JP2023513128A - ナノポアへの鋳型の貫通を低減する組成物 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Abstract
本出願は、例えば核酸シーケンシングのためのナノポアデバイスの使用中に、ナノポア結合ポリメラーゼによって置換された核酸鎖のナノポアへの有害な貫通を低減または遮断するプライマー化合物を含む組成物を開示する。また、ナノポアシークエンシングなどのナノポアをベースとする核酸検出技術における、有害な貫通事象を低減するために組成物を使用するための方法も開示される。【選択図】図１
Description
分野
本出願は、ナノポア結合ポリメラーゼによる鎖重合中の有害な鋳型の貫通を低減または遮断する組成物、およびナノポアをベースとする核酸検出技術、例えばナノポアシーケンシングにおいて組成物を使用するための方法に関する。
本出願は、ナノポア結合ポリメラーゼによる鎖重合中の有害な鋳型の貫通を低減または遮断する組成物、およびナノポアをベースとする核酸検出技術、例えばナノポアシーケンシングにおいて組成物を使用するための方法に関する。
背景
ナノポア単一分子－シーケンシングバイシンセシス（「ＳＢＳ」）は、ナノポアに共有結合したポリメラーゼ（または他の鎖伸長酵素）を使用して標的配列鋳型（すなわち、コピー鎖）に相補的なＤＮＡ鎖を合成し、各ヌクレオチドモノマーがその成長鎖に付加されるときに各ヌクレオチドモノマーの同一性を同時に検出する。例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０３６８７１０号、および第２０１８／００５７８７０Ａ１号、ならびに国際公開第２０１９／１６６４５７号を参照されたい。付加された各ヌクレオチドモノマーは、コピー鎖が合成される際にポリメラーゼ活性部位に隣接して位置するナノポアを通過するイオン流の変化によるシグナルをモニタリングすることによって検出される。正確で再現性のあるイオン流シグナルを得るには、各付加ヌクレオチドに結合したタグ部分がナノポアに入り、ナノポアを通過するイオン流を変化させ得るように、ナノポアの近くにポリメラーゼ活性部位を配置する必要がある。最適な性能のために、タグ部分は、タグに関連する特定のヌクレオチドをＳＢＳ溶液中の他のタグ付きヌクレオチドから明確に区別し得るように、ナノポアを通過するイオン流の変化に関連する検出可能で、識別可能な再現可能なシグナルを提供するのに十分な時間、ナノポア内に存在しなければならない（ベースライン「開電流」（ｏｐｅｎ ｃｕｒｒｅｎｔ）フローに対して）。
ナノポア単一分子－シーケンシングバイシンセシス（「ＳＢＳ」）は、ナノポアに共有結合したポリメラーゼ（または他の鎖伸長酵素）を使用して標的配列鋳型（すなわち、コピー鎖）に相補的なＤＮＡ鎖を合成し、各ヌクレオチドモノマーがその成長鎖に付加されるときに各ヌクレオチドモノマーの同一性を同時に検出する。例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０３６８７１０号、および第２０１８／００５７８７０Ａ１号、ならびに国際公開第２０１９／１６６４５７号を参照されたい。付加された各ヌクレオチドモノマーは、コピー鎖が合成される際にポリメラーゼ活性部位に隣接して位置するナノポアを通過するイオン流の変化によるシグナルをモニタリングすることによって検出される。正確で再現性のあるイオン流シグナルを得るには、各付加ヌクレオチドに結合したタグ部分がナノポアに入り、ナノポアを通過するイオン流を変化させ得るように、ナノポアの近くにポリメラーゼ活性部位を配置する必要がある。最適な性能のために、タグ部分は、タグに関連する特定のヌクレオチドをＳＢＳ溶液中の他のタグ付きヌクレオチドから明確に区別し得るように、ナノポアを通過するイオン流の変化に関連する検出可能で、識別可能な再現可能なシグナルを提供するのに十分な時間、ナノポア内に存在しなければならない（ベースライン「開電流」（ｏｐｅｎ ｃｕｒｒｅｎｔ）フローに対して）。
Ｋｕｍａｒら、（２０１２）’’ＰＥＧ－Ｌａｂｅｌｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，’’Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２：６８４；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ００６８４には、末端５’－ホスホロアミデートを介してｄＧヌクレオチドに結合した４つの異なる長さのＰＥＧ－クマリンタグを区別するためにナノポアを使用することが開示されており、ＤＮＡポリメラーゼによるこれらの４種のＰＥＧ－クマリンタグ付きｄＧヌクレオチドの効率的かつ正確な取り込みを別に実証している。米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０３６８７１０号、および第２０１８／００５７８７０号明細書も参照されたい。
国際公開第２０１３／１５４９９９号および第２０１３／１９１７９３号には、ナノポアＳＢＳのためのタグ付きヌクレオチドの使用が開示されており、分枝ＰＥＧ鎖を含む単一タグに結合した単一ヌクレオチドの予想される使用が開示されている。
