JP2018072353A - ナノポアベースの分子検出および配列決定 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年1月20日に出願した米国仮特許出願第61/589,196号、2012年1月23日に出願した米国仮特許出願第61/589,719号および2012年2月17日に出願した米国仮特許出願第61/600,227号の利益を主張する。これらの出願の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
(項目1)
分子またはその一部分を同定するための方法であって、
(a)電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも1つのナノポアを含むチップを用意するステップであって、前記電極は、前記ナノポアを通して流れる電流を検出するように適合されているステップと、
(b)分子またはその一部分を前記ナノポア内に挿入するステップと、
(c)前記ナノポア越しに、かつ/または前記膜越しに印加される電圧を変化させるステップと、
(d)複数の電圧下において前記電流を測定して、前記分子またはその一部分を同定するステップと
を含む方法。
(項目2)
前記分子が、ポリマー分子であり、前記ポリマー分子が、前記ナノポアを通して通過するか、または前記ナノポア内に存在するときに、前記ポリマー分子の一部分が同定される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記ポリマー分子が、核酸であり、前記ポリマー分子の前記一部分が、核酸または核酸群である、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記ポリマー分子が、ポリペプチドであり、前記ポリペプチドの前記一部分が、アミノ酸またはアミノ酸群である、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記ポリマー分子の前記ナノポアを通しての通過速度が、1または複数の減速バンプ分子を一助として減速され、前記ポリマー分子の前記通過速度が減速されるときに、前記ポリマー分子の一部分が同定される、項目2に記載の方法。
(項目6)
個々の減速バンプ分子が、リボ核酸を含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記ポリマー分子が、前記ナノポア内にトラップされる、項目2に記載の方法。
(項目8)
前記ポリマー分子に、前記ナノポアを通して前後に縫うように進ませて、前記ポリマー分子の少なくとも一部分を複数回にわたり同定する、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記ポリマー分子が、一本鎖核酸分子であり、前記分子が、前記ナノポアの両側に形成された嵩高い構造により、前記ナノポア内にトラップされる、項目7に記載の方法。
(項目10)
前記ポリマー分子の前記一部分が、それらが前記ポリマー分子の全長に沿う順序で同定される、項目2に記載の方法。
(項目11)
前記分子が、ヌクレオチドに結合している、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記ヌクレオチドが、成長中の核酸鎖に組み込まれる間に、前記分子またはその一部分が同定される、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記ヌクレオチドが成長中の核酸鎖に組み込まれると、前記分子が前記ヌクレオチドから放出される、項目11に記載の方法。
(項目14)
前記ヌクレオチドが前記成長中の核酸鎖に組み込まれる順序で前記分子が同定される、項目13に記載の方法。
(項目15)
複数の電圧下における前記電流が、電子署名を含み、(d)が、前記電子署名を複数の基準電子署名と比較して、前記分子またはその一部分を同定することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記電流を、電圧波形に従い変化させる、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記電圧波形が、方形波、正弦波、三角波、鋸歯状波、または不規則波である、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記ナノポアが、アルファヘモリシンのナノポアまたはMycobacterium smegmatis(MspA)のナノポアである、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記チップが、複数の電極に隣接または近接して複数のナノポアを含み、(i)前記電極が、個別にアドレス指定されるか、(ii)印加された前記電圧が個別に制御されるか、または(ii)(i)および(ii)の両方である、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記分子が、二本鎖核酸分子であり、前記分子を解離させて、1または複数の一本鎖核酸分子を形成し、前記1または複数の一本鎖核酸分子に、前記ナノポアを通して通過させて、前記二本鎖核酸分子の配列を決定する、項目1に記載の方法。
(項目21)
核酸ヘアピンを、前記二本鎖核酸分子の末端にライゲーションして、前記二本鎖核酸分子を解離させたときの、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む一本鎖核酸分子を用意する、項目20に記載の方法。
(項目22)
交流電流(AC)波形を、前記ナノポアおよび/または膜に印加することにより、前記電圧を変化させる、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記AC波形の周波数が、少なくとも約100Hzである、項目22に記載の方法。
(項目24)
核酸分子またはその一部分を配列決定するための方法であって、
(a)センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子を用意するステップと、
(b)第1の核酸セグメントを、前記二本鎖核酸分子の第1の末端にライゲーションするステップであって、前記第1の核酸セグメントが、前記センス鎖を前記アンチセンス鎖と、前記二本鎖核酸分子の前記第1の末端において連結するステップと、
(c)前記二本鎖核酸分子を解離させて、前記センス鎖のセンス部分および前記アンチセンス鎖のアンチセンス部分を含む一本鎖核酸分子をもたらすステップと、
(d)前記一本鎖核酸分子に、電極に隣接または近接して配置される膜内の、ナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過させるステップであって、前記電極が、前記一本鎖核酸分子が前記ナノポア内に存在するかまたはナノポアを通してもしくはナノポア近傍を通過するときの電流を検出するように適合されているステップと、
(e)前記一本鎖核酸分子が、前記ナノポア内に存在するかまたはナノポアを通してもしくはナノポア近傍を通過する間に、前記電極を使用し、電流の測定値を得るステップと、
(f)前記二本鎖核酸の前記配列を、(e)で得られた前記電流の測定値から決定するステップと
