JP6333179B2 - ナノポアベースの分子検出および配列決定 - Google Patents

ナノポアベースの分子検出および配列決定 Download PDF

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Description

相互参照
本願は、２０１２年１月２０日に出願した米国仮特許出願第６１／５８９，１９６号、２０１２年１月２３日に出願した米国仮特許出願第６１／５８９，７１９号および２０１２年２月１７日に出願した米国仮特許出願第６１／６００，２２７号の利益を主張する。これらの出願の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
核酸の配列決定とは、核酸試料についての配列情報をもたらすのに使用されうる工程である。このような配列情報は、対象を診断および／または処置するのに有用でありうる。例えば、対象の核酸配列を使用して、遺伝子疾患を同定し、診断し、遺伝子疾患のための処置を潜在的に開発することができる。別の例として述べると、病原体への探査は、接触伝染性疾患のための処置をもたらしうる。
核酸を配列決定するのに使用しうる方法が利用可能である。しかし、このような方法は、高価であり、期間内に、対象を診断および／または処置するのに必要でありうる精度で配列情報をもたらすことが可能ではない。
ナノポアを使用して、核酸分子を含むポリマーを配列決定することができる。本明細書では、核酸分子を同定し、核酸を配列決定するための方法の改善に対する必要が認識されている。場合によって、ポリマーにナノポアを通して通過させると、ポリマーの多様なサブユニット（例えば、核酸のアデニン（Ａ）塩基、シトシン（Ｃ）塩基、グアニン（Ｇ）塩基、チミン（Ｔ）塩基、および／またはウラシル（Ｕ）塩基）は、ナノポアを通してを流れる電流に影響を及ぼしうる。本明細書で記載される通り、多様なサブユニットは、ナノポアおよび／または膜越しに印加される複数の電圧下における電流を測定することにより同定することができる。場合によって、タグ付けされたヌクレオチドを重合化することにより、タグ分子がナノポアに放出および／または提示されるが、これは、ナノポアおよび／または膜越しに印加される複数の電圧下における電流を測定することにより同定することができる。本明細書ではまた、二本鎖核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方をナノポアにより配列決定するための方法、ならびにリボ核酸（ＲＮＡ）減速バンプ分子（speed bump molecule）を使用して、核酸分子のナノポアを通しての通過を減速するための方法も提供される。
本発明のある態様は、分子またはその一部分を同定するための方法であって、（ａ）電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも１つのナノポアを含むチップを用意するステップであって、この電極は、ナノポアを通して流れる電流を検出するように適合されているステップを含む方法を提供する。次に、分子またはその一部分を、ナノポア内に挿入することができる。次いで、電圧を、ナノポア越しに、かつ／または膜越しに印加し、電圧を変化させることができる。複数の電圧下において電流を測定して、分子またはその一部分を同定することができる。
本発明の別の態様は、核酸分子またはその一部分を配列決定するための方法であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子を用意するステップと、第１の核酸セグメントを二本鎖核酸分子の第１の末端にライゲーションするステップとを含む方法を提供する。第１の核酸セグメントは、センス鎖をアンチセンス鎖と、二本鎖核酸分子の第１の末端において連結する。次に、二本鎖核酸分子を解離させて、センス鎖のセンス部分およびアンチセンス鎖のアンチセンス部分を含む一本鎖核酸分子をもたらすことができる。次いで、一本鎖核酸分子に、電極に隣接もしくは近接して配置される膜内のナノポアを通してもしくはナノポア近傍を通過させるか、または一本鎖核酸分子を、電極に隣接もしくは近接して配置される膜内のナノポアを通してもしくはナノポア近傍に方向付けることができる。電極は、一本鎖核酸分子がナノポアを通してまたはナノポア近傍に存在するかまたはこれを通過するときの電流を検出するように適合されていてもよい。次に、電極を使用して、一本鎖核酸分子が、ナノポア内に存在するか、またはナノポアを通してもしくはナノポア近傍を通過する間に、電流（ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｕｒｒｅｎｔ）（本明細書ではまた、「電流（ｃｕｒｒｅｎｔ）」とも称する）の測定値を得ることができる。二本鎖核酸の配列は、電流の測定値から決定することができる。
本発明の別の態様は、核酸分子またはその一部分を配列決定するための方法であって、一本鎖核酸分子に、電極に隣接または近接して配置される膜内のナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過させるステップを含む方法を提供する。一本鎖核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々の末端部分にライゲーションされた核酸セグメントを介してアンチセンス鎖に連結されたセンス鎖を含む。電極は、一本鎖核酸分子がナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過するときの電流を検出するように適合されている。一本鎖核酸分子にナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過させる間に、電極を一助として電流の測定値を得る。一本鎖核酸分子の配列は、電流の測定値から決定することができる。
本発明の別の態様は、核酸分子を配列決定するための方法であって、電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも１つのナノポアを含むチップを用意するステップを含む方法を提供する。電極は、核酸分子またはその一部分を検出するように適合されている。次に、核酸分子を、ナノポアを通してまたはナノポア近傍に方向付けることができる。核酸分子と会合させた少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）減速バンプ分子を一助として、ナノポアを通してまたはナノポア近傍の核酸分子の進行を停止または失速させる。核酸分子またはその一部分は、核酸分子が、ナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過するときに、配列決定することができる。
本発明の別の態様は、核酸分子の配列情報を得るための方法であって、核酸分子と会合させた、少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）減速バンプ分子を含む二重鎖セグメントを形成するステップと、核酸分子に、膜内のナノポアを通して流動させるか、膜内のナノポアに隣接して流動させるか、または膜内のナノポアの近傍を流動させるステップとを含む方法を提供する。膜は、電極に隣接または近接して配置され、電極は、センシング回路に連結される場合もあり、センシング回路の一部である場合もある。核酸分子に、ナノポアを通して流動させるか、ナノポアに隣接して流動させるか、またはナノポアの近傍を流動させると、二重鎖セグメントは、ナノポアに、またはナノポア越しに方向付けられる。次に、電極からの電気シグナルを、核酸分子に、ナノポアを通して流動させるか、ナノポアに隣接して流動させるか、またはナノポアの近傍を流動させるときに得る。電気シグナルは、核酸分子の１または複数の塩基と、ナノポアの少なくとも一部分との相互作用と関連する。二重鎖セグメントを一助として、核酸分子の流動を低減することができ、場合によっては、核酸分子の流動を失速させることもできる。
本願は一つの実施形態において例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
分子またはその一部分を同定するための方法であって、
（ａ）電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも１つのナノポアを含むチップを用意するステップであって、前記電極は、前記ナノポアを通して流れる電流を検出するように適合されているステップと、
（ｂ）分子またはその一部分を前記ナノポア内に挿入するステップと、
（ｃ）前記ナノポア越しに、かつ／または前記膜越しに印加される電圧を変化させるステップと、
（ｄ）複数の電圧下において前記電流を測定して、前記分子またはその一部分を同定するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記分子が、ポリマー分子であり、前記ポリマー分子が、前記ナノポアを通して通過するか、または前記ナノポア内に存在するときに、前記ポリマー分子の一部分が同定される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ポリマー分子が、核酸であり、前記ポリマー分子の前記一部分が、核酸または核酸群である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ポリマー分子が、ポリペプチドであり、前記ポリペプチドの前記一部分が、アミノ酸またはアミノ酸群である、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記ポリマー分子の前記ナノポアを通しての通過速度が、１または複数の減速バンプ分子を一助として減速され、前記ポリマー分子の前記通過速度が減速されるときに、前記ポリマー分子の一部分が同定される、項目２に記載の方法。
（項目６）
個々の減速バンプ分子が、リボ核酸を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ポリマー分子が、前記ナノポア内にトラップされる、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記ポリマー分子に、前記ナノポアを通して前後に縫うように進ませて、前記ポリマー分子の少なくとも一部分を複数回にわたり同定する、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ポリマー分子が、一本鎖核酸分子であり、前記分子が、前記ナノポアの両側に形成された嵩高い構造により、前記ナノポア内にトラップされる、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記ポリマー分子の前記一部分が、それらが前記ポリマー分子の全長に沿う順序で同定される、項目２に記載の方法。
（項目１１）
前記分子が、ヌクレオチドに結合している、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ヌクレオチドが、成長中の核酸鎖に組み込まれる間に、前記分子またはその一部分が同定される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ヌクレオチドが成長中の核酸鎖に組み込まれると、前記分子が前記ヌクレオチドから放出される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記ヌクレオチドが前記成長中の核酸鎖に組み込まれる順序で前記分子が同定される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
複数の電圧下における前記電流が、電子署名を含み、（ｄ）が、前記電子署名を複数の基準電子署名と比較して、前記分子またはその一部分を同定することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記電流を、電圧波形に従い変化させる、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記電圧波形が、方形波、正弦波、三角波、鋸歯状波、または不規則波である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ナノポアが、アルファヘモリシンのナノポアまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ＭｓｐＡ）のナノポアである、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記チップが、複数の電極に隣接または近接して複数のナノポアを含み、（ｉ）前記電極が、個別にアドレス指定されるか、（ｉｉ）印加された前記電圧が個別に制御されるか、または（ｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記分子が、二本鎖核酸分子であり、前記分子を解離させて、１または複数の一本鎖核酸分子を形成し、前記１または複数の一本鎖核酸分子に、前記ナノポアを通して通過させて、前記二本鎖核酸分子の配列を決定する、項目１に記載の方法。
（項目２１）
核酸ヘアピンを、前記二本鎖核酸分子の末端にライゲーションして、前記二本鎖核酸分子を解離させたときの、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む一本鎖核酸分子を用意する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
交流電流（ＡＣ）波形を、前記ナノポアおよび／または膜に印加することにより、前記電圧を変化させる、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記ＡＣ波形の周波数が、少なくとも約１００Ｈｚである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
核酸分子またはその一部分を配列決定するための方法であって、
（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子を用意するステップと、
（ｂ）第１の核酸セグメントを、前記二本鎖核酸分子の第１の末端にライゲーションするステップであって、前記第１の核酸セグメントが、前記センス鎖を前記アンチセンス鎖と、前記二本鎖核酸分子の前記第１の末端において連結するステップと、
（ｃ）前記二本鎖核酸分子を解離させて、前記センス鎖のセンス部分および前記アンチセンス鎖のアンチセンス部分を含む一本鎖核酸分子をもたらすステップと、
（ｄ）前記一本鎖核酸分子に、電極に隣接または近接して配置される膜内の、ナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過させるステップであって、前記電極が、前記一本鎖核酸分子が前記ナノポア内に存在するかまたはナノポアを通してもしくはナノポア近傍を通過するときの電流を検出するように適合されているステップと、
（ｅ）前記一本鎖核酸分子が、前記ナノポア内に存在するかまたはナノポアを通してもしくはナノポア近傍を通過する間に、前記電極を使用し、電流の測定値を得るステップと、
（ｆ）前記二本鎖核酸の前記配列を、（ｅ）で得られた前記電流の測定値から決定するステップと
を含む方法。
（項目２５）
前記第１の核酸セグメントが、核酸ヘアピンである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の核酸セグメントが、第１の識別子をさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の識別子により、前記二本鎖核酸分子がどの試料に由来するのかが同定される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
（ｂ）の後で、第２の核酸セグメントを、前記二本鎖核酸分子の第２の末端にライゲーションするステップをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記第２の核酸セグメントが、前記ナノポア内に前記一本鎖核酸分子をトラップすることが可能である一部分を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
温度が約６０℃を下回るときに、前記第２の核酸セグメントが、前記ナノポア内に前記一本鎖核酸分子をトラップすることが可能である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記第２の核酸セグメントが、第２の識別子を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記第２の識別子を使用して、前記一本鎖核酸分子が、前記ナノポアを通して第１の向きに通過するのかまたは第２の向きに通過するのかを決定することが可能である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における前記一本鎖核酸分子の通過速度が、１または複数の減速バンプ分子を一助として減速される、項目２４に記載の方法。
（項目３４）
前記一本鎖核酸分子の前記通過速度が減速されるかまたは失速されるときに、電流の測定値が得られる、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
電流の測定を、前記ナノポア越しに、かつ／または前記膜越しに印加される複数の電圧下で行う、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記１または複数の減速バンプ分子のうちの個々の減速バンプ分子が、リボ核酸を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
核酸分子またはその一部分を配列決定するための方法であって、
（ａ）一本鎖核酸分子に、電極に隣接または近接して配置される膜内のナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過させるステップであって、前記一本鎖核酸分子が、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々の末端部分にライゲーションされた核酸セグメントを介して前記アンチセンス鎖に連結された前記センス鎖を含み、前記電極が、前記一本鎖核酸分子が前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を通過するときの電流を検出するように適合されているステップと、
（ｂ）前記一本鎖核酸分子に前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を通過させる間に、前記電極を一助として電流の測定値を得るステップと、
（ｃ）前記一本鎖核酸分子の配列を、（ｂ）で得られた電流の測定値から決定するステップと
を含む方法。
（項目３８）
（ｃ）における、前記一本鎖核酸分子の配列を決定するステップが、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子の配列を決定することをさらに含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記核酸セグメントが、核酸ヘアピンである、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における前記一本鎖核酸分子の通過速度が、１または複数の減速バンプ分子を一助として減速される、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記一本鎖核酸分子の前記通過速度が減速されるかまたは失速されるときに、電流の測定値が得られる、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
電流の測定を、前記ナノポア越しに、かつ／または前記膜越しに印加される複数の電圧下で行う、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記１または複数の減速バンプ分子のうちの個々の減速バンプ分子が、リボ核酸を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
核酸分子を配列決定するための方法であって、
（ａ）電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも１つのナノポアを含むチップを用意するステップであって、前記電極が、前記核酸分子またはその一部分を検出するように適合されているステップと、
（ｂ）前記核酸分子を、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍に方向付けるステップであり、前記核酸分子と会合させた少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）減速バンプ分子を一助として、前記核酸分子の前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における進行を停止または失速させるステップと、
（ｃ）前記核酸分子が、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を通過するときに、前記核酸分子またはその一部分を配列決定するステップと
を含む方法。
（項目４５）
前記ＲＮＡ減速バンプ分子を、前記核酸分子と非共有結合的に会合させる、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記ＲＮＡ減速バンプ分子が、１または複数のオリゴヌクレオチド塩基の配列を含有するオリゴヌクレオチドを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記減速バンプ分子の長さが、最長８オリゴヌクレオチド塩基である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記オリゴヌクレオチド塩基が、前記核酸分子と対合する、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記ＲＮＡ減速バンプ分子が、ユニバーサル塩基、モルホリノ、グリコールヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、メチル化核酸塩基、修飾塩基、非結合塩基模倣体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸、またはこれらの任意の組合せを有する、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記ＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させる、項目４４に記載の方法。
（項目５１）
前記ＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
前記ＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させ、別のＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、項目４４に記載の方法。
（項目５３）
前記核酸分子が前記ナノポアを通して通過するときに、前記ＲＮＡ減速バンプ分子が前記核酸分子から解離する、項目４４に記載の方法。
（項目５４）
前記ナノポアが、アルファ−ヘモリシンのナノポアである、項目４４に記載の方法。
（項目５５）
前記核酸分子が、一本鎖である、項目４４に記載の方法。
（項目５６）
前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速されるときに、前記核酸分子の単一の塩基が同定される、項目４４に記載の方法。
（項目５７）
前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速されるときに、前記核酸分子の最大３つの塩基が同定される、項目４４に記載の方法。
（項目５８）
前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速されるときに、前記核酸分子の最大５つの塩基が同定される、項目４４に記載の方法。
（項目５９）
前記核酸分子と会合させた複数のＲＮＡ減速バンプ分子を一助として、前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速される、項目４４に記載の方法。
（項目６０）
核酸分子の配列情報を得るための方法であって、
（ａ）前記核酸分子と会合させた少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）減速バンプ分子を含む二重鎖セグメントを形成するステップと、
（ｂ）前記核酸分子に、膜内のナノポアを通してまたはナノポア近傍を流動させるステップであり、前記膜を、電極に隣接または近接して配置し、前記核酸分子に、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を流動させると、前記二重鎖セグメントが、前記ナノポアへ、または前記ナノポア越しに方向付けられるステップと、
（ｃ）前記核酸分子の、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍の前記流動時において、電気シグナルを、前記電極から得るステップであり、前記電気シグナルが、前記核酸分子の１または複数の塩基と、前記ナノポアの少なくとも一部分との相互作用と関連し、前記核酸分子の、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における前記流動が、前記二重鎖セグメントを一助として低減されるステップと
を含む方法。
（項目６１）
（ｃ）における前記流動が、前記ＲＮＡ減速バンプ分子と前記ナノポアとの前記相互作用時において低減される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ナノポアが、前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記流動を制限する狭窄部を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記二重鎖セグメント内に含まれる前記核酸分子の一部分に、前記ナノポアを通して流動させる前に、前記ＲＮＡ減速バンプ分子を、前記核酸分子から解離させるステップをさらに含む、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
前記核酸分子を前記ナノポア内にトラップするステップをさらに含む、項目６０に記載の方法。
（項目６５）
前記核酸分子の１または複数の末端部分に形成された１または複数の嵩高い構造を一助として、前記核酸分子が、前記ナノポア内にトラップされる、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記核酸分子の１または複数の末端部分に取り付けられた１または複数の嵩高い構造を一助として、前記核酸分子が、前記ナノポア内にトラップされる、項目６４に記載の方法。
（項目６７）
前記核酸分子の流動の方向を反転させるステップをさらに含む、項目６０に記載の方法。
（項目６８）
前記核酸分子の流動の前記方向を反転させるステップの後に前記核酸分子の少なくとも一部分を再配列決定するステップをさらに含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記ナノポアが、アルファ−ヘモリシンのナノポアである、項目６０に記載の方法。
（項目７０）
前記核酸分子が、一本鎖である、項目６０に記載の方法。
（項目７１）
前記少なくとも１つのＲＮＡ減速バンプ分子が、１または複数のオリゴヌクレオチド塩基の配列を含有するオリゴヌクレオチドを含む、項目６０に記載の方法。
（項目７２）
前記少なくとも１つのＲＮＡ減速バンプ分子が、ユニバーサル塩基、モルホリノ、グリコールヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、メチル化核酸塩基、修飾塩基、非結合塩基模倣体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸、またはこれらの任意の組合せを有する、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記少なくとも１つのＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させる、項目６０に記載の方法。
（項目７４）
前記少なくとも１つのＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、項目６０に記載の方法。
（項目７５）
前記少なくとも１つのＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させ、別のＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、項目６０に記載の方法。
本発明のさらなる態様および利点は、本発明の例示的な実施形態だけが示され、記載される以下の詳細な記載から、当業者にたやすく明らかとなろう。気づかれる通り、全てが本発明から逸脱しない限りにおいて、本発明は、他の実施形態および異なる実施形態も可能であり、そのいくつかの細部は、多様で明白な点において改変が可能である。したがって、図面および記載は、性格において例示的であると考えられるべきであり、限定的であると考えられるべきではない。
参照による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれるように、具体的に、かつ、個別に指し示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規の特色は、付属の特許請求の範囲において、特殊性を伴って示される。本発明の原理が活用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な記載、および付属の図面を参照することにより、本発明の特色および利点についてのよりよい理解が得られるであろう。
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、ナノポア型検出器の例を示す。図１Ａでは、ナノポアが、電極上に配置され、図１Ｂでは、ナノポアが、ウェル上の膜内に挿入され、図１Ｃでは、ナノポアが、突出する電極上に配置される。 図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、ナノポア型検出器の例を示す。図１Ａでは、ナノポアが、電極上に配置され、図１Ｂでは、ナノポアが、ウェル上の膜内に挿入され、図１Ｃでは、ナノポアが、突出する電極上に配置される。 図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、ナノポア型検出器の例を示す。図１Ａでは、ナノポアが、電極上に配置され、図１Ｂでは、ナノポアが、ウェル上の膜内に挿入され、図１Ｃでは、ナノポアが、突出する電極上に配置される。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、ナノポアにより検出されうる分子の例を示す。図２Ａは、分子の検出を示し、図２Ｂは、ポリマー分子の一部分の検出を示し、図２Ｃは、核酸を配列決定するためのタグ分子の検出を示し、図２Ｄは、ヌクレオチドを組み込む間における、タグの検出を示す。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、ナノポアにより検出されうる分子の例を示す。図２Ａは、分子の検出を示し、図２Ｂは、ポリマー分子の一部分の検出を示し、図２Ｃは、核酸を配列決定するためのタグ分子の検出を示し、図２Ｄは、ヌクレオチドを組み込む間における、タグの検出を示す。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、ナノポアにより検出されうる分子の例を示す。図２Ａは、分子の検出を示し、図２Ｂは、ポリマー分子の一部分の検出を示し、図２Ｃは、核酸を配列決定するためのタグ分子の検出を示し、図２Ｄは、ヌクレオチドを組み込む間における、タグの検出を示す。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、ナノポアにより検出されうる分子の例を示す。図２Ａは、分子の検出を示し、図２Ｂは、ポリマー分子の一部分の検出を示し、図２Ｃは、核酸を配列決定するためのタグ分子の検出を示し、図２Ｄは、ヌクレオチドを組み込む間における、タグの検出を示す。 図３は、ナノポアは含むが、ウェルは含まないチップの仕組みの例を示す。 図４は、超小型測定回路の例を示す。 図５は、セルアナログ回路の例を示す。 図６は、ナノポア型検出器のアレイを示す。 図７は、試験用チップセルアレイ構成の例を示す。 図８は、配列決定装置を制御するように構成されたコンピュータシステムを示す。 図９は、核酸配列決定法を示す。 図１０は、一本鎖（ｓｓ）被験ポリヌクレオチド分子のナノポアを通しての通過を例示する。 図１１は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドのナノポアを通しての通過を失速させるために、ｓｓ被験ポリヌクレオチド分子の終端に形成された嵩高い構造を図示する。 図１２は、ｓｓ被験ポリヌクレオチド分子に結合させた複数の減速バンプを図示し、この場合、ｓｓ被験ポリヌクレオチドが、両端に嵩高い構造を有することにより、ナノポア内にトラップされる。 図１３は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを、ランダム減速バンププールと接触させることにより達成される異なる結合パターンを図示する。 図１４は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドをナノポア内でランダムに失速させて、配列情報を得ることにより達成される、異なる配列情報パターンを図示する。 図１５は、ナノポアを通してのその通過を失速させるために、第１の末端に嵩高い構造を有するｓｓ被験ポリヌクレオチドに結合させた減速バンプを図示する。 図１６は、本発明に従うナノポア型検出器により得られる複数の電気シグナルのセットを図示する。 図１７は、２つの嵩高い構造を結合させた、ナノポア内にトラップされるｓｓ被験ポリヌクレオチド内の方向識別子の検出を図示する。 図１８は、識別子特異的な減速バンプによる識別子の検出を図示する。 図１９は、試料ポリヌクレオチドおよび複数の機能的部分を含むｓｓ被験ポリヌクレオチドの例を図示する。 図２０は、試料ポリヌクレオチドおよび複数の機能的部分を含むｄｓ被験ポリヌクレオチドの例を図示する。 図２１は、ナノポアの両側に複数の減速バンプを結合させた、ナノポア内にトラップされるｓｓ被験ポリヌクレオチドを図示する。 図２２は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの、減速バンプトレインとの接触を図示する。 図２３は、本発明の実施形態に従う工程のフローチャートを図示する。 図２４は、作業温度と、一方の末端にＢＳ２−１を有し、他方の末端にＢＳ１を有するｓｓ被験ポリヌクレオチドの、ナノポア内の捕捉との関係を図示する。 図２５は、ヌクレオチドのリン酸に接合されたタグ分子の例を示す。 図２６は、代替的なタグ位置の例を示す。 図２７は、検出可能なタグ−ポリリン酸および検出可能なタグを示す。 図２８は、試料ポリヌクレオチド、試料ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、試料ポリヌクレオチドとそのアンチセンスポリヌクレオチドとを連結するリンカー、第１の嵩高前構造、および第２の嵩高前構造を含む被験ポリヌクレオチドの例を図示する。 図２９は、波形の例を示す。 図３０は、４つの核酸塩基であるアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）について、抽出されるシグナルを、印加される電圧と対比したプロットを示す。 図３１は、４つの核酸塩基であるアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）に対する複数回の試行について、抽出されるシグナルを、印加される電圧と対比したプロットを示す。 図３２は、４つの核酸塩基であるアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）に対する複数回の試行について、相対伝導差パーセント（％ＲＣＤ）の印加される電圧と対比したプロットを示す。
本明細書では、本発明の多様な実施形態を示し、記載してきたが、当業者には、このような実施形態は、例だけを目的として提示されることが明白であろう。本発明から逸脱しない限りにおいて、当業者には、多数の変更、変化、および代用が想到されうる。本明細書で記載される本発明の実施形態に対する多様な代替法を援用しうることを理解されたい。
本明細書で使用される「ナノポア」という用語は一般に、膜内に形成されるかまたは他の形で施されるポア、チャネル、または通路を指す。膜は、脂質二重層などの有機膜の場合もあり、ポリマー性材料から形成された膜などの合成膜の場合もある。膜は、ポリマー性材料でありうる。ナノポアは、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路などのセンシング回路またはセンシング回路に連結された電極に隣接または近接して配置することができる。いくつかの例では、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍのオーダーの特徴的な幅または直径を有する。一部のナノポアは、タンパク質である。アルファヘモリシンは、タンパク質によるナノポアの例である。
本明細書で使用される「ポリメラーゼ」という用語は一般に、重合化反応を触媒することが可能な任意の酵素または他の分子触媒を指す。ポリメラーゼの例は、限定なしに述べると、核酸ポリメラーゼまたは核酸リガーゼを含む。ポリメラーゼは、重合化酵素でありうる。
本明細書で使用される「核酸」という用語は一般に、１または複数の核酸サブユニットを含む分子を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、またはこれらの変異体から選択される１または複数のサブユニットを含みうる。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、もしくはＵ、またはこれらの変異体を含みうる。ヌクレオチドは、成長中の核酸鎖に組み込まれうる任意のサブユニットを含みうる。このようなサブユニットは、１もしくは複数の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、もしくはＵに対して特異的であるか、またはプリン（すなわち、ＡもしくはＧ、またはその変異体）もしくはピリミジン（すなわち、Ｃ、Ｔ、もしくはＵ、またはその変異体）と相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、もしくはＵ、または他の任意のサブユニットでありうる。サブユニットは、個々の核酸塩基または塩基群（例えば、ＡＡ、ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＴ、ＴＧ、ＡＣ、ＣＡ、またはウラシル−その対応塩基）に分解することを可能としうる。いくつかの例では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはその誘導体である。核酸は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」という用語は一般に、１または複数のヌクレオチドを含むポリマーまたはオリゴマーを指す。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む場合もあり、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む場合もあり、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドおよび／またはＲＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの１または複数の区間を含む場合もある。
本明細書で一般に使用される「ヌクレオチド」または「塩基」は、本源性ヌクレオチドの場合もあり、ヌクレオチド類似体の場合もある。本源性ヌクレオチドとは、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）またはウリジン一リン酸（ＵＭＰ）である。ヌクレオチド類似体とは、本源性ヌクレオチドの類似体または模倣体であって、本源性核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ）、デオキシリボース／リボース構造、本源性ヌクレオチドのリン酸基、またはこれらの任意の組合せにおいて修飾を有する類似体または模倣体である。例えば、ヌクレオチド類似体は、天然で存在するかまたは人工の修飾塩基を有しうる。修飾塩基の例は、限定なしに述べると、メチル化核酸塩基、修飾プリン塩基（例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、イソｄＧ）、修飾ピリミジン塩基（例えば、５，６−ジヒドロウラシルおよび５−メチルシトシン、イソｄＣ）、ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドール）、非結合塩基模倣体（例えば、４−メチルベンズイミダゾール（4-methylbezimidazole）、および２，４−ジフルオロトルエンまたは２，４−ジフルオロベンゼン）、および非塩基（ヌクレオチド類似体が塩基を有さない脱塩基ヌクレオチド）を含む。修飾デオキシリボース（例えば、ジデオキシグアノシン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシチミジン、およびジデオキシシチジンなどのジデオキシヌクレオシド）、および／またはリン酸構造（併せて骨格構造と称する）を有するヌクレオチド類似体の例は、限定なしに述べると、グリコールヌクレオチド、モルホリノ、およびロックドヌクレオチド（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含む。
