二重層を構築し、核酸分子をシーケンシングするための方法は、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１１／０９７０２８号及び同第ＷＯ２０１５／０６１５１０号にて見出すことができ、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの例示的な実施形態では、ナノポアの特徴は、野生型ナノポアに対して改変される。いくつかの実施形態では、ナノポアシーケンシング複合体のバリアントナノポアは、それが由来するナノポアのイオン電流ノイズを低減するように操作される。変化した特徴を有するバリアントナノポアの例は、締め付け部位（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅ）（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、名称「ＯｍｐＧＶａｒｉａｎｔｓ」で２０１６年９月２０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２２２４号）に一つ以上の突然変異を有するＯｍｐＧナノポアであって、これは親ＯｍｐＧのものと比較して、イオンノイズレベルを減少させる。減少したイオン電流ノイズは、ポリヌクレオチド及びタンパク質の単一分子センシングにおけるこれらのＯｍｐＧナノポアバリアントの使用を提供する。他の実施形態では、バリアントＯｍｐＧポリペプチドを更に変異させて分子アダプターに結合させることができ、この分子アダプターは、ポア内に存在している間、ポアを通る分析物、例えばヌクレオチド塩基の移動を遅くし、その結果、分析物の同定の精度を向上させる（Ａｓｔｉｅｒら、「ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ」、第１０巻１０２１／ｊａ０５７１２３＋、２００５年１２月３０日オンライン公開）。

修飾バリアントナノポアは、典型的には、そのサブユニットがサブユニット間相互作用に影響を及ぼすように操作された多量体ナノポアである（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、名称「Ａｌｐｈａ−ＨｅｍｏｌｙｓｉｎＶａｒｉａｎｔｓ」で２０１６年９月２３日出願の米国特許出願第１５／２７４，７７０号）。サブユニット相互作用の変化を利用して、脂質二重層中で多量体ナノポアを形成するように単量体がオリゴマ化する配列及び順序を特定することができる。この技術は、ナノポアを形成するサブユニットの化学量論を制御する。オリゴマ化の間のサブユニットの相互作用の配列を決定するようにサブユニットを修飾することができる多量体ナノポアの例には、ａＨＬナノポアがある。

いくつかの例示的な実施形態では、単一のポリメラーゼが、各ナノポアに結合される。他の実施形態では、２つ以上のポリメラーゼが、単量体ナノポア、又はオリゴマのナノポアのサブユニットに結合される。

ナノポア装置
ナノポア装置及びそれらを作製し、ナノポア検出用途で使用する方法、例えば、イオン流改変タグ化ヌクレオチドを用いるナノポアシーケンシングは、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第７，００５号、同第２６４Ｂ２号；同第７，８４６，７３８号；同第６，６１７，１１３号；同第６，７４６，５９４号；同第６，６７３，６１５号；同第６，６２７，０６７号；同第６，４６４，８４２号；同第６，３６２，００２号；同第６，２６７，８７２号；同第６，０１５，７１４号；同第５，７９５，７８２号；同第、並びに米国公開第２０１５／０１１９２５９号、同第２０１４／０１３４６１６，２０１３／０２６４２０７号、同第２０１３／０２４４３４０号、同第２００４／０１２１５２５号、同第及び同第２００３／０１０４４２８号を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。概して、ナノポア装置は、脂質二重層膜に埋め込まれたポア形成タンパク質を含み、ここで、該膜は、ウェル又はリザーバを備える固体基板に固定化又は接続される。ナノポアのポアは膜を貫通して延び、膜のシス側とトランス側との間に流体接続を形成する。典型的には、固体基板は、ポリマー、ガラス、シリコン、及びそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む。加えて、固体基板は、ナノポア、センサ、センシング回路、又は、任意に相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路若しくは電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路のようなセンシング回路に結合された電極に隣接して配置することができる。典型的には、ナノポアのポアを通るベースライン電流流（又はＯ．Ｃ．電流レベル）を生成する膜を横切って、ＤＣ又はＡＣ電圧電位を設定することを可能にする、膜のシス側及びトランス側に電極がある。米国仮出願第６２／６３６，８０７号、２０１８年２月２８日出願、名称「ＴａｇｇｅｄＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅＣｏｍｐｏｕｎｄｓＵｓｅｆｕｌＦｏｒＮａｎｏｐｏｒｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ」、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７０１９８号、２０１６年８月２６日出願、名称「ＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＴａｇｇｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＵｓｅｓＴｈｅｒｅｏｆ」、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０２４４３４０Ａ１、２０１３年９月１９日、名称「ＮａｎｏｐｏｒｅＢａｓｅｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、同第ＵＳ２０１３／０２６４２０７Ａ１号、２０１３年１０月１０日公開、名称「ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＢｙＳｙｎｔｈｅｓｉｓＵｓｉｎｇＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＡｎｄＮａｎｏｐｏｒｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ」、及び同第ＵＳ２０１４／０１３４６１６Ａ１、２０１４年３月１４日公開、名称「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＵｓｉｎｇＴａｇｓ」に記載されるようなタグの存在は、ナノポアを通る正イオンの流れの変化をもたらし、それによって、ナノポアのＯ．Ｃ．電流に対する電極間の電流レベルの測定可能な変化を生成する。