を含む方法。
(項目25)
前記第1の核酸セグメントが、核酸ヘアピンである、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記第1の核酸セグメントが、第1の識別子をさらに含む、項目24に記載の方法。
(項目27)
前記第1の識別子により、前記二本鎖核酸分子がどの試料に由来するのかが同定される、項目26に記載の方法。
(項目28)
(b)の後で、第2の核酸セグメントを、前記二本鎖核酸分子の第2の末端にライゲーションするステップをさらに含む、項目24に記載の方法。
(項目29)
前記第2の核酸セグメントが、前記ナノポア内に前記一本鎖核酸分子をトラップすることが可能である一部分を含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
温度が約60℃を下回るときに、前記第2の核酸セグメントが、前記ナノポア内に前記一本鎖核酸分子をトラップすることが可能である、項目28に記載の方法。
(項目31)
前記第2の核酸セグメントが、第2の識別子を含む、項目28に記載の方法。
(項目32)
前記第2の識別子を使用して、前記一本鎖核酸分子が、前記ナノポアを通して第1の向きに通過するのかまたは第2の向きに通過するのかを決定することが可能である、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における前記一本鎖核酸分子の通過速度が、1または複数の減速バンプ分子を一助として減速される、項目24に記載の方法。
(項目34)
前記一本鎖核酸分子の前記通過速度が減速されるかまたは失速されるときに、電流の測定値が得られる、項目33に記載の方法。
(項目35)
電流の測定を、前記ナノポア越しに、かつ/または前記膜越しに印加される複数の電圧下で行う、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記1または複数の減速バンプ分子のうちの個々の減速バンプ分子が、リボ核酸を含む、項目33に記載の方法。
(項目37)
核酸分子またはその一部分を配列決定するための方法であって、
(a)一本鎖核酸分子に、電極に隣接または近接して配置される膜内のナノポアを通してまたはナノポア近傍を通過させるステップであって、前記一本鎖核酸分子が、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々の末端部分にライゲーションされた核酸セグメントを介して前記アンチセンス鎖に連結された前記センス鎖を含み、前記電極が、前記一本鎖核酸分子が前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を通過するときの電流を検出するように適合されているステップと、
(b)前記一本鎖核酸分子に前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を通過させる間に、前記電極を一助として電流の測定値を得るステップと、
(c)前記一本鎖核酸分子の配列を、(b)で得られた電流の測定値から決定するステップと
を含む方法。
(項目38)
(c)における、前記一本鎖核酸分子の配列を決定するステップが、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子の配列を決定することをさらに含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記核酸セグメントが、核酸ヘアピンである、項目37に記載の方法。
(項目40)
前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における前記一本鎖核酸分子の通過速度が、1または複数の減速バンプ分子を一助として減速される、項目37に記載の方法。
(項目41)
前記一本鎖核酸分子の前記通過速度が減速されるかまたは失速されるときに、電流の測定値が得られる、項目40に記載の方法。
(項目42)
電流の測定を、前記ナノポア越しに、かつ/または前記膜越しに印加される複数の電圧下で行う、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記1または複数の減速バンプ分子のうちの個々の減速バンプ分子が、リボ核酸を含む、項目40に記載の方法。
(項目44)
核酸分子を配列決定するための方法であって、
(a)電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも1つのナノポアを含むチップを用意するステップであって、前記電極が、前記核酸分子またはその一部分を検出するように適合されているステップと、
(b)前記核酸分子を、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍に方向付けるステップであり、前記核酸分子と会合させた少なくとも1つのリボ核酸(RNA)減速バンプ分子を一助として、前記核酸分子の前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における進行を停止または失速させるステップと、
(c)前記核酸分子が、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を通過するときに、前記核酸分子またはその一部分を配列決定するステップと
を含む方法。
(項目45)
前記RNA減速バンプ分子を、前記核酸分子と非共有結合的に会合させる、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記RNA減速バンプ分子が、1または複数のオリゴヌクレオチド塩基の配列を含有するオリゴヌクレオチドを含む、項目44に記載の方法。
(項目47)
前記減速バンプ分子の長さが、最長8オリゴヌクレオチド塩基である、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記オリゴヌクレオチド塩基が、前記核酸分子と対合する、項目46に記載の方法。
(項目49)
前記RNA減速バンプ分子が、ユニバーサル塩基、モルホリノ、グリコールヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、メチル化核酸塩基、修飾塩基、非結合塩基模倣体、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸、またはこれらの任意の組合せを有する、項目46に記載の方法。
(項目50)
前記RNA減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させる、項目44に記載の方法。
(項目51)
前記RNA減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、項目44に記載の方法。
(項目52)
前記RNA減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させ、別のRNA減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、項目44に記載の方法。
(項目53)