国際公開第２０１５／１４８４０２号には、単一のタグに結合した単一のヌクレオチドを含むナノポアＳＢＳのためのタグ付きヌクレオチドの使用が開示されており、タグは、３０モノマー単位以上の長さを有する、ある範囲のオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド類似体）のいずれかを含む。
米国特許第９４１０１７２号には、オリゴカチオン－オリゴヌクレオチドコンジュゲートプライマーを使用して標的核酸を増幅する等温核酸増幅のための方法およびキットが開示されている。開示されている方法では、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼおよびポリアミンオリゴヌクレオチドコンジュゲートプライマーが使用されている。
ナノポアデバイスで使用され、ハイスループットナノポアシーケンシングを行う際に使用される電気化学的条件にさらされた場合に、より長い寿命を示す、ナノポアα－ヘモリシン（「α－ＨＬ」）の「ワイドポア」変異体が開発されている。例えば、２０１９年９月６日公開の国際公開第２０１９／１６６４５７号を参照されたい。ナノポアの寿命が長いほど、配列決定におけるリード長および全体的な精度が高くなる。構造的に、ワイドポア変異体は、細孔のシス開口から約４０オングストロームの深さに位置し、直径が約１０オングストロームの天然に存在する狭窄部位（すなわち、細孔の最も狭い部分）を効果的に排除するように設計されている。ワイドポア変異体は、細孔のより深く、シス開口部から約６５オングストロームに位置し、より広い、直径約１３オングストロームの新しい狭窄部位を創り出す。
寿命を改善する利点にもかかわらず、ワイドポアα－ＨＬナノポアは、ナノポアＳＢＳで使用される場合、有害な停止事象に依然として悩まされている。これらの有害事象は、鋳型鎖が近くのナノポアに貫通し、重合が進行するにつれてタグ部分のさらなる検出を妨げることから生じると理解される。の鋳型貫通現象は、配列リードの短縮およびナノポアＳＢＳの全体的なスループットの低下をもたらす。
したがって、ナノポアを使用する場合に有害な鋳型貫通を低減または防止し、それによって核酸ＳＢＳなどのハイスループットナノポア検出技術の効率の改善をもたらす組成物および方法が依然として必要とされている。
概要
少なくとも１つの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）：
５’－［ブロッキング部分］－［プライマー］－３’（Ｉ）
（式中、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み、該塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；プライマーは、ナノポアに連結したポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む）
の化合物を含む、組成物を提供する。
少なくとも１つの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）：
５’－［ブロッキング部分］－［プライマー］－３’（Ｉ）
（式中、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み、該塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；プライマーは、ナノポアに連結したポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む）
の化合物を含む、組成物を提供する。
組成物の少なくとも１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
（ａ）式（Ｉａ）：
（式中、ｎは１～１０であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物；
（ｂ）式（Ｉｂ）：
（式中、ｎは１～１０であり；Ｒは、Ｏ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物；
（ｃ）式（Ｉｃ）：
（式中、ｎは１～１０であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物；
（ｄ）式（Ｉｄ）：
（式中、ｎは１～１０であり；Ｂは修飾核酸塩基であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物；または
（ｅ）式（Ｉ）の化合物が、式（Ｉｅ）：
（式中、ｎは１～１０であり；Ｂは修飾核酸塩基であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物を含む、請求項１に記載の組成物から選択される化合物を含む。
（ａ）式（Ｉａ）：
（ｂ）式（Ｉｂ）：
（ｃ）式（Ｉｃ）：
（ｄ）式（Ｉｄ）：
（ｅ）式（Ｉ）の化合物が、式（Ｉｅ）：
組成物の少なくとも１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、ブロッキング部分の５’末端に結合したビオチンタグをさらに含む。
少なくとも１つの実施形態では、本開示は、式（ＩＩ）：
５’－［ビオチンタグ］－［ブロッキング部分］－［プライマー］－３’（ＩＩ）