本明細書で使用される「被験ポリマー」（ｔｅｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒ）という用語は一般に、検出目的で、ナノポアを通して通過するか、またはナノポアに隣接して通過する、ポリマー分子を指す。被験ポリマーは、類似の化学的構造を有する複数の構成要素を含みうる。被験ポリマーの例は、限定なしに述べると、被験ポリヌクレオチド、被験ペプチド／タンパク質、および被験炭水化物を含む。被験ポリヌクレオチドは、一本鎖被験ポリヌクレオチド（すなわち、ｓｓ被験ポリヌクレオチド）の場合もあり、二本鎖被験ポリヌクレオチド（すなわち、ｄｓ被験ポリヌクレオチド）の場合もある。構成要素の例は、限定なしに述べると、ヌクレオチド、アミノ酸、および単糖を含む。
本明細書で使用される「試料ポリヌクレオチド」という用語は一般に、例えば、一本鎖（「ｓｓ」）試料ポリヌクレオチド（ｓｓ試料ポリヌクレオチド）または二本鎖（「ｄｓ」）試料ポリヌクレオチド（すなわち、ｄｓ試料ポリヌクレオチドなど、例えば、ｄｓ試料ＤＮＡ、ｄｓ試料ＲＮＡ、およびｄｓ試料ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体）など、対象のポリヌクレオチドを含みうる核酸分子を指す。試料ポリヌクレオチドは、生物学的試料から得られる天然のポリヌクレオチドの場合もあり、合成ポリヌクレオチドの場合もある。合成ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの同定および／または配列決定における使用を意図して前加工されたポリヌクレオチドなど、天然のポリヌクレオチドを修飾することにより得られるポリヌクレオチドでありうる。このような前加工の例は、限定なしに述べると、所望の断片についての試料ポリヌクレオチドの濃縮、ペアドエンド加工、メイテッドペアリード加工、二硫化物処理を含むエピジェネティック前加工、ＰＣＲを介する焦点化された断片解析、ＰＣＲによる断片の配列決定、および短鎖ポリヌクレオチドの断片解析を含む。
本明細書で使用される「被験ポリヌクレオチド」という用語は一般に、検出目的で、ナノポアを通して通過するか、またはナノポアに隣接して通過する、ポリヌクレオチド分子を指す。被験ポリヌクレオチドは、一本鎖被験ポリヌクレオチド（すなわち、ｓｓ被験ポリヌクレオチド）および二本鎖被験ポリヌクレオチド（すなわち、ｄｓ被験ポリヌクレオチドなど、例えば、ｄｓ被験ＤＮＡ、ｄｓ被験ＲＮＡ、およびｄｓ被験ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体）でありうる。本明細書で使用されるｓｓ被験ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される方法により減速バンプを結合させたｓｓポリヌクレオチドの区間を含む。ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、試料ポリヌクレオチドおよび他の機能的部分（例えば、嵩高前構造、識別子、および単離用タグ）もさらに含みうる。
本明細書で使用される「嵩高前構造」（pre-bulky structure）という用語は一般に、ポリヌクレオチド分子内の分子構造であって、ある種の条件下で（例えば、ある温度、ある種の化合物（複数可）の存在／非存在下で）嵩高い構造を形成しうる分子構造を指す。嵩高前構造の例は、オリゴヌクレオチド構造を含む。嵩高前構造は、ｓｓポリヌクレオチドの場合もあり、ｄｓポリヌクレオチドの場合もある。
本明細書で使用される「嵩高い構造」（bulky structure）という用語は一般に、ｓｓ被験ポリヌクレオチド分子内の嵩高前構造から形成される構造（例えば、ヌクレオチド）を指す。嵩高い構造は、嵩高い構造を嵩高前構造または被験ポリヌクレオチド分子を失速させうる他の構造に転換する別の条件に作業条件を変化させるまで、ある作業条件において、ナノポア内の被験ポリヌクレオチド分子を減速するかまたは失速させることが可能である。嵩高い構造の例は、限定なしに述べると、ポリヌクレオチド二重鎖構造（ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ二重鎖、またはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド体）、ポリヌクレオチドヘアピン構造、多重ヘアピン構造、および多重アーム構造などの二次元構造および三次元構造を含む。別の実施形態では、嵩高前構造は、嵩高前構造に対して特異的なリガンドとの相互作用を介する嵩高い構造を形成する。このような嵩高前構造／リガンド対の例は、限定なしに述べると、ビオチン／ストレプトアビジン対、抗原／抗体対、および炭水化物／抗体対を含む。
ある実施形態では、嵩高い構造は、オリゴヌクレオチド嵩高前構造、例えば、ｓｓ被験ポリヌクレオチド分子内の嵩高前構造から形成されたオリゴヌクレオチド構造から形成される。ポリヌクレオチド嵩高構造またはオリゴヌクレオチド嵩高構造の例は、限定なしに述べると、ヘアピン核酸鎖、ハイブリダイズアンチセンス核酸鎖、複数アーム、および自己ハイブリダイズした三次元ＤＮＡ分子または三次元ＲＮＡ分子を含む。別の実施形態では、嵩高い構造は、本明細書で記載される嵩高前構造／リガンド対の相互作用を介して形成される。
本明細書で使用される「二重鎖」という用語は一般に、二重鎖構造、二重鎖区間、二重鎖領域、または二重鎖セグメントを指す。二重鎖は、ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ二重鎖、またはＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖の構造、区間、領域、またはセグメントを含みうる。
本明細書で使用される「減速バンプ」という用語は一般に、被験ポリヌクレオチド分子の結合セグメントと共に複合体を形成するオリゴヌクレオチドなどの分子を指す。例として述べると、被験ポリヌクレオチド分子が、印加される電位下で、ナノポアを通して移動するかまたはナノポアに隣接して移動するときに、減速バンプと結合セグメントとの間で形成される複合体は、ナノポア型検出器が、被験ポリヌクレオチド分子からのシグナルを得るのに十分な程度に長い滞留時間にわたり、被験ポリヌクレオチド分子を、ナノポア内で、またはナノポアに隣接して減速するかまたは失速させ、このシグナルにより、被験ポリヌクレオチド分子についての構造情報または配列情報がもたらされうる。滞留時間の後、複合体は解離し、被験ポリヌクレオチド分子はナノポアを通して前方に進む。
本明細書で使用される「公知の減速バンプ」という用語は一般に、ｓｓ被験ポリヌクレオチド内の公知の配列に特異的に結合する減速バンプを指す。ｓｓ被験ポリヌクレオチド上の結合セグメント（公知の配列）は公知であるため、減速バンプ構造もまた、公知でありうる（例えば、ｓｓ被験ポリヌクレオチド上の公知の配列に対して相補的でありうる）。
本明細書で使用される「ランダム減速バンププール」という用語は一般に、被験ポリヌクレオチド分子またはその断片の全ての区間または実質的に全ての区間に結合しうる減速バンプコレクションを指す。ランダム減速バンププールの例は、全ての本源性核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）と塩基対合するユニバーサル核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを含む。ランダム減速バンププールの別の例は、本源性核酸塩基の全ての可能な組合せを有する、所与の長さのオリゴヌクレオチドを含む。ランダム減速バンププールの別の例は、本源性核酸塩基とユニバーサル核酸塩基とのあらゆる可能な組合せを有する、所与の長さのオリゴヌクレオチドを含む。ランダム減速バンププールの別の例は、ユニバーサル核酸塩基を指定された位置において有し、全ての本源性核酸塩基の組合せを他の位置において有する減速バンプを含む。ランダム減速バンプの別の例は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドと共に二重鎖区間を形成するｓｓ減速バンプの組合せであり、この二重鎖区間の溶融温度はほぼ同じである。これらのｓｓ減速バンプは、長さが同じ場合もあり、異なる場合もあり、かつ／または同じヌクレオチドを有する場合もあり、異なるヌクレオチドを有する場合もある。
本明細書で使用される「ストッパ」という用語は一般に、被験ポリヌクレオチドと共にストッパ−被験ポリヌクレオチド複合体を形成し、ストッパ−被験ポリヌクレオチド複合体の流動を、ナノポアの狭窄領域の前で、滞留時間にわたり停止させうる構造を指す。ストッパは、被験ポリヌクレオチドの一部の場合もあり、個別の構造（例えば、本明細書で記載される減速バンプ、およびヌクレオチドポリメラーゼの存在下で形成された、被験ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖）の場合もあり、被験ポリヌクレオチドに結合し、任意選択で、被験ポリヌクレオチドにナノポアを通して移動させうる酵素の場合もある。
本明細書で使用される「識別子」という用語は一般に、本明細書で記載される方法により検出または同定されうる、被験ポリヌクレオチド内の公知の配列または構造を指す。識別子の例は、限定なしに述べると、方向識別子、基準シグナル識別子、試料供給源識別子、および試料識別子を含む。識別子は、顕著に異なる、同定可能な電気シグナルをもたらす、１または複数のヌクレオチドまたは構造を含みうる。このようなヌクレオチドおよび構造の例は、限定なしに述べると、イソｄＧ、イソｄＣ、メチル化ヌクレオチド、ロックド核酸、ユニバーサルヌクレオチド、および脱塩基ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、本源性ヌクレオチドより強いシグナルをもたらす。したがって、脱塩基ヌクレオチドおよび本源性ヌクレオチドの両方を含む配列について、ナノポアにより検出される電気シグナルは、本源性ヌクレオチドだけによる配列から得られる電気シグナルより大きな強度のシグナルをもたらしうる。例えば、約２５％の脱塩基ヌクレオチドを含む４〜５塩基の配列は、本源性ヌクレオチドだけを含む４〜５塩基の配列の２倍を超える強さのシグナルをもたらしうる。配列が有する脱塩基ヌクレオチドが多いほど、その配列の電気シグナルはより強くなる。したがって、識別子は、識別子配列内の脱塩基ヌクレオチドの量を変化させることにより、所望の強度の（例えば、同じ長さの本源性オリゴヌクレオチドによる強度の約２倍、約３、４、５、６、７、８、９、または約１０倍の）電気シグナルをもたらしうる。
本明細書で使用される「方向識別子」という用語は一般に、嵩高前構造から形成される嵩高い構造から少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または５０塩基の位置にある公知の配列（図１７に描示されるｓｓ被験ポリヌクレオチド分子内の影を付した区間）を指す。いくつかの例では、嵩高い構造は、形成されると、ｓｓ被験ポリヌクレオチド分子がその中に組み込まれるナノポアを通してｓｓ被験ポリヌクレオチド分子が流動することを停止させうる。例として述べると、ナノポアの内側で、またはナノポアに隣接して、嵩高い構造を失速させるか、減速するか、または停止させると、ｓｓ被験ポリヌクレオチド分子の流動方向で、嵩高い構造の前にある配列および嵩高い構造の最初の塩基対の配列情報をもたらしうる電気シグナルのセットを得ることができる。配列が公知の場合、このような電気シグナルは、限定なしに述べると、（１）嵩高い構造により、ｓｓ被験ポリヌクレオチド分子がナノポアを通して流動することを停止させるように、嵩高前構造が嵩高い構造に適正に形成されたことを検証することも可能であり、（２）ｓｓ被験ポリヌクレオチド分子が、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの一本鎖区間の一方の末端に到達したことを指し示すことも可能であり、かつ／または（３）同じナノポアで得られる他の電気シグナルについてのベースラインをもたらす基準読取りまたは較正読取りとして用いられる可能性もある。いくつかの実施形態では、方向識別子は、顕著に異なる電気シグナルであって、たやすく同定される電気シグナルをもたらす、１または複数のヌクレオチドまたは構造を含む。このようなヌクレオチドおよび構造の例は、限定なしに述べると、イソｄＧ、イソｄＣ、および脱塩基ヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される「基準シグナル識別子」という用語は一般に、被験ポリヌクレオチド内の公知の配列であって、本明細書で記載される方法により検出または同定されると、同じナノポアで得られる他の電気シグナルについてのベースラインをもたらす基準読取りまたは較正読取りとして用いられうる配列を指す。
本明細書で使用される「試料供給源識別子」という用語は一般に、被験ポリヌクレオチド内の公知の配列であって、本明細書で記載される方法により検出または同定されると、試料ポリヌクレオチドの供給源を同定するのに使用されうる配列を指す。
本明細書で使用される「試料識別子」という用語は一般に、被験ポリヌクレオチド内の公知の配列であって、本明細書で記載される方法により検出または同定されると、個々の試料ポリヌクレオチドを同定するのに使用されうる配列を指す。
本明細書で使用される「リンカー識別子」という用語は一般に、被験ポリヌクレオチド内の公知の配列であって、本明細書で記載される方法により検出または同定されると、試料ポリヌクレオチド区間とアンチセンスポリヌクレオチド区間との間の移行を指し示すのに使用されうる配列を指す。例として述べると、リンカー識別子が検出または同定されれば、試料ポリヌクレオチド区間／アンチセンスポリヌクレオチド区間は、ナノポアを通して通過している。
本発明は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、タンパク質、またはポリマーを配列決定するためなど、配列決定するためのデバイス、システム、および方法を提供する。本発明の方法を使用して、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸分子、またはタンパク質などの他のポリマー分子を配列決定することができる。核酸配列決定の場合は、核酸分子の核酸塩基含量を決定することができる。タンパク質配列決定の場合は、タンパク質のアミノ酸配列を決定することができる。
ナノポアによる検出
本明細書では、ナノポアにより、分子またはその一部分を同定するためのシステムおよび方法が提供される。ナノポアにより、分子またはその一部分などの分子種を同定する方法は、電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも１つのナノポアを含むチップを用意するステップを含みうる。電極は、ナノポアを通して流れる電流を検出するように適合されていてもよい。方法は、分子またはその一部分をナノポア内に挿入するステップと、ナノポア越しに、かつ／または膜越しに印加される電圧を変化させるステップとをさらに含みうる。場合によっては、方法は、複数の電圧下における電流を測定して、分子またはその一部分を同定するステップも含む。いくつかの実施形態では、複数の電圧下における電流は、電子署名を含み、電子署名を複数の基準電子署名と比較して、分子またはその一部分を同定するステップもさらに含む。
ナノポアは、集積回路などのセンシング回路のセンシング電極に隣接して配置される膜内に形成することもでき、他の形で埋め込むこともできる。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）でありうる。いくつかの例では、集積回路は、電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。センシング回路は、ナノポアを有するチップまたは他のデバイス内に配置される場合もあり、オフチップ構成であるなど、チップまたはデバイスから離れて配置される場合もある。半導体は、限定なしに述べると、ＩＶ群の半導体（例えば、ケイ素）およびＩＩＩ〜Ｖ群の半導体（例えば、ヒ化ガリウム）を含む、任意の半導体でありうる。
図１は、参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０１９３５７０号において記載されている方法に従い調製されうる、温度制御を有するナノポア型検出器（またはセンサ）の例を示す。図１Ａを参照すると、ナノポア型検出器は、伝導性溶液（例えば、塩溶液）１０７と接触する上部電極１０１を含む。下部伝導性電極１０２は、膜１０５内に挿入されるナノポア１０６の近くにあるか、これに隣接するか、または近接する。場合によって、下部伝導性電極１０２は、半導体基板１０４内の電気回路がその中に埋め込まれる半導体１０３内に埋め込まれる。半導体１０３の表面は、疎水性となるように処理することができる。検出される試料は、ナノポア１０６内のポアを通って進む。半導体チップセンサは、パッケージ２０８内に入れ、パッケージ２０８は、温度制御エレメント１０９の近くに置く。温度制御エレメント１０９は、熱電式加熱および／または冷却デバイス（例えば、Ｐｅｌｔｉｅｒデバイス）でありうる。
複数のナノポア型検出器により、ナノポアアレイを形成することができる。ナノポアアレイは、１または複数のナノポア型検出器を含みうる。場合によっては、ナノポアアレイは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、１０００、１００００、または１００，０００個のナノポア型検出器を含む。個々のナノポア型検出器は、１または複数のナノポアを、センシング電極（例えば、下部伝導性電極１０２）に隣接して含みうる。場合によって、個々のナノポア型検出器は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１００個のナノポアを、センシング電極に隣接して含む。
同じ番号が同じエレメントを表す図１Ｂを参照すると、膜１０５は、センサ１０２がウェルの表面の一部を形成する、ウェル１１０上に配置することができる。図１Ｃは、電極１０２が処理された半導体表面１０３から突出する例を示す図である。
いくつかの例では、膜１０５は、下部伝導性電極１０２上に形成され、半導体１０３上には形成されない。このような場合の膜１０５は、下部伝導性電極１０２との連結相互作用を形成しうる。しかし、場合によって、膜１０５は、下部伝導性電極１０２および半導体１０３上に形成される。代替法として述べると、膜１０５は、半導体１０３上に形成することができ、下部伝導性電極１０２上に形成することはできないが、下部伝導性電極１０２上に張り渡すこともできる。
多くの異なる種類の分子またはその一部分を、本明細書で記載される方法および／またはデバイスにより検出することができる。図２は、検出されうる分子および核酸を含むポリマーを配列決定するための方法のいくつかの例を示す。場合によって、分子２０１は、ナノポア２０２を通して、膜２０５のシス側２０３（電極から遠い側）からトランス側２０４（電極に近い側）に通過する。
図２Ｂに見られる通り、分子は、ポリマー分子２０６であることが可能であり、ポリマー分子２０７の一部分は、このポリマー分子がナノポアを通って通過するときに同定することができる。ポリマー分子は、核酸またはタンパク質などの生物学的分子であることが可能である。いくつかの実施形態では、ポリマー分子が、核酸であり、ポリマー分子の一部分は、核酸または核酸群（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つの核酸）である。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、ポリペプチドであり、ポリペプチドの一部分は、アミノ酸または核酸群（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのアミノ酸）である。
場合によっては、核酸またはタグがナノポアを通して流動するかまたはナノポアに隣接して流動するとき、センシング回路により、核酸またはタグと関連する電気シグナルを検出する。核酸は、長鎖のサブユニットでありうる。タグは、ヌクレオチド組込みイベントの副産物の場合もあり、タグ付けされた核酸と、ナノポアまたはタグを核酸から切断する酵素など、ナノポアに隣接する分子種との他の相互作用の副産物の場合もある。タグは、ヌクレオチドへの接合を維持する場合もある。検出されたシグナルは、記憶場所に収集および保存し、後に核酸の配列を構築するのに使用することができる。収集されたシグナルは、エラーなど、検出されたシグナル内の任意の異常を説明するために加工することができる。
図２Ｃに見られる通り、いくつかの実施形態では、分子２０８（例えば、「タグ分子」）を、ヌクレオチド２０９に結合させる。分子は、ヌクレオチドが、成長中の核酸鎖２１０（例えば、ポリメラーゼ２１１により）に組み込まれるときに同定することができる。ヌクレオチドは、鋳型核酸２１２とマッチする塩基対に従い組み込まれうる。異なるタグを、異なるヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＧ）の各々に結合させる場合は、ナノポアでタグ分子を検出することにより（例えば、鋳型核酸にナノポアを通して通過させずに）、鋳型核酸の配列を決定することができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドが成長中の核酸鎖に組み込まれると、分子は、ヌクレオチドから放出２１３される。図２Ｄに示す通り、分子は、ヌクレオチドが、成長中の鎖に組み込まれるときに、かつ／またはヌクレオチド２１４から放出される前に検出することができる。
デバイスの仕組み
図３は、本明細書で記載される通り、分子を検出する（および／または核酸を配列決定する）のに使用されうるナノポアデバイス１００（またはセンサ）を概略的に例示する。脂質二重層を含有するナノポアは、抵抗および静電容量を特徴としうる。ナノポアデバイス１００は、伝導性固体基板１０６の脂質二重層適合性表面１０４上に形成された脂質二重層１０２を含み、この場合、脂質二重層適合性表面１０４は、脂質二重層非適合性表面１０５により隔絶させることができ、伝導性固体基板１０６は、絶縁材料１０７により電気的に絶縁することができ、脂質二重層１０２は、脂質二重層非適合性表面１０５上に形成されたアモルファス脂質１０３により取り囲むことができる。脂質二重層１０２には、検出される分子および／または小型のイオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−）に、脂質二重層１０２の２つの側面の間を通過させるのに十分に大きなナノポア１１０を有する単一ナノポア構造１０８を埋め込むことができる。水分子層１１４を、脂質二重層適合性表面１０４上に吸着させ、脂質二重層１０２と脂質二重層適合性表面１０４との間に挟み込むことができる。親水性の脂質二重層適合性表面１０４上に吸着させた水性薄膜１１４は、脂質分子の秩序化を促進し、脂質二重層適合性表面１０４上における脂質二重層の形成を容易としうる。検出される分子（例えば、必要に応じて、任意選択で、タグ付けされたヌクレオチドまたは他の構成要素を伴う核酸分子）１１２の溶液を含有する試料チャンバ１１６を、脂質二重層１０２の上方に装備させることができる。溶液は、電解質を含有し、最適のイオン濃度に緩衝処理され、ナノポア１１０の開放を保つように最適のｐＨで維持された水溶液でありうる。デバイスは、脂質二重層越しに電気刺激（例えば、電圧バイアス）をもたらし、脂質二重層の電気的特徴（例えば、抵抗、静電容量、およびイオン電流の流れ）をセンシングするための、可変電圧供給源１２０に連結された電極対１１８（陰極ノード１１８ａおよび陽極ノード１１８ｂを含む）を含む。陽性電極１１８ｂの表面は、脂質二重層適合性表面１０４の一部であるか、またはこの一部を形成する。伝導性固体基板１０６は、電極１１８のうちの１つの一部に連結することもでき、これを形成することもできる。デバイス１００はまた、電気刺激を制御し、検出されたシグナルを加工するための電気回路１２２も含みうる。いくつかの実施形態では、（例えば、可変型）電圧供給源１２０は、電気回路１２２の一部として含まれる。電気回路１２２は、増幅器、積分器、ノイズフィルタ、フィードバック制御ロジック、および／または他の多様な構成要素を含みうる。電気回路１２２は、ケイ素基板１２８内に組み込まれた電気集積回路であることが可能であり、メモリ１２６に連結されたコンピュータプロセッサ１２４にさらに連結することもできる。
脂質二重層適合性表面１０４は、脂質二重層の形成を容易とするイオン伝導およびガス形成に適する多様な材料から形成することができる。いくつかの実施形態では、脂質二重層の電気的特徴の変化のより良好な検出を可能としうるため、伝導性または半導性の親水性材料を使用することができる。材料の例は、Ａｇ−ＡｇＣｌ、Ａｕ、Ｐｔ、またはドープケイ素もしくは他の半導体材料を含む。場合によって、電極は、犠牲電極ではない。
脂質二重層非適合性表面１０５は、脂質二重層の形成に適さない多様な材料から形成することができ、典型的には、疎水性である。いくつかの実施形態では、非伝導性の疎水性材料は、脂質二重層領域を互いから分離することに加えて、脂質二重層領域を電気的に絶縁するので好ましい。脂質二重層非適合性材料の例は、例えば、窒化ケイ素（例えば、Ｓｉ３Ｎ４）およびテフロン（登録商標）、疎水性分子でシラン処理された酸化ケイ素（例えば、ＳｉＯ２）を含む。
例として述べると、図３のナノポアデバイス１００は、アルミニウム材料１０６上にコーティングされた脂質二重層適合性銀（Ａｇ）表面１０４上に形成されたジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）による脂質二重層１０２内に埋め込まれた単一のアルファヘモリシン（ａＨＬ）タンパク質１０８を有する、アルファヘモリシン（ａＨＬ）によるナノポアデバイスである。脂質二重層適合性Ａｇ表面１０４は、脂質二重層非適合性窒化ケイ素表面１０５により絶縁され、アルミニウム材料１０６も、窒化ケイ素材料１０７により電気的に絶縁される。アルミニウム１０６は、ケイ素基板１２８内に組み込まれた電気回路１２２に連結される。オンチップで配置されるか、またはカバープレート１２８から下方に伸展する銀−塩化銀電極は、（例えば、核酸）分子を含有する水溶液に接触している。
ａＨＬナノポアとは、７つの個別のペプチドのアセンブリである。ａＨＬナノポアの入口または前庭は、直径が約２６オングストロームであり、ｄｓＤＮＡ分子の一部分を収容するのに十分な程度に広い。前庭から、ａＨＬナノポアは、まず、広がり、次いで、直径が約１５オングストロームのバレルであって、単一のｓｓＤＮＡ分子（または小型のタグ分子）が通って通過することを可能とするのに十分な程度には広いが、ｄｓＤＮＡ分子（または大型のタグ分子）がその中を通過することを可能とするのに十分な程度に広くはないバレルに狭まる。
ＤＰｈＰＣに加えて、ナノポアデバイスの脂質二重層は、使用されるナノポアの種類、特徴付けられる分子の種類、ならびに形成される脂質二重層の安定性および透過性、抵抗、ならびに静電容量など、形成される脂質二重層の多様な物理的特徴、化学的特徴、および／または電気的特徴など、多様な検討事項に基づき選択された、他の多様な適する両親媒性材料からアセンブルすることもできる。両親媒性材料の例は、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジル−コリン（ＰＯＰＣ）およびジオレオイル−ホスファチジル−メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびスフィンゴミエリンなどの多様なリン脂質を含む。
上記で示したａＨＬナノポアに加えて、ナノポアは、他の多様な種類のナノポアでもありうる。例は、γ−ヘモリシンによるナノポア、ロイコシジンによるナノポア、メリチンによるナノポア、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓのポリンＡ（ＭｓｐＡ）によるナノポア、および他の多様な自然発生のナノポア、修飾された天然のナノポア、および合成のナノポアを含む。適切なナノポアは、ナノポアのポアサイズと比べた解析物分子のサイズなど、解析物分子の多様な特徴に基づき選択することができる。例えば、ａＨＬナノポアのポアサイズは、約１５オングストロームの拘束的なポアサイズである。
電流の測定
場合によって、電流は、印加される異なる電圧下で測定することができる。これを達成するために、所望の電位を、電極に印加し、その後、印加された電位を、測定を通じて維持することができる。ある実装では、本明細書で記載される通り、オペアンプ積分器トポロジーをこの目的で使用することができる。積分器は、容量帰還により、電極における電位を維持する。積分器回路は、際立った直線性、セル間マッチング、および補正特徴をもたらしうる。オペアンプ積分器は、要請される性能を達成するために、大きなサイズを要請することが典型的である。本明細書では、より小型の積分器トポロジーが記載される。
場合によっては、電位「Ｖｌｉｑｕｉｄ」を、チップ上のセルの全てに共通の電位（例えば、３５０ｍＶ）を供給するチャンバに印加することができる。積分器回路は、電極（これは、電気的には、積分コンデンサの上部プレートである）を、共通の液間電位より高い電位に初期化しうる。例えば、４５０ｍＶでバイアスをかけると、電極と液体との間に正の１００ｍＶの電位をもたらすことができる。この正の電位により、電極から液体チャンバの接点に電流を流すことができる。この場合、キャリアは、（ａ）ポアを通して、二重層の（トランス）電極側から二重層の液体レザバー（シス）側に流動するＫ＋イオン、および（ｂ）以下の電気化学反応：Ａｇ＋Ｃｌ−→ＡｇＣｌ＋ｅ−に従い銀電極と反応する、トランス側の塩素（Ｃｌ−）イオンである。
場合によっては、Ｋ＋が、密閉されたセルの外側に（二重層のトランス側からシス側に）流動するのに対し、Ｃｌ−は、塩化銀に転換される。二重層の電極側は、電流の流れの結果として、脱塩されうる。場合によっては、銀／塩化銀の液体吸収性材料またはマトリックスが、電気チャンバの接点において生じ、回路を完結させる、逆反応においてＣｌ−イオンを供給するためのレザバーとして用いられうる。
場合によって、電子は、最終的に、積分コンデンサの上側に流動し、これにより、測定される電流が創出される。転換される銀が供給可能である限りにおいて、電気化学反応は、銀を塩化銀に転換し、電流は、流れ続ける。銀の供給が制限されると、場合によっては、電流依存的な電極の寿命がもたらされる。いくつかの実施形態では、枯渇しない電極材料（例えば、白金）が使用される。
電極を帯電させる方法
検出サイクルにおいて電極を再帯電させる能力は、犠牲電極または通電反応において分子特徴を変化させる電極（例えば、銀を含む電極）を使用する場合に有利でありうる。電極は、検出サイクルにおいて枯渇することもあるが、場合によっては、電極は、検出サイクルにおいて枯渇しないこともある。再帯電は、電極が小型である場合（例えば、電極が、平方ミリメートル当たりに少なくとも５００の電極を有する電極のアレイをもたらすのに十分な程度に小型である場合）に問題となりうる完全な枯渇など、所与の枯渇限界に電極が到達することを防止しうる。場合によって、電極の寿命は、電極の幅で見積もられ、これに少なくとも部分的に依存する。
場合によっては、長時間にわたる検出（例えば、核酸にナノポアを通して通過させることにより、核酸を配列決定する場合）において、ナノポア越しの保存される極性の電圧差を維持する必要から、電極が枯渇し、検出の持続時間および／または電極のサイズが限界づけられる可能性がある。本明細書で記載されるデバイスおよび方法は、より長い（例えば、無際限の）検出時間を可能とし、かつ／または電極を任意に小型のサイズ（例えば、検出時における電極の枯渇以外の検討事項により限界づけられる）までスケールダウンすることを可能とする。本明細書で記載される通り、分子（例えば、タグ分子）は、一部分の時間（例えば、タグがポリメラーゼと会合している時間）だけにわたり検出することができる。検出時間の間に、ナノポア越しの電圧の極性を切り換えることにより、電極の再帯電が可能となる。場合によっては、分子またはその一部分は、複数回にわたり（例えば、１００ミリ秒の間に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００回以上にわたり）検出される。
場合によっては、ナノポア越しの電圧の極性を、周期的に反転させる。電圧の極性は、任意の適する長さの時間（例えば、約１ミリ秒、約５ミリ秒、約１０ミリ秒、約１５ミリ秒、約２０ミリ秒、約２５ミリ秒、約３０ミリ秒、約４０ミリ秒、約５０ミリ秒、約６０ミリ秒、約８０ミリ秒、約１００ミリ秒、約１２５ミリ秒、約１５０ミリ秒、約２００ミリ秒など）にわたり持続する検出時間の後で反転させることができる。電極を再帯電させる間（すなわち、電圧の極性が、タグを検出するための電圧の極性と反対である場合）の時間および電界の強度は、電極が、その検出前の状態（例えば、電極の質量）に回復するような時間および強度である。場合によって、ナノポア越しの正味の電圧は、ゼロである（例えば、正電圧の時間により、１秒、１分間、または５分間など、適切に長い時間のスケールにわたり、負電圧の時間が相殺される）。場合によって、ナノポアに印加される電圧は、ナノポアに隣接または近接するセンシング電極により検出される正味の電流がゼロとなるように拮抗させる。
いくつかの例では、交流電流（ＡＣ）波形を、膜内のナノポアまたは膜に隣接する電極に印加して、分子をナノポアを通してまたはナノポア近傍に引き込み、分子を放出する。ＡＣ波形は、少なくとも１０マイクロ秒、１ミリ秒（ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ（ｍｓ））、５ミリ秒、１０ミリ秒、２０ミリ秒、１００ミリ秒、２００ミリ秒、３００ミリ秒、４００ミリ秒、５００ミリ秒のオーダーの周波数を有しうる。波形は、交互に、かつ、逐次的に分子（例えば、タグ分子）を捕捉し、かつ、分子を放出するか、または分子を他の形で複数の方向（例えば、反対方向）に移動させ、これにより、分子がナノポアと会合する全時間を延長しうる一助となりうる。この帯電と放電との平衡により、ナノポアの電極および／または所与の分子からのより長いシグナルの発生を可能とすることができる。
いくつかの例では、ＡＣ波形を印加して、分子の少なくとも一部分（例えば、タグ付けされるヌクレオチドと会合させたタグ（例えば、組み込まれる、タグ付けされたヌクレオチド））を繰り返しナノポア内に方向付け、分子の少なくとも一部分をナノポア外に方向付ける。分子（例えば、タグまたはタグに連結されたヌクレオチド）は、酵素（例えば、ポリメラーゼ）により保持することができる。酵素により保持される単一分子の、この反復的な積載および駆出は、分子を検出するより多くの機会をもたらして有利でありうる。例えば、分子を、酵素により４０ミリ秒（ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄｓ（ｍｓ））にわたり保持し、ＡＣ波形を、５ミリ秒にわたり強く印加し（例えば、タグをナノポア内に方向付けるために）、５ミリ秒にわたり弱く印加する（例えば、タグをナノポア外に方向付けるために）場合、ナノポアを使用して、分子を約４回にわたり読み取ることができる。複数の読取りにより、ナノポア内および／またはナノポア外を縫うように進む分子と関連するエラーなど、エラーの是正が可能となる。
波形は、規則的形状（例えば、ある時間にわたり反復する）および不規則的形状（例えば、１時間、１日間、または１週間など、任意の適切に長い時間にわたっては反復しない）を含む任意の適切な形状を有しうる。図２９は、いくつかの適切な（規則的）波形を示す。波形の例は、三角波（パネルＡ）、正弦波（パネルＢ）、鋸歯状波、方形波などを含む。
場合によって、電極は、分子の検出時に枯渇しうる。交流電流（ＡＣ）波形を印加するときなど、ナノポア越しの電圧の極性の反転（すなわち、陽性から陰極へ、または陰極から陽性へ）により、電極を再帯電させることができる。図２９Ｃは、大きさに比例して上方に伸びる正の電圧、および大きさに比例して下方に伸びる負の電圧と共に、水平方向の破線において、ナノポア越しの電位差ゼロを示す図である。波形の形状がどのようであろうと、正の方向３１００における電圧を、時間と対比させたプロットの総曲線下面積は、負の方向３１０１における総曲線下面積と等しくなりうる。場合によって、例えば、正の面積３１００と負の面積３１０１とが等しい場合、電極は、適切に長い時間（例えば、１時間、１日間、または１週間）にわたり、帯電も枯渇もしない。いくつかの状況では、正の電位をナノポア越しに印加すると、第１の電流が測定され、（例えば、正の電位と大きさの絶対値が等しい）負の電位をナノポア越しに印加すると、第２の電流が測定される。第１の電流は、第２の電流と等しい可能性もあるが、場合によって、第１の電流と第２の電流とは、異なる可能性もある。例えば、第１の電流は、第２の電流未満でありうる。
場合によって、ナノポアは、比較的小さな電圧（例えば、図２９の符号３１００）で、比較的長時間にわたり、タグ付けされたヌクレオチドを検出し、比較的大きな電圧（例えば、図２９の符号３１０１）で、比較的短い時間にわたり、電極を再帯電させる。場合によって、検出のための時間は、電極を再帯電させるための時間の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも５０倍である。
場合によって、波形は、入力に応答して変化する。場合によって、入力は、電極の枯渇のレベルである。場合によって、電圧の極性および／または大きさは、電極の枯渇に少なくとも部分的に基づき変化し、波形は不規則的である。
繰り返し検出し、電極を短時間で（例えば、約５秒未満、約１秒未満、約５００ミリ秒未満、約１００ミリ秒未満、約５０ミリ秒未満、約１０ミリ秒未満、または約１ミリ秒未満の間にわたり）再帯電させる能力により、一定の直流（ＤＣ）電位およびＤＣ電流を維持しうる電極と比べて小型の電極の使用が可能となり、これらは、ナノポアを通して縫うように進むポリヌクレオチドを配列決定するのに使用される。小型の電極は、表面上の多数の検出部位（例えば、電極、センシング回路、ナノポア、およびポリメラーゼを含む）を可能としうる。
表面は、任意の適切な密度（例えば、所与の長さの時間または所与の費用で核酸試料を配列決定するのに適する密度）の離散部位を含む。ある実施形態では、表面は、１ｍｍ２当たりの部位約５００カ所以上の密度の離散部位を有する。いくつかの実施形態では、表面は、１ｍｍ２当たりの部位約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００カ所の密度の離散部位を有する。いくつかの実施形態では、表面は、１ｍｍ２当たりの部位少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１００００、少なくとも約２００００、少なくとも約４００００、少なくとも約６００００、少なくとも約８００００、少なくとも約１０００００、または少なくとも約５０００００カ所の密度の離散部位を有する。
電極は、検出（例えば、ヌクレオチド組込みイベントの）前に、検出の間に、検出時に、または検出後に再帯電させることができる。場合によっては、電極を、約２０ミリ秒（ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄｓ（ｍｓ））、約４０ミリ秒、約６０ミリ秒、約８０ミリ秒、約１００ミリ秒、約１２０ミリ秒、約１４０ミリ秒、約１６０ミリ秒、約１８０ミリ秒、または約２００ミリ秒で再帯電させる。場合によっては、電極を、約２０ミリ秒（ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄｓ（ｍｓ））未満、約４０ミリ秒未満、約６０ミリ秒未満、約８０ミリ秒未満、約１００ミリ秒未満、約１２０ミリ秒未満、約１４０ミリ秒未満、約１６０ミリ秒未満、約１８０ミリ秒未満、約２００ミリ秒、約５００ミリ秒未満、または約１秒未満で再帯電させる。
セル回路
セル回路の例を、図４に示す。印加される電圧Ｖａは、ＭＯＳＦＥＴ電流コンベアゲート４０１の手前のオペアンプ１２００に印加する。この図ではまた、電極４０２ならびにデバイス４０３により検出される核酸および／またはタグの抵抗も示される。
印加される電圧Ｖａは、電流コンベアゲート４０１を駆動しうる。よって、電極上で結果として得られる電圧は、Ｖａ−Ｖｔ［式中、Ｖｔは、ＭＯＳＦＥＴの閾値電圧である］である。場合によって、ＭＯＳＦＥＴ閾値電圧は、工程、電圧、温度にわたり大幅に変化する可能性があり、チップ内のデバイス間でもなお大幅に変化する可能性があるので、これは、電極に印加される実際の電圧の制御の限定を結果としてもたらす。このＶｔの変化は、閾値未満のリーク効果が役割を果たしうる低い電流レベルで大きくなりうる。したがって、印加される電圧のより良好な制御をもたらすために、電流コンベアデバイスによるフォロワーフィードバック構成でオペアンプを使用することができる。これにより、電極に印加された電圧がＶａであり、ＭＯＳＦＥＴ閾値電圧の変化に依存しないことを確保する。
セル回路の別の例を、図５に示すが、これは、積分器、比較器、制御ビットをシフトインし、同時に、比較器出力の状態をシフトアウトするためのデジタルロジックを含む。セル回路は、本明細書で提示されるシステムおよび方法による使用に適合させることができる。Ｂ０〜Ｂ１の回線は、シフトレジスタに由来しうる。アナログシグナルは、バンク内の全てのセルにより共有されるが、デジタル回線は、セルからセルにデイジーチェーン接続される。
セルデジタルロジックは、５ビットのデータシフトレジスタ（ＤＳＲ）、５ビットのパラレルロードレジスタ（ＰＬＲ）、制御ロジック、およびアナログ積分器回路を含む。ＬＩＮシグナルを使用して、ＤＳＲにシフトされた制御データを、ＰＬＲにパラレルロードする。これらの５ビットにより、セル内のスイッチを制御するデジタル「ブレークビフォーメーク」タイミングのロジックを制御する。加えて、デジタルロジックは、比較器出力の切換えを記録するセットリセット（ＳＲ）ラッチも有する。