前記核酸分子が前記ナノポアを通して通過するときに、前記RNA減速バンプ分子が前記核酸分子から解離する、項目44に記載の方法。
(項目54)
前記ナノポアが、アルファ−ヘモリシンのナノポアである、項目44に記載の方法。
(項目55)
前記核酸分子が、一本鎖である、項目44に記載の方法。
(項目56)
前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速されるときに、前記核酸分子の単一の塩基が同定される、項目44に記載の方法。
(項目57)
前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速されるときに、前記核酸分子の最大3つの塩基が同定される、項目44に記載の方法。
(項目58)
前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速されるときに、前記核酸分子の最大5つの塩基が同定される、項目44に記載の方法。
(項目59)
前記核酸分子と会合させた複数のRNA減速バンプ分子を一助として、前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記進行が停止または失速される、項目44に記載の方法。
(項目60)
核酸分子の配列情報を得るための方法であって、
(a)前記核酸分子と会合させた少なくとも1つのリボ核酸(RNA)減速バンプ分子を含む二重鎖セグメントを形成するステップと、
(b)前記核酸分子に、膜内のナノポアを通してまたはナノポア近傍を流動させるステップであり、前記膜を、電極に隣接または近接して配置し、前記核酸分子に、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍を流動させると、前記二重鎖セグメントが、前記ナノポアへ、または前記ナノポア越しに方向付けられるステップと、
(c)前記核酸分子の、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍の前記流動時において、電気シグナルを、前記電極から得るステップであり、前記電気シグナルが、前記核酸分子の1または複数の塩基と、前記ナノポアの少なくとも一部分との相互作用と関連し、前記核酸分子の、前記ナノポアを通してまたは前記ナノポア近傍における前記流動が、前記二重鎖セグメントを一助として低減されるステップと
を含む方法。
(項目61)
(c)における前記流動が、前記RNA減速バンプ分子と前記ナノポアとの前記相互作用時において低減される、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記ナノポアが、前記核酸分子の前記ナノポアを通しての前記流動を制限する狭窄部を含む、項目60に記載の方法。
(項目63)
前記二重鎖セグメント内に含まれる前記核酸分子の一部分に、前記ナノポアを通して流動させる前に、前記RNA減速バンプ分子を、前記核酸分子から解離させるステップをさらに含む、項目60に記載の方法。
(項目64)
前記核酸分子を前記ナノポア内にトラップするステップをさらに含む、項目60に記載の方法。
(項目65)
前記核酸分子の1または複数の末端部分に形成された1または複数の嵩高い構造を一助として、前記核酸分子が、前記ナノポア内にトラップされる、項目64に記載の方法。
(項目66)
前記核酸分子の1または複数の末端部分に取り付けられた1または複数の嵩高い構造を一助として、前記核酸分子が、前記ナノポア内にトラップされる、項目64に記載の方法。
(項目67)
前記核酸分子の流動の方向を反転させるステップをさらに含む、項目60に記載の方法。
(項目68)
前記核酸分子の流動の前記方向を反転させるステップの後に前記核酸分子の少なくとも一部分を再配列決定するステップをさらに含む、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記ナノポアが、アルファ−ヘモリシンのナノポアである、項目60に記載の方法。
(項目70)
前記核酸分子が、一本鎖である、項目60に記載の方法。
(項目71)
前記少なくとも1つのRNA減速バンプ分子が、1または複数のオリゴヌクレオチド塩基の配列を含有するオリゴヌクレオチドを含む、項目60に記載の方法。
(項目72)
前記少なくとも1つのRNA減速バンプ分子が、ユニバーサル塩基、モルホリノ、グリコールヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、メチル化核酸塩基、修飾塩基、非結合塩基模倣体、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸、またはこれらの任意の組合せを有する、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記少なくとも1つのRNA減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させる、項目60に記載の方法。
(項目74)
前記少なくとも1つのRNA減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、項目60に記載の方法。
(項目75)
前記少なくとも1つのRNA減速バンプ分子を、前記膜のシス側で、前記核酸分子と会合させ、別のRNA減速バンプ分子を、前記膜のトランス側で、前記核酸分子と会合させる、項目60に記載の方法。
本発明のさらなる態様および利点は、本発明の例示的な実施形態だけが示され、記載される以下の詳細な記載から、当業者にたやすく明らかとなろう。気づかれる通り、全てが本発明から逸脱しない限りにおいて、本発明は、他の実施形態および異なる実施形態も可能であり、そのいくつかの細部は、多様で明白な点において改変が可能である。したがって、図面および記載は、性格において例示的であると考えられるべきであり、限定的であると考えられるべきではない。
参照による組込み
本明細書では、ナノポアにより、分子またはその一部分を同定するためのシステムおよび方法が提供される。ナノポアにより、分子またはその一部分などの分子種を同定する方法は、電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも1つのナノポアを含むチップを用意するステップを含みうる。電極は、ナノポアを通して流れる電流を検出するように適合されていてもよい。方法は、分子またはその一部分をナノポア内に挿入するステップと、ナノポア越しに、かつ/または膜越しに印加される電圧を変化させるステップとをさらに含みうる。場合によっては、方法は、複数の電圧下における電流を測定して、分子またはその一部分を同定するステップも含む。いくつかの実施形態では、複数の電圧下における電流は、電子署名を含み、電子署名を複数の基準電子署名と比較して、分子またはその一部分を同定するステップもさらに含む。