イオン流改変タグ化合物（すなわち、タグ化ヌクレオチド）は、天然に存在する及び天然に存在しない（例えば、操作又は組換え）ポア形成タンパク質の両方によって生成されたナノポアを含む、広範囲のナノポア装置と共に使用することができると考えられる。本開示のイオン流改変タグのナノポア検出に有用なナノポアを生成するために使用することができる、広範囲のポア形成タンパク質が当技術分野で公知である。代表的なポア形成タンパク質としては、α−溶血素、β−溶血素、γ−溶血素、エアロリジン、細胞溶解素、ロイコシジン、メリチン、ＭｓｐＡポリン、及びポリンＡが挙げられるが、これらに限定されない。

野生型α−ＨＬアミノ酸配列（配列番号４）
ＡＤＳＤＩＮＩＫＴＧＴＴＤＩＧＳＮＴＴＶＫＴＧＤＬＶＴＹＤＫＥＮＧＭＨＫＫＶＦＹＳＦＩＤＤＫＮＨＮＫＫＬＬＶＩＲＴＫＧＴ６０
ＩＡＧＱＹＲＶＹＳＥＥＧＡＮＫＳＧＬＡＷＰＳＡＦＫＶＱＬＱＬＰＤＮＥＶＡＱＩＳＤＹＹＰＲＮＳＩＤＴＫＥＹＭＳＴＬＴＹＧＦ１２０
ＮＧＮＶＴＧＤＤＴＧＫＩＧＧＬＩＧＡＮＶＳＩＧＨＴＬＫＹＶＱＰＤＦＫＴＩＬＥＳＰＴＤＫＫＶＧＷＫＶＩＦＮＮＭＶＮＱＮＷＧ１８０
ＰＹＤＲＤＳＷＮＰＶＹＧＮＱＬＦＭＫＴＲＮＧＳＭＫＡＡＤＮＦＬＤＰＮＫＡＳＳＬＬＳＳＧＦＳＰＤＦＡＴＶＩＴＭＤＲＫＡＳＫ２４０
ＱＱＴＮＩＤＶＩＹＥＲＶＲＤＤＹＱＬＨＷＴＳＴＮＷＫＧＴＮＴＫＤＫＷＴＤＲＳＳＥＲＹＫＩＤＷＥＫＥＥＭＴＮＧＬＳＡＷＳＨ３００
ＰＱＦＥＫ

上記の野生型α−ＨＬアミノ酸配列は、本明細書に記載される置換の位置を決定するのに適した成熟配列であり、したがって、最初のメチオニン残基を含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示された突然変異を含むことに加えて、α−ＨＬの変異体サブユニットもまた、アミノ酸Ｇ２９４で切断され、任意に、以下に開示されるようなＣ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合を含む。

ポリヌクレオチドのシーケンシング方法
本明細書の別の箇所に記載されているように、本明細書に記載のＰｏｌ６ナノポアシーケンシング複合体のバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼを用いて特徴付けられる分子は、荷電ポリマー分子又は極性ポリマー分子などの荷電分子又は極性分子を含む、様々なタイプの分子であり得る。具体例としては、リボ核酸（ＲＮＡ）分子及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子が挙げられる。ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子であり得る。リボ核酸は逆転写され、次いでシーケンシングされる。

ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に提供される方法に従って調製したポリメラーゼ−鋳型複合体を用いて、すなわち、高濃度の塩で、及びヌクレオチドの非存在下で、核酸をシーケンシングするための方法が提供される。続いて、ポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアに結合させて、ポリヌクレオチド配列を検出するナノポアシーケンシング複合体を形成する。他の例示的な実施形態では、低ヌクレオチド濃度を用いて、高温で、過剰のポリメラーゼの存在下においてポリメラーゼ−鋳型複合体を形成するなどの本明細書に提供される方法に従って調製した、ポリメラーゼ−鋳型複合体を用いて、核酸をシーケンシングするための方法が提供される。続いて、ポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアに結合させて、ポリヌクレオチド配列を検出するナノポアシーケンシング複合体を形成する。