アーキテクチャは、個々のセル電流に比例して、可変試料速度を送達する。大きな電流は、小さな電流より１秒間当たりに多くの試料を結果としてもたらしうる。電流測定の分解能は、測定される電流と関連する。小さな電流は、大きな電流より精緻な分解能で測定することができ、これは、分解能固定式測定システムを凌駕する利益でありうる。アナログ入力により、使用者が、積分器の電圧振幅を変化させることにより、試料速度を調整することが可能となる。生物学的に迅速な過程を解析するために、試料速度を増大させることが可能な場合もあり、または生物学的に緩徐な過程を解析するために、試料速度を減速する（そして、これにより精度を増大させる）ことが可能な場合もある。
積分器の出力をＬＶＢ（低電圧バイアス）電圧に初期化し、ＣＭＰ電圧まで積分する。これらの２つのレベルの間で積分器の出力が振幅するときはいつも、試料が作成されている。したがって、電流が大きいほど、積分器の出力は急速に振幅し、試料速度も速くなる。同様に、ＣＭＰ電圧が低減されると、新たな試料を作成するのに必要とされる積分器の出力振幅も低減され、したがって、試料速度も増大する。したがって、ＬＶＢとＣＭＰとの間の電圧差を低減するだけで、試料速度を増大させる機構がもたらされる。
ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成された多数の自立作動型セルまたは個別にアドレス可能なセルを組み込みうる。例えば、百万個のセルによるアレイであれば、１０００行のセル×１０００列のセルで構築しうるであろう。例えば、ヌクレオチド組込みイベント時に放出されるタグを、ナノポアにより検出する場合、このアレイで、伝導差を測定することにより、核酸分子の並行配列決定が可能となる。なおさらに、この回路を実装することにより、ポア−分子複合体の伝導特徴を決定することが可能となり、これは、タグの間の識別において有益でありうる。
電流の測定を実施するために、組み込まれたナノポア／二重層電子セル構造により、適切な電圧を印加することができる。例えば、適正に実施するためには、（ａ）電極電位を制御し、かつ、同時に（ｂ）電極電流もモニタリングすることが必要でありうる。
なおさらに、セルを互いから独立に制御することも必要でありうる。異なる物理的状態にありうる多数のセルを扱うためには、セルの独立の制御が要請されうる。電極に印加される区分的線形電圧波形による刺激の精密な制御を使用して、セルの物理的状態の間を移行することができる。
回路サイズおよび複雑性を低減するためには、２つの個別の電圧を印加するためのロジックを用意するので十分でありうる。これにより、セルと、対応する、印加される状態移行刺激とについての、２つの独立の群分けが可能となる。発生の確率が比較的小さい場合、状態の移行は、性格において確率論的である。したがって、適切な制御電圧をアサートし、その後、測定を実施して、所望の状態の移行が生じたのかどうかを決定することが高度に有用でありうる。例えば、適切な電圧をセルに印加し、次いで、電流を測定して、二重層が形成されたのかどうかを決定することができる。セルは、２つの群：（ａ）二重層を形成し、もはや電圧を印加する必要がないセル（ヌル操作（ＮＯＰ）（すなわち、同じ状態にとどまる）を実行するために、これらのセルには、０Ｖのバイアスを印加することができる）；および（ｂ）二重層が形成されなかったセル（これらのセルには、二重層形成のための電圧を再度印加することになる）に分けられる。
実質的な単純化および回路サイズの低減は、許容可能な、印加される電圧を２つに制約し、バッチ内のセルに、物理的状態の間を繰り返し移行させることにより達成することができる。例えば、許容可能な、印加される電圧を制約することにより、少なくとも１．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００分の１の低減を達成することができる。
ナノポアアレイ
本発明は、分子を検出し、かつ／または核酸を配列決定するための、ナノポアアレイ型検出器（またはセンサ）を提供する。図６を参照すると、ナノポアアレイ型検出器上で、複数の（例えば、核酸）分子を検出および／または配列決定することができる。この図で、各ナノポアの位置（例えば、６０１）は、ポリメラーゼ酵素および／またはホスファターゼ酵素に任意選択で接合されたナノポアを含む。本明細書で記載される各アレイ位置にはまた一般に、センサも存在する。いくつかの例では、核酸ポリメラーゼに接合されたナノポアアレイが提供され、タグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼと共に組み込まれる。重合化時に、タグは、ナノポアにより検出される（例えば、ナノポア内もしくはナノポアを通して放出および通過させることにより、またはナノポアに提示することにより）。
ナノポアアレイは、任意の適する数のナノポアを有しうる。場合によって、アレイは、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約１００００、約１５０００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、約２０００００、約４０００００、約６０００００、約８０００００、約１００００００個などのナノポアを含む。場合によって、アレイは、少なくとも２００、少なくとも４００、少なくとも６００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、少なくとも１５０００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、少なくとも１０００００、少なくとも２０００００、少なくとも４０００００、少なくとも６０００００、少なくとも８０００００、または少なくとも１００００００個のナノポアを含む。
ナノポアアレイ型検出器は、高密度の離散部位を有しうる。例えば、単位面積当たり比較的多数の部位（すなわち、密度）は、携帯可能であるか、廉価であるか、または他の有利な特色を有しうる、小型デバイスの構築を可能とする。アレイ内の個々の部位は、個別にアドレス可能な部位でありうる。ナノポアおよびセンシング回路を含む多数の部位は、比較的多数の核酸分子が、例えば、並行配列決定を介するなど、一度に配列決定されることを可能としうる。このようなシステムは、スループットを増大させ、かつ／または核酸試料を配列決定する費用を減少させることが可能である。
表面は、任意の適切な密度（例えば、所与の長さの時間で、または所与の費用で核酸試料を配列決定するのに適する密度）の離散部位を含む。各離散部位は、センサを含みうる。表面は、１ｍｍ２当たりの部位約５００カ所以上の密度の離散部位を有しうる。いくつかの実施形態では、表面は、１ｍｍ２当たりの部位約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００カ所の密度の離散部位を有する。場合によっては、表面は、１ｍｍ２当たりの部位少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、少なくとも１０００００、または少なくとも５０００００カ所の密度の離散部位を有する。
いくつかの例では、試験チップは、各々６６個ずつのセンサセルによる４つの個別の群（バンクとしてもまた公知の）に配置された２６４個のセンサによるアレイを含む。各群は、各列に２２個ずつのセンサ「セル」を伴う３つの「列」に分けられる。理想的には、仮想セルが、脂質二重層を含み、挿入されるナノポアが、アレイ内の２６４個のセンサの各々の上方に形成されることを踏まえると、「セル」という名称は適切である（デバイスがうまく作動しうるのは、このように密集したセンサセルのうちのある割合だけによってであるが）。
成形表面には、伝導性シリンダ内に含有される液体に電位を印加する、単一のアナログＩ／Ｏパッドが取り付けられる。この「液間」電位は、ポアの上側に印加され、検出器アレイ内の全てのセルに共通である。ポアの下側は露出された電極を有し、各センサセルは、その電極に、顕著に異なる下側電位を印加しうる。次いで、上部液体への接続部と、ポアの下側における各セルの電極への接続部との間の電流を測定する。センサセルにより、ポアを通して流れる電流であって、ポア内を通過するタグ分子により調節される電流を測定する。
場合によっては、５ビットにより、各センサセルのモードを制御する。図７への参照を続けると、アレイ内の２６４個のセルの各々は、個別に制御することができる。値は、６６個ずつのセルによる群に個別に適用される。群内の６６個ずつのセルの各々のモードは、３３０（セル１個当たり６６×５ビット）のデジタル値の、データシフトレジスタ（ＤＳＲ）へのシリアルシフトにより制御する。これらの値は、６６個ずつのセルによる各群に個別のピン対を伴うＫＩＮ（クロック）ピン、およびＤＩＮ（データイン）ピンを使用して、アレイにシフトさせる。
こうして、３３０クロックを使用して、３３０ビットを、ＤＳＲシフトレジスタにシフトさせる。第２の３３０ビットによるパラレルロードレジスタ（ＰＬＲ）は、対応するＬＩＮ＜ｉ＞（ロード入力）が大きいとアサートされると、このシフトレジスタからパラレルロードされる。ＰＬＲがパラレルロードされるのと同時に、セルのステータス値が、ＤＳＲにロードされる。
完全な動作は、３３０データビットを、ＤＳＲにシフトインする３３０クロック、ＬＩＮシグナルを大きいとアサートする単一のクロックサイクルに続いて、ＤＳＲからシフトアウトされる、捕捉されたステータスデータを読み取る３３０クロックサイクルを含みうる。３３０ビットがアレイから読み取られる間に、新たな３３０ビットをＤＳＲに同時にシフトさせうるように、作動をパイプライン化する。したがって、クロック周波数を５０ＭＨｚとするとき、読取りのためのサイクル時間は、３３１／５０ＭＨｚ＝６．６２ｕｓである。
核酸試料を配列決定するためのコンピュータシステム
本発明のデバイス、システム、および方法は、コンピュータシステムを一助として調節することができる。図８は、ナノポアによる検出および／または核酸配列決定システム８０２に連結されたコンピュータシステム８０１を含むシステム８００を示す。コンピュータシステム８０１は、１または複数のサーバでありうる。コンピュータシステム８０１をプログラムして、試料の調製および加工、ならびに配列決定システム８０２による核酸の配列決定を調節することができる。ナノポアによる検出および／または配列決定システム８０２は、本明細書で記載されるナノポアベースの配列決定装置（または検出器）でありうる。
コンピュータシステムをプログラムして、本発明の方法を実装することができる。コンピュータシステム８０１は、中央処理装置（ＣＰＵ；本明細書ではまた「プロセッサ」とも称する）８０５を含み、これは、シングルコアプロセッサの場合もあり、マルチコアプロセッサの場合もあり、並列処理のための複数のプロセッサの場合もある。プロセッサ８０５は、集積回路などの回路の一部でありうる。いくつかの例では、プロセッサ８０５は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）内に組み込むことができる。コンピュータシステム８０１はまた、メモリ８１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置８１５（例えば、ハードディスク）、１または複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース８２０（例えば、ネットワークアダプタ）、および周辺デバイス８２５など、キャッシュ、他のメモリ、データ保存および／または電子ディスプレイ用アダプタも含む。メモリ８１０、記憶装置８１５、インターフェース８２０、および周辺デバイス８２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ８０５と連通している。記憶装置８１５は、データを保存するためのデータ記憶装置（またはデータレポジトリ）でありうる。コンピュータシステム８０１は、通信インターフェース８２０を一助として、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）に作動的に連結することができる。ネットワークは、インターネット、インターネットと連通しているインターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはイントラネットおよび／もしくはエクストラネットでありうる。ネットワークは、分散コンピューティングを可能としうる１または複数のコンピュータサーバを含みうる。
いくつかの例では、コンピュータシステム８０１は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を含む。このような場合、プロセッサ８０５は、除外することができる。
本発明の方法は、例えば、メモリ８１０または電子記憶装置８１５など、コンピュータシステム８０１の電子記憶場所に保存される、マシン（またはコンピュータプロセッサ）に実行可能なコード（またはソフトウェア）により実装することができる。使用時において、コードは、プロセッサ８０５により実行することができる。場合によっては、コードを記憶装置８１５から検索し、プロセッサ８０５による容易なアクセスのために、メモリ８１０に保存することができる。いくつかの状況では、電子記憶装置８１５を除外することができ、マシンに実行可能な命令をメモリ８１０に保存する。
コードは、コードを実行するように適合されているプロセッサを有するマシンを伴う使用のためにプレコンパイルおよび構成することもでき、ランタイム中にコンパイルすることもできる。コードは、コードがプレコンパイルされた形で、またはコンパイルされた通りの形で実行することを可能とするように選択されうるプログラミング言語により提供される場合もある。
コンピュータシステム８０１は、例えば、氏名、住所、電子メールアドレス、電話番号、インスタントメッセージ（ＩＭ）ハンドル、学歴情報、職歴情報、好きなものおよび／または嫌いなもの、ならびに使用者または他の使用者に対して潜在的に関与性である他の情報などの使用者プロファイル情報を保存するように適合されていてもよい。このようなプロファイル情報は、コンピュータシステム８０１の記憶装置８１５に保存することができる。
コンピュータシステム８０１など、本明細書で提示されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングにより具体化することができる。技術の多様な態様は、典型的には、マシンで読取り可能な種類の媒体に収録され、これにより具体化される、マシン（またはプロセッサ）に実行可能なコードおよび／または関連するデータの形態における「製品」または「製造品」と考えることができる。マシンに実行可能なコードは、メモリ（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ）またはハードディスクなどの電子記憶装置に保存することができる。「記憶」型媒体は、ソフトウェアプログラミングのための、任意の時点における非一時的保存をもたらしうる、コンピュータの有形のメモリ、プロセッサなど、または多様な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなど、これらの関連するモジュールのうちのいずれかまたは全てを含みうる。ソフトウェアの全てまたは一部分は、時折、インターネットまたは他の多様な通信ネットワークを介して通信することができる。このような通信は、例えば、ソフトウェアを、１つのコンピュータまたはプロセッサから、別のコンピュータまたはプロセッサにロードすること、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームにロードすることを可能としうる。したがって、ソフトウェアエレメントを保有しうる別の種類の媒体は、有線および光学的陸線ネットワークを介して、かつ、多様な無線により、ローカルデバイス間の物理的インターフェース越しに使用される光波、電波、および電磁波などを含む。有線接続または無線接続、光学的接続など、このような波を搬送する物理的エレメントもまた、ソフトウェアを保有する媒体と考えることができる。非一時的な有形の「記憶」媒体に制約されない限り、本明細書で使用されるコンピュータまたはマシンに「読取り可能な媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を与えることに関与する任意の媒体を指す。
よって、コンピュータ実行可能なコードなど、マシンで読取り可能な媒体は、有形の保存媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態をとりうる。非揮発性保存媒体は、例えば、図面に示されるデータベースなどを実装するのに使用しうるような、任意のコンピュータ（複数可）内の保存デバイスなどのうちのいずれかなどの光学ディスクまたは磁気ディスクを含む。揮発性保存媒体は、このようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリを含む。有形の伝送媒体は、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを含む導線を含む銅線および光ファイバを含む。搬送波伝送媒体は、電気シグナルもしくは電磁シグナル、またはラジオ周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）によるデータ通信時に発生する音波もしくは光波などの音波もしくは光波の形態をとりうる。したがって、コンピュータに読取り可能な媒体の一般的な形態は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の任意の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、他の任意の光学媒体、パンチカード用の紙テープ、孔のパターンによる他の任意の物理的保存媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、他の任意のメモリチップもしくはキャリッジ、搬送波移送型データもしくは命令、このような搬送波を移送するケーブルもしくは接続、またはコンピュータによりプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取りうる他の任意の媒体を含む。これらのコンピュータに読取り可能な媒体の形態のうちの多くは、１または複数の命令の１または複数の連鎖を、実行のためのプロセッサに搬送することに関与しうる。
核酸配列決定
核酸を配列決定するための方法は、配列決定される核酸を有する生物学的試料を回収するステップと、核酸試料を生物学的試料から抽出または他の形で単離するステップと、場合によっては、核酸試料を配列決定用に調製するステップとを含みうる。
図９は、核酸試料を配列決定するための方法を概略的に例示する。方法は、核酸分子を生物学的試料（例えば、組織試料、体液試料）から単離するステップと、核酸試料を配列決定用に調製するステップとを含む。配列決定は、核酸試料の個々の核酸塩基の順序を含む塩基構成を決定することを伴いうる。場合によって、核酸試料は、細胞から抽出される。核酸を抽出するための技法の例は、リゾチーム、超音波処理、抽出、高圧、またはこれらの任意の組合せの使用である。核酸は、場合によって、無細胞核酸であり、細胞からの抽出を要請しない。
場合によって、核酸試料は、タンパク質、細胞壁破砕物、および他の構成要素を核酸試料から除去することを伴う工程により、配列決定用に調製することができる。これを達成するために、例えば、スピンカラムなど、多くの市販製品が利用可能である。エタノール沈殿および遠心分離もまた、使用することができる。
核酸試料は、アレイ内に複数のナノポアを含むデバイスを一助とするなど、核酸配列決定を容易としうる複数の断片に分割（または破砕）することができる。しかし、配列決定される核酸分子（複数可）を破砕することは必要でない場合もある。
場合によっては、長い配列が決定される（すなわち、「ショットガン配列決定」法は、要請されない場合もある）。任意の適切な長さの核酸を配列を決定することができる。例えば、少なくとも約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、または約１０００００などの塩基を配列決定することができる。場合によっては、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも３５００、少なくとも４０００、少なくとも４５００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、少なくとも１０００００などの塩基が配列決定される。場合によって、配列決定される塩基は、連続的である。場合によって、配列決定される塩基は、連続的ではない。例えば、所与の数の塩基を、一続きに配列決定することができる。別の例では、１または複数の配列決定される塩基を、配列情報が決定されておらず、かつ／または入手可能でない、１または複数のブロックで隔てることができる。いくつかの実施形態では、鋳型を、任意選択で、冗長性の配列情報を発生させながら、複数回にわたり（例えば、環状核酸鋳型を使用して）配列決定することができる。場合によっては、ソフトウェアを使用して、配列をもたらす。場合によっては、核酸試料を、配列決定する前に分割することができる。場合によっては、二重鎖ＤＮＡ領域、または二重鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ領域の対応するセンス部分およびアンチセンス部分が、環状ＤＮＡ分子または環状ＤＮＡ／ＲＮＡ分子内に含まれるよう、所与の二重鎖ＤＮＡ領域、または二重鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ領域が環状となるように、核酸試料鎖を加工することができる。このような場合、このような分子から配列決定される塩基は、より容易なデータ構築および塩基位置の読取りのチェックを可能としうる。
本発明のシステムおよび方法を使用して、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびタンパク質など、多様な種類の生物学的試料を配列決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で記載される方法、デバイス、およびシステムを使用して、生物学的試料（例えば、タンパク質または核酸）を分取することができる。分取された試料および／または分子は、さらなる解析のために、多様なビンに方向付けることができる。
核酸分子は、直接的に（例えば、核酸に、図２Ｂに示すナノポアを通して通過させることにより）配列決定することもでき、間接的に（例えば、図２Ｃに示す通り、放出されるタグ分子を検出することにより）配列決定することもできる。
核酸試料を配列決定するための方法およびシステム
本明細書では、１もしくは複数のナノポアを使用するか、またはこれらを一助として、核酸を配列決定するための方法、デバイス、およびシステムが記載される。１または複数のナノポアは、集積回路の一部であるか、または集積回路に連結されたセンシング電極に隣接または近接して配置される、膜内のナノポア（例えば、脂質二重層）でありうる。
いくつかの例では、ナノポアデバイスは、センシング電極に隣接または近接する、膜内の単一のナノポアを含む。他の例では、ナノポアデバイスは、センサ回路またはセンシング電極に近接する、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、または１０，０００個のナノポアを含む。１または複数のナノポアは、個々の電極およびセンシング集積回路または複数の電極およびセンシング集積回路と関連させることができる。
システムは、１または複数のナノポアデバイスを含む反応チャンバを含みうる。ナノポアデバイスは、個別にアドレス可能なナノポアデバイス（例えば、シグナルを検出し、システム内の他のナノポアデバイスから独立した出力をもたらすことが可能なデバイス）でありうる。個別にアドレス可能なナノポアは、個別に読取り可能でありうる。場合によっては、個別にアドレス可能なナノポアは、個別に書き込み可能でありうる。代替法として述べると、個別にアドレス可能なナノポアは、個別に読取り可能であり、かつ、個別に書き込み可能でありうる。システムは、試料の調製および核酸の配列決定など、本開示の多様な動作を容易とするための、１または複数のコンピュータプロセッサを含みうる。プロセッサは、ナノポアデバイスに連結することができる。
ナノポアデバイスは、複数の個別にアドレス可能なセンシング電極を含みうる。各センシング電極は、電極に隣接した膜、および膜内の１または複数のナノポアを含みうる。
本発明の方法、デバイス、およびシステムは、核酸分子がナノポアを通して通過するときに、核酸塩基を検出しうる。核酸分子は、参照によりその全体において組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００７／１４６１５８号において記載されている通り、修飾して、それらがナノポアを通して通過するときに、多様な塩基の間でよりたやすく差別化することができる。
ＲＮＡ減速バンプ（RNA speed bump）および嵩高い構造
本明細書では、ポリヌクレオチドを配列決定するためのシステムおよび方法が提供される。特に、本明細書で開示されるシステムおよび方法は、分子（例えば、ポリヌクレオチド）の、ナノポア（または一部の種類のタンパク質または突然変異体タンパク質）の内部、ナノポア（または一部の種類のタンパク質または突然変異体タンパク質）を通して、または少なくとも部分的にナノポア（または一部の種類のタンパク質または突然変異体タンパク質）を通しての制御、速さ、動き、および／または移動を最適化する。場合によっては、十分な電流狭窄情報を蓄積して、ポリヌクレオチドの一本鎖領域内の連続ヌクレオチドにより、分子および／または配列を同定するために、通過速度を、十分な長さの時間にわたり、十分に減速するかまたは失速させる。すなわち、いくつかの実施形態では、標的の一本鎖部分（「ｓｓ」）が精査され、遺伝子解析がなされ、検出される間のある長さの時間にわたり、それらの二本鎖部分が、ナノポアの一部分の内部に「貼り付けられる」ように、減速バンプ（例えば、オリゴヌクレオチドｎマー）を、標的ポリヌクレオチドに結合させることができる。ある長さの時間の後、「貼り付けられた」オリゴヌクレオチドは、溶融させて消失させることができ、試料は、ナノポアを通して移動しうる。いくつかの実施形態では、試料が、制御され、かつ／または一定の速度でナノポアを通して移動するよう、各オリゴヌクレオチドｎマーが溶融して消失しうるか、または均一の速度で除去されるように、オリゴヌクレオチドｎマーを選択することができる。減速バンプ分子の使用は、参照によりその全体において組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１２／０８８３３９号、およびＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１２／０８８３４１号において記載されている。
驚くべきことに、核酸がナノポアを通して通過する速度は、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む減速バンプを使用して制御することができる。減速バンプは、ＲＮＡ骨格に沿って任意選択で配置されるユニバーサル塩基を含みうる。核酸分子は、分子に、本明細書で記載されるナノポアを通して通過させることにより配列決定することができるが、核酸の通過速度は、核酸配列を正確に決定し、かつ／または個々の核酸位置を分解するには急速に過ぎることが多い。ＲＮＡ減速バンプは、核酸分子がナノポアを通して通過する速度を効果的に低減することもでき、かつ／または核酸分子がナノポアを通して通過する速さを効果的に制御することもできる。
ある態様では、核酸分子を配列決定するための方法は、電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも１つのナノポアを含むチップを用意するステップを含む。電極は、核酸分子またはその一部分を検出するように適合されていてもよい。方法は、核酸分子をナノポアを通して方向付けるステップもさらに含みうる。核酸分子のナノポアを通しての進行は、核酸分子と会合させた少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）減速バンプ分子を一助として停止または失速させることができる。方法は、核酸分子が、ナノポアを通して通過するときに、核酸分子またはその一部分を配列決定するステップもさらに含みうる。
別の態様では、核酸分子の配列情報を得るための方法は、核酸分子と会合させた、少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）減速バンプ分子を含有する二重鎖セグメントを形成するステップと、核酸分子に、膜内のナノポアを通して流動させるステップとを含む。膜を、電極に隣接または近接して配置し、核酸分子に、ナノポアを通して流動させ、二重鎖セグメントを、ナノポアに方向付ける。方法は、核酸分子に、ナノポアを通して流動させるときに、電極からの電気シグナルを得るステップもさらに含みうる。電気シグナルは、核酸分子の１または複数の塩基とナノポアとの相互作用と関連させることができ、核酸分子の流動は、二重鎖セグメントを一助として低減することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ減速バンプ分子（RNA speed-bump molecule）を、核酸分子と非共有結合的に会合させる（例えば、減速バンプと核酸との間の塩基対相互作用など、非共有結合を形成する）。
ＲＮＡ減速バンプ分子は、１または複数のオリゴヌクレオチド塩基の配列を含有するオリゴヌクレオチドを含みうる。減速バンプ分子は、最大２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のオリゴヌクレオチド塩基を含む任意の長さを有しうる。場合によっては、ＲＮＡ減速バンプ分子は、ユニバーサル塩基、モルホリノ、グリコールヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、メチル化核酸塩基、修飾塩基、非結合塩基模倣体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸、またはこれらの任意の組合せを有する。
減速バンプ分子は、膜の１または複数の側で核酸と会合させることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ減速バンプ分子を、膜のシス側（例えば、電極から遠い側）で核酸分子と会合させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ減速バンプ分子を、膜のトランス側で（例えば、電極に近い側で）核酸分子と会合させる。場合によっては、ＲＮＡ減速バンプ分子を、膜のシス側および膜のトランス側で核酸分子と会合させる。ＲＮＡ減速バンプ分子は、核酸分子が、ナノポアを通して通過するときに、核酸分子から解離しうる。いくつかの実施形態では、方法は、二重鎖セグメント内に含まれる核酸分子の一部分に、ナノポアを通して流動させる前に、ＲＮＡ減速バンプ分子を核酸分子から解離させるステップをさらに含む。核酸分子は、一本鎖であることが可能である。
核酸分子のナノポアを通しての進行は、核酸分子と会合させた複数のＲＮＡ減速バンプ分子を一助として、減速するか、停止させるか、または失速させることができる。ＲＮＡ減速バンプ分子がナノポアと相互作用すると、流動は低減されうる（例えば、ナノポアは、ナノポアを通しての核酸分子の流動を制限する狭窄部を含有する）。核酸分子のナノポアを通しての進行を停止または失速させるときに、任意の適切な数の塩基を同定する（例えば、ナノポアにより配列決定する）ことができる。いくつかの実施形態では、核酸分子の単一の塩基が同定される。場合によっては、核酸分子の最大２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０以上の塩基が同定される（例えば、群として）。
場合によっては、方法は、核酸分子をナノポア内にトラップするステップをさらに含む。核酸分子は、核酸分子の１または複数の末端部分に形成された嵩高い構造を一助として、ナノポア内にトラップすることが可能である。場合によって、核酸分子は、核酸分子の１または複数の末端部分に取り付けられた（例えば、ライゲーションされた）嵩高い構造を一助として、ナノポア内にトラップされる。いくつかの実施形態では、方法は、核酸分子の流動の方向を反転させるステップをさらに含む。核酸分子またはその一部分は、核酸分子の流動の方向を反転させることにより再配列決定することができる。
ある態様では、本発明を、ナノポア型検出器を使用して、被験ポリヌクレオチド内の配列を検出および／または同定するための方法に方向付ける。同じナノポア型検出器により、同じ被験ポリヌクレオチドを、複数回にわたり読み取りうるように、ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列の末端（複数可）に形成された１つまたは２つの嵩高い構造により、ナノポア内にトラップすることができる。さらにまた、各嵩高い構造を、５’末端または３’末端に結合させて、試料ポリヌクレオチドに、ポア内を、公知の方向に、縫うように進ませることもできる。
公知の配列を検出／同定するために、公知の減速バンプを使用して、被験ポリヌクレオチド内の公知の配列に結合させることができる。この方法を使用して、限定なしに述べると、被験ポリヌクレオチドが適正にナノポア内を縫うように進んだかどうか、被験ポリヌクレオチドがどの試料供給源に由来するのかを検出し、ナノポア内にトラップされる被験ポリヌクレオチドを個別に同定することができる。さらにまた、被験ポリヌクレオチドは、同じナノポアから得られる他の電気シグナルを較正するための基準として使用しうる電気シグナルを発生させる基準シグナルインジケータもさらに含みうる。さらにまた、同時的な配列決定および／または分子の特徴付けのために、複数の被験ポリヌクレオチドを、複数のナノポアにより同時に解析することもできる。複数のナノポアは、個別にアドレス可能な場合もあり、かつ／または電位を個別に印加される場合もある。したがって、複数の被験ポリヌクレオチドを同時に解析して、任意選択で、１または複数の所望の公知の配列を有するポリヌクレオチドをまず同定することができる。所望の公知の配列を有さないポリヌクレオチドは、さらなる特徴付けを伴わずに放出することができる。所望の公知の配列を有するポリヌクレオチドは、本明細書で記載される通り、さらに特徴付けし、任意選択で単離および濃縮することもできる。
ランダム減速バンププールを使用して、被験ポリヌクレオチドまたはその断片に、ランダムな形で結合させることができる。したがって、被験ポリヌクレオチドまたはその断片の各ヌクレオチドは、ナノポア内で、ヌクレオチドの配列情報を収集するのに十分な程度に長い時間にわたり失速させることができる。被験ポリヌクレオチドまたはその断片のヌクレオチド配列は、得られた全ての配列情報をまとめることにより同定することができる。被験ポリヌクレオチドは、情報（例えば、嵩高い構造の形成、被験ポリヌクレオチドの供給源、および被験ポリヌクレオチドの同定）をもたらすための方向識別子、基準シグナル識別子、試料供給源識別子、試料識別子などの公知の構造もさらに含みうる。被験ポリヌクレオチドは、被験ポリヌクレオチドを単離および濃縮するための単離用タグもさらに含みうる。いくつかの実施形態では、複数の被験ポリヌクレオチドを、複数のナノポア（例えば、アレイ内のナノポア）により検出／同定する。本明細書で記載される方法は、検出／同定される各被験ポリヌクレオチドに適用することができる。ナノポアは、個別にアドレス指定および制御して、その中の被験ポリヌクレオチド（複数可）を選択的に検出／同定／収集／濃縮することができる。
図１０に例示する通り、一本鎖（ｓｓ）ポリヌクレオチド分子は、印加される電位下でナノポアを通して進みうる。ｓｓポリヌクレオチドは、被験ポリヌクレオチドでありうる。ｓｓポリヌクレオチド分子によるナノポアを通してのイオン流動の遮断に対応する電気シグナルのセットは、ｓｓポリヌクレオチド分子に、ナノポアを通して縫うように進ませるときに検出することができる。減速バンプまたは嵩高い構造の非存在下では、ｓｓポリヌクレオチド分子は、ほとんど抵抗に遭遇せず、ｓｓポリヌクレオチドを配列決定するための電気シグナルを信頼できる形で記録するにはあまりに急速にナノポアを通して移動する。例示される例では、ｓｓポリヌクレオチドを、ナノポアを通しての膜のシス側（すなわち、センシング電極から遠い側に配置される膜の側）から、膜のトランス側（すなわち、センシング電極に向かって配置される膜の側）に方向付ける。
嵩高い構造（ＢＳ）を使用して、ｓｓポリヌクレオチドのナノポアを通しての通過を減速することもでき、停止させることもできる。図１１は、ｓｓ被験ポリヌクレオチド分子のナノポアを通しての通過を停止させるのに使用される終端ＢＳを例示する。ＢＳは、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの終端をそれ自体でラッピングすることにより、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの一方の末端に形成されたヘアピン構造でありうる。典型的には、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、嵩高いヘアピン構造が、ナノポアの入口に到達するまで、印加される電位下で、ナノポアを通して縫うように進ませることができる。ヘアピン構造は、ナノポアの直径より大きいので、ｓｓ被験ポリヌクレオチドをナノポア内で、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの電気シグナルのセットを得るのに十分な程度に長く失速させる。しかし、得られる電気シグナルは、ヘアピンの前にあるか、または特殊な二重鎖領域の前にあり、したがって、ナノポアの狭窄領域内にあるかまたはこの近くにあるポリヌクレオチドの一部分だけの構造を反映しうる。
図１２は、２つの嵩高い構造によりナノポア内にトラップされるｓｓ被験ポリヌクレオチドを例示する。ナノポアによる検出は、減速バンプとｓｓ被験ポリヌクレオチドとの間の１または複数の短いポリヌクレオチド二重鎖区間（減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメント）が形成されうるように、室温より低いことが可能である作業温度および／または嵩高い構造が形成される温度で実行する。減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントは、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの前にあるｓｓ被験ポリヌクレオチドセグメント、および減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの最初の塩基対の配列情報を得るのに十分な滞留時間にわたり、減速するかまたは失速させることが可能である。次いで、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントは解離することが可能であり、ｓｓ被験ポリヌクレオチドに、ナノポアを通して、別の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントにより失速させるか、またはｓｓ被験ポリヌクレオチドの一方の末端上の嵩高い構造により失速させるか、減速するか、もしくは停止させるまで、前方に移動させることができる。ｓｓ被験ポリヌクレオチドが一方の末端に到達したら、電位の極性を任意選択で反転させて、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを、反転させた方向に移動させ、工程を所望に応じて反復することができる。
ｓｓ被験ポリヌクレオチドが、未知の配列（例えば、試料ポリヌクレオチド）を有する場合は、ランダム減速バンププールを構築して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドのランダムな区間に結合させることができる。あらゆるｓｓ被験ポリヌクレオチドの区間には、ランダム減速バンププール内の少なくとも１つの減速バンプを結合させうるので、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを、ランダム減速バンププールと接触させることによりそのたびごとに達成される結合パターンは、ランダムでありうる（例えば、図１３）。したがって、その配列情報が得られるセグメントもまた、試行のたびごとにランダムでありうる（例えば、図１４）。しかし、記載される通りに工程を反復することにより、配列が未知の各ヌクレオチドおよびあらゆるヌクレオチドを、ナノポア型検出器により同定することが可能となる。したがって、ｓｓ被験ポリヌクレオチドのランダムな区間の得られた配列情報を重ね合せることにより、未知の全配列を構築することができる。
ｓｓ被験ポリヌクレオチドが、１または複数の公知の配列（例えば、識別子）を含む場合もまた、本明細書で記載される方法を使用して、１または複数の識別子の存在を検出し、かつ／またはｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で識別子の前にある、ｓｓ被験ポリヌクレオチド上の配列を同定することができる。ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、ＢＳを一方だけの末端に有する場合（図１５）もあり、両端に有する場合もある。ナノポア型検出器は、任意選択で、室温より低い作業温度で作動させる。識別子（例えば、識別子１；図１５）に特異的に結合して、減速バンプ−識別子二重鎖セグメントを形成しうる減速バンプを含む減速バンププールを使用することができる。減速バンプ−識別子二重鎖セグメントにより、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させ、電気シグナルのセットを得ることができる。これらのシグナルを特徴付けて、識別子の存在を示すか、またはｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で識別子の前のセグメントの配列を同定することができる。このような電気シグナルの例を、図１６に示す。
被験ポリヌクレオチドのデザインおよび試料ポリヌクレオチドからの構築