図3は、本明細書で記載される通り、分子を検出する(および/または核酸を配列決定する)のに使用されうるナノポアデバイス100(またはセンサ)を概略的に例示する。脂質二重層を含有するナノポアは、抵抗および静電容量を特徴としうる。ナノポアデバイス100は、伝導性固体基板106の脂質二重層適合性表面104上に形成された脂質二重層102を含み、この場合、脂質二重層適合性表面104は、脂質二重層非適合性表面105により隔絶させることができ、伝導性固体基板106は、絶縁材料107により電気的に絶縁することができ、脂質二重層102は、脂質二重層非適合性表面105上に形成されたアモルファス脂質103により取り囲むことができる。脂質二重層102には、検出される分子および/または小型のイオン(例えば、Na+、K+、Ca2+、Cl−)に、脂質二重層102の2つの側面の間を通過させるのに十分に大きなナノポア110を有する単一ナノポア構造108を埋め込むことができる。水分子層114を、脂質二重層適合性表面104上に吸着させ、脂質二重層102と脂質二重層適合性表面104との間に挟み込むことができる。親水性の脂質二重層適合性表面104上に吸着させた水性薄膜114は、脂質分子の秩序化を促進し、脂質二重層適合性表面104上における脂質二重層の形成を容易としうる。検出される分子(例えば、必要に応じて、任意選択で、タグ付けされたヌクレオチドまたは他の構成要素を伴う核酸分子)112の溶液を含有する試料チャンバ116を、脂質二重層102の上方に装備させることができる。溶液は、電解質を含有し、最適のイオン濃度に緩衝処理され、ナノポア110の開放を保つように最適のpHで維持された水溶液でありうる。デバイスは、脂質二重層越しに電気刺激(例えば、電圧バイアス)をもたらし、脂質二重層の電気的特徴(例えば、抵抗、静電容量、およびイオン電流の流れ)をセンシングするための、可変電圧供給源120に連結された電極対118(陰極ノード118aおよび陽極ノード118bを含む)を含む。陽性電極118bの表面は、脂質二重層適合性表面104の一部であるか、またはこの一部を形成する。伝導性固体基板106は、電極118のうちの1つの一部に連結することもでき、これを形成することもできる。デバイス100はまた、電気刺激を制御し、検出されたシグナルを加工するための電気回路122も含みうる。いくつかの実施形態では、(例えば、可変型)電圧供給源120は、電気回路122の一部として含まれる。電気回路122は、増幅器、積分器、ノイズフィルタ、フィードバック制御ロジック、および/または他の多様な構成要素を含みうる。電気回路122は、ケイ素基板128内に組み込まれた電気集積回路であることが可能であり、メモリ126に連結されたコンピュータプロセッサ124にさらに連結することもできる。
場合によって、電流は、印加される異なる電圧下で測定することができる。これを達成するために、所望の電位を、電極に印加し、その後、印加された電位を、測定を通じて維持することができる。ある実装では、本明細書で記載される通り、オペアンプ積分器トポロジーをこの目的で使用することができる。積分器は、容量帰還により、電極における電位を維持する。積分器回路は、際立った直線性、セル間マッチング、および補正特徴をもたらしうる。オペアンプ積分器は、要請される性能を達成するために、大きなサイズを要請することが典型的である。本明細書では、より小型の積分器トポロジーが記載される。
検出サイクルにおいて電極を再帯電させる能力は、犠牲電極または通電反応において分子特徴を変化させる電極(例えば、銀を含む電極)を使用する場合に有利でありうる。電極は、検出サイクルにおいて枯渇することもあるが、場合によっては、電極は、検出サイクルにおいて枯渇しないこともある。再帯電は、電極が小型である場合(例えば、電極が、平方ミリメートル当たりに少なくとも500の電極を有する電極のアレイをもたらすのに十分な程度に小型である場合)に問題となりうる完全な枯渇など、所与の枯渇限界に電極が到達することを防止しうる。場合によって、電極の寿命は、電極の幅で見積もられ、これに少なくとも部分的に依存する。
セル回路の例を、図4に示す。印加される電圧Vaは、MOSFET電流コンベアゲート401の手前のオペアンプ1200に印加する。この図ではまた、電極402ならびにデバイス403により検出される核酸および/またはタグの抵抗も示される。
本発明は、分子を検出し、かつ/または核酸を配列決定するための、ナノポアアレイ型検出器(またはセンサ)を提供する。図6を参照すると、ナノポアアレイ型検出器上で、複数の(例えば、核酸)分子を検出および/または配列決定することができる。この図で、各ナノポアの位置(例えば、601)は、ポリメラーゼ酵素および/またはホスファターゼ酵素に任意選択で接合されたナノポアを含む。本明細書で記載される各アレイ位置にはまた一般に、センサも存在する。いくつかの例では、核酸ポリメラーゼに接合されたナノポアアレイが提供され、タグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼと共に組み込まれる。重合化時に、タグは、ナノポアにより検出される(例えば、ナノポア内もしくはナノポアを通して放出および通過させることにより、またはナノポアに提示することにより)。
本発明のデバイス、システム、および方法は、コンピュータシステムを一助として調節することができる。図8は、ナノポアによる検出および/または核酸配列決定システム802に連結されたコンピュータシステム801を含むシステム800を示す。コンピュータシステム801は、1または複数のサーバでありうる。コンピュータシステム801をプログラムして、試料の調製および加工、ならびに配列決定システム802による核酸の配列決定を調節することができる。ナノポアによる検出および/または配列決定システム802は、本明細書で記載されるナノポアベースの配列決定装置(または検出器)でありうる。
核酸を配列決定するための方法は、配列決定される核酸を有する生物学的試料を回収するステップと、核酸試料を生物学的試料から抽出または他の形で単離するステップと、場合によっては、核酸試料を配列決定用に調製するステップとを含みうる。
本明細書では、1もしくは複数のナノポアを使用するか、またはこれらを一助として、核酸を配列決定するための方法、デバイス、およびシステムが記載される。1または複数のナノポアは、集積回路の一部であるか、または集積回路に連結されたセンシング電極に隣接または近接して配置される、膜内のナノポア(例えば、脂質二重層)でありうる。
本明細書では、ポリヌクレオチドを配列決定するためのシステムおよび方法が提供される。特に、本明細書で開示されるシステムおよび方法は、分子(例えば、ポリヌクレオチド)の、ナノポア(または一部の種類のタンパク質または突然変異体タンパク質)の内部、ナノポア(または一部の種類のタンパク質または突然変異体タンパク質)を通して、または少なくとも部分的にナノポア(または一部の種類のタンパク質または突然変異体タンパク質)を通しての制御、速さ、動き、および/または移動を最適化する。場合によっては、十分な電流狭窄情報を蓄積して、ポリヌクレオチドの一本鎖領域内の連続ヌクレオチドにより、分子および/または配列を同定するために、通過速度を、十分な長さの時間にわたり、十分に減速するかまたは失速させる。すなわち、いくつかの実施形態では、標的の一本鎖部分(「ss」)が精査され、遺伝子解析がなされ、検出される間のある長さの時間にわたり、それらの二本鎖部分が、ナノポアの一部分の内部に「貼り付けられる」ように、減速バンプ(例えば、オリゴヌクレオチドnマー)を、標的ポリヌクレオチドに結合させることができる。ある長さの時間の後、「貼り付けられた」オリゴヌクレオチドは、溶融させて消失させることができ、試料は、ナノポアを通して移動しうる。いくつかの実施形態では、試料が、制御され、かつ/または一定の速度でナノポアを通して移動するよう、各オリゴヌクレオチドnマーが溶融して消失しうるか、または均一の速度で除去されるように、オリゴヌクレオチドnマーを選択することができる。減速バンプ分子の使用は、参照によりその全体において組み込まれる、PCT特許公開第WO2012/088339号、およびPCT特許公開第WO2012/088341号において記載されている。