本明細書中で提供された組成物及び方法に従って調製したポリメラーゼ−鋳型複合体を含むナノポアシーケンシング複合体は、ポリヌクレオチドのシーケンシングにおいて酵素を利用する当業者に公知の、他のナノポアシーケンシングのプラットフォームを用いて、高濃度の塩で核酸の配列を決定するために使用することができる。同様に、提供された組成物及び方法に従って調製したポリメラーゼ−鋳型複合体を含むナノポアシーケンシング複合体は、ポリヌクレオチドのシーケンシングにおいて酵素を利用する当業者に公知の、例えば、他のナノポアシーケンシングのプラットフォームを用いて高温で核酸の配列を決定するために使用することができる。例えば、本明細書に記載の方法に従って調製したポリメラーゼ−鋳型複合体を含むナノポアシーケンシング複合体は、ＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅ（オックスフォード、英国）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（カリフォルニア州サンディエゴ）のヘカリーゼ及びエキソヌクレアーゼベースの方法、並びにＳｔｒａｔｏｓＧｅｎｏｍｉｃｓ（ワシントン州シアトル）のナノポアの伸長によるシーケンシング法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）に従って核酸をシーケンシングするために使用することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、核酸のシーケンシングは、本明細書に記載の方法に従って調製したポリメラーゼ−鋳型複合体を含むナノポアシーケンシング複合体を調製することと、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年１１月７日に出願の、名称「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＵｓｉｎｇＴａｇｓ」）に記載されているように、タグ化ヌクレオチドを用いて高濃度の塩でポリヌクレオチド配列を決定することと、を含む。例えば、１つ以上の検出電極に隣接して又はセンシング近接して、膜（例えば、脂質二重層）内に位置するナノポアシーケンシング複合体は、ヌクレオチド塩基が、ポリメラーゼに結合したポリヌクレオチドのそれと相補的な鎖に組み込まれ、ヌクレオチドのタグがナノポアによって検出される際、高濃度の塩のポリメラーゼによるタグ化ヌクレオチドの取り込みを検出することができる。ポリメラーゼ−鋳型複合体は、本明細書に提供されるように、ナノポアと結合させることができる。

タグ付けされたヌクレオチドのタグは、ナノポアによって検出され得る化学基又は分子を含むことができる。タグ化ヌクレオチドを提供するために使用されるタグの例は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７号の［０４１４］〜［０４５２］段落に少なくとも記載される。ヌクレオチドは、異なるヌクレオチドの混合物、例えば、Ｎがアデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）、又はウラシル（Ｕ）であるタグ化ｄＮＴＰの混合物から取り込まれ得る。あるいは、ヌクレオチドは、個々のタグ化ｄＮＴＰ、すなわち、タグ化ｄＡＴＰ、続いてタグ化ｄＣＴＰ、続いてタグ化ｄＧＴＰ等の溶液から交互に取り込まれ得る。ポリヌクレオチド配列の決定は、タグがナノポアを通過する際若しくはタグがナノポアに隣接する際、タグがナノポア内に存在する際、及び／又はタグがナノポアに提示される際に、ナノポアがタグを検出する場合、発生し得る。各タグ化ヌクレオチドのタグは、ヌクレオチドのリン酸（例えば、γリン酸）、糖、又は窒素性塩基部分を含むがこれらに限定されない任意の位置で、ヌクレオチド塩基にカップリングされ得る。いくつかの場合において、タグは、ヌクレオチドタグの取込み中にポリメラーゼと結合している間に検出される。タグは、ヌクレオチドの取込み、及び続くタグの切断並びに／又は放出後に、ナノポアを介してタグが移動するまで検出し続けることができる。いくつかの場合において、ヌクレオチド取込み事象がタグ付けされたヌクレオチドからタグを放出し、タグはナノポアを通過して検出される。タグは、ポリメラーゼによって放出され得るか、又はポリメラーゼの近くに位置する酵素による切断を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法で切断／放出され得る。このようにして、取り込まれた塩基を同定することができる（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ）が、これは、特有のタグが各タイプのヌクレオチドから放出されるからである（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル）。いくつかの状況では、ヌクレオチド取込み事象は、タグを放出しない。このような場合、取り込まれたヌクレオチドに結合したタグは、ナノポアの助けを借りて検出される。いくつかの例では、タグは、ナノポアを通って、又はナノポアに近接して移動することができ、ナノポアの助けを借りて検出され得る。