ある実施形態では、試料ポリヌクレオチドを、多様な機能的部分と連結して、ナノポアの配列決定および／または同定を容易とする。機能的部分の例は、限定なしに述べると、本明細書で記載される嵩高前構造および識別子、ならびに試料ポリヌクレオチドの単離および濃縮を容易とする単離用タグを含む。機能的部分は、任意選択で、１または複数のヌクレオチドを含む。
試料ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドの場合もあり、生物学的試料から得られるポリヌクレオチドの場合もある。ある実施形態では、試料ポリヌクレオチドは、１〜約１００，０００塩基、１〜約１０，０００塩基、１〜約１，０００塩基、１〜約５００塩基、１〜約３００塩基、１〜約２００塩基、１〜約１００塩基、約５〜約１００，０００塩基、約５〜約１０，０００塩基、約５〜約１，０００塩基、約５〜約５００塩基、約５〜約３００塩基、約５〜約２００塩基、約５〜約１００塩基、約１０〜約１００，０００塩基、約１０〜約１０，０００塩基、約１０〜約１，０００塩基、約１０〜約５００塩基、約１０〜約３００塩基、約１０〜約２００塩基、約１０〜約１００塩基、約２０〜約１００，０００塩基、約２０〜約１０，０００塩基、約２０〜約１，０００塩基、約２０〜約５００塩基、約２０〜約３００塩基、約２０〜約２００塩基、約２０〜約１００塩基、約３０〜約１００，０００塩基、約３０〜約１０，０００塩基、約３０〜約１，０００塩基、約３０〜約５００塩基、約３０〜約３００塩基、約３０〜約２００塩基、約３０〜約１００塩基、約５０〜約１００，０００塩基、約５０〜約１０，０００塩基、約５０〜約１，０００塩基、約５０〜約５００塩基、約５０〜約３００塩基、約５０〜約２００塩基、または約５０〜約１００塩基を有する。
嵩高前構造
いくつかの実施形態では、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、第１の条件下で第１の嵩高い構造（ＢＳ１）を形成しうる、第１の末端上の第１の嵩高前構造（ＰＢ１）と、第２の条件下で第２の嵩高い構造（ＢＳ２）を形成しうる、第２の末端上の第２の嵩高前構造（ＰＢ２）とを含む。いくつかの実施形態では、ＰＢ１は、第１の条件下でＢＳ１を形成しうるｓｓポリヌクレオチドセグメントを含む。第１の条件は、室温近傍〜７０℃、約４０℃以上、約３０℃以上、約２５℃以上、約２０℃以上、または約１５℃以上であることが可能な、第１の温度Ｔ１でありうる。いくつかの実施形態では、第１の条件は、Ｔ１、およびＰＢ１に結合して、ＢＳ１を形成することが可能な、第１のリガンドの存在でありうる。第１のリガンドの例は、限定なしに述べると、ＰＢ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＢＳ１の形成を容易とする他の化合物（例えば、ＰＢ１に接合されたリガンドと結合対を形成しうる化合物）を含む。このような結合対の例は、限定なしに述べると、抗体−抗原系、およびビオチン−ストレプトアビジン系、ならびに共有結合的相互作用および／または非共有結合的相互作用を介するこれらの組合せを含む。ＢＳ１が、ポリヌクレオチドの二次元構造または三次元構造（例えば、二重鎖、ヘアピン構造、多重ヘアピン構造および多重アーム構造）である場合、ＢＳ１の溶融温度（Ｔｍ１）は、１５℃以上、約２０℃以上、約２５℃以上、約３０℃以上、約３５℃以上、約４０℃以上、または約５０℃以上である。
ＰＢ２は、第２の条件下でＢＳ２を形成する。いくつかの実施形態では、ＰＢ２は、第２の条件下でＢＳ２を形成しうる、ｓｓポリヌクレオチドセグメント（例えば、ポリヌクレオチド二重鎖、ヘアピン構造、多重ヘアピン構造および多重アーム構造）である。第２の条件は、第２の温度Ｔ２であることが可能であり、Ｔ２は、約−５〜約５０℃、約４０℃以上、約３０℃以上、約２５℃以上、約２０℃以上、約１５℃以上、約１０℃以上、または約５℃以上である。いくつかの実施形態では、Ｔ２は、Ｔ１より少なくとも約５℃低いか、好ましくは少なくとも約１０℃低いか、または少なくとも約２０℃低い。いくつかの実施形態では、第２の条件は、Ｔ２と、ＰＢ２に結合してＢＳ２を形成しうる第２のリガンドの存在とでありうる。第２のリガンドの例は、限定なしに述べると、ＰＢ２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＢＳ２の形成を容易とする他の化合物、（例えば、ＰＢ２に接合されたリガンドと結合対を形成しうる化合物）を含む。このような結合対の例は、限定なしに述べると、抗体−抗原系、およびビオチン−ストレプトアビジン系、ならびに共有結合的相互作用および／または非共有結合的相互作用を介するこれらの組合せを含む。ＢＳ２が、ポリヌクレオチドの二次元構造または三次元構造（例えば、二重鎖、ヘアピン構造、多重ヘアピン構造および多重アーム構造）である場合、ＢＳ２の溶融温度（Ｔｍ２）は、約５〜約１０℃、約１０〜約２０℃、約２０〜約３０℃、または約２０〜約５０℃である。
いくつかの実施形態では、ＰＢ１および／またはＰＢ２は、減速バンププール内の減速バンプに結合しない構造を含む。このような構造の例は、限定なしに述べると、イソｄＧ、イソｄＣ、および脱塩基部位などの非結合塩基を含むヌクレオチド類似体を含む。
識別子
いくつかの実施形態では、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、識別子および単離用タグなどの機能的部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを、ランダム減速バンププールと接触させる場合、識別子および単離用タグは、それらにランダム減速バンププールが結合しないように構築する。例えば、識別子セグメントは、互いと結合することが好ましい、イソｄＧ塩基およびイソｄＣ塩基を有しうる。ランダム減速バンププールの減速バンプが、イソｄＧ塩基またはイソｄＣ塩基を有さない場合は、ランダム減速バンププールに由来する減速バンプを、識別子セグメント以外のｓｓ被験ポリヌクレオチドの区間に結合させることがより好ましいであろう。こうして、識別子の配列情報に関して収集される電気シグナルが少数となり、これにより、収集される電気シグナルを特徴付けることがより容易となろう。
識別子の例は、限定なしに述べると、方向識別子、基準シグナル識別子、試料供給源識別子、および試料識別子を含む。
ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、一方の末端に唯一の嵩高い構造を有する場合（例えば、図１５）もあり、両端に２つの嵩高い構造を有する場合（例えば、図１７）もある。一方の方向識別子は、ｓｓ被験ポリヌクレオチド内の各嵩高い構造に対して近接して（例えば、０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、・・・または５０塩基に）位置させることができる。異なる嵩高い構造のための方向識別子は、同じ場合もあり、異なる場合もある。
ｓｓ被験ポリヌクレオチドが、２つの嵩高い構造および２つの方向識別子を有する場合、他の識別子は、２つの方向識別子の間に位置させることができる。ｓｓ被験ポリヌクレオチドが、一方の末端に唯一の嵩高い構造および１つの方向識別子を有する場合、他の識別子は、方向識別子と比較して、嵩高い構造からさらに遠く離して位置させることができる。
他の識別子は、限定なしに述べると、同じナノポアで得られる他の電気シグナルについてのベースラインをもたらす基準読取りまたは較正読取り；試料ポリヌクレオチドの供給源を同定するのに使用される試料供給源識別子；および個々の試料ポリヌクレオチドを同定するのに使用される試料識別子として用いられる基準シグナル識別子を含む。
識別子の構造は公知であるため、識別子は、識別子特異的な減速バンプをｓｓ被験ポリヌクレオチドと接触させることにより検出および／または同定することができる。ｓｓ被験ポリヌクレオチドが、対象の識別子を含む場合は、識別子特異的な減速バンプ二重鎖区間が形成され、これが、ナノポア内でｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるであろう。ｓｓ被験ポリヌクレオチドをナノポア内で失速させる間に電気シグナルのセットを得ることができ、これを使用して、減速バンプ−識別子二重鎖区間（識別子；図１８）の形成を指し示し、かつ／またはｓｓ被験ポリヌクレオチド分子の流動方向で、識別子−減速バンプ二重鎖の前にある配列および識別子−減速バンプ二重鎖の最初の塩基対（影を付した区間；図１８）を同定することができる。図１８は、唯一の嵩高い構造を有するｓｓ被験ポリヌクレオチド内の状況を示す。ｓｓ被験ポリヌクレオチドが嵩高い構造を両端に有する場合も、同じ方法を使用することができる。
いくつかの実施形態では、識別子および／または識別子特異的な減速バンプおよび／またはｓｓ被験ポリヌクレオチド分子の流動方向で識別子の前にある配列は、顕著に異なる電気シグナルであって、たやすく同定される電気シグナルをもたらす、１または複数のヌクレオチドまたは構造を含みうる。このようなヌクレオチドおよび構造の例は、限定なしに述べると、イソｄＧまたはイソｄＣ、脱塩基ヌクレオチド、メチル化ヌクレオチドなどを含むヌクレオチドを含む。
単離用タグ
単離用タグとは、リガンドと共に結合対を形成しうる構造であって、リガンドが、その濃縮または単離を容易とするようにさらに修飾された構造である。このような結合対の例は、限定なしに述べると、抗体−抗原系およびビオチン−ストレプトアビジン系を含む。濃縮または単離を容易とするさらなる修飾の例は、限定なしに述べると、リガンドの、たやすく濃縮および／または単離されうる電磁ビーズへの接合を含む。
いくつかの実施形態では、複数の機能的部分は、互いと重複する場合もあり、複数の機能に用いられる場合もある。
ｓｓ被験ポリヌクレオチドの例は、複数の機能的部分（セグメントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩ；図１９）を含むが、試料ポリヌクレオチドを図１９に示す。
セグメントＩは、嵩高前構造として用いられる可能性があり、その相補鎖と共に嵩高い構造を形成する場合もあり、構造（例えば、ポリヌクレオチドのヘアピン構造、多重ヘアピン構造、および多重アーム構造）に自己フォールディングすることにより嵩高い構造を形成する場合もあり、セグメントＨまたはその断片は、方向識別子として用いられる可能性がある。代替的に、セグメントＩは、ある種の条件下で、セグメントＨと共にヘアピンを形成する場合もある。したがって、この場合には、嵩高前構造は、セグメントＩおよびＨである。セグメントＧまたはその断片は、方向識別子として用いられうる。
セグメントＦ、Ｇ、およびＨ、またはその断片は、基準シグナル識別子の場合もあり、試料識別子の場合もあり、試料供給源識別子の場合もある。代替的に、セグメントＦ、Ｇ、およびＨは、併せて識別子の場合もあり、また、その任意の断片が、本明細書で記載される識別子として用いられる場合もある。類似の状況は、３’末端におけるセグメントＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤにも当てはまる。それが、減速バンプのｓｓ被験ポリヌクレオチドへの結合、ナノポアの機能、または嵩高い構造の形成に干渉しない限りにおいて、単離用タグは、３’末端に配置することもでき、５’末端に配置することもでき、３’末端または５’末端のヌクレオチドに連結することもでき、セグメントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩ上の任意のヌクレオチドに連結することもできる。
試料ポリヌクレオチドおよび１または複数の機能的部分を含むｓｓ被験ポリヌクレオチドの構築
試料ポリヌクレオチド、および１または複数の機能的部分を含む被験ポリヌクレオチドは、所望に応じて、従来の有機的方法および／または生物学的方法を使用して、試料ポリヌクレオチドを、他のセグメントとライゲーションすることにより構築する。
図１９に示されるｓｓ被験ポリヌクレオチドは、従来のライゲーション法（例えば、共有結合の形成（例えば、ライゲーションが、ペアドエンド配列決定化学反応、平滑末端ポリヌクレオチドのライゲーション、および／または粘着末端ライゲーションにより達成されうる、リガーゼ支援ライゲーションまたは他の共有結合）または非共有結合的相互作用）を使用して、複数の機能的部分を、試料ポリヌクレオチドに連結することにより形成することができる。
いくつかの実施形態では、得られる試料ポリヌクレオチドは、二本鎖（ｄｓ）試料ポリヌクレオチドである。ｄｓ試料ポリヌクレオチドは、従来のライゲーション法（例えば、平滑末端、突出末端に後続するリガーゼ支援ライゲーション、および／またはリンカーライゲーション；メイトペアドプロトコールおよびエンドペアドプロトコール）を使用して、１または複数のｄｓ機能部分（例えば、ｄｓ ＰＢ１（セグメントＩおよびＨ−セグメントＡ’およびＢ’；図２０）、ｄｓ ＰＢ２（セグメントＢおよびＡ−セグメントＨ’およびＩ；図２０）、ｄｓ識別子（例えば、（セグメントＧおよびＦ−セグメントＣ’およびＤ’、ならびにセグメントＤおよびＣ−セグメントＦ’およびＧ’；図２０）など）とライゲーションすることができる（図２０）。機能的部分は、一体型ステップで試料ポリヌクレオチドにライゲーションすることもでき、逐次的にライゲーションすることもでき、試料ポリヌクレオチドの一方の末端における全ての機能的部分は、まず併せて構築し、次いで、試料ポリヌクレオチドの末端にライゲーションする。従来のライゲーション法の例は、限定なしに述べると、平滑末端、突出末端に後続するリガーゼ支援ライゲーション、および／またはリンカーライゲーション；ペアドエンド配列決定プロトコール；メイトペアドプロトコールおよびエンドペアドプロトコールを含む。次いで、従来の方法を使用して（例えば、加熱して、ｄｓポリヌクレオチドを変性させる）、得られたｄｓポリヌクレオチドを変性させて、ｓｓ被験ポリヌクレオチドをもたらす。
いくつかの実施形態では、得られる試料ポリヌクレオチドは、ｄｓ試料ポリヌクレオチドであり、ホスホジエステル結合以外の共有結合を介して、１または複数のｄｓ機能部分（例えば、ｄｓ ＰＢ１、ｄｓ ＰＢ２、ｄｓ識別子など）に連結される。このような連結の例は、限定なしに述べると、グリコールヌクレオチド、モルホリノ、およびロックドヌクレオチドによる連結を含む。
いくつかの実施形態では、得られる試料ポリヌクレオチドは、ｓｓ試料ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、またはＲＮＡ）であり、従来の方法を使用して、その相補鎖（ＤＮＡ、またはＲＮＡ）を創出して、ｓｓ試料ポリヌクレオチドとアニーリングさせて、ｄｓ試料ポリヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体）を形成し、次いで、本明細書で記載される１または複数のｄｓ機能部分にライゲーションすることができる。
いくつかの実施形態では、リガーゼ支援ライゲーションを使用して、ｓｓ試料ポリヌクレオチドを、１または複数のｓｓ機能部分（例えば、ｓｓＰＢ１、ｓｓＰＢ２、ｓｓ識別子など）に連結する。いくつかの実施形態では、ホスホジエステル結合以外の共有結合を介して、ｓｓ試料ポリヌクレオチドを、１または複数のｓｓ機能部分に連結する。このような連結の例は、限定なしに述べると、グリコールヌクレオチド、モルホリノ、およびロックドヌクレオチドによる連結を含む。
いくつかの実施形態では、得られる試料ポリヌクレオチドは、ｄｓ試料ポリヌクレオチドであり、変性させて、本明細書で記載される１または複数のｓｓ機能部分に連結されるｓｓ試料ポリヌクレオチドをもたらすことができる。
いくつかの実施形態では、１または複数の個々の機能的部分が、ｓｓ被験ポリヌクレオチドから切断されうるように、機能的部分を、切断可能な結合により連結する。ある実施形態では、試料ポリヌクレオチドと嵩高い構造との間に位置する機能的部分を切断することにより、嵩高い構造を、ｓｓ被験ポリヌクレオチドから除去することができる。次いで、電位を印加して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドにナノポアを通して移動させることにより、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを、それが中に入るナノポアから、切断された嵩高い構造によりそれをもはや失速させるか、減速するか、または停止させることがない方向に放出させることができる。
いくつかの実施形態では、それにより得られる被験ポリヌクレオチドに、ナノポア内を、所望の方向に（例えば、３’末端から、または５’末端から）縫うように進ませうるように、試料ポリヌクレオチドの所望される末端（３’末端または５’末端）に、所望の機能的部分を連結する。
ランダム減速バンププールを使用する、試料ポリヌクレオチドの同定
本発明の一態様は、試料ポリヌクレオチド配列を同定する方法であって、
（Ａ１）二本鎖（ｄｓ）試料ポリヌクレオチドを用意するステップと、
（Ａ２）第１の嵩高前（ＰＢ１）構造を、ｄｓ試料ポリヌクレオチドの第１の末端にライゲーションし、第２の嵩高前（ＰＢ２）構造を、ｄｓ試料ポリヌクレオチドの第２の末端にライゲーションするステップと、
（Ａ３）Ａ２のｄｓ試料ポリヌクレオチドを、ｓｓ被験ポリヌクレオチドに変性させるステップと、
（Ｂ１）第１の嵩高い構造（ＢＳ１）を、ＰＢ１から、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの第１の末端上、第１の温度で形成するステップと、
（Ｂ２）第１の電位を印加して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドにナノポアを通して流動させるステップと、
（Ｂ３）第２の嵩高い構造（ＢＳ２）を、ＰＢ２から、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの第２の末端上、第２の温度で形成するステップと、
（Ｂ４）任意選択で、ＢＳ２により、ナノポアの狭窄領域の前で、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、別の電位を印加して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動を反転させるステップと、
（Ｂ５）作業温度で、ランダム減速バンププールを、ｓｓ被験ポリヌクレオチドと接触させて、少なくとも１つの減速バンプ−ｓｓ被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを有する、減速バンプ−ｓｓ被験ポリヌクレオチド複合体を形成するステップと、
（Ｂ６）ナノポアの狭窄領域の前で、第１の減速バンプ−ｓｓ被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、第３の電位を印加して、減速バンプ−ｓｓ被験ポリヌクレオチド複合体に、ナノポアを通して流動させるステップと、
（Ｂ７）第１の減速バンプ−ｓｓ被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させるときに、第１の電気シグナルのセットを得、ｓｓポリヌクレオチドの流動方向で、第１の減速バンプ−ｓｓ被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの前にあるヌクレオチド配列および第１の減速バンプ−ｓｓ被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの最初の塩基対を特徴付けるステップと、
（Ｂ８）第１の減速バンプ−ｓｓ被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを解離させ、ｓｓポリヌクレオチドのナノポアを通しての流動を持続させるステップと、
（Ｂ９）ＢＳ１またはＢＳ２により、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、ステップ（Ｂ４）〜（Ｂ８）を反復するステップと
を含む方法に関する。
ある実施形態では、ｓｓポリヌクレオチドは、本明細書で記載される試料ポリヌクレオチドを含むｓｓ被験ポリヌクレオチドである。減速バンプは、本明細書で規定される１または複数のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｓ試料ポリヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｄｓ試料ポリヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体でありうる。
ランダム減速バンププールは、全てのｓｓ被験ポリヌクレオチドの区間またはその断片（例えば、試料ポリヌクレオチド）に結合しうる、所与の長さの減速バンプコレクションを含む。このような所与の長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６、好ましくは、１０以下、８以下、６以下、および４以下でありうる。ある実施形態では、ランダム減速バンププールは、ユニバーサルヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、本源性ヌクレオチド、これらの修飾、およびこれらの組合せからなる群から選択される１または複数のヌクレオチドからなる減速バンプを含む。ユニバーサルヌクレオチドおよび本源性ヌクレオチドの修飾は、核酸塩基構造、骨格構造（例えば、グリコールヌクレオチド、モルホリノ、およびロックドヌクレオチド）、およびこれらの組合せにおける修飾を含む。ある実施形態では、ランダム減速バンププールは、全ての本源性核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）と塩基対合するユニバーサル核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ランダム減速バンププールは、本源性核酸塩基の全ての可能な組合せを有するオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ランダム減速バンププールは、本源性核酸塩基およびユニバーサル核酸塩基の全ての可能な組合せを有するオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ランダム減速バンププールは、指定された位置においてユニバーサルヌクレオチドを有し、他の位置において全ての本源性核酸塩基の組合せを有するオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ランダム減速バンププール内の減速バンプの骨格構造を、指定された位置（複数可）、ランダムな位置、またはこれらの組合せにおいて修飾する（例えば、グリコールヌクレオチド、モルホリノ、およびロックドヌクレオチド）。別の実施形態では、ランダム減速バンププール内の減速バンプは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド（oligonucleotdies）、またはこれらの組合せを含む。
減速バンプは、指定された位置にユニバーサル核酸塩基を含み、他の位置に、可能な本源性核酸塩基の組合せの総数をより少なくして、ランダムな本源性核酸塩基を含みうる。例えば、１０塩基のオリゴヌクレオチドを有するランダム減速バンププールでは、本源性核酸塩基の組合せの総計は、４１０＝１，０４８，５７６である。しかし、１０塩基のヌクレオチドのうちの４つの位置がユニバーサル核酸塩基だけを有するように指定すれば、本源性核酸塩基の組合せの総計は４６＝４，０９６となり、著明に小さくなる。
いくつかの実施形態では、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの最初の塩基対は、部分的または完全にナノポア内にあり、得られる電気シグナルに影響を及ぼす可能性があるため、ユニバーサルヌクレオチドを５’末端および／または３’末端に有する減速バンプを構築して、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの最初の塩基対の寄与を標準化し、シグナルの解析をより容易とすることが好ましい。
いくつかの実施形態では、ランダム減速バンププールの１または複数の減速バンプの濃度を、所望に応じてさらに調整することができる。例えば、濃度は、各種類の減速バンプについて、ほぼ同じであることが可能であり、ｓｓ被験ポリヌクレオチドに接触するのに十分なｓｓ減速バンプが存在するように調整することができる。ある実施形態では、ポリＧ鎖は、ポリＣ鎖に強く結合するため、ポリＧ減速バンプおよびポリＣ減速バンプは、他の配列を有する減速バンプより高濃度であり、ｓｓ被験ポリヌクレオチドに接触するのに十分なｓｓポリＧおよびｓｓポリＣをもたらす。別の実施形態では、減速バンプを作製するのに使用される減速バンプおよび／またはヌクレオチドの濃度を、各減速バンプが、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体を形成するのに、ほぼ同じアフィニティを有し、特定の減速バンプが、他の減速バンプより著明に選好されないように調整する。いくつかの実施形態では、減速バンプを作製するのに使用される減速バンプおよび／またはヌクレオチドの濃度を、１または複数の特定の減速バンプが、他の減速バンプより著明に選好されるように調整する。例えば、ｓｓ被験ポリヌクレオチド内の公知のセグメントに結合しうる減速バンプを実質的に含まない減速バンププールを構築することができる。こうして、得られるより多くの配列情報を、ｓｓ被験ポリヌクレオチド内の未知のセグメントについての配列情報とし、公知のセグメントについての配列情報とはしないことになる。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ５）は、少なくとも１つの減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを有する減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体であって、減速バンプが、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６塩基対であり、第１の作業条件でナノポア内を縫うように進むｓｓ被験ポリヌクレオチドセグメントと共に二重鎖を形成する、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体を形成する。作業条件は、作業温度（Ｔｗ）、曝露時間、減速バンプおよびｓｓ被験ポリヌクレオチドの濃度、ｐＨ、塩濃度、ならびに減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体の形成に影響を及ぼしうる他の添加物およびその濃度などのパラメータを含む。Ｔｗは、比較的短い減速バンプ（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６塩基）の、ｓｓ被験ポリヌクレオチドへの会合を可能とするように、約−１０〜約２５℃、約−１０〜約２０℃、約−１０〜約１５℃、約−１０〜約１０℃、約−１０〜約５℃、約−１０〜約０℃、約−１０〜約−５℃、約−５〜約２５℃、約−５〜約２０℃、約−５〜約１５℃、約−５〜約１０℃、約−５〜約５℃、または約−５〜約０℃でありうる。ある実施形態では、Ｔｗは、Ｔ２より少なくとも約１０℃低く、好ましくは少なくとも約２０℃低い。別の実施形態では、Ｔｗにおいて、ＰＢ１およびＰＢ２のうちの少なくとも約５０％は、それぞれ、ＢＳ１およびＢＳ２の形態にある。別の実施形態では、Ｔｗにおいて、ＰＢ１およびＰＢ２のうちの少なくとも約７０％は、それぞれ、ＢＳ１およびＢＳ２の形態にある。別の実施形態では、Ｔｗにおいて、ＰＢ１およびＰＢ２のうちの少なくとも約９０％は、それぞれ、ＢＳ１およびＢＳ２の形態にある。
ｓｓ被験ポリヌクレオチドの減速バンプへの曝露時間は、十分な減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体が形成することを可能とするように、約１ナノ秒以上、約１０ナノ秒以上、約１マイクロ秒以上、約１０マイクロ秒以上、約１ミリ秒以上、約１０ミリ秒以上、約１秒以上、または約５秒以上である。減速バンプの濃度は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの濃度の約１００，０００倍、１０，０００倍、１，０００倍、３００倍、約２００倍、約１００倍、約５０倍、または約２０倍であるか、減速バンプの濃度は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの濃度とほぼ同じであることが好ましい。減速バンプの濃度は、約１ｎＭ〜約１００ｍＭ、約１ｎＭ〜約１０ｍＭ、約１ｎＭ〜約１ｍＭ、約１０ｎＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｎＭ〜約１０ｍＭ、約１０ｎＭ〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましい。ｓｓ被験ポリヌクレオチドの濃度は、約１ｎＭ〜約１００ｍＭ、約１ｎＭ〜約１０ｍＭ、約１ｎＭ〜約１ｍＭ、約１０ｎＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｎＭ〜約１０ｍＭ、または約１０ｎＭ〜約１ｍＭである。ｐＨは、約６〜約８、または約７であることが好ましい。塩（例えば、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、リン酸）濃度は、約１ｍＭ〜約１０Ｍ、約１ｍＭ〜約１Ｍ、約１０ｍＭ〜約１０Ｍ、約１０ｍＭ〜約１Ｍ、約１００ｍＭ〜約１０Ｍ、または約１００ｍＭ〜約１Ｍである。減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体の形成に影響を及ぼしうる他の添加物は、限定なしに述べると、硫酸デキストランおよびグリセロールを含む。それらの濃度は、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体の形成を最適化するように調整することができる。
作業条件は、所望の極性における約０ｍＶ〜約３２０ｍＶの電位をさらに含む。作業条件は、シグナルの品質を最適化するように、減速バンプ結合の特徴（例えば、長さ、ヌクレオチドの構成要素、および結合アフィニティ）、ナノポアの特徴、およびｓｓ被験ポリヌクレオチドの特性（例えば、ＧＣ含量またはその二次構造）に基づき、工程を通して持続的に調整することができる。したがって、電位は、例えば、−３２０ｍＶ〜＋３２０ｍＶにおいて持続的に変化させることができる。
ステップ（Ｂ４）〜（Ｂ９）は、本明細書で記載される第１の作業条件で実行することができる。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ４）〜（Ｂ９）の各ステップに適用される電位は、同じ場合もあり、異なる場合もあり、持続的に変化させることもできる。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ８）のための電位は、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの解離を容易とするように調整することができる。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ８）のための電位を、ステップ（Ｂ６）におけるｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向（順方向）と比較して逆方向にｓｓ被験ポリヌクレオチドを移動させるように印加して、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントをナノポアの狭窄領域から移動させてから、別の電位を印加して、ポリヌクレオチドを順方向に移動させて、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを解離させることができる。
ナノポア型検出器により、関与性の配列情報を収集し、読み取りうるように、ポリヌクレオチド二重鎖セグメントをナノポアの内側で失速させるための滞留時間がもたらされる。滞留時間は、ナノポア型検出器および作業条件に依存することが典型的である。いくつかの実施形態では、滞留時間は、少なくとも約１０マイクロ秒、少なくとも約１ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約２００ミリ秒、少なくとも約５００ミリ秒、少なくとも約１秒、少なくとも約２秒、または少なくとも約５秒である。一般に、滞留時間が長いほど、シグナルの品質は向上し、より多くの配列情報を得ることができる。
停止点の前にある最大１００塩基（好ましくは最大５０塩基）内のどこかにある少数の塩基（２０塩基未満）の配列は、ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させるときに、一度に読み取ることができる。好ましくは、５または６未満の塩基を一度に読み取る。例えば、１〜５０位の任意のヌクレオチド位置（例えば、減速バンプ−ｓｓ被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、・・・５０ヌクレオチドの位置）における、最大５０塩基のより長いポリヌクレオチド配列内の１、２、３、４、または５塩基を一度に読み取る。
図１２に示す通り、両端に形成された嵩高い構造を含むｓｓ被験ポリヌクレオチドは、ナノポア内でロックされ（ステップ（Ｂ１）〜（Ｂ４））、複数の減速バンプと共に減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体を形成する（ステップ（Ｂ５））。
減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントにより、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを、ナノポア内で、滞留時間にわたり失速させ、次いで、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを解離させ、次の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントにより失速させるまで、ｓｓ被験ポリヌクレオチドが前方に進むたびに、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの電気シグナルのセットを得ることができる（図１２；シス側からトランス側に移動するｓｓ被験ポリヌクレオチドを例示する）。一方の末端の嵩高い構造により、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、この失速−検出−解離−失速工程を反復する。得られる電気シグナルの例を、図１６に示す。
いくつかの実施形態では、ランダム減速バンププールを、主にナノポアの一方の側（例えば、図１３に示されるシス側）に存在させるが、方法は、
（Ｂ１０）ナノポアの狭窄領域の前で、他の嵩高い構造により、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、別の電位を印加して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを、ステップ（Ｂ５）におけるｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動の逆方向に移動させるステップと、
（Ｂ１１）ステップ（Ｂ４）〜（Ｂ１０）を、少なくとも１回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも５０回、または少なくとも１００回反復するステップと、
（Ｂ１２）収集されたヌクレオチドの配列情報を重ね合せることにより、ｓｓ被験ポリヌクレオチド配列を構築するステップと
をさらに含む。
ステップ（Ｂ１０）は、本明細書で記載される作業条件下で実行することができる。印加される電位は、被験ポリヌクレオチドの流動を反転させるために、ステップ（Ｂ４）〜（Ｂ９）において印加される電位と比較して低減された値であるか、または逆の極性でありうる。各ステップにおいて印加される電位は、同じ場合もあり、異なる場合もあり、持続的に変化させることもできる。
いくつかの実施形態では、ランダム減速バンププールを、ナノポアの両側に存在させるが、減速バンプは、ナノポアの両側（図２１に示されるシス側およびトランス側）で減速バンププールに露出されたセグメントにおいて、ｓｓ被験ポリヌクレオチドに結合する。本明細書で記載されるｓｓ被験ポリヌクレオチド内の試料ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を同定する方法は、
（１）他の嵩高い構造により、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、ナノポアの狭窄領域の前で、第２の作業条件下において、ステップ（Ｂ４）〜（Ｂ８）を反復するステップと、
（２）ステップ（Ｂ９）および（１）を、少なくとも１回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも５０回、または少なくとも１００回反復するステップと、
（３）収集されたヌクレオチドの配列情報を重ね合せることにより、試料ポリヌクレオチドの核酸配列を構築するステップと
をさらに含む。
第２の作業条件は、本明細書で記載される作業条件でありうる。第２の作業条件は、第１の作業条件と比較して同じパラメータを有する場合もあり、異なるパラメータを有する場合もある。ステップ（１）において印加される電位は、ステップ（Ｂ９）において印加される電位と比較して低減された値であるか、または逆の極性でありうる。各ステップにおいて印加される電位は、早期のステップにおいて印加される電位と同じ場合もあり、早期のステップと比較して異なる場合もあり、持続的に変化させることもできる。
ランダム減速バンププールは、ｓｓ被験ポリヌクレオチドのランダムな区間に結合しうる減速バンプを含むため、ｓｓ被験ポリヌクレオチドが、本明細書で記載される過程に従い、一方の末端から、ＢＳ１／ＢＳ２により失速するか、減速されるか、または停止して、他方の末端に進むたびに、減速バンプは、ｓｓ被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの異なる組合せに結合することが可能であり（図１３）、ｓｓ被験ポリヌクレオチド内の異なるセグメントについての配列情報をもたらしうる（図１４）。したがって、ｓｓ被験ポリヌクレオチド内の試料ポリヌクレオチドの各ヌクレオチドおよびあらゆるヌクレオチドの配列情報が得られるように、ステップ（Ｂ８）および／またはステップ（Ｂ９）を反復する場合は、収集されたヌクレオチドの配列情報を重ね合せることにより、試料ポリヌクレオチドを構築することができる。
いくつかの実施形態では、各減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの解離により、全減速バンプトレインのｓｓ被験ポリヌクレオチドからの解離が引き起こされないように、複数の減速バンプを、非結合リンカー（例えば、脱塩基オリゴヌクレオチド）により連結して、減速バンプトレイン（図２２）を形成する。いくつかの実施形態では、非結合リンカーを、約１塩基、約２塩基、約３塩基、約４塩基、または約５塩基だけ間隔を置くようにデザインする。したがって、図１４に示される公知のセグメントの間のギャップは、リンカーの長さ（例えば、約１塩基、約２塩基、約３塩基、約４塩基、または約５塩基）と同じである可能性がいっそう大きい。この場合には、試料ポリヌクレオチドの核酸配列を構築することがより容易であろう。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ２）は、
（Ｂ２ａ）ナノポアの内側で第１の嵩高い構造を失速させるときに電気シグナルのセットを得、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で、第１の嵩高い構造の前にあるヌクレオチド配列および第１の嵩高い構造の最初の塩基対を特徴付けるステップ、
をさらに含み、ステップ（Ｂ３）は、
（Ｂ３ａ）ナノポアの内側で第２の嵩高い構造を失速させるときに別の電気シグナルのセットを得、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で、第２の嵩高い構造の前にあるヌクレオチド配列および第２の嵩高い構造の最初の塩基対を特徴付けるステップ
をさらに含む。