（式中、ビオチンタグはビオチンタグを含み；ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み、該塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；プライマーは、ナノポアに連結したポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む）
の化合物を含む、組成物を提供する。
５’－［ビオチンタグ］－［ブロッキング部分］－［プライマー］－３’（ＩＩ）
（式中、ビオチンタグはビオチンタグを含み；ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み、該塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；プライマーは、ナノポアに連結したポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む）
の化合物を含む、組成物を提供する。
組成物の少なくとも１つの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、
（ａ）式（ＩＩａ）：
（式中、ｎは１～１０であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物；
（ｂ）式（ＩＩｂ）：
（式中、ｎは１～１０であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物；
（ｃ）式（ＩＩｃ）：
（式中、ｎは１～１０であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物；
（ｄ）（ＩＩｄ）：
（式中、ｎは１～１０であり；Ｂは修飾核酸塩基であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物；または
（ｅ）式（ＩＩｅ）：
（式中、ｎは１～１０であり；Ｂは修飾核酸塩基であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物から選択される化合物を含む。
（ａ）式（ＩＩａ）：
（ｂ）式（ＩＩｂ）：
（ｃ）式（ＩＩｃ）：
（ｄ）（ＩＩｄ）：
（ｅ）式（ＩＩｅ）：
式（ＩＩ）の化合物を含む組成物の少なくとも１つの実施形態では、ビオチンタグは、式（ＩＩＩ）：
Ｂ－Ｌ－［（Ｎ）ｘ－（Ｕ）ｙ－（Ｎ）ｚ］ｗ（ＩＩＩ）
（式中、Ｂはビオチンまたはデスチオビオチンであり；Ｌはリンカーであり；Ｎはヌクレオチドであり；Ｕはウラシルであり；ｘおよびｚは少なくとも１であり；ｙは少なくとも３であり；ｗは０または１である）の構造を含む。
Ｂ－Ｌ－［（Ｎ）ｘ－（Ｕ）ｙ－（Ｎ）ｚ］ｗ（ＩＩＩ）
（式中、Ｂはビオチンまたはデスチオビオチンであり；Ｌはリンカーであり；Ｎはヌクレオチドであり；Ｕはウラシルであり；ｘおよびｚは少なくとも１であり；ｙは少なくとも３であり；ｗは０または１である）の構造を含む。
式（ＩＩ）の化合物を含む組成物の少なくとも１つの実施形態では、ビオチンタグは、ビオチン部分とリンカー部分、またはデスチオビオチン部分とリンカー部分を含み、前記リンカー部分が前記ブロッキング部分の５’末端に結合しており；リンカー部分はブロッキング部分の５’末端に結合しており；リンカー部分は任意にオリゴヌクレオチドを含み；オリゴヌクレオチドは、ＴＴＴＴＵＵＵ（配列番号１）；ＴＴＴＴＵＵＵＴ（配列番号２）；ＴＴＴＴＵＵＵＴＴ（配列番号３）；ＴＴＴＴＵＵＵＴＴＴ（配列番号４）；ＴＴＴＴＵＵＵＴＴＴＴ（配列番号５）；ＴＴＴＴＵＵＴＴＴＴＴＵＵＴ（配列番号６）；ＴＵＵＴＴＴＴＵＵ（配列番号７）；ＴＵＵＴＴＴＴＴＵＵ（配列番号８）；およびＴＴＴＴＵＵＵＵＵＵ（配列番号９）から選択される配列を含む。
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物の少なくとも１つの実施形態では、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基を含み、
（ａ）ポリカチオン性基が、スペルミン、スペルミジン、［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）８］、［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）１２］、［（Ｌｙｓ）８－εＬｙｓ－Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）］、［（Ｌｙｓ）１２－εＬｙｓ－Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）］、［ＰＡＭＡＭ Ｇｅｎ１アミノ］、ポリ（エチレンジアミン）、ポリ（プロピレンジアミン）、ポリ（アリルアミン）、カチオン性アミノ酸のオリゴマー、およびカチオン性アミノアルキルのオリゴマーから選択され；
（ｂ）ポリカチオン性基が、リジン、ε－リジン、オルニチン、（アミノエチル）グリシン、アルギニン、ヒスチジン、メチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジンおよび／またはアミノプロリンのオリゴマーから選択されるカチオン性アミノ酸のオリゴマーであり、；および／または