したがって、一態様では、高濃度の塩でナノポアシーケンシング複合体の助けを借りて、試料、例えば生物学的試料からポリヌクレオチドをシーケンシングするための方法が提供される。試料ポリヌクレオチドを、高濃度の塩を含み、本質的にヌクレオチドを含まない溶液中でポリメラーゼと合わせて、ナノポアシーケンシング複合体のポリメラーゼ−鋳型複合体部分を得る。一実施形態では、試料ポリヌクレオチドは試料ｓｓＤＮＡ鎖であり、これをＤＮＡポリメラーゼと合わせて、ポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体、例えばＰｏｌ６−ＤＮＡ複合体を得る。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド試料のナノポアシーケンシングは、例えば１００ｍＭを超える高濃度の塩を含み、本質的にヌクレオチドを含まない溶液中に、ポリメラーゼ−鋳型複合体、例えばＰｏｌ６−鋳型又はバリアントＰｏｌ６−鋳型複合体を提供すること；と、ポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアに結合させて、ナノポアシーケンシング複合体を形成すること；と、鋳型依存性の鎖合成を開始させるヌクレオチドを提供することと、によって実施される。シーケンシング複合体のナノポア部分は、本明細書の別の箇所に記載されているように、検出電極に隣接して、又は検出電極に近接して、膜内に配置される。得られたナノポアシーケンシング複合体は、本明細書の別の箇所に記載されているように、高濃度の塩で試料ＤＮＡのヌクレオチド塩基の配列を決定することができる。他の実施形態では、ナノポアシーケンシング複合体は、二本鎖ＤＮＡの配列を決定する。他の実施形態では、ナノポアシーケンシング複合体は、一本鎖ＤＮＡの配列を決定する。更に他の実施形態では、ナノポアシーケンシング複合体は、逆転写産物をシーケンシングすることによってＲＮＡの配列を決定する。

いくつかの実施形態では、ナノポアシーケンシングのための方法が提供される。本方法は、（ａ）高濃度の塩、例えば少なくとも１００ｍＭの塩を含み、かつヌクレオチドを含まない溶液中にポリメラーゼ−鋳型複合体を提供すること；と、（ｂ）ポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアとみ合わせて、ナノポア−シーケンシング複合体を形成すること；と、（ｃ）ナノポアシーケンシング複合体へタグ化ヌクレオチドを与えて、鋳型依存性ナノポアシーケンシングを開始すること；と、（ｄ）ナノポアの助けを借りて、ヌクレオチドの各々の取り込み中に、タグ付けされたヌクレオチドの各々に結合したタグを検出して、鋳型のその配列を決定することと、を含む。ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、高濃度の塩でポリメラーゼ活性を保持する野生型又はバリアントポリメラーゼであり得る。本明細書に記載される組成物及び方法における使用が見出されるポリメラーゼの例には、本明細書の別の箇所に記載される耐塩性ポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼは、配列番号３と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、Ｐｏｌ６ポリメラーゼである。

いくつかの実施形態では、核酸試料をナノポアシーケンシングする方法が提供される。本方法は、本明細書中に提供されるバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼを備えるナノポアシーケンシング複合体を用いることを含む。一実施形態では、本方法は、Ｐｏｌ６ナノポアシーケンシング複合体にタグ付けされたヌクレオチドを提供することと、鋳型依存的な様式でヌクレオチドを取り込むために重合反応を実施することと、取り込まれたヌクレオチドの各々のタグを検出して鋳型ＤＮＡの配列を決定することと、を含む。

一実施形態では、タグ化ヌクレオチドは、本明細書中に提供されたバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼを含むＰｏｌ６ナノポアシーケンシング複合体に提供し、該ナノポアシーケンシング複合体のバリアントＰｏｌ６酵素の助けを借りて重合反応を行って、核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な成長中の鎖にタグタグ化ヌクレオチドを組み込み、そして個々のタグ化ヌクレオチドの取り込み中に、ナノポアの助けを借りて、該個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを検出する。ここで、該タグは、ヌクレオチドがバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼと結合している間に、該ナノポアの助けを借りて検出される。