ある実施形態では、本明細書で記載される方法は、図２３に示されるフローチャートに従い実行する。ＰＢ１、ＰＢ２、ＤＩ１、ＤＩ２を含むｓｓ被験ポリヌクレオチドおよび試料ポリヌクレオチドが構築され、ナノポアアレイ上に配置されている（ブロック１０；図２３）。次いで、Ｔ１で、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの一方の末端上で、ＢＳ１を、ＰＢ１から形成する（ブロック２０；図２３）。ＢＳ１により、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、第１の電位を印加して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドに、ナノポアを通して縫うように進ませ、このとき、ＤＩ１を特徴付ける電気シグナルのセットを収集する（ブロック３０；図２３）。次いで、温度をＴ２に下げ、ＢＳ２をＰＢ２から形成する（ブロック４０；図２３）。ＢＳ２により、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、第１の電位より低いか、または第１の電位と極性が逆である第２の電位を印加し、このとき、ＤＩ２を特徴付ける電気シグナルのセットを収集する（ブロック５０；図２３）。温度をＴｗにさらに下げ（ブロック６０；図２３）、次いで、本明細書で記載される第１の作業条件下で、ランダム減速バンププールを、ｓｓ被験ポリヌクレオチドと接触させて、ランダムに結合させた減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体を形成する（ブロック７０；図２３）。第１の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントにより、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるまで、第３の電位を印加して、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体に、ナノポアを通して移動させる。滞留時間にわたりｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させ、この間に電気シグナルのセットを得、これを使用して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で、第１の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの前にある配列および減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの最初の塩基対を特徴付ける。次いで、第１の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを解離させると、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、次の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントまたはＢＳ１により失速するか、減速されるか、または停止するまで、ナノポアを通して進み続ける。ナノポア内で、ＢＳ１により、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるときに、ＤＩ１と称する電気シグナルのセットを収集する（ブロック８０；図２３）。次いで、ＢＳ２により、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、第３の電位に照らして低減された値であるか、または逆の極性である第４の電位を印加し、このとき、ＤＩ２を特徴付ける電気シグナルのセットを収集する（ブロック９０；図２３）。次いで、試料ポリヌクレオチドの配列を特徴付けるのに十分な配列情報を収集するまで、ブロック７０〜９０のステップを反復する。
識別子の検出、および被験ポリヌクレオチド分子内の識別子の同定
本発明の別の態様は、本明細書で記載されるｓｓ被験ポリヌクレオチド分子の配列情報を得る方法に関する。方法は、
（Ｂ１）被験ポリヌクレオチド分子の第１の末端に第１の嵩高い構造を形成するステップと、
（Ｃ１）減速バンプのプール（減速バンププール）を、被験ポリヌクレオチド分子と接触させて、少なくとも１つの減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを有する減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子複合体を形成するステップと、
（Ｃ２）ナノポアの狭窄領域の前で第１の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを失速させるまで、電位を印加して、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子複合体に、ナノポアを通して流動させるステップと、
（Ｃ３）被験ポリヌクレオチド分子の流動方向で、第１の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させるときに、第１の電気シグナルのセットを得るステップと、
（Ｃ４）第１の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを解離させ、ナノポアを通しての分子の流動を持続させるステップと、
（Ｃ５）ＢＳ１により、被験ポリヌクレオチド分子を失速させるか、減速するか、または停止させるまで、ステップ（Ｃ１）〜（Ｃ４）を反復するステップと
を含む。
ある実施形態では、被験ポリヌクレオチド分子は、本明細書で記載される１または複数のヌクレオチドを含むｓｓ被験ポリヌクレオチドであり、減速バンプは、本明細書で記載される１または複数のヌクレオチドを含む。ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるＰＢ１を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｃ１）は、少なくとも１つの減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを有する減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体であって、減速バンプが、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６塩基対の被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントと共に二重鎖を形成する、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体を形成する。
ステップ（Ｃ１）〜（Ｃ５）は、本明細書で記載される作業条件において実行することができる。
ナノポア型検出器により関与性の配列情報を収集するための滞留時間は、本明細書で記載される滞留時間と同じである。
本明細書で記載される方法を使用して、ｓｓ被験ポリヌクレオチド内に存在する識別子を検出することができる。識別子は、例えば、方向識別子（例えば、ＢＳ１の形成を検証し、ｓｓ被験ポリヌクレオチドが、ＢＳ１を有する末端に到達したことを示す）、基準シグナル識別子（同じナノポアで得られる他の電気シグナルについてのベースラインをもたらす基準読取りまたは較正読取り）、試料供給源識別子（被験ポリヌクレオチドの供給源を同定する）、または被験ポリヌクレオチドについての試料識別子（被験ポリヌクレオチドを同定する）として用いられうる。いくつかの実施形態では、減速バンププールは、第１の識別子（図１５中の識別子１）に結合しうる第１の減速バンプを含み（図１５）、ｓｓ被験ポリヌクレオチドに結合しうる他の減速バンプを実質的に含まない（好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満であり、最も好ましくは１％未満である）。識別子１を含むｓｓ被験ポリヌクレオチドが、第１の減速バンプに接触すると、第１の減速バンプ−識別子１二重鎖セグメントが形成されて、第１の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体を形成する。第１の減速バンプ−識別子１二重鎖セグメントにより失速するまで、適切な電界の存在下で、第１の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体は、ナノポアを通して進む。ナノポア型検出器により、第１の電気シグナルのセットを得る。次いで、第１の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド複合体は解離し、第１の末端においてＢＳ１により失速するか、減速するか、または停止するまで、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、ナノポアを通して進む（すなわち、ステップ（Ｃ４）において、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、ＢＳ１により失速するか、減速するか、または停止するまで、ナノポア内で再度失速することなく、ナノポアを通して滑らかに流動する）。ＢＳ１構造により、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるときに、ナノポア型検出器により、別の電気シグナルのセットを得る。したがって、識別子１の配列を含まないｓｓ被験ポリヌクレオチドと比較して、識別子１の配列を含むｓｓ被験ポリヌクレオチドは、２つの電気シグナルのセットをもたらすことから、識別子１の配列を含むｓｓ被験ポリヌクレオチドが、ナノポア内で２回失速することが示されるのに対し、識別子１の配列を含まないｓｓ被験ポリヌクレオチドは、１つの電気シグナルのセットをもたらすことから、識別子１の配列を含まないｓｓ被験ポリヌクレオチドは、ナノポア内で１回失速する（ＢＳ１により）ことが示される。
別の実施形態では、ステップ（Ｃ３）で得られる第１の電気シグナルのセットが、ナノポアにより本源性ヌクレオチド配列を検出するときに得られる電気シグナルのセットと顕著に異なるように、ｓｓ被験ポリヌクレオチドおよび／または減速バンプを構築することができる。例えば、公知の識別子配列は、イソｄＧおよび／またはイソｄＣを有する１または複数のヌクレオチド類似体を含みうる。減速バンプを識別子配列とハイブリダイズさせ、ポア内で失速させるか、減速するか、または停止させる場合は、この識別子配列の前に、ポアの狭窄帯域にある公知の読取り用配列が置かれる。読取り用配列は、天然のヌクレオチドに結合しないイソｄＣ位置、イソｄＧ位置、および／または脱塩基位置を含みうるであろう。加えて、識別子に対して特異的な減速バンプだけがその位置とハイブリダイズするように、識別子配列および識別子に対して特異的なアンチセンスの減速バンプ配列のいずれも、適切なイソｄＧおよびイソｄＣを含有するであろう。天然のヌクレオチドによる減速バンプであれば、イソｄＧ、イソｄＣを含有する識別子配列に干渉したり、これらに結合したりしないであろうし、天然のヌクレオチドによる減速バンプであれば、読取り用配列に干渉しないであろう。結果として得られるポア内の鎖の同定は、他の天然または人工のヌクレオチドによる減速バンプの存在に依存せずになされるであろう。この場合には、減速バンププールは、ｓｓ被験ポリヌクレオチドと共に複合体を形成しうる他の減速バンプを実質的に含まなくてもよい。別の減速バンプが、識別子１セグメント以外のｓｓ被験ポリヌクレオチドのセグメントに結合する場合、第１の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントをナノポア内で失速させる間に得られる第１の電気シグナルのセットは、他の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントをナノポア内で失速させる間に得られる他の電気シグナルのセットと顕著に異なる。したがって、ｓｓ被験ポリヌクレオチドと共に複合体を形成しうる他の減速バンプの存在は、第１の減速バンプの、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの識別子１との結合から発生する顕著に異なるシグナルの検出に干渉しない。他の減速バンプが、本明細書で記載される識別子１セグメントに結合しないように、ｓｓ被験ポリヌクレオチドおよび／または減速バンプをさらに構築することができる。したがって、イソｄＧ塩基またはイソｄＣ塩基を含まない他の減速バンプは、識別子１セグメントに結合しないであろう。
別の実施形態では、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、複数の識別子を含み、識別子セグメント（識別子Ｎ）のそれぞれに結合するｓｓ被験ポリヌクレオチドおよび／または減速バンプ（ＳＢＮ；Ｎ＝１、２、・・・）は、各ＳＢＮ−識別子Ｎ二重鎖セグメントをナノポア内で失速させるとき、ナノポアから得られる電気シグナルのセットが本源性ヌクレオチド配列と顕著に異なり、他のＳＢＮ−識別子Ｎ二重鎖セグメントをナノポア内で失速させる場合とも顕著に異なるようにデザインされる。減速バンププールは、検出される識別子（複数可）に特異的な減速バンプを含み、任意選択では、他の識別子の減速バンプおよび／またはｓｓ被験ポリヌクレオチドに結合しうる他の減速バンプも含む。
別の実施形態では、識別子特異的な減速バンプおよびｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で識別子の前にある配列に結合する識別子は、いずれも公知である。したがって、ステップＣ３で得られる電気シグナルのセットはまた、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で識別子の前にある配列を同定するのにも使用することができ、識別子の前にある配列は、識別子の配列を同定するのに使用することができる。
別の実施形態では、方法は、第１の電位を印加して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドにナノポアを通して流動させるステップと、本明細書で記載される第２の条件下で、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの第２の末端において第２の嵩高い構造（ＢＳ２）を形成するステップとをさらに含む。ある実施形態では、第１の条件の温度（Ｔ１）は、第２の条件の温度（Ｔ２）より高く、Ｔ２は、作業温度Ｔｗより高い。ある実施形態では、第１の条件の温度（Ｔ１）は、第２の条件の温度（Ｔ２）より少なくとも１０℃高いか、または少なくとも２０℃高く、Ｔ２は、作業温度Ｔｗより少なくとも約１℃高いか、少なくとも約５℃高いか、少なくとも約１０℃高いか、少なくとも約１５℃高いか、少なくとも約２０℃高いか、または少なくとも約２５℃高い。
公知の減速バンプの配列を、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で伸長させることにより、試料ポリヌクレオチド内のより長い配列の同定が可能となる。この方法は、以下のステップ：
（Ｅ１）第１の公知の減速バンプを、被験ポリヌクレオチド分子と接触させて、第１の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを有する、第１の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子複合体を形成するステップと、
（Ｅ２）ナノポアの狭窄領域の前で、第１の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを失速させるまで、電位を印加して、第１の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子複合体に、ナノポアを通して流動させるステップと、
（Ｅ３）第１の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させるとき、被験ポリヌクレオチド分子の流動方向で第１の電気シグナルのセットを得るステップと、
（Ｅ４）第１の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを解離させ、ナノポアを通しての分子の流動を持続させるステップと、
（Ｅ５）第１の公知の減速バンプを、ナノポア型検出器システムから除去し、末端の嵩高い構造により、被験ポリヌクレオチドの流動を失速させるか、減速するか、または停止させるまで、被験ポリヌクレオチドの流動を反転させるステップと、
（Ｅ６）ステップ（Ｅ３）の被験ポリヌクレオチド分子の流動方向で、第１の公知の減速バンプの配列に加えてより長い公知の数の塩基を有する別の公知の減速バンプにより、ステップ（Ｅ１）〜（Ｅ５）を反復するステップであり、
Ｅ−ａ）公知の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６であり、
Ｅ−ｂ）公知の数の塩基が、ユニバーサル塩基または試料ポリヌクレオチドの対応する位置における塩基と相補的な塩基であることが可能であり、
Ｅ−ｃ）ステップ（Ｅ４）の条件が、例えば、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントをうまく解離させるように、ステップ（Ｅ４）において、作業温度を上げることにより、かつ／または印加される電位値を増大させることにより調整されうるステップと
を含みうる。
このような知識は、本明細書で記載される方法を使用する（例えば、ランダム減速バンププールを使用する）、未知の試料ポリヌクレオチドの配列の残余を同定／配列決定を容易としうる。さらにまた、同じ工程を使用して、試料ポリヌクレオチドの配列を別の末端から同定することもできる。したがって、未知の試料ポリヌクレオチドの最大３０塩基を同定することができ、これにより、試料ポリヌクレオチドの全配列のさらなる同定／配列決定における良好な基準をもたらすであろう。
試料ポリヌクレオチドの単離
本発明の別の態様は、試料ポリヌクレオチドを単離する方法であって、
本明細書で記載されるステップ（Ａ１）〜（Ａ３）を使用して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを調製するステップと、
（Ｄ１）ｓｓ被験ポリヌクレオチドの対応する末端が、失速するか、減速されるか、または停止することなく、ナノポアを通して進みうるように、２つの嵩高い構造のうちの１つを転換するステップと、
（Ｄ２）電位を印加して、ｓｓ標的ポリヌクレオチドを放出するステップと
を含む方法に関する。
いくつかの実施形態では、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される単離用タグをさらに含み、方法は、ステップ（Ｄ２）の後にステップ（Ｄ３）：
（Ｄ３）単離用タグをリガンドに接合するステップ
をさらに含む。
リガンドを電磁ビーズにさらに接合するいくつかの実施形態では、ステップ（Ｄ３）は、
（Ｄ３−１）放出されたｓｓ被験ポリヌクレオチドを含む伝導性の塩溶液を除去するステップと、
（Ｄ３−２）放出されたｓｓ被験ポリヌクレオチドを、電磁ビーズに接合されたリガンドと混合することにより、単離用タグをリガンドに接合するステップと、
（Ｄ３−３）従来の単離法を使用して、放出されたｓｓ被験ポリヌクレオチドを単離するステップと
をさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（Ｄ３）の後に、ステップ（Ｄ４）
（Ｄ４）単離ｓｓ被験ポリヌクレオチドを、従来の方法を使用して（例えば、塩基性溶液を使用して）、ビーズから除去するステップと、
（Ｄ５）ＰＢ１およびＰＢ２を、ｓｓ被験ポリヌクレオチドから切断して、ｓｓ試料ポリヌクレオチドを創成するステップと
をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｄ５）は、エンドヌクレアーゼを使用して、ＰＢ１およびＰＢ２を切断することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｄ５）は、切断可能な部位において、ＰＢ１およびＰＢ２を切断することをさらに含む。
ある実施形態では、ステップ（Ｄ１）は、
（Ｄ１−１）ナノポアの温度を、ほぼ第２の温度以上であり、かつ第１の温度以下に変化させて、ＢＳ２を嵩高くない構造に転換するステップ
をさらに含む。
複数のナノポア型検出器を使用する、試料ポリヌクレオチドの配列決定、同定、濃縮、および単離
本発明の別の態様は、複数のナノポア型検出器を使用して、試料ポリヌクレオチドを配列決定、同定、濃縮、および単離する方法に関する。単一のナノポア型検出器に関して本明細書で記載される同じ方法は、複数のナノポア型検出器にも使用することができる。
ある実施形態では、複数のナノポアは、個別にアドレス可能であり、この場合、各ナノポアの電位は、個別に制御することができる。ナノポアの温度もまた、制御することができる。したがって、ナノポア内で検出されるｓｓ被験ポリヌクレオチド分子は、選択されたナノポアにおいて、ステップ（Ｄ１）〜（Ｄ３）を実行することにより、個別に放出することができる。
例えば、ナノポアアレイ（Ｎｉ、Ｎ２、・・・Ｎ１０と番号付けされた）において、各ナノポアには、本明細書で記載される方法に従うｓｓ被験ポリヌクレオチドがトラップされ、個々のポリヌクレオチドは、対応するナノポアＮ１、Ｎ２、・・・Ｎ１０におけるポリヌクレオチド１、ポリヌクレオチド２、・・・ポリヌクレオチド１０と番号付けされる。ポリヌクレオチド１およびポリヌクレオチド３だけの収集が所望である場合、ナノポアＮ１、Ｎ２、・・・Ｎ１０は、ポリヌクレオチド１およびポリヌクレオチド３だけを収集するように、個別に制御する（例えば、電位を印加して、ポリヌクレオチド１およびポリヌクレオチド３に、それぞれ、ナノポアＮ１およびＮ３から移動させることにより）ことができる。ある実施形態では、ポリヌクレオチド１、ポリヌクレオチド２、・・・ポリヌクレオチド１０のＢＳ２を、ナノポアを通して進みうる構造（例えば、ほぼ第２の温度以上である一方で、ほぼ第１の温度以下の温度とするか、またはナノポアを通して進みうるｓｓ構造を残すように切断されたＰＢ２のそれぞれ）に転換する。ナノポアＮ２、Ｎ４〜Ｎ１０の電位は、ポリヌクレオチド２、ポリヌクレオチド４〜ポリヌクレオチド１０のそれぞれをナノポアから放出する一方で、ポリヌクレオチド１およびポリヌクレオチド３はナノポアＮ１内およびＮ３内のそれぞれにおいて依然としてトラップされるように個別に制御する。次いで、ナノポアＮ１およびＮ３は、ポリヌクレオチド１およびポリヌクレオチド３のそれぞれを放出して、収集、濃縮、および／または単離するように個別に制御する。
タグにより核酸を配列決定するための方法およびシステム
ナノポアを使用して、間接的に、任意選択で、電気的検出により核酸分子を配列決定することができる。間接的な配列決定は、成長中の鎖内に組み込まれるヌクレオチドが、ナノポア内を通して通過しない任意の方法でありうる。核酸分子は、ナノポアから任意の適切な距離内および／またはナノポアの近傍を通過することが可能であり、任意選択で、ヌクレオチド組込みイベントから放出されるタグがナノポア内（例えば、図２Ｃおよび図２Ｄに示される）で検出されるような距離内を通過しうる。任意選択で、タグを、それが放出される前にナノポア（図２Ｄに示される）内にあらかじめロードする。タグによる核酸分子の配列決定の例は、参照によりその全体において組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１２／０８３２４９号において記載されている。
ヌクレオチド組込みイベントの副産物は、ナノポアにより検出することができる。「ヌクレオチド組込みイベント」とは、ヌクレオチドの、成長中のポリヌクレオチド鎖への組込みである。副産物は、所与の種類のヌクレオチドの組込みと相関しうる。ヌクレオチド組込みイベントは一般に、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素により触媒され、塩基対による鋳型分子との相互作用を使用して、各位置における組込みに利用可能なヌクレオチドを選択する。
核酸試料は、タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を使用して配列決定することができる。いくつかの例では、核酸分子を配列決定するための方法は、（ａ）タグ付けされたヌクレオチドを組み込む（例えば、重合化する）ステップであり、組み込まれると、個々のヌクレオチドと会合させたタグが放出されるステップと、（ｂ）ナノポアを一助として、放出されたタグを検出するステップとを含む。場合によって、方法は、個々のヌクレオチドに接合されるかまたは個々のヌクレオチドから放出されるタグを、ナノポアを通して方向付けるステップをさらに含む。放出または接合されたタグは、任意の適切な技法により、場合によって、酵素（または分子モータ）および／またはポア越しの電圧差を一助として方向付けることができる。代替的に、放出または接合されたタグは、酵素を使用せずにナノポアを通して方向付けることもできる。例えば、タグは、本明細書で記載される通り、ナノポア越しの電圧差により方向付けることができる。
本発明の方法、デバイス、およびシステムは、鋳型と相補的な、成長中の鎖へのヌクレオチドの組込み時などの個々のヌクレオチド組込みイベントを検出しうる。酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リガーゼ）により、ヌクレオチドを、成長中のポリヌクレオチド鎖に組み込むことができる。本明細書で提示される酵素（例えば、ポリメラーゼ）は、ポリマー鎖を創成しうる。
付加されるヌクレオチドは、成長中の鎖とハイブリダイズする、対応する鋳型核酸鎖と相補的でありうる（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））。ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリン酸（例えば、ガンマリン酸）部分、糖部分、または窒素性塩基部分を含むがこれらに限定されない、ヌクレオチドの任意の位置に連結されるタグ（またはタグ分子種）を含みうる。場合によって、タグは、ヌクレオチドタグの組込み時に、タグがポリメラーゼと会合している間に検出される。タグは、ヌクレオチドの組込みならびにその後のタグの切断および／または放出の後でタグがナノポアを通して移動するまで検出され続ける。場合によって、ヌクレオチド組込みイベントは、ナノポアを通して通過し、検出されるヌクレオチドから、タグを放出する。タグは、ポリメラーゼにより放出することもでき、限定なしに述べると、ポリメラーゼの近くに配置される酵素による切断を含む、任意の適切な形で切断／放出することもできる。固有のタグが、各種類のヌクレオチド（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシル）から放出されるため、このようにして、組み込まれた塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ）を同定することができる。いくつかの状況では、ヌクレオチド組込みイベントはタグを放出しない。このような場合の、組み込まれたヌクレオチドに連結されたタグは、ナノポアを一助として検出される。いくつかの例では、タグにナノポアを通してまたはナノポア近傍を移動させ、ナノポアを一助としてタグを検出する。
本発明の方法およびシステムは、所与の時間内に少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００、または１０００００の核酸塩基（「塩基」）の分解能などで、核酸組込みイベントの検出を可能としうる。いくつかの例では、ナノポアデバイスを、各イベントが個々の核酸塩基と関連する個々の核酸組込みイベントを検出するのに使用する。他の例では、ナノポアデバイスを、複数の塩基と関連するイベントを検出するのに使用する。例えば、ナノポアデバイスにより感知されるシグナルは、少なくとも２、３、４、または５塩基からのシグナルを組み合わせることが可能である。
場合によって、タグは、ナノポアを通して通過しない。タグは、ナノポアにより検出することが可能であり、ナノポアを通して通過することなしにナノポアから抜け出る（例えば、タグがナノポアに入る方向とは逆方向から抜け出る）ことが可能である。チップは、タグをナノポアから能動的に駆逐するように構成することができる。
場合によって、タグは、ヌクレオチド組込みイベント時に放出されない。場合によって、ヌクレオチド組込みイベントは、タグをナノポアに「提示する」（すなわち、タグを放出することを伴わない）。タグは、放出することなしに、ナノポアにより検出することができる。タグは、検出のためにタグをナノポアに提示するのに十分な長さのリンカーにより、ヌクレオチドに接合することができる。
ヌクレオチド組込みイベントは、リアルタイムで（すなわち、それらが生じるときに）、かつ、ナノポアを一助として検出することができる。場合によっては、ナノポアに接合されるかまたはこれに近接させた酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、ナノポアを通してまたはナノポアに隣接した核酸分子の流動を容易としうる。ヌクレオチド組込みイベントまたは複数のヌクレオチドの組込みは、ナノポアにより検出されうる、１または複数のタグ分子種（本明細書ではまた、「タグ」とも称する）を放出または提示しうる。検出は、タグが、ナノポアを通して流動するか、またはナノポアに隣接して流動するとき、タグがナノポア内に滞留するとき、および／またはタグがナノポアに提示されるときになされうる。場合によって、ナノポアに接合されるか、またはこれに近接させた酵素は、１または複数のヌクレオチドの組込み時において、タグを検出する一助となりうる。
本発明のタグは、原子の場合もあり、分子の場合もあり、原子または分子のコレクションの場合もある。タグは、光学的署名、電気化学的署名、磁気的署名、または静電的（例えば、誘導性、容量性の）署名をもたらすことが可能であり、これらの署名は、ナノポアを一助として検出することができる。
本明細書で記載される方法は、単一分子法でありうる。すなわち、検出されるシグナルは、単一の分子（すなわち、単一ヌクレオチドの組込み）により発生するものであり、複数のクローン分子から発生するものではない。方法は、ＤＮＡ増幅を要請しなくともよい。
ヌクレオチド組込みイベントは、複数のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ［式中、Ｎは、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）、またはウリジン（Ｕ）である］）を含む混合物から生じうる。ヌクレオチド組込みイベントは、必ずしも単一種類のヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ）を含む溶液から生じるわけではない。ヌクレオチド組込みイベントは、複数のヌクレオチド溶液の交替（例えば、ｄＡＴＰに続くｄＣＴＰに続くｄＧＴＰに続くｄＴＴＰに続くｄＡＴＰ）から生じるわけではない。場合によっては、複数のヌクレオチド（例えば、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＧ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ・・・などの二量体）が、リガーゼにより組み込まれる。
タグ付けされたヌクレオチド
場合によっては、タグ付けされたヌクレオチドは、ヌクレオチド組込みイベントにおいて切断することが可能であり、ナノポアを一助として検出することが可能なタグを含む。タグは、ヌクレオチドの５’−リン酸に接合することができる。場合によって、タグは、フルオロフォアではない。タグは、その電荷、形状、サイズ、またはこれらの任意の組合せにより検出可能でありうる。タグの例は、多様なポリマーを含む。各種類のヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）は一般に、固有のタグを含む。
タグは、ヌクレオチド上の任意の適切な位置に配置することができる。図２５は、タグ付けされたヌクレオチドの例を提示する。この図では、Ｒ１は一般に、ＯＨであり、Ｒ２は、Ｈ（すなわち、ＤＮＡの場合）またはＯＨ（すなわち、ＲＮＡの場合）であるが、他の修飾も許容可能である。図２５では、Ｘは、任意の適切なリンカーである。場合によって、リンカーは、切断可能である。リンカーの例は、限定なしに述べると、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、またはＣＨ２を含む。位置Ｚに適する化学基の例は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ３を含む。塩基は、核酸への組込みに適する任意の塩基であり、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはこれらの誘導体を含む。場合によってはまた、ユニバーサル塩基も許容可能である。
リン酸の数（ｎ）は、任意の適切な整数値（例えば、ヌクレオチドを核酸分子に組み込みうるような数のリン酸）である。場合によって、全ての種類のタグ付けされたヌクレオチドは、同じ数のリン酸を有するが、これは要請されない。いくつかの適用では、各種類のヌクレオチドについて異なるタグが存在するが、リン酸の数は、必ずしも多様なタグを識別するのに使用されるわけではない。しかし、場合によって、複数の種類のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、またはＵ）は、同じタグ分子を有し、１つのヌクレオチドを別のヌクレオチドから識別する能力は、少なくとも部分的にリン酸の数（多様な種類のヌクレオチドがｎに応じて異なる値を有する）により決定される。いくつかの実施形態では、ｎに応じた値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上である。
本明細書では、適切なタグが記載される。場合によって、タグは、化合物の残余における電荷と比べて符号が逆の電荷を有する。タグを接合すると、化合物全体の電荷は中性でありうる。タグの放出は、帯電したタグおよび帯電したヌクレオチドという２つの分子を結果としてもたらしうる。場合によって、帯電したタグは、ナノポアを通して通過し、検出される。
タグ付けされた適切なヌクレオチドのさらなる例を、図２６に示す。タグは、糖分子、塩基分子、またはこれらの任意の組合せに接合することができる。図１３を参照すると、Ｙは、タグであり、Ｘは、リンカー（任意選択で切断可能な）である。さらにまた、存在する場合、Ｒ１は一般に、ＯＨ、−ＯＣＨ２Ｎ３、または−Ｏ−２−ニトロベンジルであり、存在する場合、Ｒ２は一般に、Ｈである。Ｚもまた一般に、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ３であり、ｎは、１、２、３、または４を含む任意の整数である。場合によって、Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦＦ、またはＮＨである。
図２６への参照を続けると、各ｄＮＰＰ類似体における塩基の種類は一般に、他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々における塩基の種類と異なり、各ｄＮＰＰ類似体におけるタグの種類は一般に、他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々におけるタグの種類と異なる。適切な塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、もしくはチミン、またはこれら各々の誘導体を含むがこれらに限定されない。場合によって、塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、または５−メチルシトシンのうちの１つである。
Ｒ１が−Ｏ−ＣＨ２Ｎ３である場合、方法は、−ＣＨ２Ｎ３を除去し、３’位に接合されたＯＨ基を結果としてもたらし、これにより、さらなるｄＮＰＰ類似体の組込みを可能とするように、任意選択で、組み込まれたｄＮＰＰ類似体を処理するステップをさらに含む。
Ｒ１が−Ｏ−２−ニトロベンジルである場合、方法は、−２−ニトロベンジルを除去し、３’位に接合されたＯＨ基を結果としてもたらし、これにより、さらなるｄＮＰＰ類似体の組込みを可能とするように、任意選択で、組み込まれたヌクレオチド類似体を処理するステップをさらに含む。
タグの例
タグは、ナノポア内で検出することが可能な任意の化学基または分子でありうる。場合によって、タグは、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪族酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはこれらの組合せのうちの１または複数を含む。
タグは、化合物中のリン酸の数を釣り合わせるのに適する数のリシンまたはアルギニンをさらに含むこともまた想定される。
場合によって、タグは、ポリマーである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリマーの例であり、以下の構造：
Figure 0006333179
 を有する。
任意の数のエチレングリコール単位（Ｗ）を使用することができる。場合によって、Ｗは、０〜１００の間の整数である。場合によって、エチレングリコール単位の数は、ヌクレオチドの各種類に応じて異なる。ある実施形態では、４種類のヌクレオチドは、１６、２０、２４、または３６エチレングリコール単位を有するタグを含む。場合によって、タグは、クマリンベースの色素など、さらなる同定可能部分をさらに含む。場合によっては、ポリマーを帯電させる。場合によっては、ポリマーを帯電させず、タグを、高濃度（例えば、３〜４Ｍ）の塩中で検出する。
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、指定された数の炭素原子を有する分枝状および直鎖状両方の飽和脂肪族炭化水素基を含み、置換されていない場合もあり、置換されている場合もある。本明細書で使用される「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素間二重結合を含有する、直鎖状または分枝状の非芳香族炭化水素ラジカルを指し、最大可能数までの非芳香族炭素間二重結合を存在させることが可能であり、置換されていない場合もあり、置換されている場合もある。「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素間三重結合を含有する、直鎖状または分枝状の炭化水素ラジカルを指し、最大可能数までの非芳香族炭素間三重結合を存在させることが可能であり、置換されていない場合もあり、置換されている場合もある。「置換された」という用語は、正常な価数が維持され、置換（複数可）が、安定的な化合物を結果としてをもたらすことを条件として、その中に含有される水素原子への少なくとも１つの結合を、水素以外の原子または炭素以外の原子への結合で置きかえたアルキルまたはヒドロカルビルなど、上記で記載した官能基を指す。置換基はまた、炭素原子（複数可）または水素原子（複数可）への１または複数の結合を、ヘテロ原子への二重結合または三重結合を含む１または複数の結合で置きかえた基も含む。
タグを接合するための方法
任意の適切なタグを接合するための方法を使用することができる。例として述べると、タグは、（ａ）環式トリメタリン酸の生成を可能とする条件下で、ヌクレオチド三リン酸を、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルホルムアミドと接触させるステップと、（ｂ）−ＯＨまたは−ＮＨ２による官能化化合物を形成するように、ステップａ）から結果として生じる生成物を、求核試薬と接触させるステップと、（ｃ）タグが末端のリン酸に間接的に結合し、これにより、ヌクレオチド三リン酸類似体を形成することを可能とする条件下で、ステップｂ）の生成物を、−ＣＯＲ基をそれに接合したタグと反応させるステップとにより末端のリン酸に接合することができる。
場合によって、求核試薬は、Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＮＨ２、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＯＨ、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＮＨ２、または
Figure 0006333179
 である。
場合によって、方法は、ステップｂ）において、ステップａ）から結果として生じる生成物を、構造：
Figure 0006333179
 を有する化合物と接触させ、構造：
Figure 0006333179
 を有する化合物を形成するように、生成物を、ＮＨ４ＯＨと逐次的または共時的に接触させるステップを含む。次いで、タグが、末端のリン酸に間接的に結合し、これにより、構造：
Figure 0006333179
 ［式中、Ｒ１は、ＯＨであり、Ｒ２は、ＨまたはＯＨであり、塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリン、または５−メチルピリミジンである］を有するヌクレオチド三リン酸類似体を形成することを可能とする条件下で、ステップｂ）の生成物を、−ＣＯＲ基をそれに接合したタグと反応させることができる。
タグの放出
タグは、任意の形で放出することができる。場合によっては、タグを、ポリリン酸（例えば、図２５）に接合し、ヌクレオチドを核酸分子に組み込む結果として、タグをそれに接合したポリリン酸の放出をもたらす。組込みは、任意選択でナノポアに接合された少なくとも１つのポリメラーゼにより触媒することができる。場合によって、少なくとも１つのホスファターゼ酵素もまた、ポアに接合することができる。ホスファターゼ酵素は、タグをポリリン酸から切断して、タグを放出することが可能である。場合によっては、ポリメラーゼ反応においてポリメラーゼにより生成するピロリン酸が、ポアに入る前にホスファターゼ酵素と相互作用するように、ホスファターゼ酵素を配置する。
場合によっては、タグを、ポリリン酸に接合しない（例えば、図２６を参照されたい）。これらの場合には、タグを、任意選択で切断可能なリンカー（Ｘ）により接合する。切断可能にキャップされ、かつ／または切断可能に連結されたヌクレオチド類似体を生成するための方法は、参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６６４，０７９号において開示されている。リンカーは、切断可能でなくともよい。
リンカーは、任意の適切なリンカーであることが可能であり、任意選択では、任意の適切な形で切断することができる。リンカーは、光切断型でありうる。ある実施形態では、ＵＶ光を、光化学的に切断可能なリンカーおよび部分を光化学的に切断するのに使用する。ある実施形態では、光切断型リンカーは、２−ニトロベンジル部分である。
−ＣＨ２Ｎ３基は、それをｄＮＰＰ類似体またはｒＮＰＰ類似体の３’Ｏ原子からを除去し、これにより、３’ＯＨ基を創出するように、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で処理することができる。
タグの検出
場合によっては、ポリメラーゼにより、複数の異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、および／またはＵ）を含むタグ付けされたヌクレオチドのプールからの抜き出しがなされる。また、ポリメラーゼを、多様な種類のタグ付けされた塩基と繰り返し接触させることも可能である。この場合には、各種類のヌクレオチドが固有の塩基を有することが必要でない場合もあり、異なる塩基種類の間でサイクリングすると、工程に費用および複雑性がかさむにもかかわらず、場合によっては、この実施形態も本発明に包摂される。