ある実施形態では、試料ポリヌクレオチドを、多様な機能的部分と連結して、ナノポアの配列決定および/または同定を容易とする。機能的部分の例は、限定なしに述べると、本明細書で記載される嵩高前構造および識別子、ならびに試料ポリヌクレオチドの単離および濃縮を容易とする単離用タグを含む。機能的部分は、任意選択で、1または複数のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ss被験ポリヌクレオチドは、第1の条件下で第1の嵩高い構造(BS1)を形成しうる、第1の末端上の第1の嵩高前構造(PB1)と、第2の条件下で第2の嵩高い構造(BS2)を形成しうる、第2の末端上の第2の嵩高前構造(PB2)とを含む。いくつかの実施形態では、PB1は、第1の条件下でBS1を形成しうるssポリヌクレオチドセグメントを含む。第1の条件は、室温近傍〜70℃、約40℃以上、約30℃以上、約25℃以上、約20℃以上、または約15℃以上であることが可能な、第1の温度T1でありうる。いくつかの実施形態では、第1の条件は、T1、およびPB1に結合して、BS1を形成することが可能な、第1のリガンドの存在でありうる。第1のリガンドの例は、限定なしに述べると、PB1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、BS1の形成を容易とする他の化合物(例えば、PB1に接合されたリガンドと結合対を形成しうる化合物)を含む。このような結合対の例は、限定なしに述べると、抗体−抗原系、およびビオチン−ストレプトアビジン系、ならびに共有結合的相互作用および/または非共有結合的相互作用を介するこれらの組合せを含む。BS1が、ポリヌクレオチドの二次元構造または三次元構造(例えば、二重鎖、ヘアピン構造、多重ヘアピン構造および多重アーム構造)である場合、BS1の溶融温度(Tm1)は、15℃以上、約20℃以上、約25℃以上、約30℃以上、約35℃以上、約40℃以上、または約50℃以上である。
いくつかの実施形態では、ss被験ポリヌクレオチドは、識別子および単離用タグなどの機能的部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ss被験ポリヌクレオチドを、ランダム減速バンププールと接触させる場合、識別子および単離用タグは、それらにランダム減速バンププールが結合しないように構築する。例えば、識別子セグメントは、互いと結合することが好ましい、イソdG塩基およびイソdC塩基を有しうる。ランダム減速バンププールの減速バンプが、イソdG塩基またはイソdC塩基を有さない場合は、ランダム減速バンププールに由来する減速バンプを、識別子セグメント以外のss被験ポリヌクレオチドの区間に結合させることがより好ましいであろう。こうして、識別子の配列情報に関して収集される電気シグナルが少数となり、これにより、収集される電気シグナルを特徴付けることがより容易となろう。
単離用タグとは、リガンドと共に結合対を形成しうる構造であって、リガンドが、その濃縮または単離を容易とするようにさらに修飾された構造である。このような結合対の例は、限定なしに述べると、抗体−抗原系およびビオチン−ストレプトアビジン系を含む。濃縮または単離を容易とするさらなる修飾の例は、限定なしに述べると、リガンドの、たやすく濃縮および/または単離されうる電磁ビーズへの接合を含む。
試料ポリヌクレオチド、および1または複数の機能的部分を含む被験ポリヌクレオチドは、所望に応じて、従来の有機的方法および/または生物学的方法を使用して、試料ポリヌクレオチドを、他のセグメントとライゲーションすることにより構築する。
本発明の一態様は、試料ポリヌクレオチド配列を同定する方法であって、
(A1)二本鎖(ds)試料ポリヌクレオチドを用意するステップと、
(A2)第1の嵩高前(PB1)構造を、ds試料ポリヌクレオチドの第1の末端にライゲーションし、第2の嵩高前(PB2)構造を、ds試料ポリヌクレオチドの第2の末端にライゲーションするステップと、
(A3)A2のds試料ポリヌクレオチドを、ss被験ポリヌクレオチドに変性させるステップと、
(B1)第1の嵩高い構造(BS1)を、PB1から、ss被験ポリヌクレオチドの第1の末端上、第1の温度で形成するステップと、
(B2)第1の電位を印加して、ss被験ポリヌクレオチドにナノポアを通して流動させるステップと、
(B3)第2の嵩高い構造(BS2)を、PB2から、ss被験ポリヌクレオチドの第2の末端上、第2の温度で形成するステップと、
(B4)任意選択で、BS2により、ナノポアの狭窄領域の前で、ss被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、別の電位を印加して、ss被験ポリヌクレオチドの流動を反転させるステップと、
(B5)作業温度で、ランダム減速バンププールを、ss被験ポリヌクレオチドと接触させて、少なくとも1つの減速バンプ−ss被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを有する、減速バンプ−ss被験ポリヌクレオチド複合体を形成するステップと、
(B6)ナノポアの狭窄領域の前で、第1の減速バンプ−ss被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、第3の電位を印加して、減速バンプ−ss被験ポリヌクレオチド複合体に、ナノポアを通して流動させるステップと、
(B7)第1の減速バンプ−ss被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させるときに、第1の電気シグナルのセットを得、ssポリヌクレオチドの流動方向で、第1の減速バンプ−ss被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの前にあるヌクレオチド配列および第1の減速バンプ−ss被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントの最初の塩基対を特徴付けるステップと、
(B8)第1の減速バンプ−ss被験ポリヌクレオチド二重鎖セグメントを解離させ、ssポリヌクレオチドのナノポアを通しての流動を持続させるステップと、
(B9)BS1またはBS2により、ss被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、ステップ(B4)〜(B8)を反復するステップと
を含む方法に関する。
(B10)ナノポアの狭窄領域の前で、他の嵩高い構造により、ss被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、別の電位を印加して、ss被験ポリヌクレオチドを、ステップ(B5)におけるss被験ポリヌクレオチドの流動の逆方向に移動させるステップと、