一態様では、高温にて低濃度のヌクレオチドで、ナノポアシーケンシング複合体の助けを借りて、試料、例えば生物学的試料からポリヌクレオチドをシーケンシングするための方法が提供される。例えば、試料ポリヌクレオチドは、高温であり、かつ低濃度のヌクレオチドを有する溶液中で、ポリメラーゼと組み合わされる。一実施形態では、試料ポリヌクレオチドは試料ｓｓＤＮＡ鎖であり、これをＤＮＡポリメラーゼと合わせて、ポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体、例えばＰｏｌ６−ＤＮＡ複合体を得る。温度は、本明細書に記載されるように、約４０℃など室温より高くてもよい。ヌクレオチド濃度は、例えば、本明細書に記載されるように、約１．２μＭであり得る。更に、溶液は、ポリメラーゼで飽和されているといった高濃度のポリメラーゼを含んでもよい。ポリメラーゼは、本明細書に記載されるようなバリアントポリメラーゼであり得る。

ある特定の例示的な態様では、ポリヌクレオチド鋳型のナノポアに基づくシーケンシングのための方法が提供される。本方法は、溶液が室温より高い温度といった高温である、低濃度のヌクレオチドを含む溶液中において、本明細書に記載のポリメラーゼ−鋳型複合体を形成することを含む。例えば、温度は、本明細書に記載されるように、約４０℃であり得る。この方法は、形成されたポリメラーゼ−鋳型複合体をナノポアと組み合わせて、ナノポア−シーケンシング複合体を形成することを含む。次いで、タグ化ヌクレオチドをナノポアシーケンシング複合体に提供して、高温で鋳型の鋳型依存性ナノポアシーケンシングを開始することができる。ナノポアの助けを借りて、タグ付きヌクレオチドの各々がポリメラーゼと結合している間に、タグ化ヌクレオチドの各々の取り込み中にタグ化ヌクレオチドの各々と結合したタグを検出し、それによって、ポリヌクレオチド鋳型の配列を決定する。ある特定の例では、ポリメラーゼ−鋳型複合体を形成することに、溶液をポリメラーゼ−鋳型複合体のポリメラーゼで飽和させることが含まれる。ヌクレオチド濃度は、０．８μＭ〜２．２μＭ、例えば約１．２μＭであり得る。温度は、例えば、約３５℃〜４５℃、例えば、約４０℃であり得る。

ポリヌクレオチドをシーケンシングするための本発明のナノポアシーケンシング複合体によるタグ化ヌクレオチドの使用を含む、シーケンシング方法の他の実施形態は、国際公開第ＷＯ２０１４／０７４７２７号に提供されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

ＡＣ波形及びタグ化ヌクレオチドを用いる核酸のシーケンシングは、２０１３年１１月６日に出願された米国特許公開第ＵＳ２０１４／０１３４６１６号、名称「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＵｓｉｎｇＴａｇｓ」に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。米国特許公開第ＵＳ２０１４／０１３４６１６号に記載のタグ化ヌクレオチドに加えて、シーケンシングは、糖又は非環状部分を欠くヌクレオチド類似体、例えば、５つの一般的な核酸塩基：アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、及びチミジンの（Ｓ）−グリセロールヌクレオシド三リン酸（ｇＮＴＰ）を用いて行うことができる（Ｈｏｒｈｏｔａら、「ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔｅｒｓ」、第８巻第５３４５〜５３４７頁（２００６年））。

以下の実験的開示では、次の略語が適用される：ｅｑ（等量）；Ｍ（モル）；μＭ（マイクロモル）；Ｎ（標準）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；°Ｃ（摂氏度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）。

実施例１−アニーリング鋳型の調製
本実施例は、アニーリング鋳型の調製方法に関する。

エッペンドルフチューブ（１．５ｍＬ）中において、２５．０μＬのアニーリング緩衝液（５００ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）、５．０μＬの濃縮プライマー（２０μＭ）、及び２０μＬのヌクレアーゼフリー水を混合することによって、プライマー混合物を調製した。濃縮プライマーは、鋳型ＤＮＡの一部に相補的なヌクレオチド配列、少なくとも１つのウラシル残基、及び精製部分に連結されたヌクレオチド配列を含む。

シーケンシングされる各試料用の別々のチューブにおいて、１０μＬのプライマー混合物を４０μＬの試料ＤＮＡ（２５ｎＭ）に添加し、混合した。

各チューブをサーモサイクラーに入れ、以下のプロトコルを用いてインキュベートした：４５℃で３０秒、２０℃〜４℃まで−０．１℃／秒の速度で冷却。チューブをサーモサイクラーから取り出し、氷上に置くまで、温度を４℃に維持した。