図２７は、いくつかの実施形態では、タグ付けされたヌクレオチドを核酸分子に組み込むこと（例えば、ポリメラーゼを使用して、鋳型と対合させたプライマー塩基を伸長させて）により、検出可能なタグ−ポリリン酸を放出させうることを示す。場合によって、タグ−ポリリン酸は、それがナノポアを通して通過するときに検出される。いくつかの実施形態では、タグ−ポリリン酸は、それがナノポア内に存在するときに検出される。
場合によって、方法は、ポリリン酸を含むリン酸の数に基づき、ヌクレオチドを識別する（例えば、タグが同一である場合でもなお）。にもかかわらず、各種類のヌクレオチドは一般に、固有のタグを有する。
タグ−ポリリン酸化合物は、タグをナノポアに通過させ、かつ／またはタグにナノポアを通して通過させ、イオン電流を測定する前に、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）で処理することができる。
タグは、ヌクレオチドから放出された後、ナノポアを通して流動しうる。場合によっては、電圧を印加して、タグをナノポアを通して引き寄せる。放出されたタグのうちの少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または少なくとも９９．９９％は、ナノポアを通して移動しうる。
場合によって、タグは、それらが検出される時間にわたりナノポア内に滞留する。場合によっては、電圧を印加して、タグをナノポア内に引き寄せて、タグを検出し、タグをナノポアから駆逐し、またはこれらの任意の組合せを行う。タグは、ヌクレオチド組込みイベント時に放出することもでき、ヌクレオチドになお結合させておくこともできる。
タグは、その電荷のために、ナノポア内で（少なくとも部分的に）検出することができる。場合によって、タグ化合物は代替的に、第１の正味電荷を有し、化学反応、物理学的反応、または生物学的反応の後、異なる第２の正味電荷を有する帯電化合物でもある。場合によって、タグにおける電荷の大きさは、化合物の残余における電荷の大きさと同じである。ある実施形態では、タグは正の電荷を有し、タグを除去することにより、化合物の電荷は変化する。
場合によっては、タグは、ナノポア内に通過し、かつ／またはナノポアを通して通過するときに、電子的変化を発生させうる。場合によって、電子的変化は、電流振幅の変化、ナノポアの伝導度の変化、またはこれらの任意の組合せである。
ナノポアは、生物学的ナノポアの場合もあり、合成ナノポアの場合もある。ポアが、タンパク質性である、例えば、アルファヘモリシンタンパク質であることもまた想定される。合成ナノポアの例は、固体状態のポアまたはグラフェンである。
場合によっては、ポリメラーゼ酵素および／またはホスファターゼ酵素を、ナノポアに接合する。融合タンパク質またはジスルフィド架橋は、タンパク質性ナノポアに接合するための方法の例である。固体状態ナノポアの場合、ナノポア近くの表面への接合は、ビオチン−ストレプトアビジン連結を介することが可能である。例として述べると、ＤＮＡポリメラーゼは、自己アセンブルしてアミノ基で官能化されたアルカンチオール単層であって、ＤＮＡポリメラーゼ上のアミノ基に接合するために、アミノ基をＮＨＳエステルに修飾したアルカンチオール単層により修飾された金表面を介して固体表面に接合する。
方法は、任意の適切な温度で実施することができる。いくつかの実施形態では、温度は、４℃〜１０℃の間である。いくつかの実施形態では、温度は、周囲温度である。
方法は、任意の適する溶液中および／または緩衝液中で実施することができる。場合によって、緩衝液は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳでｐＨ７．０〜８．０に緩衝処理された３００ｍＭのＫＣｌである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、二価カチオンを含まない。場合によっては、方法は、二価カチオンの存在の影響を受けない。
両方の核酸鎖の配列決定
二本鎖核酸分子（例えば、デオキシリボ核酸）は、周知の塩基対相互作用（例えば、ＡはＴと相互作用し、ＧはＣと相互作用する）に従いハイブリダイズする（例えば、互いと結合する）センス鎖およびアンチセンス鎖を有しうる。場合によって、センス鎖とアンチセンス鎖とは、周知のアルファ螺旋の立体構成において互いに巻きつきあう。一般に、センス鎖は、大半の生物により使用される周知のコドンに従いアミノ酸をコードする（例えば、５’〜３’方向に、ＴＣＡは一般に、アミノ酸であるセリン・・・などをコードする）鎖である。しかし、どちらの鎖がセンス鎖であり、どちらがアンチセンス鎖であるかの指示は、恣意的でありうる。全ての核酸がタンパク質をコードするわけではない。
本明細書では、アンチセンス鎖（例えば、３’→５’方向）の核酸配列を使用して、センス鎖（例えば、５’→３’方向）の配列を決定および／または検証しうる（例えば、公知の塩基対相互作用のために）ことが認識される。さらにまた、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を配列決定して、二本鎖核酸分子の配列を決定することは、ある種の利点も有しうる。場合によっては、センス鎖またはアンチセンス鎖の配列を決定することがより容易でありうる（例えば、任意の理由または未知の理由（例は、（ａ）一方の鎖は、他の鎖により形成されない二次構造を形成しうること、または（ｂ）一方の鎖からのシグナルは、比較的強く、かつ／または他の鎖からのシグナルよりよく分解されることを含むがこれらに限定されない）で）。一方の鎖から得られる配列シグナルおよび／または配列情報は、他の鎖から得られる配列シグナルおよび／または配列情報と相補的でありうる（例えば、一方の鎖上でたやすく分解されない塩基は、他の鎖上でたやすく分解することができる）。
核酸分子は、多様な種類の突然変異および／またはミスマッチを有しうる。例えば、塩基対のミスマッチは、任意の数の塩基位置（例えば、１、２、３、４、５、６、７以上の）が、２つの鎖の間（例えば、センス鎖上のＡとアンチセンス鎖上のＧとの間）で相補的でない場所に存在しうる。場合によって、一方の鎖は、他の鎖と比べて塩基位置の挿入または欠失を有しうる（例えば、センス鎖は、アンチセンス鎖と塩基対合させない配列ＡＣＣＴＣＧＡＴを有する）。センス鎖とアンチセンス鎖とは、欠失および／または挿入から５’方向、欠失および／または挿入から３’方向、または両方の方向に塩基対合させることができる。場合によって、二本鎖核酸分子は、鎖のうちの一方だけにおいて見出される情報（例えば、メチル化塩基などのエピジェネティックマーカー）を含有しうる。この場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を配列決定して、エピジェネティック情報（例えば、メチル化塩基）を検出することができる。
本明細書では、ナノポアを使用して、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を配列決定するための方法が提示される。センス鎖およびアンチセンス鎖の末端は、併せてライゲーションして、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有する、配列決定される一本鎖核酸分子を形成することができる。一本鎖核酸分子は、ナノポアを通して通過させる（例えば、図２Ｂに示す通り）ことにより配列決定することもでき、タグ分子が検出されるナノポアに隣接して通過させる（例えば、図２Ｃおよび図２Ｄに示される）ことにより配列決定することもできる。
ある態様では、核酸分子またはその一部分を配列決定するための方法は、（ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子を用意するステップと、（ｂ）第１の核酸セグメントを、センス鎖とアンチセンス鎖が連結する二本鎖核酸分子の第１の末端にライゲーションするステップと、（ｃ）二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離させて、前記センス鎖のセンス部分および前記アンチセンス鎖のアンチセンス部分を含む分子をもたらすステップと、（ｄ）一本鎖核酸分子に、電極に隣接または近接して配置される膜内のナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過させるステップと、（ｅ）電極を使用して、一本鎖核酸分子に、ナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過させる間に、電流の測定値を得るステップと、（ｆ）二本鎖核酸の配列を、（ｅ）で得られた電流の測定値から決定するステップとを含む。電極は、一本鎖核酸分子がナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過するときの電流を検出するように適合されていてもよい。
第１の核酸セグメントは、核酸ヘアピン（例えば、図２８のリンカー区間）を有しうる。ヘアピンは、塩基対合させた（二本鎖）核酸を含むヘアピン二重鎖（ＨＤ）の２つのセグメントの間に配置される、塩基対合させないヘアピン構造を有しうる。第１の核酸セグメントは、第１の識別子をさらに含みうる。第１の識別子により、二本鎖核酸分子がどの試料に由来するのかを同定することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、第２の核酸セグメントを、二本鎖核酸の第２の末端（例えば、図２８の嵩高前区間）にライゲーションするステップをさらに含む。場合によって、第２の核酸セグメントは、ナノポア内に一本鎖核酸分子をトラップすることが可能である一部分（例えば、第１の嵩高前構造および／または第２の嵩高前構造）を含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸セグメントは、ある温度未満で（例えば、温度が、約６０℃を下回るか、約５０℃を下回るか、約４０℃を下回るか、約３０℃を下回るか、約２０℃を下回るか、約１０℃を下回るか、約０℃を下回るか、または約−１０℃を下回る場合）は、ナノポア内に一本鎖核酸分子をトラップすることが可能である。いくつかの実施形態では、第２の核酸セグメントは、第２の識別子（例えば、一本鎖核酸分子が、ナノポアを通して第１の向きに通過するのか、第２の向きに通過するのかを決定するのに使用することが可能な）を含む。
場合によって、一本鎖核酸分子の、ナノポアを通してまたはナノポア近傍の通過速度は、本明細書で記載される１または複数の減速バンプ分子を一助として減速される。電流の測定値は、一本鎖核酸分子の通過速度が減速されるときに得ることができる。いくつかの実施形態では、電流の測定は、ナノポア越しに、かつ／または膜越しに印加される複数の電圧下で行う。場合によって、前記１または複数の減速バンプ分子のうちの個々の減速バンプ分子は、リボ核酸を含む。
ある態様では、本発明は、ナノポア型検出器ならびに試料ポリヌクレオチド構造およびそのアンチセンスポリヌクレオチドの両方を含む被験ポリヌクレオチドを使用して、試料ポリヌクレオチドの配列情報および／または構造情報を得るための方法を対象とする。被験ポリヌクレオチドは、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントにより、滞留時間にわたり、ナノポア内にトラップすることができる。この滞留時間において、複数の電圧を有する電位を含む、一定の電位プロファイルまたは変化する電位プロファイルを、ナノポア型検出器の電極に印加し、電気シグナルのセットを得る。電位は、波形（例えば、図２９に示される波形）に従い変化させることができる。一定の電位プロファイル下または変化する電位プロファイル下で収集される電気シグナルは、被験ポリヌクレオチドの流動方向で、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある配列および／または構造の情報をもたらしうる。ナノポアおよび／または被験ポリヌクレオチドの性格に応じて、試料ポリヌクレオチドの異なる配列および／または構造から収集される電気シグナルは、高度な信頼性で分解するのが困難でありうる。しかし、試料ポリヌクレオチドおよび対応するアンチセンスポリヌクレオチドから収集された電気シグナルをまとめることにより、試料ポリヌクレオチド内の配列および／または構造を分解するときの信頼性を改善することができる。試料ポリヌクレオチドおよび対応するアンチセンスポリヌクレオチドを同じナノポア内で特徴付けることからもまた、シグナルを同じナノポアからほぼ同時に収集することにより、システムエラーを減少させることができる。既往の方法では、試料ポリヌクレオチドだけを解析する。したがって、試料ポリヌクレオチドおよびそのアンチセンスポリヌクレオチドの読取りから収集される電気シグナルは、現在利用可能な方法より信頼でき、正確な試料ポリヌクレオチドの配列および／または構造の決定をもたらしうる。
本発明の一態様は、試料の構造情報を得る方法であって、
（Ｆ１）第１の末端および第２の末端を有するｄｓ試料区間であり、
一本鎖（ｓｓ）試料ポリヌクレオチドおよびそのｓｓアンチセンスポリヌクレオチド、
第１の末端でｓｓ試料ポリヌクレオチドとｓｓアンチセンスポリヌクレオチドとを連結するリンカー、ならびに
各々が第２の末端でセンスポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドに連結される第１の嵩高前構造および第２の嵩高前構造
を含むｄｓ試料区間を含む二本鎖（ｄｓ）被験ポリヌクレオチドを調製するステップと、
（Ｆ２）Ａ１のｄｓ被験ポリヌクレオチドを、一方の末端に第１の嵩高前構造を有し、他方の末端に第２の嵩高前構造を有する、ｓｓ被験ポリヌクレオチドに変性させるステップと、
（Ｇ１）第１の条件で、第１の嵩高前構造から第１の嵩高い構造（ＢＳ１）を形成するステップと、
（Ｇ２）任意選択で、ＢＳＨにより、ナノポアの狭窄領域の前で、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、電位を印加して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドにナノポア型検出器のナノポアを通して流動させるステップと、
（Ｇ３）第２の条件で、第２の嵩高前構造から第２の嵩高い構造（ＢＳ２）を形成するステップと、
（Ｇ４）任意選択で、ＢＳＬにより、ナノポアの狭窄領域の前で、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、別の電位を印加して、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動を反転させるステップと、
（Ｇ５）ストッパをｓｓ被験ポリヌクレオチドと接触させて、第１のストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントを含む被験ポリヌクレオチド複合体を形成するステップと、
（Ｇ６）ナノポアの狭窄領域の前で、第１のストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、別の電位を印加して、被験ポリヌクレオチド複合体にナノポアを通して流動させるステップと、
（Ｇ７）第１のストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させるときに、複数の電圧を有する電位を含む、一定の電位プロファイルまたは変化する電位プロファイルを、ナノポア型検出器の電極に印加し、第１の電気シグナルのセットを得るステップと、
（Ｇ８）第１の電気シグナルのセットを、ステップ（Ｇ７）における同じ電位プロファイル下で、被験ポリヌクレオチドの流動方向で、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある公知の構造について収集された電気シグナルと比較することにより、被験ポリヌクレオチドの流動方向で、第１のストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある構造を決定するステップと、
（Ｇ９）第１のストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントを解離させ、ポリヌクレオチドのナノポアを通しての流動を持続させるステップと、
（Ｇ１０）ＢＳＨまたはＢＳＬにより、ｓｓ被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、ステップ（Ｇ５）〜（Ｇ９）を反復するステップと、
（Ｇ１１）任意選択で、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、・・・または１００回にわたり、ステップ（Ｇ４）〜（Ｇ１０）を反復するステップと、
（Ｇ１２）試料ポリヌクレオチドおよびそのアンチセンスポリヌクレオチドの両方について収集されたヌクレオチドの配列情報を重ね合せることにより、試料ポリヌクレオチド配列を構築するステップと
を含む方法に関する。
ある実施形態では、第１の嵩高前構造および第２の嵩高前構造のいずれも、ポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチドによる嵩高前構造である。第１の嵩高前構造は、第１の温度で、対応する第１の嵩高い構造を形成する。第２の嵩高前構造は、第２の温度で、対応する第２の嵩高い構造を形成する。そして、第１の温度は、第２の温度より高い。
別の実施形態では、第１の嵩高前構造は、第１の嵩高前構造に対して特異的なリガンドとの相互作用を介して第１の嵩高い構造を形成する、ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドによる嵩高前構造である。ある実施形態では、第１の嵩高い構造の形成は、温度に依存しない。第２の嵩高前構造は、嵩高前構造と対応する嵩高い構造との転換が温度依存的であるような第２の嵩高前構造でありうる。
ある実施形態では、ビオチン修飾されたポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドを含む第１の嵩高前構造は、ビオチン／ストレプトアビジン間相互作用を介するストレプトアビジンへの結合を介して、第１の嵩高い構造を形成する。第１の嵩高い構造の形成は、温度に依存しない場合がある。
図２８を参照すると、ある実施形態では、本明細書で記載されるｄｓ被験ポリヌクレオチドは、試料ポリヌクレオチド、試料ポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチド）、試料ポリヌクレオチドとそのアンチセンスポリヌクレオチドとを連結するリンカー（区間Ｉ３−ＨＤ−ヘアピン−ＨＤ’−Ｉ３’）、第１の嵩高前構造、第２の嵩高前構造、適正な第１の嵩高い構造の形成を指し示す第１の方向識別子（ＤＩ１）を含む（図２８）。区間Ｉ２、Ｉ３、Ｉ２’、およびＩ３’の各々は、任意選択で、１または複数の本明細書で記載される識別子を含む。ＨＤ１とＨＤ１’とは併せて、ポリヌクレオチド二重鎖である。区間ＤＩ−１は、第１の方向識別子を含み、任意選択で、１または複数の他の識別子を含む。区間ＬＩは、低温の方向識別子を含み、任意選択で、１または複数の他の識別子を含む。区間Ｉ２−ＨＩは、区間Ｉ２’−ＬＩと完全に相補的な場合もあり、完全には相補的でない場合もあるが、少なくともその一部分は、二重鎖構造を形成する。区間Ｉ２−ＨＩとＩ２’−ＬＩとの間の二重鎖区間は、ｄｓ試料ポリヌクレオチド区間の末端と近接することが可能であり、より好ましくは隣接することが可能である（図２８）。ｄｓ被験ポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の従来の変性法により（例えば、熱により）、ｓｓ被験ポリヌクレオチドに転換することができる。
試料ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合もあり、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合もあり、アンチセンスポリヌクレオチドは、試料ポリヌクレオチドと相補的なＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドである。リンカー区間は、試料二重鎖区間の第１の末端において、（ａ）試料ポリヌクレオチドの３’末端とアンチセンス試料ポリヌクレオチドの５’末端とを連結することにより、かつ／または（ｂ）試料ポリヌクレオチドの５’末端とアンチセンス試料ポリヌクレオチドの３’末端とを連結することにより、試料ポリヌクレオチドとアンチセンス試料ポリヌクレオチドとを連結する。
ある実施形態では、被験ポリヌクレオチドは、１〜約１０，０００塩基、１〜約１，０００塩基、１〜約５００塩基、１〜約３００塩基、１〜約２００塩基、１〜約１００塩基、約５〜約１０，０００塩基、約５〜約１，０００塩基、約５〜約５００塩基、約５〜約３００塩基、５〜約２００塩基、５〜約１００塩基、１０〜約１０，０００塩基、１０〜約１，０００塩基、１０〜約５００塩基、１０〜約３００塩基、１０〜約２００塩基、１０〜約１００塩基、２０〜約１０，０００塩基、２０〜約１，０００塩基、２０〜約５００塩基、２０〜約３００塩基、２０〜約２００塩基、２０〜約１００塩基、３０〜約１０，０００塩基、３０〜約１，０００塩基、３０〜約５００塩基、３０〜約３００塩基、３０〜約２００塩基、３０〜約１００塩基、３０〜約５０塩基、５０〜約１０，０００塩基、５０〜約１，０００塩基、５０〜約５００塩基、５０〜約３００塩基、５０〜約２００塩基、または５０〜約１００塩基を有する。
ストッパは、本明細書で記載される減速バンプ（例えば、オリゴヌクレオチド）であることが可能であり、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される方法における減速バンプが結合するｓｓポリヌクレオチド区間を含みうる。いくつかの実施形態では、被験ポリヌクレオチドは、被験ＤＮＡまたは被験ＲＮＡであり、減速バンプは、ＤＮＡ減速バンプまたはＲＮＡ減速バンプである。減速バンプの長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６、好ましくは１０以下、８以下、６以下、および４以下でありうる。減速バンプは、ユニバーサルヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、本源性ヌクレオチド、これらの修飾、およびこれらの組合せからなる群から選択される１または複数のヌクレオチドを含みうる。ユニバーサルヌクレオチドおよび本源性ヌクレオチドの修飾は、核酸塩基構造、骨格構造（例えば、グリコールヌクレオチド、モルホリノ、およびロックドヌクレオチド）、およびこれらの組合せにおける修飾を含む。別の好ましい実施形態では、減速バンプの骨格構造は、指定された位置（複数可）、ランダムな位置、またはこれらの組合せにおいて修飾される（例えば、グリコールヌクレオチド、モルホリノ、およびロックドヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、減速バンプ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対は、部分的または完全にナノポア内にある可能性があり、ステップ（Ｇ７）で得られる電気シグナルに寄与する。したがって、ステップ（Ｇ８）は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で、減速バンプ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対の構造情報を得ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、全ての本源性核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）と塩基対合するユニバーサルヌクレオチドを、５’末端および／または３’末端に有する減速バンプを構築して、減速バンプ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対の寄与を標準化し、シグナルの解析をより容易とすることが好ましい。
いくつかの実施形態では、全ての本源性核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）と塩基対合するユニバーサルヌクレオチドを、５’末端および／または３’末端に有する減速バンプを構築して、減速バンプ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対の寄与を標準化し、シグナルの解析をより容易とすることが好ましい。
ストッパは、ｓｓ被験ポリヌクレオチドとプライマーとのハイブリダイゼーションにより創出される二重鎖区間においてｓｓ被験ポリヌクレオチドに結合し、任意選択で、ｓｓ被験ポリヌクレオチドにナノポアを通して移動させ、読取り工程の間、ポア内で被験ポリヌクレオチドと会合して滞留することにより、または、被験ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の単一ヌクレオチドが伸長した後で解離し、その後、新たに創出された試料／アンチセンス二重鎖をポア内に挿入して、既往の二重鎖の試料鎖による読取りとは異なる１つの塩基を読み取ることにより、被験ポリヌクレオチドの読取りをもたらす酵素でありうる。このような酵素の例は、限定なしに述べると、Ｋｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ ｍｉｎｕｓ；Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ；Ｐｈｉ２９−ｅｘｏ ｍｉｎｕｓポリメラーゼ；Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素；およびＴ７ Ｇｐ４ａヘリカーゼを含む。
いくつかの実施形態では、ストッパは、酵素であり、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、酵素がｓｓ被験ポリヌクレオチドに結合するための酵素結合部位をさらに含む。図２８を参照すると、このような酵素結合部位は、全ての試料ポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを、ナノポアにより特徴付けうることを確保するために、区間ＤＩ１、ＤＩ２、Ｉ２、またはＩ２’に存在することが可能であり、好ましくはＤＩ１、またはＩ２に存在しうる。
いくつかの実施形態では、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対は、部分的または完全にナノポア内にある可能性があり、ステップ（Ｇ７）で得られる電気シグナルに寄与し、したがって、ステップ（Ｇ８）は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、全ての本源性核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）と塩基対合するユニバーサルヌクレオチドを有するストッパを構築して、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対を形成し、シグナルの解析をより容易とすることが好ましい。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｇ８）において決定される、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある構造は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０〜５０塩基、５０〜１００塩基、１００〜２００塩基、２００〜５００塩基の配列、または５００塩基を超える配列である。いくつかの実施形態では、ステップ（Ｇ８）において決定される、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある構造は、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０位、またはこれらの組合せなど、１〜５０位にある任意のヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｇ７）において印加される電位プロファイルは、約１６０ｍＶ〜約−１６０ｍＶ、約１６０ｍＶ〜約０ｍＶ、約１６０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約１００ｍＶ〜約０ｍＶ、１００ｍＶ〜約８０ｍＶ、または８０ｍＶ〜約７０ｍＶの電圧を有する一定の電位プロファイルである。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｇ７）において印加される電位プロファイルは、各々がある時間にわたり印加される２つ以上の電圧を有する電位を含む、変化する電位プロファイルである。いくつかの実施形態では、変化する電位プロファイルは、ステップ（Ｇ６）の間に、またはステップ（Ｇ６）において、ストッパ−被験ポリヌクレオチド複合体を、ナノポア内で失速させるか、減速するか、もしくは停止させた後で、結果として得られる１または複数の電位を含む。印加される２つ以上の電位のうちの少なくとも２つの電位には、約１ｍＶ、５ｍＶ、１０ｍＶ、または３０ｍＶを超える電位差がある。ある実施形態では、電位は、約１６０ｍＶ〜約−１６０ｍＶ、約１６０ｍＶ〜約０ｍＶ、約１６０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約１００ｍＶ〜約０ｍＶ、１００ｍＶ〜約８０ｍＶ、または８０ｍＶ〜約７０ｍＶの電圧を有する。各電位の時間は、少なくとも約５マイクロ秒、少なくとも約１０マイクロ秒、少なくとも約５０マイクロ秒、少なくとも約１００マイクロ秒、少なくとも約５００マイクロ秒、少なくとも約１ミリ秒、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約５０ミリ秒、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約５００ミリ秒、少なくとも約１秒、または少なくとも約２秒でありうる。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｇ７）において印加される、変化する電位プロファイルは、ある時間にわたり第１の電位から第２の電位に変化する電位ランプを含む。いくつかの実施形態では、変化する電位プロファイルは、ステップ（Ｇ６）の間に、またはステップ（Ｇ６）において、ストッパ−被験ポリヌクレオチド複合体を、ナノポア内で失速させるか、減速するか、もしくは停止させた後で、結果として得られる１または複数の電位を含みうる。例えば、変化する電位プロファイルの第１の電位は、ステップ（Ｇ６）の間に、またはステップ（Ｇ６）において、ストッパ−被験ポリヌクレオチド複合体を、ナノポア内で失速させるか、減速するか、もしくは停止させた後で、結果として得られる電位でありうる。変化する電位プロファイルの最高電位と最低電位との電位差は、約１ｍＶ、５ｍＶ、１０ｍＶ、２０ｍＶ、または３０ｍＶを超える。別の実施形態では、第１の電位は、約１６０ｍＶであり、第２の電位は、約−１６０ｍＶである。ある実施形態では、第１の電位は、約１６０ｍＶであり、第２の電位は、約６０ｍＶである。別の実施形態では、第１の電位は、約１００ｍＶであり、第２の電位は、約０ｍＶである。別の実施形態では、第１の電位は、約１６０ｍＶであり、第２の電位は、約０ｍＶである。別の実施形態では、第１の電位は、約１００ｍＶであり、第２の電位は、約８０ｍＶである。別の実施形態では、第１の電位は、約１００ｍＶであり、第２の電位は、約９０ｍＶである。別の実施形態では、第１の電位は、約９０ｍＶであり、第２の電位は、約８５ｍＶである。所定の時間は、少なくとも約５マイクロ秒、少なくとも約１０マイクロ秒、少なくとも約５０マイクロ秒、少なくとも約１００マイクロ秒、少なくとも約５００マイクロ秒、少なくとも約１ミリ秒、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約５０ミリ秒、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約５００ミリ秒、少なくとも約１秒、または少なくとも約２秒である。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｇ７）において印加される、変化する電位プロファイルは、第１の電位から第２の電位から第３の電位など複数の電位に変化する電位波形であって、全体で、印加される、変化する電位波形を形成する電位波形を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｇ７）は、少なくとも０．１Ｍの塩を有する溶液中で実施する。塩は、塩化物塩、リン酸塩、硝酸塩、および硫酸塩からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｇ７）は、ｐＨが約６．５〜約８．５または約７〜約８である溶液中で実施する。このようなｐＨをもたらしうる任意の緩衝液を使用することができる。例は、限定なしに述べると、ＨＥＰＥＳ緩衝液を含む。
いくつかの実施形態では、ナノポアは、アルファヘモリシンのナノポアまたはＭｓｐＡのナノポアである。
いくつかの実施形態では、ナノポア型検出器は、絶縁表面内に埋め込まれた少なくとも１つの金属製電極を含む。金属電極の材料の例は、限定なしに述べると、銀、塩化銀、白金、金、ルテニウム、およびニッケルを含む。絶縁表面の材料の例は、限定なしに述べると、プラスチック材料（例えば、テフロン（登録商標））、ガラス、または半導体材料（例えば、ケイ素、ゲルマニウム、およびガリウム）を含む。いくつかの実施形態では、生物学的分子の絶縁表面への接合を容易とする当技術分野で公知の方法を使用して、絶縁表面を、疎水性および脂溶性となるようにさらに修飾する。例えば、６〜２０炭素長の鎖を含有するシラン分子（例えば、オクタデシル−トリクロロシラン、オクタデシル−トリメトキシシラン、またはオクタデシル−トリエトキシシラン）またはＤＭＯＣによるさらなるシラン処理は、ケイ素表面上の二酸化ケイ素表面上で施すことができる。
ある実施形態では、ステップ（Ｇ７）における被験ポリヌクレオチドの流動方向で、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある構造は、試料ポリヌクレオチドおよびそのアンチセンスポリヌクレオチド内の対応する相補的な構造から集められた情報に従い決定することができる。したがって、情報を、試料ポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方から集めることにより、読取りの信頼性および精度を改善する。さらにまた、いくつかの実施形態では、ステップ（Ｇ７）において類似のシグナルをもたらすある種の構造は、アンチセンスポリヌクレオチド内の対応する相補的な構造により、互いからさらに差別化することもできる。
一例では、被験ポリヌクレオチドの流動方向で、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある構造の単一ヌクレオチドの差違は、ステップ（Ｇ７）において特徴付けることができる。ＣおよびＴは、高度な信頼性（＞約９７％の信頼性、＞約９９％の信頼性であり、好ましくは＞９９．５％の信頼性）で決定することができる。ＧおよびＡは、低度の信頼性（約９０〜９５％の信頼性）で特徴付けることができる。ＧおよびＡの相補的構造は、それぞれ、ＣおよびＴである。したがって、試料ＤＮＡおよびアンチセンス鎖の両方においてＣおよびＴを決定することにより、試料ＤＮＡだけから収集される情報により４つのヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧの全てを決定する場合（約９５％の信頼性）より高度な信頼性（＞９９％の信頼性、好ましくは＞９９．５％の信頼性）で、試料ＤＮＡの構造がもたらされる。いくつかの実施形態では、ナノポアは、アルファヘモリシンのナノポアであり、特徴付けられるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、ステップ（Ｇ６〜Ｇ７）において、一定のプロファイルまたは変化するプロファイルにより印加される電位（複数可）は、少なくとも約１０ｍＶ、少なくとも約５０ｍＶ、少なくとも約６０ｍＶ、約６０ｍＶ〜約１６０ｍＶ、好ましくは少なくとも約９０ｍＶ、少なくとも約１００ｍＶ、より好ましくは約１００ｍＶ〜約１６０ｍＶである。
別の例では、被験ポリヌクレオチドの流動方向で、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある構造の単一ヌクレオチドの差違は、ステップ（Ｇ７）において特徴付けることができる。ＣおよびＡは、高度な信頼性（＞約９８％の信頼性、好ましくは＞９９．５％の信頼性）で決定することができる。ＧおよびＴは、低度の信頼性（約９５％の信頼性）で特徴付けることができる。ＧおよびＴの相補的構造は、それぞれ、ＣおよびＡである。したがって、試料ＤＮＡおよびアンチセンス鎖の両方においてＣおよびＡを決定することにより、試料ＤＮＡだけから収集される情報により４つのヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧの全てを決定する場合（約９５％の信頼性）より高度な信頼性（＞９９％の信頼性、好ましくは＞９９．５％の信頼性）で、試料ＤＮＡの構造がもたらされる。いくつかの実施形態では、ナノポアは、アルファヘモリシンのナノポアであり、特徴付けられるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、ステップ（Ｇ６〜Ｇ７）において、一定のプロファイルまたは変化するプロファイルにより印加される電位（複数可）は、約１４０ｍＶ未満、約８０ｍＶ未満、約０ｍＶ〜約１４０ｍＶ、好ましくは約１００ｍＶ未満、約７０ｍＶ未満、より好ましくは約０ｍＶ〜約７０ｍＶである。
別の例では、被験ポリヌクレオチドの流動方向で、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある構造の、２つのヌクレオチドによる二量体を、ステップ（Ｇ７）において決定することができる。試料ＤＮＡおよびアンチセンス鎖の両方において二量体を特徴付けることにより、試料ＤＮＡだけから全ての二量体を決定する場合（＞約９０％の信頼性、または＞約９５％の信頼性）より高度な信頼性（＞約９７％の信頼性、または＞約９９％の信頼性、好ましくは＞９９．５％の信頼性）で、試料ＤＮＡの構造がもたらされる。好ましい例では、このような２つのヌクレオチドによる二量体は、ステップ（Ｇ７）において、アルファヘモリシンポアの狭窄部位内で浮遊している。
本発明の別の態様は、アレイフォーマット内の複数の一本鎖（ｓｓ）被験ポリヌクレオチドの配列情報を得る方法に関する。「複数」とは、１を超えること、好ましくは１０、１００、１，０００、１００，０００、百万、１千万、または１億を超えることを指す。方法は、
（Ｈ１）アレイフォーマット内の複数のナノポアおよび複数のｓｓ被験ポリヌクレオチドを用意するステップと、
（Ｈ２）各ｓｓ被験ポリヌクレオチドについて、本明細書で記載されるステップ（Ｆ１）〜（Ｆ２）および（Ｇ１）〜（Ｇ１２）を実施するステップであり、ナノポアが、複数のナノポアのうちの１つであり、アレイフォーマット内の複数のナノポアの各々が、個別にアドレス指定され、複数のナノポアの各々に印加される電位が、個別に制御されるステップと
を含む。
可変性刺激および電子署名
本明細書では、ナノポアにより、分子またはその一部分を同定するためのシステムおよび方法が提供される。方法は、電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも１つのナノポアを含むチップを用意するステップを含みうる。電極は、ナノポアを通して流れる電流を検出するように適合されていてもよい。方法は、分子またはその一部分をナノポア内に挿入するステップと、ナノポア越しに、かつ／または膜越しに印加される電圧を印加するステップとを含みうる。分子またはその一部分は、電流に影響を及ぼしうる（そして電流により同定されうる）。本明細書では、単一の電圧下で測定される電流は、分子またはその一部分を同定するのに不十分でありうることが認識される。ある態様では、本明細書で記載される方法は、複数の電圧下における電流を測定して、分子またはその一部分を同定するステップを含む。いくつかの実施形態では、複数の電圧下における電流は、電子署名を含み、電子署名を複数の基準電子署名と比較して、分子またはその一部分を同定するステップもさらに含む。
いくつかの実施形態では、ポリマー分子の一部分は、それらがポリマー分子の全長に沿う序列で同定され、かつ／または分子は、ヌクレオチドが成長中の核酸鎖に組み込まれる順序で同定される。
複数の電圧下で電流を測定するステップ（例えば、「電子署名」を得るステップ）を伴う、本明細書で記載される方法は、任意の適用において、ナノポアと共に使用することができる。例えば、分子は、図２Ａに示す通りに同定することができる。場合によって、分子は、ポリマー分子（例えば、核酸分子、タンパク質、炭水化物）であり、ポリマーの一部分は、任意選択で、それらがポリマー上に現れる序列で同定される（例えば、ポリマーは、配列決定される）。場合によって、ポリマーは、図２Ｂに示す通りにナノポアを通して流動する。場合によって、ポリマーは、核酸分子であり、ポリマーは、ナノポアを通して流動しない。核酸分子は、これをタグ分子が検出されるナノポアに隣接して通過させることにより、配列決定することができる（例えば、図２Ｃおよび図２Ｄに示される）。
いくつかの実施形態では、電圧は、電圧波形に従い変化させる。電圧波形は、方形波、正弦波、三角波、鋸歯状波、不規則波を含む任意の波形でありうる。図２９は、いくつかの適切な波形を示す。