(B11)ステップ(B4)〜(B10)を、少なくとも1回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、少なくとも20回、少なくとも25回、少なくとも30回、少なくとも50回、または少なくとも100回反復するステップと、
(B12)収集されたヌクレオチドの配列情報を重ね合せることにより、ss被験ポリヌクレオチド配列を構築するステップと
をさらに含む。
(1)他の嵩高い構造により、ss被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、ナノポアの狭窄領域の前で、第2の作業条件下において、ステップ(B4)〜(B8)を反復するステップと、
(2)ステップ(B9)および(1)を、少なくとも1回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、少なくとも20回、少なくとも25回、少なくとも30回、少なくとも50回、または少なくとも100回反復するステップと、
(3)収集されたヌクレオチドの配列情報を重ね合せることにより、試料ポリヌクレオチドの核酸配列を構築するステップと
をさらに含む。
(B2a)ナノポアの内側で第1の嵩高い構造を失速させるときに電気シグナルのセットを得、ss被験ポリヌクレオチドの流動方向で、第1の嵩高い構造の前にあるヌクレオチド配列および第1の嵩高い構造の最初の塩基対を特徴付けるステップ、
をさらに含み、ステップ(B3)は、
(B3a)ナノポアの内側で第2の嵩高い構造を失速させるときに別の電気シグナルのセットを得、ss被験ポリヌクレオチドの流動方向で、第2の嵩高い構造の前にあるヌクレオチド配列および第2の嵩高い構造の最初の塩基対を特徴付けるステップ
をさらに含む。
本発明の別の態様は、本明細書で記載されるss被験ポリヌクレオチド分子の配列情報を得る方法に関する。方法は、
(B1)被験ポリヌクレオチド分子の第1の末端に第1の嵩高い構造を形成するステップと、
(C1)減速バンプのプール(減速バンププール)を、被験ポリヌクレオチド分子と接触させて、少なくとも1つの減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを有する減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子複合体を形成するステップと、
(C2)ナノポアの狭窄領域の前で第1の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを失速させるまで、電位を印加して、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子複合体に、ナノポアを通して流動させるステップと、
(C3)被験ポリヌクレオチド分子の流動方向で、第1の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させるときに、第1の電気シグナルのセットを得るステップと、
(C4)第1の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを解離させ、ナノポアを通しての分子の流動を持続させるステップと、
(C5)BS1により、被験ポリヌクレオチド分子を失速させるか、減速するか、または停止させるまで、ステップ(C1)〜(C4)を反復するステップと
を含む。
(E1)第1の公知の減速バンプを、被験ポリヌクレオチド分子と接触させて、第1の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを有する、第1の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子複合体を形成するステップと、
(E2)ナノポアの狭窄領域の前で、第1の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを失速させるまで、電位を印加して、第1の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子複合体に、ナノポアを通して流動させるステップと、
(E3)第1の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させるとき、被験ポリヌクレオチド分子の流動方向で第1の電気シグナルのセットを得るステップと、
(E4)第1の公知の減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントを解離させ、ナノポアを通しての分子の流動を持続させるステップと、
(E5)第1の公知の減速バンプを、ナノポア型検出器システムから除去し、末端の嵩高い構造により、被験ポリヌクレオチドの流動を失速させるか、減速するか、または停止させるまで、被験ポリヌクレオチドの流動を反転させるステップと、
(E6)ステップ(E3)の被験ポリヌクレオチド分子の流動方向で、第1の公知の減速バンプの配列に加えてより長い公知の数の塩基を有する別の公知の減速バンプにより、ステップ(E1)〜(E5)を反復するステップであり、
E−a)公知の数が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16であり、
E−b)公知の数の塩基が、ユニバーサル塩基または試料ポリヌクレオチドの対応する位置における塩基と相補的な塩基であることが可能であり、
E−c)ステップ(E4)の条件が、例えば、減速バンプ−被験ポリヌクレオチド分子セグメントをうまく解離させるように、ステップ(E4)において、作業温度を上げることにより、かつ/または印加される電位値を増大させることにより調整されうるステップと
を含みうる。
本発明の別の態様は、試料ポリヌクレオチドを単離する方法であって、
本明細書で記載されるステップ(A1)〜(A3)を使用して、ss被験ポリヌクレオチドを調製するステップと、
(D1)ss被験ポリヌクレオチドの対応する末端が、失速するか、減速されるか、または停止することなく、ナノポアを通して進みうるように、2つの嵩高い構造のうちの1つを転換するステップと、
(D2)電位を印加して、ss標的ポリヌクレオチドを放出するステップと
を含む方法に関する。
(D3)単離用タグをリガンドに接合するステップ
をさらに含む。
(D3−1)放出されたss被験ポリヌクレオチドを含む伝導性の塩溶液を除去するステップと、
(D3−2)放出されたss被験ポリヌクレオチドを、電磁ビーズに接合されたリガンドと混合することにより、単離用タグをリガンドに接合するステップと、
(D3−3)従来の単離法を使用して、放出されたss被験ポリヌクレオチドを単離するステップと
をさらに含む。
(D4)単離ss被験ポリヌクレオチドを、従来の方法を使用して(例えば、塩基性溶液を使用して)、ビーズから除去するステップと、
(D5)PB1およびPB2を、ss被験ポリヌクレオチドから切断して、ss試料ポリヌクレオチドを創成するステップと
をさらに含む。
(D1−1)ナノポアの温度を、ほぼ第2の温度以上であり、かつ第1の温度以下に変化させて、BS2を嵩高くない構造に転換するステップ