各５０μＬのアニーリング反応に、７５μＬのＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を添加した（ＤＮＡ：ビーズ比＝１：１．５）。チューブを５秒間ボルテックスし、次いで短時間回転した。反応物を室温で１０分間インキュベートし、その後、上清が除去されるまで、チューブを室温の磁気ラック上に数分間置いた。本実施例にはこのクリーンアップ工程が含まれているが、これは任意であり、省略することができる。上清を注意深く除去し、２００μＬの８０％エタノールを加えた。チューブを磁気ラックに戻し、数分後にエタノールを除去した。ビーズをもう一度エタノールで注意深く洗浄し、上記のようにエタノールを除去した。ビーズを、１０μＬの緩衝液（７５ｍＭＫＧｌｕ、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、０．０１％（重量／体積）Ｔｗｅｅｎ−２０、５ｍＭＴＣＥＰ、８％（重量／体積）トレハロース、及び１０μＭのブロックドシトシン（例えば、ｄＣｐＣｐｐ（ｄＣＭＰＣＰＰ）２’−デオキシシチジン−５’−［（α，β）−メチルエノ］トリホスフェート、ナトリウム塩）に再懸濁した。ｄｐＣｐＣｐｐはｄＣＴＰのα，β非加水分解性類似体であり、チューブを短時間ボルテックスし、回転して、内容物をチューブの底に移す。チューブを室温で５分間インキュベートする。次いで、チューブを磁気ラック上に置き、上清が透明になるまで１分間磁化した。上清を注意深く取り出し、新しい０．２ｍＬのＰＣＲチューブに移す。上清はアニーリング鋳型を含有する。

実施例２−１ポット調製及び複合体形成
本実施例は、１ポット組成物の調製方法に関する。１ポットはアニーリング鋳型の溶液であり、シーケンシング複合体の形成を可能にするコンジュゲートである。

コンジュゲートはＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを用いて本明細書に記載の通りに調製した。１ポット緩衝液中１０マイクロリットルの０．４μＭコンジュゲート（７５ｍＭＫＧｌｕ、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、０．０１％（重量／体積）Ｔｗｅｅｎ−２０、５ｍＭＴＣＥＰ、８％（重量／体積）トレハロース、及び１０μＭのブロックドシトシン）を、実施例１で調製した通りに各アニーリング鋳型に加えた。得られたコンジュゲート：鋳型比はおよそ４：１であり、最終的なコンジュゲート濃度は４００ｎＭであり、全容量は２０μＬであった（すなわち、１０μＬのアニーリング鋳型及び１０μＬのコンジュゲート）。

次いで、チューブをサーモサイクラーに入れ、３０分間３６℃でインキュベートし、その後４℃まで冷却した。これにより、ＳｐｙＴａｇ部分とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分との間に自発的なイソペプチド結合が形成される。終了の際、チューブをサーモサイクラーから取り出し、氷上に置くか、又は４℃で保持した。シーケンシング複合体を１ポット組成物の調製日に使用しない場合、以下の実施例３に記載される通りに、濃縮の準備ができるまで−８０℃で貯蔵した。

実施例３−複合体濃縮
本実施例は、上記の実施例２で調製した１ポットからのシーケンシング複合体の濃縮に関する。

前濃縮−ビーズ洗浄
新しい１．５ｍＬのチューブ中に、５０μＬのＫｉｌｏｂａｓｅＢＩＮＤＥＲＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＢｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、シーケンシングすべき各試料についてアリコートした。チューブを磁気ラック上に置き、上清が透明になるまでビーズを２〜３分間分離した。ビーズ床を乱さないように注意しながら、上清を除去した。チューブがまだ磁気ラック上にある間に、５００μＬの１ポット緩衝液を加えた。ビーズ床を乱さないように注意しながら、上清をゆっくりと除去した。ビーズ床を乱したり又はビーズを乾燥させたりしないように注意しながら、別の５００μＬの１ポット緩衝液を添加し、除去した。次いで、チューブを磁気ラックから取り出し、短時間回転して、内容物をチューブの底に移した。チューブを再び磁気ラック上に置き、上清が透明になるまで１分間磁化した。任意の残った上清を注意深く除去し、２０μＬの１ポット緩衝液を加え、チューブを磁気ラックから除去した。チューブを激しくボルテックスしてビーズを再懸濁し、ベンチトップ微小遠心機中で短時間回転して、内容物をチューブの底に移した。これでビーズは洗浄され、濃縮プロトコルで使用する準備は整った。