場合によって、電圧は、交流電流（ＡＣ）波形を、ナノポアおよび／または膜に印加することにより変化させる。ＡＣ波形は、任意の適切な周波数を有しうる。いくつかの実施形態では、周波数は、約０．１ヘルツ（Ｈｚ）、約０．５Ｈｚ、約１Ｈｚ、約５Ｈｚ、約１０Ｈｚ、約５０Ｈｚ、約１００Ｈｚ、約５００Ｈｚ、約１０００Ｈｚ、約５０００Ｈｚ、約１００００Ｈｚ、約５００００Ｈｚ、約１０００００Ｈｚ、約５０００００Ｈｚ、または約１００００００Ｈｚである。いくつかの実施形態では、周波数は、少なくとも約０．１ヘルツ（Ｈｚ）、少なくとも約０．５Ｈｚ、少なくとも約１Ｈｚ、少なくとも約５Ｈｚ、少なくとも約１０Ｈｚ、少なくとも約５０Ｈｚ、少なくとも約１００Ｈｚ、少なくとも約５００Ｈｚ、少なくとも約１０００Ｈｚ、少なくとも約５０００Ｈｚ、少なくとも約１００００Ｈｚ、少なくとも約５００００Ｈｚ、少なくとも約１０００００Ｈｚ、少なくとも約５０００００Ｈｚ、または少なくとも約１００００００Ｈｚである。いくつかの実施形態では、周波数は、最大で約０．１ヘルツ（Ｈｚ）、最大で約０．５Ｈｚ、最大で約１Ｈｚ、最大で約５Ｈｚ、最大で約１０Ｈｚ、最大で約５０Ｈｚ、最大で約１００Ｈｚ、最大で約５００Ｈｚ、最大で約１０００Ｈｚ、最大で約５０００Ｈｚ、最大で約１００００Ｈｚ、最大で約５００００Ｈｚ、最大で約１０００００Ｈｚ、最大で約５０００００Ｈｚ、または最大で約１００００００Ｈｚである。
場合によって、電圧は、分子またはその一部分が、高度な統計学的信頼性で同定されるように変化させる。場合によって、分子またはその一部分は、約９０％、約９５％、約９９％、約９９．９％、約９９．９９％、または約９９．９９９％の統計学的信頼性で同定される。場合によって、分子またはその一部分は、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、または少なくとも約９９．９９９％の統計学的信頼性で同定される。
場合によって、チップは、複数の電極に隣接または近接して複数のナノポアを含み、（ｉ）電極は、個別にアドレス指定されるか、（ｉｉ）印加される電圧は個別に制御されるか、または（ｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である。電圧は、約１２０ｍＶ〜約１５０ｍＶまたは約４０ｍＶ〜約１５０ｍＶを含む任意の適切な範囲にわたり変化させることができる。
分子は、二本鎖核酸分子であることが可能であり、この場合、分子を解離させて、１または複数の一本鎖核酸分子を形成することができ、１または複数の一本鎖核酸分子は、ナノポアを通して通過させて、二本鎖核酸分子の配列を決定することが可能である。ナノポアの例は、アルファヘモリシンのナノポアおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ＭｓｐＡ）のナノポアを含む。
場合によって、ポリマー分子のナノポアを通しての通過速度は、１または複数の減速バンプ分子を一助として減速され、ここで、ポリマー分子の通過速度が減速されるときに、ポリマー分子の一部分が同定される。いくつかの実施形態では、個々の減速バンプ分子は、リボ核酸を含む。
いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、ナノポア内にトラップされる（例えば、ポリマー分子は、一本鎖核酸分子であり、分子は、ナノポアの両側に形成された嵩高い構造により、ナノポア内にトラップされる）。ポリマー分子に、ナノポアを通して前後に縫うように進ませて、ポリマー分子の一部分を複数回にわたり（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上にわたり）同定することが可能である。
場合によっては、核酸ヘアピンを、二本鎖核酸分子の末端にライゲーションして、二本鎖核酸分子を解離させて、二本鎖核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む一本鎖核酸分子をもたらす。
ある態様では、本発明は、ナノポア型検出器を使用して、被験ポリマーの配列情報および／または構造情報を得るための方法を対象とする。被験ポリマーは、滞留時間にわたり、ナノポア内にトラップすることもでき、ナノポア内に滞留させることもできる（任意選択で、ストッパ−被験ポリマーセグメントにより）。この滞留時間の間に、複数の電圧を有する電位を含む、変化する電位プロファイルを、ナノポア型検出器の電極に印加して、電気シグナルのセットを得ることができる。変化する電位プロファイル下で収集される電気シグナルは、一定の電位下で収集される電気シグナルと比較してより顕著に異なる配列情報および／または構造情報（例えば、被験ポリマーの流動方向で、ストッパ−被験ポリマーセグメントの前にある）をもたらしうる。したがって、変化する電位プロファイル下で収集される電気シグナルは、被験ポリマーの配列および／または構造の、一定の電位を使用する既往の方法より信頼でき、かつ、正確な決定をもたらしうる。
本発明の一態様は、被験ポリマーの配列情報および／または構造情報を得る方法であって、
（Ｉ１）ストッパ−被験ポリマーセグメントを含む被験ポリマー複合体を用意するステップと、
（Ｊ１）ナノポアの狭窄領域の前で、ストッパ−被験ポリマーセグメントを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、第１の試験電位を印加して、被験ポリマー複合体にナノポア型検出器のナノポアを通して流動させるステップと、
（Ｊ２）複数の電圧を有する電位を含む、変化する電位プロファイルを、ナノポア型検出器の電極に印加し、このとき、ストッパ−被験ポリマーセグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させ、第１の電気シグナルのセットを得るステップと、
（Ｊ３）第１の電気シグナルのセットを、ステップ（Ｊ２）における、同じ変化する電位プロファイル下で、被験ポリマーの流動方向で、ストッパ−被験ポリマーセグメントの前にある公知の構造について収集された電気シグナルと比較することにより、被験ポリマーの流動方向で、ストッパ−被験ポリマーセグメントの前にある構造を決定するステップと
を含む方法に関する。
ある実施形態では、被験ポリマーは、被験ポリヌクレオチドであり、構成要素は、本明細書で記載されるヌクレオチドである。ある実施形態では、被験ポリヌクレオチドは、１〜約１０，０００塩基、１〜約１，０００塩基、１〜約５００塩基、１〜約３００塩基、１〜約２００塩基、１〜約１００塩基、約５〜約１０，０００塩基、約５〜約１，０００塩基、約５〜約５００塩基、約５〜約３００塩基、５〜約２００塩基、５〜約１００塩基、１０〜約１０，０００塩基、１０〜約１，０００塩基、１０〜約５００塩基、１０〜約３００塩基、１０〜約２００塩基、１０〜約１００塩基、２０〜約１０，０００塩基、２０〜約１，０００塩基、２０〜約５００塩基、２０〜約３００塩基、２０〜約２００塩基、２０〜約１００塩基、３０〜約１０，０００塩基、３０〜約１，０００塩基、３０〜約５００塩基、３０〜約３００塩基、３０〜約２００塩基、３０〜約１００塩基、３０〜約５０塩基、５０〜約１０，０００塩基、５０〜約１，０００塩基、５０〜約５００塩基、５０〜約３００塩基、５０〜約２００塩基、または５０〜約１００塩基を有する。
ストッパは、オリゴヌクレオチドによる減速バンプであることが可能であり、ｓｓ被験ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される方法における減速バンプが結合するｓｓポリヌクレオチド区間を含みうる。いくつかの実施形態では、被験ポリヌクレオチドは、被験ＤＮＡまたは被験ＲＮＡであり、減速バンプは、ＤＮＡ減速バンプまたはＲＮＡ減速バンプである。減速バンプの長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６塩基でありうる。場合によって、減速バンプは、１０以下、８以下、６以下、または４塩基以下でありうる。減速バンプは、ユニバーサルヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、本源性ヌクレオチド、これらの修飾、およびこれらの組合せからなる群から選択される１または複数のヌクレオチドを含みうる。ユニバーサルヌクレオチドおよび本源性ヌクレオチドの修飾は、核酸塩基構造、骨格構造（例えば、グリコールヌクレオチド、モルホリノ、およびロックドヌクレオチド）、およびこれらの組合せにおける修飾を含む。別の好ましい実施形態では、減速バンプの骨格構造を、指定された位置（複数可）、ランダムな位置、またはこれらの組合せにおいて修飾する（例えば、グリコールヌクレオチド、モルホリノ、およびロックドヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、減速バンプ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対は、部分的または完全にナノポア内にある可能性があり、ステップ（Ｊ２）で得られる電気シグナルに寄与する。したがって、ステップ（Ｊ３）は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で、減速バンプ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対の配列情報および／または構造情報を得ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、全ての本源性核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）と塩基対合するユニバーサルヌクレオチドを、５’末端および／または３’末端に有する減速バンプを構築して、減速バンプ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対の寄与を標準化し、シグナルの解析をより容易とすることが好ましい。
ストッパは、ｓｓ被験ポリヌクレオチドに結合する酵素であることが可能であり、任意選択で、ｓｓ被験ポリヌクレオチドにナノポアを通して移動させる。このような酵素の例は、限定なしに述べると、Ｋｌｅｎｏｗ−ｅｘｏ ｍｉｎｕｓ；Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ；Ｐｈｉ２９−ｅｘｏ ｍｉｎｕｓポリメラーゼ；Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素；およびＴ７ Ｇｐ４ａヘリカーゼを含む。
ストッパは、ポリヌクレオチドのヘアピン構造、多重ヘアピン構造、および多重アーム構造などの二次元構造または三次元構造を形成しうる、被験ポリヌクレオチドの一部でありうる。いくつかの実施形態では、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対は、部分的または完全にナノポア内にある可能性があり、ステップ（Ｊ２）で得られる電気シグナルに寄与し、したがって、ステップ（Ｊ３）は、ｓｓ被験ポリヌクレオチドの流動方向で、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの最初の塩基対を決定することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｊ３）において決定されるストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある構造は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０〜５０塩基、５０〜１００塩基、１００〜２００塩基、２００〜５００塩基、または５００塩基を超える配列である。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｊ３）において決定されるストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある構造は、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０位、またはこれらの組合せなど、１〜５０位にある任意のヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｊ２）において印加される、変化する電位プロファイルは、各々がある時間にわたり印加される２つ以上の電圧を有する電位を含む。いくつかの実施形態では、変化する電位プロファイルは、ステップ（Ｊ１）の間に、またはステップ（Ｊ１）において、ストッパ−被験ポリマー複合体を、ナノポア内で失速させるか、減速するか、または停止させた後で結果として得られる１または複数の電位を含む。印加される２つ以上の電位のうちの少なくとも２つの電位には、約１ｍＶ、５ｍＶ、１０ｍＶ、または３０ｍＶを超える電位差がある。ある実施形態では、電位は、約１６０ｍＶ〜約−１６０ｍＶ、約１６０ｍＶ〜約０ｍＶ、約１６０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約１００ｍＶ〜約０ｍＶ、１００ｍＶ〜約８０ｍＶ、または８０ｍＶ〜約７０ｍＶの電圧を有する。各電位の時間は、少なくとも約５マイクロ秒、少なくとも約１０マイクロ秒、少なくとも約５０マイクロ秒、少なくとも約１００マイクロ秒、少なくとも約５００マイクロ秒、少なくとも約１ミリ秒、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約５０ミリ秒、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約５００ミリ秒、少なくとも約１秒、または少なくとも約２秒である。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｊ２）において印加される、変化する電位プロファイルは、ある時間にわたり第１の電位から第２の電位に変化する電位ランプを含む。いくつかの実施形態では、変化する電位プロファイルは、ステップ（Ｊ１）の間に、またはステップ（Ｊ１）において、ストッパ−被験ポリマー複合体を、ナノポア内で失速させるか、減速するか、または停止させた後で結果として得られる１または複数の電位を含む。例えば、変化する電位プロファイルの第１の電位は、ステップ（Ｊ１）の間に、またはステップ（Ｊ１）において、ストッパ−被験ポリマー複合体を、ナノポア内で失速させるか、減速するか、または停止させた後で結果として得られる電位でありうる。変化する電位プロファイルの最高電位と最低電位との電位差は、約１ｍＶ、５ｍＶ、１０ｍＶ、２０ｍＶ、または３０ｍＶを超える。別の実施形態では、第１の電位は、約１６０ｍＶであり、第２の電位は、約−１６０ｍＶである。ある実施形態では、第１の電位は、約１６０ｍＶであり、第２の電位は、約６０ｍＶである。別の実施形態では、第１の電位は、約１００ｍＶであり、第２の電位は、約０ｍＶである。別の実施形態では、第１の電位は、約１６０ｍＶであり、第２の電位は、約０ｍＶである。別の実施形態では、第１の電位は、約１００ｍＶであり、第２の電位は、約８０ｍＶである。別の実施形態では、第１の電位は、約１００ｍＶであり、第２の電位は、約９０ｍＶである。別の実施形態では、第１の電位は、約９０ｍＶであり、第２の電位は、約８５ｍＶである。所定の時間は、少なくとも約５マイクロ秒、少なくとも約１０マイクロ秒、少なくとも約５０マイクロ秒、少なくとも約１００マイクロ秒、少なくとも約５００マイクロ秒、少なくとも約１ミリ秒、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約５０ミリ秒、少なくとも約１００ミリ秒、少なくとも約５００ミリ秒、少なくとも約１秒、または少なくとも約２秒である。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｊ２）において印加される、変化する電位プロファイルは、第１の電位から第２の電位から第３の電位など複数の電位に変化する電位波形であって、全体で、印加される、変化する電位波形を形成する電位波形を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｊ２）は、少なくとも０．１Ｍの塩を有する溶液中で実施する。塩は、塩化物塩、リン酸塩、硝酸塩、および硫酸塩からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｊ２）は、ｐＨが約６．５〜約８．５または約７〜約８である溶液中で実施する。このようなｐＨをもたらしうる任意の緩衝液を使用することができる。例は、限定なしに述べると、ＨＥＰＥＳ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、ナノポアは、アルファヘモリシンのナノポアまたはＭｓｐＡのナノポアである。
いくつかの実施形態では、ナノポア型検出器は、絶縁表面内に埋め込まれた少なくとも１つの金属電極を含む。金属電極の材料の例は、限定なしに述べると、銀、塩化銀、白金、金、ルテニウム、およびニッケルを含む。絶縁表面の材料の例は、限定なしに述べると、プラスチック材料（例えば、テフロン（登録商標））、ガラス、または半導体材料（例えば、ケイ素、ゲルマニウム、およびガリウム）を含む。いくつかの実施形態では、生物学的分子の絶縁表面への接合を容易とする当技術分野で公知の方法を使用して、絶縁表面を、疎水性および脂溶性となるようにさらに修飾する。例えば、６〜２０炭素長の鎖を含有するシラン分子（例えば、オクタデシル−トリクロロシラン、オクタデシル−トリメトキシシラン、またはオクタデシル−トリエトキシシラン）またはＤＭＯＣによるさらなるシラン処理は、ケイ素表面上の二酸化ケイ素表面上で施すことができる。
本発明の別の態様は、アレイフォーマット内の複数の一本鎖（ｓｓ）被験ポリヌクレオチドの配列情報を得る方法に関する。「複数」とは、１を超えること、好ましくは１０、１００、１，０００、１００，０００、百万、１千万、または１億を超えることを指す。方法は、
（Ｋ１）アレイフォーマット内の複数のナノポアおよび複数のｓｓ被験ポリヌクレオチドを用意するステップと、
（Ｋ２）各ｓｓ被験ポリヌクレオチドについて、本明細書で記載されるステップを実施するステップであり、ナノポアが、複数のナノポアのうちの１つであり、アレイフォーマット内の複数のナノポアの各々が、個別にアドレス指定され、複数のナノポアの各々と関連する電位が、個別に制御されるステップと
を含む。
例を目的として述べると、図３０〜３２は、ヌクレオチドについて、印加される、変化する電圧に対する応答を示す。印加される、変化する電圧および／または電子署名の方法および概念を使用して、タグ分子（例えば、タグ付けされたヌクレオチドに接合された）を識別することができる。
図３０は、ヌクレオチドであるアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）について、抽出されるシグナル（ＤＬＣ）を、印加される電圧と対比して示す。図３１は、複数のヌクレオチド（多くの実験）についての同じ情報を示す。この図で見られる通り、１２０ｍＶでは、シトシンをチミンから識別することが比較的容易であるが、１５０ｍＶでは、互いから識別することが困難である（例えば、１５０ｍＶで抽出されるシグナルは、ＣおよびＴについてほぼ等しいため）。また、１２０ｍＶでは、チミンをアデニンから識別することが困難であるが、１５０ｍＶでは識別が比較的容易でもある。したがって、場合によって、印加される電圧を、約１２０ｍＶ〜１５０ｍＶで変化させ（例えば、電圧スイープの一部として）て、ヌクレオチドであるＡ、Ｃ、ＧおよびＴ（またはＵ）の各々を識別することができる。
図３２は、ヌクレオチドであるアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）について、相対伝導差パーセント（％ＲＣＤ）を、印加される電圧の関数として示す。％ＲＣＤ（これは本質的に、３０Ｔの基準分子に照らした、各分子の伝導差である）をプロットすることにより、実験間の補正および増大の変化を除去することができる。図３２は、２０回中１７回の試験の第１のブロックに由来する個々のＤＮＡ波形を含む。１７回の良好な試験全てについて、単一ヌクレオチドによるＤＮＡの５０〜２００回の捕捉全ての％ＲＣＤである。ヌクレオチドの各々が識別可能となる電圧が指し示される。
（実施例１）
ＰＢ２構造（Ｉ）
ＢＳ２を一方の末端に有するｓｓ被験ＤＮＡを、Ｔ２より低い温度でナノポア内に捕捉し、Ｔ２より高い温度で放出する（図２４）。
ＢＳ２（ＢＳ２−１）とは、5’-CCCCC CCCCC TTATA CCCCT ATAA-3’（配列番号１、ＰＢ２−１）の配列を有するＰＢ２から形成された、ＤＮＡによる５塩基二重鎖のヘアピン構造である。ＵＮＡＦＯＬＤプログラムを使用するシミュレーションによれば、ＢＳ２−１の溶融温度は、約１５℃であり、５℃におけるΔＧは、約−０．９６ｋｃａｌ／モルであった。このやや小さなΔＧは、ＢＳ２−１の結合エネルギーが比較的小さいことを指し示した。
図２４では、実線は２℃から１４℃への温度の変化を示した。ドットは、個々のＤＮＡ捕捉を表し、これは、ＰＢ２−１が、対応する温度でＢＳ２−１を形成し、ナノポア内に捕捉されたことを意味した。温度がほぼＴ２（約５℃）以下であるときに捕捉が提示されたことから、ＢＳ２−１がＰＢ２−１から形成され、ＤＮＡがナノポア内で失速することが指し示される。温度がＴ２を超えて約５〜１０℃に上昇すると、ＤＮＡの捕捉が消失したことから、ＢＳ２−１が溶融し、もはやナノポア内で失速しないことが指し示される。
したがって、ＰＢ２−１は、ＢＳ２−１を形成し、これは、その溶融温度より約１０℃低い温度のポア内で、ｓｓＤＮＡを失速させるか、減速するか、または停止させる。これは、ＢＳ２−１のΔＧが比較的小さかったことに起因しうる。したがって、ＢＳ２−１内のＤＮＡ二重鎖構造は、ナノポア内で解離させることが比較的容易である。したがって、ΔＧが大きなＢＳ２は、破壊することがより困難である可能性があり、ＢＳ２の溶融温度に近い温度のナノポアにおける滞留時間を延長しうる。
（実施例２）
ＰＢ１およびＰＢ２構造（ＩＩ）
ＰＢ１は、ＢＳ２がＰＢ２から形成される第２の温度（Ｔ２）より高い第１の温度（Ｔ１）でＢＳ１を形成する。Ｔ２は、作業温度（Ｔｗ）より高い。本実施例では、Ｔｗは、室温を下回る。したがって、ＰＢ１は、比較的長いＤＮＡ二重鎖セグメントの所望の溶融温度が達成されるように、比較的長いＤＮＡ二重鎖セグメント（アンチセンスのＤＮＡセグメントを伴うＤＮＡ二重鎖内、またはヘアピン構造内の）を有するようにデザインされる。
ＰＢ２は、溶融温度が低く、結合エネルギーが大きくなるようにデザインされる（作業条件において、ΔＧ＝約−１〜−５ｋｃａｌ／モル、約−４〜−６ｋｃａｌ／モル、約−４〜−５ｋｃａｌ／モル、約−４．５ｋｃａｌ／モル、または約−４．０ｋｃａｌ／モル）。Ｔ２は低いが、作業条件においてたやすく解離しないＢＳ２をもたらすように、アンカーボルト分子または分枝状分子がデザインされている。
ＰＢ１の例は、１５塩基の配列および４つのＡ塩基によるループ：5’-CGTCT AGCGT TGCCG AAAAC GGCAA CGCTA GACG-3’（配列番号２、ＰＢ１−１）を有する。ＵＮＡＦＯＬＤプログラムを使用するシミュレーションによれば、この配列の溶融温度は、１ＭのＫＣｌ中、１μＭの配列濃度で、９１．４℃である。
ＰＢ２の例は、5’-GACCC TGCCC CCAGC TTTCC CCAAA CGTCA AAAAA-3’（配列番号３、ＰＢ２−２）の配列を有し、ＵＮＡＦＯＬＤプログラムを使用するシミュレーションによれば、形成されたＢＳ２−２は、
Figure 0006333179
 に示す通り、３つのステム、３つの二重鎖、２つのループによる分子である。
ＵＮＡＦＯＬＤプログラムを使用して、ＢＳ２−２の以下の特徴：
５℃において、ΔＧ＝−４．５１４０ｋｃａｌ／モル（１００％のフォールディング）、
ΔＨ＝−６７．９０ｋｃａｌ／モル、
ΔＳ＝−２２７．９ｃａｌ／（Ｋ・モル）、および
Ｔｍ＝２４．８０８３℃
をもたらした。
最近傍ベースを使用して、計算によるＢＳ２−１の溶融曲線を得る。溶融曲線は、３０℃超では、構造のうちの約９０％が、直鎖状（ＰＢ２−２）であり、２０℃未満では、構造のうちの約９０％が、ＢＳ２−２を形成することを例示する。このような急勾配の溶融曲線は、よく制御されたＢＳ２−２の嵩高い構造の形成を示し、これは、強く所望される。５℃におけるＢＳ２−２のΔＧは、−４．５ｋｃａｌ／モルであり、これは、実施例１における５塩基のヘアピン分子によるＢＳ２−１より強い結合アフィニティを指し示す。
（実施例３）
４塩基の二重鎖セグメントによるＤＮＡの失速
本実施例は、４塩基の二重鎖セグメントが、所望の配列情報を得るのに十分な滞留時間にわたり、ナノポア内でｓｓ被験ＤＮＡを失速させたことを例示する。
被験ＤＮＡは、以下のＤＮＡであった。
被験ＤＮＡは、ＤＮＡ−１：5’-CCCCC CCCCC GCGC-3’（配列番号４）の自己ハイブリダイゼーションにより形成される。ＤＮＡ−１を、生物学グレードの水中に溶存させ、９０℃まで加熱し、次いで、自己ハイブリダイゼーションのために室温まで冷却されるように放置した。ＤＮＡ−１分子は、別のＤＮＡ−１分子とハイブリダイズして、その３’末端において４塩基のＧＣＧＣ二重鎖セグメントを有し、その５’末端において２つの突出するｓｓ １０−Ｃテールを有する、自己ハイブリダイズＤＮＡ−１構造を形成する。作業条件において、自己ハイブリダイズＤＮＡ−１構造は、２つの突出するｓｓ １０−Ｃテールのうちの１つと共にナノポアに入り、ナノポア内で、３’末端における４塩基の二重鎖セグメントにより、滞留時間にわたり失速し、次いで、４塩基の二重鎖セグメントを解離させると、自己ハイブリダイズＤＮＡ−１構造は、２つのｓｓ ＤＮＡ−１分子へと転換され、これらは、ｓｓ被験ＤＮＡと同様にナノポアを通して進んだ。したがって、ナノポアを通して流動するとき、自己ハイブリダイズＤＮＡ−１構造は、減速バンプとｓｓ被験ＤＮＡとにより形成された４塩基の二重鎖セグメントを有するｓｓ被験ＤＮＡをシミュレートした。
別の被験ＤＮＡである、自己ハイブリダイズＤＮＡ−２構造は、自己ハイブリダイズＤＮＡ−１の形成に関して本明細書で記載した同じ工程を使用して、ＤＮＡ−２：5’-TTTTT TTTTT GCGC-3’（配列番号５）の自己ハイブリダイゼーションにより形成される。自己ハイブリダイズＤＮＡ−２構造は、３’末端における４塩基のＧＣＧＣ二重鎖および５’末端における２つの突出するｓｓ１０−Ｔテールを有した。
別の被験ＤＮＡは、下記に記載する条件における、ＤＮＡ−３：5’-TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT-ビオチン-3’（配列番号６）と、ストレプトアビジンとのインキュベーションにより形成される、ストレプトアビジン−ＤＮＡ−３複合体である。電位下でナノポアを通して流動するとき、ストレプトアビジン−ＤＮＡ−３複合体は、ナノポア内で電位が変化／反転するまで失速する。したがって、ストレプトアビジン−ＤＮＡ−３複合体は、ナノポア型検出器システムが、適正に作動していることを示す陽性対照として用いた。この分子の滞留時間は、比較的長い。
作業条件は、０℃における２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液および１ＭのＫＣｌである。印加される電位は、約１２８ｍＶである。
ナノポアは、参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０１９３５７０号において記載されている通り、０．２ｎｇ／ｍＬの最終濃度で、電気刺激の印加により、二重層の表面に沈着させた１０ｎｇ／ｍＬのアルファヘモリシンから創出した。二重層は、米国出願公開第２０１１／０１９３５７０号において記載されている、テフロン（登録商標）表面上の本質的に平面状のＡｇＣｌ電極にわたる、デカン中に１０ｍｇ／ｍＬのＤＰｈＰＣによる塗布法を伴って創出した。
自己ハイブリダイズＤＮＡ−１（２μＭ）、自己ハイブリダイズＤＮＡ−２（２μＭ）、ＤＮＡ−３（２μＭ）、およびストレプトアビジン（１μＭ）を、本明細書で記載される通りに構築された複数のナノポアと共に、本明細書の本実施例で記載される作業条件において、約２時間にわたりインキュベートした。約１２８ｍＶの電位をナノポアに印加し、電気シグナルを収集する。電気シグナルは、４塩基の二重鎖セグメントが、ＤＮＡ−１およびＤＮＡ−２を、ナノポア内で、約１００ミリ秒〜２００ミリ秒の滞留時間にわたり失速させることが可能なことを示す。これらのデータは、４塩基という短い減速バンプが、関与性の配列情報を得るのに十分な程度に長く、ｓｓ被験ＤＮＡを失速させるように作動することを示す。
（実施例４）
６塩基のランダム減速バンププールによるＤＮＡの失速
本実施例は、ナノポアにうまく結合し、ナノポア型検出器内で失速し、被験ＤＮＡから解離する６塩基のランダム減速バンププールを例示する。
本実施例では、ｓｓ被験ＤＮＡは、女性のｓｓゲノムＤＮＡである。ランダム減速バンププールは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている、本源性ＤＮＡヌクレオチドの全ての組合せを有する、ヘキサマーＤＮＡオリゴヌクレオチドを含んだ。
作業条件は、０℃における２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液および１ＭのＫＣｌである。印加される電位は、約１２８ｍＶである。
ナノポアは、参照により全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０１９３５７０号において記載されている通り、０．２ｎｇ／ｍＬの最終濃度で、電気刺激の印加により、二重層の表面に沈着させた１０ｎｇ／ｍＬのアルファヘモリシンから創出した。二重層は、米国出願公開第２０１１／０１９３５７０号において記載されている、テフロン（登録商標）表面上の本質的に平面状のＡｇＣｌ電極にわたる、デカン中に１０ｍｇ／ｍＬのＤＰｈＰＣによる塗布法を伴って創出した。
６塩基のランダム減速バンププール（１００μＭ）と共にインキュベートされたｓｓ被験ＤＮＡ（１μＭ）を、本明細書で記載される通りに構築された複数のナノポアと共に、本明細書の本実施例で記載される作業条件において、約２時間にわたりインキュベートした。約１２８ｍＶの電位をナノポアに印加し、電気シグナルを収集する。電気シグナルは、６塩基のランダム減速バンププールが、ｓｓ被験ＤＮＡに結合し、ｓｓ被験ＤＮＡを、ナノポア内で、関与性の配列情報を得るのに十分な程度に長く失速させ、本明細書で記載されるｓｓ被験ＤＮＡから解離することが可能なことを示した。
（実施例５）
試料ポリヌクレオチドおよびそのアンチセンスポリヌクレオチドを含む被験ポリヌクレオチドの調製
Ａ．試料ポリヌクレオチドがｄｓ試料ＤＮＡである場合
二本鎖（ｄｓ）被験ポリヌクレオチドは、従来のＤＮＡライゲーション法により形成することができる。ｄｓ試料ポリヌクレオチドは、図２８に示される、リンカー区間の二重鎖区間および嵩高前区間の二重鎖区間とライゲーションすることができる。次いで、ｄｓ被験ポリヌクレオチドを変性させて（例えば、加熱して）、ｓｓ被験ポリヌクレオチドをもたらすことができる（図２８）。
Ｂ．試料ポリヌクレオチドがｓｓ試料ＤＮＡである場合
ｄｓ試料ＤＮＡは、当技術分野で周知の従来の方法を使用して、ｓｓ試料ＤＮＡから調製することができる。次いで、ｄｓ試料ＤＮＡは、ｄｓ試料ＤＮＡに関して本明細書で記載される方法に従い、さらに加工することができる。
Ｃ．試料ポリヌクレオチドがｓｓ試料ＲＮＡである場合
ｄｓ試料ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体は、当技術分野で周知の従来の方法を使用して、ｓｓ試料ＲＮＡから調製することができる。次いで、ｄｓ試料ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体は、ｄｓ試料ＤＮＡに関して本明細書で記載される類似の方法に従い、さらに加工することができる。
Ｄ．ｄｓ被験ポリヌクレオチドの、ｓｓ試料ポリヌクレオチド（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）からの調製における酵素法
用意された試料がｄｓＤＮＡである場合、ｄｓＤＮＡを変性させて、以下のこの酵素法において使用されるｓｓ試料ＤＮＡをもたらすことができる：
Ｄ１）ｓｓ試料ポリヌクレオチドの３’末端に対して特異的なフックプライマーをライゲーションするが、ここで、フック形のプライマーは、ｓｓ試料ポリヌクレオチドの３’末端と共に二重鎖区間を形成しうる３’突出区間である、ヘアピン構造を含む。試料ポリヌクレオチドの構造が、全く未知である場合、フックプライマーの３’突出は、任意のオリゴヌクレオチド配列と相互作用しうる、少数のユニバーサルヌクレオチド（例えば、２、３、４、５、６、７、もしくは８ヌクレオチドまたはこれを超える）を含みうる。
Ｄ２）フックプライマーの５’末端は、ｓｓ試料ポリヌクレオチドの３’末端からのギャップを有することが可能であるが、これは、当技術分野で公知の単一温度の伸長反応において、酵素によりライゲーション／充填することができる。
Ｄ３）ステップＤ２）から得られたポリヌクレオチドは、ヘアピン構造を一方の末端に有し、一本鎖区間を他方の末端に有する。一本鎖区間は、ポリヌクレオチドを、フックプライマーの３’末端から、当技術分野で公知の単一温度の伸長反応において、酵素により伸長させるための鋳型として使用する。伸長が完結したら、ポリヌクレオチドは、平滑末端を一方の末端に有し、ヘアピンを他方の末端に有する。
Ｄ４）ステップＤ３）から得られたポリヌクレオチドを、平滑末端ライゲーションにより、図２８に示される嵩高前区間とライゲーションする。嵩高前区間が、ビオチン接合部を有する場合、得られたポリヌクレオチドは、ビオチンの電磁ストレプトアビジンビーズへの接合により単離することができる。他の種類の相互作用、例えば、抗体−抗原間相互作用もまた、所望のポリヌクレオチドを単離するのに使用することができる。
Ｄ５）必要な場合は、所望のポリヌクレオチドを、ストレプトアビジンビーズから分離および除去し、対応するｓｓ被験ポリヌクレオチドに変性させる。
特異的ハイブリダイゼーション配列をヘアピンプライマー内で使用し、新たにを創出された二重鎖試料に平滑末端ライゲーションされた嵩高前構造のうちの１または複数に接合されたビオチン分子を使用する方法により、試料を、ヘアピンプライマーによりターゲティングされる特異的な試料断片について選択的に濃縮する方法がもたらされる。ユニバーサルポリヌクレオチドをヘアピンプライマー分子内で使用する場合は、単一のヘアピンプライマーまたはごく少数の変異体ヘアピンプライマーを使用して、試料中の全ての鎖から、センス試料／アンチセンス試料を創出することができる。このような方法では、試料の３’末端における対応するアンチセンス構造についての情報は失われうるが、異なる核酸分子の大規模なコレクションからの調製試料の創出が可能となる。
Ｅ．ｓｓライゲーションによる、ｄｓ被験ポリヌクレオチドの、ｓｓ試料ポリヌクレオチド（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）からの調製における酵素法
Ｅ１）アダプタにより容易となる試料のライゲーション
Ａ）アダプタにより容易となるライゲーション
５’突出が、ハイブリダイズアダプタ上に存在するように、ｓｓ試料ポリヌクレオチドを、特異的プライマー（アダプタ）またはユニバーサルアダプタにより、試料分子の３’末端にハイブリダイズさせる。アダプタのこの突出末端に、ヘアピン構造を含む別のポリヌクレオチドをライゲーションし、ヘアピンの３’末端が、アダプタの５’末端と接触し、ヘアピンの５’側が、元のｓｓ試料ポリヌクレオチドの３’末端と接触するように構築する。アダプタは、完全または部分的にヘアピン核酸鎖である個別の分子に特異的に結合する、本明細書で規定されるヌクレオチドを含有しうる突出区間を含有する。アダプタはまた、特定の試料鎖配列に対して特異的な配列の一部分を含有する場合もあり、アダプタのライブラリーに作製されると、任意の試料鎖に結合しうるランダム配列を含有する場合もあり、アダプタが任意の試料鎖に結合することを可能とするユニバーサル塩基または正常塩基とユニバーサル塩基との組合せを含有する場合もある。これらの潜在的なヌクレオチドの組合せは、特異的ヌクレオチドをアダプタ内で使用する場合、特異的配列についての試料の濃縮を可能とするか、または一本鎖核酸試料中の全ての試料からの、センス／アンチセンス鎖の普遍的な創出を可能とするために重要である。いずれにせよ、その突出を伴い、適切な相補的核酸または核酸類似体を有する付加ヘアピン分子だけが、ヘアピンまたは部分的なヘアピン分子に結合するように、人工のＤＮＡに結合させることはできるが、天然のＤＮＡには結合させることはできない、アダプタの突出部分を創出することができる。これは、例えば、イソｄＧヌクレオチドおよびイソｄＣヌクレオチドの使用により達成することができる。次いで、全長ハイブリダイズ複合体を、上記の２つの位置において併せてライゲーションすることができ、分子は、アンチセンスの伸長の準備ができる。
ｓｓ試料ポリヌクレオチドはまた、アダプタとヘアピンとのハイブリダイゼーション、試料鎖とヘアピンとのライゲーション、アダプタの溶融、伸長、および平滑末端ライゲーションにより分子の末端に接合された選り抜きの嵩高前構造を伴うセンス−アンチセンス表示にも変えることができる。アダプタは、完全または部分的にヘアピン核酸鎖である個別の分子に特異的に結合する、天然または人工のヌクレオチドを含有しうる突出区間を含有するであろう。アダプタはまた、特定の試料鎖配列に対して特異的な配列の一部分を含有する場合もあり、アダプタのライブラリーに作製されると、任意の試料鎖に結合しうるランダム配列を含有する場合もあり、アダプタが任意の試料鎖に結合することを可能とするユニバーサル塩基または正常塩基とユニバーサル塩基との組合せを含有する場合もある。いずれにせよ、その突出を伴い、適切な相補的核酸または核酸類似体を有する付加ヘアピン分子だけが、ヘアピンまたは部分的なヘアピン分子に結合するように、人工のＤＮＡに結合させることはできるが、天然のＤＮＡには結合させることはできない、アダプタの突出部分を創出することができる。これは、例えば、イソｄＧヌクレオチドおよびイソｄＣヌクレオチドの使用により達成することができる。
また、アダプタ核酸鎖の５’末端が、ライゲーションを生じさせるために必要とされる三リン酸基を含有しないようなアダプタ分子も創出することができる。この場合、アダプタは、やはり、ｓｓＤＮＡ試料またはｓｓＲＮＡ試料にハイブリダイズし、ヘアピン分子にハイブリダイズし、これにより、ライゲーションを生じさせるために２つの分子を近傍させるという、その意図される機能をもたらす。しかし、適切なリン酸基がなければ、アダプタとヘアピンとのライゲーションは生じないであろう。ライゲーションは、試料分子およびヘアピンの末端では生じるが、ヘアピンとアダプタとの間では生じないであろう。次いで、アダプタは溶融させることができ、その後の充填反応は、適切な二本鎖３’末端を、伸長反応のための伸長酵素に提示する、新たにライゲーションされたヘアピン分子の３’側からやはり進行させうるため、これは、望ましいことである。新たにを創出されたアンチセンス鎖は今や、元の試料センス鎖の全てに対応するアンチセンスヌクレオチドを含有するため、これは有利である。
Ｂ）アダプタにより容易とならない一本鎖ライゲーション
センス試料鎖と新たなアンチセンス鎖との連結の創出はまた、ｓｓ試料ポリヌクレオチドと、一本鎖の突出を含むヘアピン核酸との一本鎖ライゲーションによっても達成することができる。市販されるＴ４リガーゼは、２つの個別の一本鎖ポリヌクレオチドの一部分を連結しうる。その後の充填および嵩高前構造の平滑末端ライゲーションおよび変性（例えば、溶融）により、センス／アンチセンス調製分子が創出される。
上記の試料調製法の全ては、単一分子の検出および配列決定に理想的である。個別に制御される電極のアレイであって、各電極が印加され、読み取られる、ナノポアへの刺激を制御するアレイを使用するナノポアによる配列決定にはとりわけ理想的である。複数の電極／ナノポアセンサは、半導体の技術分野ではよく知られた技法を使用して、半導体材料上または半導体材料中で構築されうるものなど、平面表面上または三次元表面上の、個別に制御される電極のアレイ／ナノポアセンサに組み合わせることができる。
ヘアピンを一本鎖試料核酸鎖にライゲーションした後は、以下により、ナノポアによる配列決定および／または検出のために調製されたセンス／アンチセンス／嵩高前構造の試料分子の完成例が詳述される。
Ｅ２）Ｋｌｅｎｏｗなどの充填酵素により、ステップ（Ｅ１）から得られたポリヌクレオチドからアンチセンス鎖を合成して、ヘアピン構造を一方の末端に有し、平滑末端を他方の末端に有するポリヌクレオチドをもたらす。
Ｅ３）ステップＥ２）から得られたポリヌクレオチドを、平滑末端ライゲーションにより、図２８に示される嵩高前区間とライゲーションする。嵩高前構造の１または複数の鎖が、ビオチン接合部を有する場合、得られたポリヌクレオチドは、ビオチンの電磁ストレプトアビジンビーズへの接合により単離することができる。他の種類の相互作用、例えば、抗体−抗原間相互作用もまた、所望のポリヌクレオチドを単離するのに使用することができる。
Ｅ４）必要な場合は、所望のポリヌクレオチドを、ストレプトアビジンビーズから分離および除去し、対応するｓｓ被験ポリヌクレオチドに変性させる。
（実施例６）
ＤＮＡナノポアによる検出により、単一ヌクレオチドの差別化が９９％を超える信頼性で得る
Figure 0006333179
 を合成する。各種類のＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＡ、ＤＮＡ−ＴＴ、ＤＮＡ−ＴＣ、ＤＮＡ−ＴＧ、およびＤＮＡ−ＴＲ）を、ストレプトアビジンと、１００μＭのＤＮＡおよび２５μＭのストレプトアビジンという作業濃度まで個別に混合する。次いで、得られた溶液を、４μＭの被験ＤＮＡおよび１．０μＭのストレプトアビジンというＤＮＡ原液としての最終濃度までさらに希釈する。
試験は、アルファヘモリシンのナノポア型検出器上で行う。ナノポア型検出器は、平面状のテフロン（登録商標）表面内に埋め込まれた銀電極の対を有した。脂質二重層は、バブル法により、または脂質デカン中に１５ｍｇ／ｍＬのＤＰｈＰＣ １μＬを使用して、少量の脂質ミックス中に浸漬されたピペットの先端を、平面状の電極の表面にわたりスライドさせることにより創出する。ナノポアは、２０％のグリセロールおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳによりｐＨ８．０に緩衝処理された水中に１μｇ／ｍＬのアルファヘモリシン最大１μＬにより調製する。代替的に、ナノポアは、１〜１００ｎｇ／ｍＬのアルファヘモリシンポリンによっても調製される。