をさらに含む。
本発明の別の態様は、複数のナノポア型検出器を使用して、試料ポリヌクレオチドを配列決定、同定、濃縮、および単離する方法に関する。単一のナノポア型検出器に関して本明細書で記載される同じ方法は、複数のナノポア型検出器にも使用することができる。
ナノポアを使用して、間接的に、任意選択で、電気的検出により核酸分子を配列決定することができる。間接的な配列決定は、成長中の鎖内に組み込まれるヌクレオチドが、ナノポア内を通して通過しない任意の方法でありうる。核酸分子は、ナノポアから任意の適切な距離内および/またはナノポアの近傍を通過することが可能であり、任意選択で、ヌクレオチド組込みイベントから放出されるタグがナノポア内(例えば、図2Cおよび図2Dに示される)で検出されるような距離内を通過しうる。任意選択で、タグを、それが放出される前にナノポア(図2Dに示される)内にあらかじめロードする。タグによる核酸分子の配列決定の例は、参照によりその全体において組み込まれる、PCT特許公開第WO2012/083249号において記載されている。
場合によっては、タグ付けされたヌクレオチドは、ヌクレオチド組込みイベントにおいて切断することが可能であり、ナノポアを一助として検出することが可能なタグを含む。タグは、ヌクレオチドの5’−リン酸に接合することができる。場合によって、タグは、フルオロフォアではない。タグは、その電荷、形状、サイズ、またはこれらの任意の組合せにより検出可能でありうる。タグの例は、多様なポリマーを含む。各種類のヌクレオチド(すなわち、A、C、G、T)は一般に、固有のタグを含む。
タグは、ナノポア内で検出することが可能な任意の化学基または分子でありうる。場合によって、タグは、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪族酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはこれらの組合せのうちの1または複数を含む。
任意の適切なタグを接合するための方法を使用することができる。例として述べると、タグは、(a)環式トリメタリン酸の生成を可能とする条件下で、ヌクレオチド三リン酸を、ジシクロヘキシルカルボジイミド/ジメチルホルムアミドと接触させるステップと、(b)−OHまたは−NH2による官能化化合物を形成するように、ステップa)から結果として生じる生成物を、求核試薬と接触させるステップと、(c)タグが末端のリン酸に間接的に結合し、これにより、ヌクレオチド三リン酸類似体を形成することを可能とする条件下で、ステップb)の生成物を、−COR基をそれに接合したタグと反応させるステップとにより末端のリン酸に接合することができる。
タグは、任意の形で放出することができる。場合によっては、タグを、ポリリン酸(例えば、図25)に接合し、ヌクレオチドを核酸分子に組み込む結果として、タグをそれに接合したポリリン酸の放出をもたらす。組込みは、任意選択でナノポアに接合された少なくとも1つのポリメラーゼにより触媒することができる。場合によって、少なくとも1つのホスファターゼ酵素もまた、ポアに接合することができる。ホスファターゼ酵素は、タグをポリリン酸から切断して、タグを放出することが可能である。場合によっては、ポリメラーゼ反応においてポリメラーゼにより生成するピロリン酸が、ポアに入る前にホスファターゼ酵素と相互作用するように、ホスファターゼ酵素を配置する。
場合によっては、ポリメラーゼにより、複数の異なる塩基(例えば、A、C、G、T、および/またはU)を含むタグ付けされたヌクレオチドのプールからの抜き出しがなされる。また、ポリメラーゼを、多様な種類のタグ付けされた塩基と繰り返し接触させることも可能である。この場合には、各種類のヌクレオチドが固有の塩基を有することが必要でない場合もあり、異なる塩基種類の間でサイクリングすると、工程に費用および複雑性がかさむにもかかわらず、場合によっては、この実施形態も本発明に包摂される。
二本鎖核酸分子(例えば、デオキシリボ核酸)は、周知の塩基対相互作用(例えば、AはTと相互作用し、GはCと相互作用する)に従いハイブリダイズする(例えば、互いと結合する)センス鎖およびアンチセンス鎖を有しうる。場合によって、センス鎖とアンチセンス鎖とは、周知のアルファ螺旋の立体構成において互いに巻きつきあう。一般に、センス鎖は、大半の生物により使用される周知のコドンに従いアミノ酸をコードする(例えば、5’〜3’方向に、TCAは一般に、アミノ酸であるセリン・・・などをコードする)鎖である。しかし、どちらの鎖がセンス鎖であり、どちらがアンチセンス鎖であるかの指示は、恣意的でありうる。全ての核酸がタンパク質をコードするわけではない。
(F1)第1の末端および第2の末端を有するds試料区間であり、
一本鎖(ss)試料ポリヌクレオチドおよびそのssアンチセンスポリヌクレオチド、
第1の末端でss試料ポリヌクレオチドとssアンチセンスポリヌクレオチドとを連結するリンカー、ならびに
各々が第2の末端でセンスポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドに連結される第1の嵩高前構造および第2の嵩高前構造
を含むds試料区間を含む二本鎖(ds)被験ポリヌクレオチドを調製するステップと、
(F2)A1のds被験ポリヌクレオチドを、一方の末端に第1の嵩高前構造を有し、他方の末端に第2の嵩高前構造を有する、ss被験ポリヌクレオチドに変性させるステップと、
(G1)第1の条件で、第1の嵩高前構造から第1の嵩高い構造(BS1)を形成するステップと、
(G2)任意選択で、BSHにより、ナノポアの狭窄領域の前で、ss被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、電位を印加して、ss被験ポリヌクレオチドにナノポア型検出器のナノポアを通して流動させるステップと、
(G3)第2の条件で、第2の嵩高前構造から第2の嵩高い構造(BS2)を形成するステップと、
(G4)任意選択で、BSLにより、ナノポアの狭窄領域の前で、ss被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、別の電位を印加して、ss被験ポリヌクレオチドの流動を反転させるステップと、
(G5)ストッパをss被験ポリヌクレオチドと接触させて、第1のストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントを含む被験ポリヌクレオチド複合体を形成するステップと、
(G6)ナノポアの狭窄領域の前で、第1のストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、別の電位を印加して、被験ポリヌクレオチド複合体にナノポアを通して流動させるステップと、
(G7)第1のストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させるときに、複数の電圧を有する電位を含む、一定の電位プロファイルまたは変化する電位プロファイルを、ナノポア型検出器の電極に印加し、第1の電気シグナルのセットを得るステップと、