濃縮
サーモミキサを２０℃に予熱する。洗浄したビーズに、実施例２で調製した１ポット組成物２０μＬを加え、よく混合した。チューブをプログラム可能なサーモミキサに入れ、１０分間２０℃で１，２００ｒｐｍにてインキュベートした。チューブを取り出し、磁気ラック上に置き、上清が透明になるまでビーズを２〜３分間分離した。ビーズ床を乱さないように注意しながら、上清をゆっくりと除去した。チューブがまだ磁気ラック上にある間に、５００μＬの洗浄緩衝液（３００ｍＭＫＧｌｕ、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、０．０１％（重量／体積）Ｔｗｅｅｎ−２０、５ｍＭＴＣＥＰ、８％（重量／体積）トレハロース、及び１０μＭのブロックドＣ）を加えた。ビーズ床を乱さないように注意しながら、上清をゆっくりと除去した。チューブを磁気ラックから取り出し、７９μＬの洗浄緩衝液及び１μＬのＵＳＥＲ酵素をビーズに加えた。チューブをよく混合し、短時間回転して、内容物をチューブの底に移した。チューブをサーモミキサに入れ、１０分間２０℃で１，２００ｒｐｍにてインキュベートした。チューブを取り出し、短時間回転し、磁気ラック上に置き、上清が透明になるまでビーズを２〜３分間分離した。再びビーズ床を乱さないように注意しながら、上清をゆっくりと除去し、新しい１．５ｍＬチューブに移した。回収した２μＬのＤＮＡを使用し、製造業者の推奨プロトコルに従いＱｕｂｉｔ高感度（ＨＳ）ｄｓＤＮＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、シーケンシング複合体に結合するｄｓＤＮＡを定量化した。次の式を用いて濃度をｎＭに変換した：
Ｑｕｂｉｔ濃度（ｎｇ／μＬ）×１ｅ６／［平均断片長（ｎｔ）ｘ６６０（ｇ／ｍｏｌ）］＝濃度（ｎＭ）
次いで、適切な量の洗浄緩衝液を添加することによって、ＤＮＡの濃度を６ｎＭに調節した。次いで、シーケンシングで使用する準備が整うまで、６ｎＭの試料を氷上で保存するか、又は１２時間以内に使用される場合４℃で保持するか、又は−８０℃で保存した。

この時点での組成物は、コンジュゲートに結合したプライミングされた鋳型（例えば、アニーリング鋳型、自己プライミング鋳型等）である、濃縮シーケンシング複合体と称される。

実施例４−シーケンシングのための調製
本実施例は、ナノポアシーケンシングに使用するための濃縮シーケンシング複合体の調製を説明する。

希釈体積及び負荷濃度の例を以下の表に示す：

試料は、調製から１２時間以内にシーケンシングへ進む準備ができるまで、４℃又は氷上で保存した。

実施例５−シーケンシング
本実施例は、ナノポアシーケンシングにおける濃縮シーケンシング複合体の使用を説明する。

バイオチップは、二重層が複数のウェル上に配置されている、複数のウェルを含む。二重層は、２０１４年１０月２３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／６１８５３号に記載されるように形成した。分子を検出する（及び／又は核酸をシーケンシングする）ために使用されるナノポア装置（又はセンサ）は、国際公開第ＷＯ２０１３１２３４５０号に記載されているように設定した。

電極をコンディショニングし、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２６５１４号に記載される通り、リン脂質二重層をチップ上に確立した。上記の実施例４で得られた希釈した濃縮シーケンシング複合体をバイオチップ上に流し、２０１４年１０月２３日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／６１８５３号又は国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２６５１４号（国際公開第ＷＯ２０１３／１２３４５０号として公開）に記載されているように、シーケンシング複合体を挿入した。これらのプロトコルは、アニーリング鋳型が結合していないポア−ポリメラーゼ複合体の使用を説明しているが、同じプロトコルをシーケンシング複合体に使用してもよい。

ナノポアイオン流測定：複合体を膜に挿入した後、シス側の溶液をモル浸透圧濃度緩衝液で置換する：１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１５ｍＭＬｉＯＡｃ、５ｍＭＴＣＥＰ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、３００ｍＭグルタミン酸カリウム、ｐＨ７．８、２０℃。５００μＭである４つの異なるヌクレオチド基質のセットの各々を添加する。トランス側の緩衝溶液は次の通りである：１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１５ｍＭＬｉＯＡｃ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、３８０ｍＭグルタミン酸カリウム、ｐＨ７．５、２０℃。これらの緩衝溶液をナノポアイオン流測定のための電解質溶液として使用する。Ｐｔ／Ａｇ／ＡｇＣｌ電極設定を使用し、２１０ｍＶのｐｋ−ｔｏ−ｐｋ波形のＡＣ電流を９７６Ｈｚで印加した。ＡＣ電流は、タグがナノポアに繰り返し配向され、次いでナノポアから排出されることを可能にし、それにより、ナノポアを通るイオン流から生じるシグナルを測定するより多くの機会を提供するので、ナノポア検出のための特定の利点を有する。また、正及び負のＡＣ電流サイクル間のイオン流は、互いに反作用して、シス側からのイオン枯渇の正味速度を減少させ、この枯渇から生じるシグナルに対して起こり得る有害な影響を減少させる。