一実験では、ストレプトアビジンを３’末端に接合させたホモポリマー３０Ｔである２μＬの基準ＤＮＡ原液（ＤＮＡ−ＴＲ）と、（ＤＮＡ−ＴＡ、ＤＮＡ−ＴＴ、ＤＮＡ−ＴＣ、またはＤＮＡ−ＴＧ）から選択される２μＬの被験ＤＮＡ原液とを、１．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＨＥＰＥＳで緩衝処理された二重濾過溶液４０μＬにより混合し、生物学グレードの水４μＬを、本明細書で調製されるナノポア型検出器に投入する。外部波形発生器により、変化する電位プロファイルを印加し、ナノポアを通して流れる電流を記録する。１６０ｍＶの初期電位を、ナノポア型検出器の電極に印加する。記録された電流により、ナノポア内のＤＮＡ（これは、被験ＤＮＡの場合もあろうし、基準ＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＲ）の場合もあろう）の捕捉が指し示されたら、電極に印加される電位を、１６０ｍＶから０ｍＶに、２秒で直線的に変化させる。約０ｍＶでは、短い負の電位パルス（０．５秒間にわたり約−４０ｍＶ）を印加して、被験分子をポアから駆出し、この後、別の捕捉／読取りサイクルのために、＋１６０ｍＶの捕捉電圧に復帰させる。基準ＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＲ）が捕捉されたら、捕捉されたＤＮＡは、印加される電位が約４０ｍＶであるときにポアから放出される。被験ＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＡ、ＤＮＡ−ＴＴ、ＤＮＡ−ＴＣ、またはＤＮＡ−ＴＧ）が捕捉されたら、捕捉されたＤＮＡは、印加された電位が約０ｍＶに到達した後で放出される。したがって、捕捉されたＤＮＡがポアから放出されるときの電位に基づき、捕捉されたＤＮＡを、基準ＤＮＡまたは被験ＤＮＡのうちの１つとして同定することができる。各実験は、１つのナノポア上で、約３０分間にわたり実行する。同じ実験を、各被験ＤＮＡについて３つずつのナノポア上で繰り返し、これにより、１２セットのデータがもたらされる。
本明細書では、基準ＤＮＡがナノポア内に捕捉されるときにナノポア型検出器により記録される電流を、基準読取りと称する。本明細書では、被験ＤＮＡがナノポア内に捕捉されるときにナノポア型検出器により記録される電流を、被験読取りと称する。被験読取りおよび基準読取りの両方を有するデータセットについて、印加される電位の変化と対比した基準読取りを、二次曲線に近似する。電位の変化と対比した基準読取りの中央値が得られる（以下では、基準中央値と称する）。印加される各電位について、各被験読取りと基準中央値との間のデルタ電流を計算し、次いで、これを基準二次近似曲線の微分係数で除して、被験読取りの、基準読取りに対する比を得る。次いで、デルタ電流の伝導度に１００を乗じて、基準伝導差％に変える。次いで、印加される電位（ｍＶ）と対比した被験読取りについて、基準伝導差％の曲線を描き、まとめる。曲線は、ナノポア内で捕捉されるポリＴ ＤＮＡにおけるＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧの単一の置換を、本明細書で記載される通り、９５％を超える信頼性で同定しうることを示す。単一の置換されたヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧ）以外の他のヌクレオチドのうちのいずれも、ナノポア型検出器により得られるシグナルに影響を及ぼさないことが仮定される。ステップ（Ｂ６〜Ｂ７）において、一定のプロファイルまたは変化するプロファイルにより印加される電位（複数可）は、少なくとも約９０ｍＶ、好ましくは少なくとも約１００ｍＶ、より好ましくは約１００ｍＶ〜約１６０ｍＶであり、ＣおよびＴは、高度な信頼性（＞約９９％、好ましくは＞９９．５％の信頼性）で決定される。ＧおよびＡは、低度の信頼性（約９５％の信頼性）で特徴付けられる。ＧおよびＡの相補的構造は、それぞれ、ＣおよびＴである。したがって、アンチセンス鎖内のＣおよびＴを決定することにより、試料ＤＮＡ内のＧおよびＡの決定も同様に、高度な信頼性（＞９９％、好ましくは＞９９．５％の信頼性）でもたらされる。したがって、試料ＤＮＡおよびアンチセンス鎖の両方においてＣおよびＴを決定することにより、試料ＤＮＡだけから収集される情報により４つのヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧの全てを決定する場合（約９５％の信頼性）より高度な信頼性（＞９９％の信頼性、好ましくは＞９９．５％の信頼性）で、試料ＤＮＡの構造をもたらすことができる。
ステップ（Ｂ６Ｂ７）において、一定のプロファイルまたは変化するプロファイルにより印加される電位（複数可）が、約８０ｍＶ未満、好ましくは約７０ｍＶ未満、より好ましくは約０ｍＶ〜約７０ｍＶである場合、ＣおよびＡは、高度な信頼性（＞約９９％、好ましくは＞９９．５％の信頼性）で決定される。ＧおよびＴは、低度の信頼性（約９５％の信頼性）で特徴付けられる。ＧおよびＴの相補的構造は、それぞれ、ＣおよびＡである。したがって、アンチセンス鎖内のＣおよびＡを決定することにより、試料ＤＮＡ内のＧおよびＴの決定も同様に、高度な信頼性（＞９９％、好ましくは＞９９．５％の信頼性）でもたらされる。したがって、試料ＤＮＡおよびアンチセンス鎖の両方においてＣおよびＡを決定することにより、試料ＤＮＡだけから収集される情報により４つのヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧの全てを決定する場合（約９５％の信頼性）より高度な信頼性（＞９９％の信頼性、好ましくは＞９９．５％の信頼性）で、試料ＤＮＡの構造をもたらすことができる。こうして、試料ポリヌクレオチドおよび対応するアンチセンス構造から収集される電気シグナルをまとめることにより、試料ポリヌクレオチド内の構造を分解するときの信頼性が改善された。
シグナルは、前出で記載した減速バンプ読取りシステムに由来する場合もあり、前出で記載した酵素伸長システムに由来する場合もあり、前出で記載した試料読取りシステムによる酵素伸長および酵素解離に由来する場合もあり、例として述べると、ヘリカーゼ酵素鎖の移動を含む、他の酵素／鎖移動法に由来する場合もある。ヘリカーゼは、ナノポアを通しての試料鎖を移動させるためのアンチセンス鎖の塩基伸長を要請せず、読取りのために、ナノポアを通して直線的に、ＤＮＡ試料をほどく。
（実施例７）
ＤＮＡナノポアによる検出を介して、ヌクレオチド二量体の差別化を得る
１．０μＭのストレプトアビジン、および３’末端から１２位において単一ヌクレオチド置換を有するポリＡ４０ ＤＮＡ（下記に示す、３９Ａ１Ｎ、ＤＮＡ−ＡＡ、ＤＮＡ−ＡＴ、ＤＮＡ−ＡＣ、およびＤＮＡ−ＡＧ）、３’末端から１２位において単一ヌクレオチド置換を有するポリＣ４０ ＤＮＡ（下記に示す、３９Ｃ１Ｎ、ＤＮＡ−ＣＡ、ＤＮＡ−ＣＴ、ＤＮＡ−ＣＣ、およびＤＮＡ−ＣＧ）、３’末端から１２位において単一ヌクレオチド置換を有するポリＴ４０ ＤＮＡ（３９Ｔ１Ｎ；実施例６と同様）、または基準ＤＮＡ ３０Ｃ（下記に示す、ＤＮＡ−ＣＲ）による４μＭのＤＮＡを有するＤＮＡ原液を、実施例６で記載した方法に従い調製する。
Figure 0006333179
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室温ではなく、０℃で実験を行うことを除き、実施例６で記載したのと同様の実験を、各被験ＤＮＡ（ＤＮＡ−ＡＡ、ＤＮＡ−ＡＴ、ＤＮＡ−ＡＣ、ＤＮＡ−ＡＧ、ＤＮＡ−ＣＡ、ＤＮＡ−ＣＴ、ＤＮＡ−ＣＣ、ＤＮＡ−ＣＧ、ＤＮＡ−ＴＡ、ＤＮＡ−ＴＴ、ＤＮＡ−ＴＣ、またはＤＮＡ−ＴＧ）について、ＤＮＡ−ＣＲを基準ＤＮＡとして使用して実行する。全ての被験ＤＮＡについて、実験を１回ずつ実施し、得られたデータは、実施例６で記載した通りに加工する。まとめられたデータは、３つの異なるホモポリマー骨格鎖から構成される、被験ＤＮＡの３’末端から１１〜１３位における２塩基の差違を、本明細書で記載される、変化する電位プロファイルを使用する、ＤＮＡナノポアによる検出を介して、信頼できる形で同定しうることを示した。例では、電位プロファイル、ポリＡ骨格を有するＤＮＡ、ポリＣ骨格を有するＤＮＡ、およびポリＴ骨格を有するＤＮＡに対応するデータが提供される。
公表された研究は、アルファヘモリシンポアバレルの上部における狭窄帯域は、ポア内の主要な狭窄帯域であり、ＤＮＡがポア内に滞留するときの電流の減少の大半の一因となることを示している。理論に束縛される意図なしに述べると、ＤＮＡがポア内に滞留するときは、合計１０ヌクレオチドが、アルファ−ヘモリシンポアのバレルの全長に収まることが推定される。グラフの読取りにより、狭窄帯域内の２ヌクレオチドが同定されたが、ポア内の残りの８ヌクレオチドの全ての可能な組合せについてのデータは採取されなかった。文献で提示されている通り、電位プロファイルの読取りレベルは、ポア内の残りの８ヌクレオチドが、測定時において、２ヌクレオチド対の電流の読取りに感知可能な程度に影響を及ぼすことはなかったことを仮定する。
Figure 0006333179
電位プロファイルは、二量体であるＡＣおよびＴＣが、たやすく検出可能であるため、対応するアンチセンス二量体であるＧＴおよびＧＡも同様にたやすく検出可能であることを指し示す。
例では、ステップ（Ｂ６〜Ｂ７）において印加される電位（複数可）（一定のプロファイルまたは変化するプロファイルにより印加される）は、少なくとも約１３０ｍＶであり、電位プロファイル（電圧（ｍＶ）の関数としての基準伝導差％）は、以下を示す。
ＴＧ、ＴＡ、およびＴＴのシグナルを、併せて混合する。ＴＧ、ＴＡ、およびＴＴの対応するアンチセンス二量体は、それぞれ、ＣＡ、ＴＡ、およびＡＡであり、これらは、互いから差別化することが容易である。
ＡＴ、ＡＡ、およびＡＧのシグナルを、併せて混合する。ＡＴ、ＡＡ、およびＡＧの対応するアンチセンス二量体は、それぞれ、ＡＴ、ＴＴ、およびＣＴであり、これらは、互いから差別化することが容易である
ＣＧ、ＣＡ、およびＣＴのシグナルを、併せて混合する。ＣＧ、ＣＡ、およびＣＴの対応するアンチセンス二量体は、それぞれ、ＣＧ、ＴＧ、およびＡＧであり、約１３０ｍＶ以上の電位（複数可）下では、ＣＧおよびＣＴを互いから差別化するのは困難であるが、ステップ（Ｂ６〜Ｂ７）において印加される電位（複数可）が低い（例えば、約１００ｍＶ）場合は、互いから差別化するのが容易である。ステップ（Ｂ６〜Ｂ７）において、一定のプロファイルまたは変化するプロファイルにより印加される電位（複数可）が、約８０ｍＶ〜約１２０ｍＶである場合：
ＴＧ、ＴＡ、およびＴＴのシグナルを、併せて混合する。ＴＧ、ＴＡ、およびＴＴの対応するアンチセンス二量体は、それぞれ、ＣＡ、ＴＡ、およびＡＡであり、これらは、互いから差別化することが容易である。
ＡＴ、ＡＡ、およびＡＧのシグナルを、併せて混合する。ＡＴ、ＡＡ、およびＡＧの対応するアンチセンス二量体は、それぞれ、ＡＴ、ＴＴ、およびＣＴであり、これらは、互いから差別化することが容易である
ＣＧ、ＣＡ、およびＣＴのシグナルを、併せて混合する。ＣＧ、ＣＡ、およびＣＴの対応するアンチセンス二量体は、それぞれ、ＣＧ、ＴＧ、およびＡＧであり、これらは、互いから差別化することが容易である。
したがって、本明細書で記載される方法は、試料ＤＮＡおよびそのアンチセンスＤＮＡの両方を特徴付けることにより、試料ＤＮＡのより信頼でき、正確な特徴付けをもたらす。
試料ポリヌクレオチドおよび対応するアンチセンス構造について同じナノポア内で収集される電気シグナルを採取することにより、システムエラーが減殺され、試料ポリヌクレオチド内の構造を分解するときの信頼性が改善される。試料ポリヌクレオチドが、ＲＮＡであり、アンチセンスポリヌクレオチドが、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは人工ヌクレオチドである場合も、同様の結果を期待することができる。
本明細書で記載される試料の調製法は容易であり、任意の核酸試料に適用することができる。本明細書で記載される調製法は、同じナノポアセンサ上のマルチプレックス試料を許容する。本明細書で記載されるセンス試料／アンチセンス試料の調製および読取り法は、個別に制御されるナノポアセンサのアレイを含むナノポアによる配列決定装置上またはナノポア型検出器上での使用に理想的であるか、または他の形で適しうる。試料ＤＮＡまたは試料ＲＮＡの同じ領域のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、ほぼ同時に、かつ、同じナノポア内で読み取る能力は、システムエラーを減殺し、試料を適正に読み取り、配列決定する能力を改善する。察知されうる通り、１つのアレイ内のナノポアセンサの数は、多数であることが可能であり、半導体加工技術だけで限界づけられる。個々の核酸試料を個々のナノポアにおいて高度な信頼性で読み取る能力、および１つのチップまたは１つの検出器上のナノポアアレイセンサを使用して、多数の試料を大きな規模で並行して読み取る能力は、簡便で、廉価で、携帯可能なＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定が現実となることを可能とする。
（実施例８）
３’末端から１２位において単一ヌクレオチド置換を有するポリＴ４０ ＤＮＡ（３９Ｔ１Ｎ）を、変化する電位プロファイルを使用する、ＤＮＡナノポアによる検出を介して、９５％を超える信頼性で互いから識別する
Figure 0006333179
 を合成する。各種類のＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＡ、ＤＮＡ−ＴＴ、ＤＮＡ−ＴＣ、ＤＮＡ−ＴＧ、およびＤＮＡ−ＴＲ）を、ストレプトアビジンと、１００μＭのＤＮＡおよび２５μＭのストレプトアビジンという作業濃度まで個別に混合する。次いで、得られた溶液を、４μＭの被験ＤＮＡおよび１．０μＭのストレプトアビジンというＤＮＡ原液としての最終濃度までさらに希釈する。
試験は、アルファヘモリシンのナノポア型検出器上で行う。ナノポア型検出器は、平面状のテフロン（登録商標）表面内に埋め込まれた銀電極の対を有した。脂質二重層は、バブル法により、または脂質デカン中に１５ｍｇ／ｍＬのＤＰｈＰＣ １μＬを使用して、少量の脂質ミックス中に浸漬されたピペットの先端を、平面状の電極の表面にわたりスライドさせることにより創出する。ナノポアは、２０％のグリセロールおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳによりｐＨ８．０に緩衝処理された水中に１μｇ／ｍＬのアルファヘモリシン最大１μＬにより調製する。代替的に、ナノポアは、１〜１００ｎｇ／ｍＬのアルファヘモリシンポリンによっても調製される。
一実験では、２μＬの基準ＤＮＡ原液（ＤＮＡ−ＴＲ）と、２μＬの被験ＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＡ、ＤＮＡ−ＴＴ、ＤＮＡ−ＴＣ、またはＤＮＡ−ＴＧ）の原液とを、１ＭのＫＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝処理された二重濾過溶液４０μＬにより混合し、生物学グレードの水４μＬを、前出で調製したナノポア型検出器に投入する。外部波形発生器により、変化する電位プロファイルを印加し、ナノポアを通して流れる電流を記録する。１６０ｍＶの初期電位を、ナノポア型検出器の電極に印加する。記録された電流により、ナノポア内のＤＮＡ（これは、被験ＤＮＡの場合もあろうし、基準ＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＲ）の場合もあろう）の捕捉が指し示されたら、電極に印加される電位を、１６０ｍＶから０ｍＶに、２秒で直線的に変化させる。記録された電流により、捕捉されたＤＮＡが、ナノポアから放出されることが示された後、次のＤＮＡ捕捉がなされるまで、ナノポア型検出器に印加される電位を、１６０ｍＶに回復させる。基準ＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＲ）が捕捉されたら、捕捉されたＤＮＡは、印加される電位が約４０ｍＶであるときにポアから放出される。被験ＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＡ、ＤＮＡ−ＴＴ、ＤＮＡ−ＴＣ、またはＤＮＡ−ＴＧ）が捕捉されたら、捕捉されたＤＮＡは、印加された電位が約０ｍＶに到達した後で放出される。したがって、捕捉されたＤＮＡがポアから放出されるときの電位に基づき、捕捉されたＤＮＡを、基準ＤＮＡまたは被験ＤＮＡのうちの１つとして同定することができる。実験は、１つのナノポア上で、３０分間にわたり実行する。同じ実験を、各被験ＤＮＡについて３つずつのナノポア上で繰り返し、これにより、１２セットのデータがもたらされる。
本明細書では、基準ＤＮＡがナノポア内に捕捉されるときにナノポア型検出器により記録される電流を、基準読取りと称する場合がある。本明細書では、被験ＤＮＡがナノポア内に捕捉されるときにナノポア型検出器により記録される電流を、被験読取りと称する。
被験読取りおよび基準読取りの両方を有するデータセットについて、印加される電位の変化と対比した基準読取りを、二次曲線に近似する。電位の変化と対比した基準読取りの中央値が得られる（以下では、基準中央値と称する）。印加される各電位について、各被験読取りと基準中央値との間のデルタ電流を計算し、次いで、これを基準二次近似曲線の微分係数で除して、被験読取りの、基準読取りに対する比を得る。デルタ電流の伝導度を計算し、これに１００を乗じて、基準伝導差％に変える。次いで、印加される電位（ｍＶ）と対比した被験読取りについて、基準伝導差％の曲線を描き、まとめて、電位プロファイル（グラフ）をもたらす。曲線の第１のセットは、ＤＮＡ−ＴＡから得られるデータを示し、曲線の第２のセットは、ＤＮＡ−ＴＧから得られるデータを示し、曲線の第３のセットは、ＤＮＡ−ＴＴから得られるデータを示し、曲線の第４のセットは、ＤＮＡ−ＴＣから得られるデータを示す。電位プロファイルは、ナノポア内で捕捉されるポリＴ ＤＮＡにおけるＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧの単一の置換を、本明細書で記載される通り、９５％を超える信頼性で同定しうることを示す。
（実施例２）
変化する電位をナノポア型検出器の電極に印加することにより、ＤＮＡナノポアによる検出を介して、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧの単一ヌクレオチド差別化を得る
１．０μＭのストレプトアビジン、および３’末端から１２位において単一ヌクレオチド置換を有するポリＡ４０ ＤＮＡ（下記に示す、３９Ａ１Ｎ、ＤＮＡ−ＡＡ、ＤＮＡ−ＡＴ、ＤＮＡ−ＡＣ、およびＤＮＡ−ＡＧ）、３’末端から１２位において単一ヌクレオチド置換を有するポリＣ４０ ＤＮＡ（下記に示す、３９Ｃ１Ｎ、ＤＮＡ−ＣＡ、ＤＮＡ−ＣＴ、ＤＮＡ−ＣＣ、およびＤＮＡ−ＣＧ）、３’末端から１２位において単一ヌクレオチド置換を有するポリＴ４０ ＤＮＡ（３９Ｔ１Ｎ；実施例８と同様）、または基準ＤＮＡ ３０Ｃ（下記に示す、ＤＮＡ−ＣＲ）による４μＭのＤＮＡを有するＤＮＡ原液を、実施例８で記載した方法に従い調製する。
Figure 0006333179
Figure 0006333179
室温ではなく、０℃で実験を行うことを除き、実施例８で記載したのと同様の実験を、各被験ＤＮＡ（ＤＮＡ−ＡＡ、ＤＮＡ−ＡＴ、ＤＮＡ−ＡＣ、ＤＮＡ−ＡＧ、ＤＮＡ−ＣＡ、ＤＮＡ−ＣＴ、ＤＮＡ−ＣＣ、ＤＮＡ−ＣＧ、ＤＮＡ−ＴＡ、ＤＮＡ−ＴＴ、ＤＮＡ−ＴＣ、またはＤＮＡ−ＴＧ）について、ＤＮＡ−ＣＲを基準ＤＮＡとして使用して実行する。全ての被験ＤＮＡについて、実験を１回ずつ実施し、得られたデータは、実施例８で記載した通りに加工する。まとめられたデータは、３つの異なるホモポリマー骨格鎖から構成される、被験ＤＮＡの３’末端から１１〜１３位における２塩基の差違を、本明細書で記載される、変化する電位プロファイルを使用する、ＤＮＡナノポアによる検出を介して、信頼できる形で同定しうることを示した。例では、電位プロファイル、ポリＡ骨格を有するＤＮＡのデータ、ポリＣ骨格を有するＤＮＡのデータ、およびポリＴ骨格を有するＤＮＡのデータが提供される。曲線の第１のセットは、ＤＮＡ−ＡＡ、ＤＮＡ−ＣＡ、およびＤＮＡ−ＴＡのデータに由来し、曲線の第２のセットは、ＤＮＡ−ＡＣ、ＤＮＡ−ＣＣ、およびＤＮＡ−ＴＣのデータに由来し、曲線の第３のセットは、ＤＮＡ−ＡＴ、ＤＮＡ−ＣＴ、およびＤＮＡ−ＴＴのデータに由来し、曲線の第４のセットは、ＤＮＡ−ＡＧ、ＤＮＡ−ＣＧ、およびＤＮＡ−ＴＧのデータに由来する。
記載される３９Ａ１Ｎの実験から得られるデータを使用して、電圧（Ｖ）の関数としての基準伝導差パーセントを示す電位プロファイルを作成する。曲線の第１のセットは、ＤＮＡ−ＡＡのデータから作成し、曲線の第２のセットは、ＤＮＡ−ＡＣのデータから作成し、曲線の第３のセットは、ＤＮＡ−ＡＴのデータから作成し、曲線の第４のセットは、ＤＮＡ−ＡＧのデータから作成する。
本明細書で記載される３９Ｃ１Ｎの実験から得られるデータを使用して、電圧（Ｖ）の関数としての基準伝導差パーセントを示す電位プロファイルを作成する。曲線の第１のセットは、ＤＮＡ−ＣＡのデータから作成し、曲線の第２のセットは、ＤＮＡ−ＣＣのデータから作成し、曲線の第３のセットは、ＤＮＡ−ＣＴのデータから作成、曲線の第４のセットは、ＤＮＡ−ＣＧのデータから作成する。
本明細書で記載される３９Ｔ１Ｎの実験から得られるデータを使用して、示される電圧（Ｖ）の関数としての基準伝導差パーセントを示す電位プロファイルを作成する。曲線の第１のセットは、ＤＮＡ−ＴＡのデータから作成し、曲線の第２のセットは、ＤＮＡ−ＴＣのデータから作成し、曲線の第３のセットは、ＤＮＡ−ＴＴのデータから作成、曲線の第４のセットは、ＤＮＡ−ＴＧのデータから作成する。
全てのデータは、ナノポア内で捕捉されるホモポリマーＤＮＡ（ポリＡ、ポリＣ、またはポリＴ）内の単一のＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧが、９５％を超える信頼性で同定されることを示す。
本明細書では、本発明の好ましい実施形態を示し、記載してきたが、このような実施形態は、例だけを目的として提示されることが当業者には明白であろう。本発明から逸脱しない限りにおいて、当業者には今や、多数の変更、変化、および代用が想到されるであろう。本発明の実施では、本明細書で記載される本発明の実施形態に対する多様な代替法を援用しうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が規定され、これらの特許請求の範囲内にある方法および構造ならびにそれらの同等物がその対象となることが意図される。

Claims (68)

  1. 分子またはその一部分を同定するための方法であって、
    （ａ）電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも１つのナノポアを含むチップを用意するステップであって、前記電極は、前記ナノポアを通して流れる電流を検出するように適合されているステップと、
    （ｂ）前記分子またはその一部分を前記ナノポア内に挿入するステップと、
    （ｃ）前記ナノポア越しに、かつ／または前記膜越しに印加される電圧を変化させるステップと、
    （ｄ）複数の電圧下において前記電流を測定して、前記分子またはその一部分を同定するステップと
    を含み、１または複数のランダム減速バンプ分子が、前記分子またはその一部分に結合し、前記分子がポリマー分子であり、前記ポリマー分子が、前記ナノポアを通して通過するか、または前記ナノポア内に存在するときに、前記ポリマー分子の一部分が同定され、ここで、前記ポリマー分子が核酸であり、前記ポリマー分子の前記一部分が、核酸または核酸群である方法。
  2. 前記ポリマー分子の前記ナノポアを通しての通過速度が、前記１または複数のランダム減速バンプ分子を一助として減速され、前記ポリマー分子の前記通過速度が減速されるときに、前記ポリマー分子の一部分が同定される、請求項１に記載の方法。
  3. 個々のランダム減速バンプ分子が、リボ核酸を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ポリマー分子が、前記ナノポア内にトラップされる、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ポリマー分子に、前記ナノポアを通して前後に縫うように進ませて、前記ポリマー分子の少なくとも一部分を複数回にわたり同定する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ポリマー分子が、一本鎖核酸分子であり、前記分子が、前記ナノポアの両側に形成された嵩高い構造により、前記ナノポア内にトラップされる、請求項４に記載の方法。
  7. 前記ポリマー分子の前記一部分が、それらが前記ポリマー分子の全長に沿う順序で同定される、請求項１に記載の方法。
  8. 複数の電圧下における前記電流が、電子署名を含み、（ｄ）が、前記電子署名を複数の基準電子署名と比較して、前記分子またはその一部分を同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記電流を、電圧波形に従い変化させる、請求項１に記載の方法。
  10. 前記電圧波形が、方形波、正弦波、三角波、鋸歯状波、または不規則波である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ナノポアが、アルファヘモリシンのナノポアまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ＭｓｐＡ）のナノポアである、請求項１に記載の方法。
  12. 前記チップが、複数の電極に隣接または近接して複数のナノポアを含み、（ｉ）前記電極が、個別にアドレス指定されるか、（ｉｉ）印加された前記電圧が個別に制御されるか、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記分子が、二本鎖核酸分子であり、前記分子を解離させて、１または複数の一本鎖核酸分子を形成し、前記１または複数の一本鎖核酸分子に、前記ナノポアを通して通過させて、前記二本鎖核酸分子の配列を決定する、請求項１に記載の方法。
  14. 核酸ヘアピンを、前記二本鎖核酸分子の末端にライゲーションして、前記二本鎖核酸分子を解離させたときの、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む一本鎖核酸分子を用意する、請求項１３に記載の方法。
  15. 交流電流（ＡＣ）波形を、前記ナノポアおよび／または膜に印加することにより、前記電圧を変化させる、請求項１に記載の方法。
  16. 前記ＡＣ波形の周波数が、少なくとも約１００Ｈｚである、請求項１５に記載の方法。
  17. 核酸分子またはその一部分を配列決定するための方法であって、
    （ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子を用意するステップと、
    （ｂ）第１の核酸セグメントを、前記二本鎖核酸分子の第１の末端にライゲーションするステップであって、前記第１の核酸セグメントが、前記センス鎖を前記アンチセンス鎖と、前記二本鎖核酸分子の前記第１の末端において連結するステップと、
    （ｃ）前記二本鎖核酸分子を解離させて、前記センス鎖のセンス部分および前記アンチセンス鎖のアンチセンス部分を含む一本鎖核酸分子をもたらすステップと、
    （ｄ）前記一本鎖核酸分子に、電極に隣接または近接して配置される膜内の、ナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過させるステップであって、前記電極が、前記一本鎖核酸分子が前記ナノポア内に存在するかまたはナノポアを通してもしくはナノポア近傍を通過するときの電流を検出するように適合されているステップと、
    （ｅ）前記一本鎖核酸分子が、前記ナノポア内に存在するかまたはナノポアを通してもしくはナノポア近傍を通過する間に、前記電極を使用し、電流の測定値を得るステップと、
    （ｆ）前記二本鎖核酸の前記配列を、（ｅ）で得られた前記電流の測定値から決定するステップと
    を含み、１または複数のランダム減速バンプ分子が、前記一本鎖核酸分子またはその一部分に結合する方法。
  18. 前記第１の核酸セグメントが、核酸ヘアピンである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記第１の核酸セグメントが、第１の識別子をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記第１の識別子により、前記二本鎖核酸分子がどの試料に由来するのかが同定される、請求項１９に記載の方法。
  21. （ｂ）の後で、第２の核酸セグメントを、前記二本鎖核酸分子の第２の末端にライゲーションするステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記第２の核酸セグメントが、前記ナノポア内に前記一本鎖核酸分子をトラップすることが可能である一部分を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 温度が約６０℃を下回るときに、前記第２の核酸セグメントが、前記ナノポア内に前記一本鎖核酸分子をトラップすることが可能である、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記第２の核酸セグメントが、第２の識別子を含む、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記第２の識別子を使用して、前記一本鎖核酸分子が、前記ナノポアを通して第１の向きに通過するのかまたは第２の向きに通過するのかを決定することが可能である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における前記一本鎖核酸分子の通過速度が、前記１または複数のランダム減速バンプ分子を一助として減速される、請求項１７に記載の方法。
  27. 前記一本鎖核酸分子の前記通過速度が減速されるかまたは失速されるときに、電流の測定値が得られる、請求項２６に記載の方法。
  28. 電流の測定を、前記ナノポア越しに、かつ／または前記膜越しに印加される複数の電圧下で行う、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記１または複数のランダム減速バンプ分子のうちの個々のランダム減速バンプ分子が、リボ核酸を含む、請求項２６に記載の方法。
  30. 核酸分子またはその一部分を配列決定するための方法であって、
    （ａ）一本鎖核酸分子に、電極に隣接または近接して配置される膜内のナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過させるステップであって、前記一本鎖核酸分子が、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々の末端部分にライゲーションされた核酸セグメントを介して前記アンチセンス鎖に連結された前記センス鎖を含み、前記電極が、前記一本鎖核酸分子が前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を通過するときの電流を検出するように適合されているステップと、
    （ｂ）前記一本鎖核酸分子に前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を通過させる間に、前記電極を一助として電流の測定値を得るステップと、
    （ｃ）前記一本鎖核酸分子の配列を、（ｂ）で得られた電流の測定値から決定するステップと
    を含み、１または複数のランダム減速バンプ分子が、前記一本鎖核酸分子またはその一部分に結合する方法。
  31. （ｃ）における、前記一本鎖核酸分子の配列を決定するステップが、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子の配列を決定することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記核酸セグメントが、核酸ヘアピンである、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における前記一本鎖核酸分子の通過速度が、前記１または複数のランダム減速バンプ分子を一助として減速される、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記一本鎖核酸分子の前記通過速度が減速されるかまたは失速されるときに、電流の測定値が得られる、請求項３３に記載の方法。
  35. 電流の測定を、前記ナノポア越しに、かつ／または前記膜越しに印加される複数の電圧下で行う、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記１または複数のランダム減速バンプ分子のうちの個々のランダム減速バンプ分子が、リボ核酸を含む、請求項３３に記載の方法。
  37. 核酸分子を配列決定するための方法であって、
    （ａ）電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも１つのナノポアを含むチップを用意するステップであって、前記電極が、前記核酸分子またはその一部分を検出するように適合されているステップと、
    （ｂ）前記核酸分子を、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍に方向付けるステップであり、前記核酸分子と会合させた少なくとも１つのランダムリボ核酸（ＲＮＡ）減速バンプ分子を一助として、前記核酸分子の前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における進行を停止または失速させるステップと、
    （ｃ）前記核酸分子が、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を通過するときに、前記核酸分子またはその一部分を配列決定するステップと
    を含む方法。
  38. 前記ランダムＲＮＡ減速バンプ分子を、前記核酸分子と非共有結合的に会合させる、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ランダムＲＮＡ減速バンプ分子が、１または複数のオリゴヌクレオチド塩基の配列を含有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記ランダム減速バンプ分子の長さが、最長８オリゴヌクレオチド塩基である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記オリゴヌクレオチド塩基が、前記核酸分子と対合する、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記ランダムＲＮＡ減速バンプ分子が、ユニバーサル塩基、モルホリノ、グリコールヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、メチル化核酸塩基、修飾塩基、非結合塩基模倣体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸、またはこれらの任意の組合せを有する、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記ランダムＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させる、請求項３７に記載の方法。
  44. 前記ランダムＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、請求項３７に記載の方法。
  45. 前記ランダムＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させ、別のランダムＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、請求項３７に記載の方法。
  46. 前記核酸分子が前記ナノポアを通して通過するときに、前記ランダムＲＮＡ減速バンプ分子が前記核酸分子から解離する、請求項３７に記載の方法。
  47. 前記ナノポアが、アルファ−ヘモリシンのナノポアである、請求項３７に記載の方法。
  48. 前記核酸分子が、一本鎖である、請求項３７に記載の方法。
  49. 前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速されるときに、前記核酸分子の単一の塩基が同定される、請求項３７に記載の方法。
  50. 前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速されるときに、前記核酸分子の最大３つの塩基が同定される、請求項３７に記載の方法。
  51. 前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速されるときに、前記核酸分子の最大５つの塩基が同定される、請求項３７に記載の方法。
  52. 前記核酸分子と会合させた複数のランダムＲＮＡ減速バンプ分子を一助として、前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速される、請求項３７に記載の方法。
  53. 核酸分子の配列情報を得るための方法であって、
    （ａ）前記核酸分子と会合させた少なくとも１つのランダムリボ核酸（ＲＮＡ）減速バンプ分子を含む二重鎖セグメントを形成するステップと、
    （ｂ）前記核酸分子に、膜内のナノポアを通してまたはナノポア近傍を流動させるステップであり、前記膜を、電極に隣接または近接して配置し、前記核酸分子に、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を流動させると、前記二重鎖セグメントが、前記ナノポアへ、または前記ナノポア越しに方向付けられるステップと、
    （ｃ）前記核酸分子の、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍の前記流動時において、電気シグナルを、前記電極から得るステップであり、前記電気シグナルが、前記核酸分子の１または複数の塩基と、前記ナノポアの少なくとも一部分との相互作用と関連し、前記核酸分子の、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における前記流動が、前記二重鎖セグメントを一助として低減されるステップと
    を含む方法。
  54. （ｃ）における前記流動が、前記ランダムＲＮＡ減速バンプ分子と前記ナノポアとの前記相互作用時において低減される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ナノポアが、前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記流動を制限する狭窄部を含む、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記二重鎖セグメント内に含まれる前記核酸分子の一部分に、前記ナノポアを通して流動させる前に、前記ランダムＲＮＡ減速バンプ分子を、前記核酸分子から解離させるステップをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  57. 前記核酸分子を前記ナノポア内にトラップするステップをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  58. 前記核酸分子の１または複数の末端部分に形成された１または複数の嵩高い構造を一助として、前記核酸分子が、前記ナノポア内にトラップされる、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記核酸分子の１または複数の末端部分に取り付けられた１または複数の嵩高い構造を一助として、前記核酸分子が、前記ナノポア内にトラップされる、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記核酸分子の流動の方向を反転させるステップをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  61. 前記核酸分子の流動の前記方向を反転させるステップの後に前記核酸分子の少なくとも一部分を再配列決定するステップをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記ナノポアが、アルファ−ヘモリシンのナノポアである、請求項５３に記載の方法。
  63. 前記核酸分子が、一本鎖である、請求項５３に記載の方法。
  64. 前記少なくとも１つのランダムＲＮＡ減速バンプ分子が、１または複数のオリゴヌクレオチド塩基の配列を含有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項５３に記載の方法。
  65. 前記少なくとも１つのランダムＲＮＡ減速バンプ分子が、ユニバーサル塩基、モルホリノ、グリコールヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、メチル化核酸塩基、修飾塩基、非結合塩基模倣体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸、またはこれらの任意の組合せを有する、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記少なくとも１つのランダムＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させる、請求項５３に記載の方法。
  67. 前記少なくとも１つのランダムＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、請求項５３に記載の方法。
  68. 前記少なくとも１つのランダムＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させ、別のランダムＲＮＡ減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、請求項５３に記載の方法。
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