(G8)第1の電気シグナルのセットを、ステップ(G7)における同じ電位プロファイル下で、被験ポリヌクレオチドの流動方向で、ストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある公知の構造について収集された電気シグナルと比較することにより、被験ポリヌクレオチドの流動方向で、第1のストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントの前にある構造を決定するステップと、
(G9)第1のストッパ−被験ポリヌクレオチドセグメントを解離させ、ポリヌクレオチドのナノポアを通しての流動を持続させるステップと、
(G10)BSHまたはBSLにより、ss被験ポリヌクレオチドを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、ステップ(G5)〜(G9)を反復するステップと、
(G11)任意選択で、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、・・・または100回にわたり、ステップ(G4)〜(G10)を反復するステップと、
(G12)試料ポリヌクレオチドおよびそのアンチセンスポリヌクレオチドの両方について収集されたヌクレオチドの配列情報を重ね合せることにより、試料ポリヌクレオチド配列を構築するステップと
を含む方法に関する。
(H1)アレイフォーマット内の複数のナノポアおよび複数のss被験ポリヌクレオチドを用意するステップと、
(H2)各ss被験ポリヌクレオチドについて、本明細書で記載されるステップ(F1)〜(F2)および(G1)〜(G12)を実施するステップであり、ナノポアが、複数のナノポアのうちの1つであり、アレイフォーマット内の複数のナノポアの各々が、個別にアドレス指定され、複数のナノポアの各々に印加される電位が、個別に制御されるステップと
を含む。
本明細書では、ナノポアにより、分子またはその一部分を同定するためのシステムおよび方法が提供される。方法は、電極に隣接または近接して配置される膜内に少なくとも1つのナノポアを含むチップを用意するステップを含みうる。電極は、ナノポアを通して流れる電流を検出するように適合されていてもよい。方法は、分子またはその一部分をナノポア内に挿入するステップと、ナノポア越しに、かつ/または膜越しに印加される電圧を印加するステップとを含みうる。分子またはその一部分は、電流に影響を及ぼしうる(そして電流により同定されうる)。本明細書では、単一の電圧下で測定される電流は、分子またはその一部分を同定するのに不十分でありうることが認識される。ある態様では、本明細書で記載される方法は、複数の電圧下における電流を測定して、分子またはその一部分を同定するステップを含む。いくつかの実施形態では、複数の電圧下における電流は、電子署名を含み、電子署名を複数の基準電子署名と比較して、分子またはその一部分を同定するステップもさらに含む。
(I1)ストッパ−被験ポリマーセグメントを含む被験ポリマー複合体を用意するステップと、
(J1)ナノポアの狭窄領域の前で、ストッパ−被験ポリマーセグメントを失速させるか、減速するか、または停止させるまで、第1の試験電位を印加して、被験ポリマー複合体にナノポア型検出器のナノポアを通して流動させるステップと、
(J2)複数の電圧を有する電位を含む、変化する電位プロファイルを、ナノポア型検出器の電極に印加し、このとき、ストッパ−被験ポリマーセグメントを、ナノポアの内側で、滞留時間にわたり失速させ、第1の電気シグナルのセットを得るステップと、
(J3)第1の電気シグナルのセットを、ステップ(J2)における、同じ変化する電位プロファイル下で、被験ポリマーの流動方向で、ストッパ−被験ポリマーセグメントの前にある公知の構造について収集された電気シグナルと比較することにより、被験ポリマーの流動方向で、ストッパ−被験ポリマーセグメントの前にある構造を決定するステップと
を含む方法に関する。
(K1)アレイフォーマット内の複数のナノポアおよび複数のss被験ポリヌクレオチドを用意するステップと、
(K2)各ss被験ポリヌクレオチドについて、本明細書で記載されるステップを実施するステップであり、ナノポアが、複数のナノポアのうちの1つであり、アレイフォーマット内の複数のナノポアの各々が、個別にアドレス指定され、複数のナノポアの各々と関連する電位が、個別に制御されるステップと
を含む。
PB2構造(I)
BS2を一方の末端に有するss被験DNAを、T2より低い温度でナノポア内に捕捉し、T2より高い温度で放出する(図24)。
PB1およびPB2構造(II)
PB1は、BS2がPB2から形成される第2の温度(T2)より高い第1の温度(T1)でBS1を形成する。T2は、作業温度(Tw)より高い。本実施例では、Twは、室温を下回る。したがって、PB1は、比較的長いDNA二重鎖セグメントの所望の溶融温度が達成されるように、比較的長いDNA二重鎖セグメント(アンチセンスのDNAセグメントを伴うDNA二重鎖内、またはヘアピン構造内の)を有するようにデザインされる。
5℃において、ΔG=−4.5140kcal/モル(100%のフォールディング)、
ΔH=−67.90kcal/モル、
ΔS=−227.9cal/(K・モル)、および
Tm=24.8083℃
をもたらした。
4塩基の二重鎖セグメントによるDNAの失速
本実施例は、4塩基の二重鎖セグメントが、所望の配列情報を得るのに十分な滞留時間にわたり、ナノポア内でss被験DNAを失速させたことを例示する。
6塩基のランダム減速バンププールによるDNAの失速
本実施例は、ナノポアにうまく結合し、ナノポア型検出器内で失速し、被験DNAから解離する6塩基のランダム減速バンププールを例示する。
試料ポリヌクレオチドおよびそのアンチセンスポリヌクレオチドを含む被験ポリヌクレオチドの調製
B)アダプタにより容易とならない一本鎖ライゲーション
DNAナノポアによる検出により、単一ヌクレオチドの差別化が99%を超える信頼性で得る
(実施例7)
DNAナノポアによる検出を介して、ヌクレオチド二量体の差別化を得る
3’末端から12位において単一ヌクレオチド置換を有するポリT40 DNA(39T1N)を、変化する電位プロファイルを使用する、DNAナノポアによる検出を介して、95%を超える信頼性で互いから識別する
変化する電位をナノポア型検出器の電極に印加することにより、DNAナノポアによる検出を介して、A、T、C、およびGの単一ヌクレオチド差別化を得る
1.0μMのストレプトアビジン、および3’末端から12位において単一ヌクレオチド置換を有するポリA40 DNA(下記に示す、39A1N、DNA−AA、DNA−AT、DNA−AC、およびDNA−AG)、3’末端から12位において単一ヌクレオチド置換を有するポリC40 DNA(下記に示す、39C1N、DNA−CA、DNA−CT、DNA−CC、およびDNA−CG)、3’末端から12位において単一ヌクレオチド置換を有するポリT40 DNA(39T1N;実施例8と同様)、または基準DNA 30C(下記に示す、DNA−CR)による4μMのDNAを有するDNA原液を、実施例8で記載した方法に従い調製する。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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