各々の異なるポリマー部分タグから生じる別の変化したイオン流事象を表すタグ電流レベルシグナルは、タグ付けされたヌクレオチドがＤＮＡ鋳型でプライミングされたα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポア−ポリメラーゼ・コンジュゲートによって捕捉される際に、観察される。これらの事象のプロットを経時的に記録し、分析する。概して、１０ｍｓより長く続く事象は、鋳型鎖に相補的な正しい塩基のポリメラーゼ取込みと同時に、生産的なタグ捕捉が起こることを示す。

本出願において引用されている全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書は、全ての目的のために個々の刊行物、特許、特許出願、又は他の文書が全ての目的のために参照により援用されることが個別に示されているのと同じ程度に、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。

Claims

シーケンシング複合体を単離する方法であって：
（ａ）試料ＤＮＡに濃縮プライマーをアニーリングして、アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドを形成すること；と、
（ｂ）前記アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドを精製すること；と、
（ｃ）コンジュゲートを前記アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドと組み合わせて、１ポット（Ｅｉｎｔｏｐｆ）を形成すること；と、
（ｄ）前記１ポットを、前記精製部分に結合することができる固体支持体と組み合わせて、濃縮１ポットを生成すること；と、
（ｅ）リンカーを酵素組成物で切断して前記精製部分を放出し、それによってシーケンシング複合体を放出して、濃縮シーケンシング複合体溶液を提供することと、を含む、方法。
シーケンシング複合体を単離する方法であって：
（ａ）コンジュゲートを精製部分を含むアニーリング鋳型オリゴヌクレオチドと組み合わせて１ポットを形成し、前記コンジュゲートが前記アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドに結合してシーケンシング複合体を形成することを可能にすること；と、
（ｂ）前記１ポットを、前記アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドの前記精製部分に結合することができる固体支持体と組み合わせること；と、
（ｃ）結合したシーケンシング複合体から結合していない複合体成分を分離すること；と、
（ｄ）前記リンカーを酵素組成物で切断して前記精製部分を放出することであって、ここで、前記精製部分が前記固体支持体と結合したままであり、それによって前記シーケンシング複合体を放出する、放出すること；と、
（ｅ）前記シーケンシング複合体から前記固体支持体を分離して、濃縮シーケンシング複合体溶液を提供することと、を含む、方法。
前記濃縮プライマーが、アダプターの一部に相補的なオリゴヌクレオチド、酵素的に切断可能なリンカー、及び精製部分を含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記リンカーが、非塩基部位又は少なくとも１つのウラシル残基を含む、請求項３に記載の方法。
前記試料ＤＮＡが、直鎖、環状、又は自己プライミングのいずれかである、請求項１又は２に記載の方法。
前記試料ＤＮＡが、少なくとも１つのアダプターに連結されている、請求項５に記載の方法。
アダプターが、前記試料ＤＮＡの各末端に連結されている、請求項５に記載の方法。
前記アダプターが、ダンベル型アダプターである、請求項７に記載の方法。
前記アダプターが、前記濃縮プライマーに結合することができるプライマー認識配列を含む、請求項６に記載の方法。
前記アニーリング鋳型オリゴヌクレオチドを精製することが、二本鎖ＤＮＡに選択的に結合する固体支持体への結合を含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記試料ＤＮＡが、バーコードを含む、請求項１０に記載の方法。
前記精製部分に結合することができる前記固体支持体が、ビーズである、請求項１又は２に記載の方法。
前記酵素組成物が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、リアーゼ、グリコリアーゼ、又はそれらの組合せを含む、請求項１又は２に記載の方法。
バイオチップを調製する方法であって、
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によってシーケンシング複合体を単離すること；と、
（ｂ）シーケンシング複合体を前記バイオチップの脂質二重層上に流すこと；と、
（ｃ）前記脂質二重層にシーケンシング複合体を挿入するのに充分な電圧を前記チップに印加することと、を含む、方法。
前記バイオチップが、少なくとも５００，０００個のナノポアシーケンシング複合体１ｍｍ^２の前記ナノポアシーケンシング複合体の密度を有する、請求項１４に記載の方法。