（ｃ）ポリカチオン性基がスペルミン基のオリゴマーであり、スペルミン基のオリゴマーは、（スペルミン）２、（スペルミン）３、（スペルミン）４、および（スペルミン）５から選択され；オリゴマーのスペルミン基はホスホジエステル結合していてもよい。
（ａ）ポリカチオン性基が、スペルミン、スペルミジン、［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）８］、［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）１２］、［（Ｌｙｓ）８－εＬｙｓ－Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）］、［（Ｌｙｓ）１２－εＬｙｓ－Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）］、［ＰＡＭＡＭ Ｇｅｎ１アミノ］、ポリ（エチレンジアミン）、ポリ（プロピレンジアミン）、ポリ（アリルアミン）、カチオン性アミノ酸のオリゴマー、およびカチオン性アミノアルキルのオリゴマーから選択され；
（ｂ）ポリカチオン性基が、リジン、ε－リジン、オルニチン、（アミノエチル）グリシン、アルギニン、ヒスチジン、メチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジンおよび／またはアミノプロリンのオリゴマーから選択されるカチオン性アミノ酸のオリゴマーであり、；および／または
（ｃ）ポリカチオン性基がスペルミン基のオリゴマーであり、スペルミン基のオリゴマーは、（スペルミン）２、（スペルミン）３、（スペルミン）４、および（スペルミン）５から選択され；オリゴマーのスペルミン基はホスホジエステル結合していてもよい。
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物の少なくとも１つの実施形態では、ブロッキング部分はかさ高い基を含み、
（ａ）かさ高い基は、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびそれらの組み合わせから選択され；
（ｂ）かさ高い基は、ピレン、コレステリル、ベータ－シクロデキストリン、高ポリ（エチレングリコール）ポリマー、ペリレン、ペリレンジイミド、およびククルビチュリルから選択され；および／または
（ｃ）かさ高い基は、ホスホジエステル結合したかさ高い基である。
（ａ）かさ高い基は、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびそれらの組み合わせから選択され；
（ｂ）かさ高い基は、ピレン、コレステリル、ベータ－シクロデキストリン、高ポリ（エチレングリコール）ポリマー、ペリレン、ペリレンジイミド、およびククルビチュリルから選択され；および／または
（ｃ）かさ高い基は、ホスホジエステル結合したかさ高い基である。
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物の少なくとも１つの実施形態では、ブロッキング部分は、塩基修飾ヌクレオシドを含み：
（ａ）前記塩基修飾は、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリ（アミノエチル）グリシン、ポリメチルリジン、ポリジメチルリジン、ポリトリメチルリジン、ポリアミノプロリンおよびポリ－ε－リジンから選択されるポリカチオン性基を含み；または
（ｂ）前記塩基修飾は、ペリレン、コレステリルおよびベータ－シクロデキストリンから選択されるかさ高い基を含む。
（ａ）前記塩基修飾は、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリ（アミノエチル）グリシン、ポリメチルリジン、ポリジメチルリジン、ポリトリメチルリジン、ポリアミノプロリンおよびポリ－ε－リジンから選択されるポリカチオン性基を含み；または
（ｂ）前記塩基修飾は、ペリレン、コレステリルおよびベータ－シクロデキストリンから選択されるかさ高い基を含む。
組成物の少なくとも１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、５’－（スペルミン）２－［プライマー］－３’；５’－（スペルミン）３－［プライマー］－３’；５’－（スペルミン）４－［プライマー］－３’；５’－（スペルミン）５－［プライマー］－３’；５’－（ピレン）２－［プライマー］－３’；５’－（コレステリル）－［プライマー］－３’；５’－［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）１２］－［プライマー］－３’；５’－［（Ｌｙｓ）８－εＬｙｓ－Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）］－［プライマー］－３’；５’－［（Ｌｙｓ）１２－εＬｙｓ－Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）］－［プライマー］－３’；５’－［ＰＡＭＡＭ Ｇｅｎ１アミノ］－［プライマー］－３’；および５’－（ペリレン－ｄＵ）－［プライマー］－３’から選択される。
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物の少なくとも１つの実施形態では、プライマーは：
（ａ）（ａ）少なくとも９量体、少なくとも１２量体、または少なくとも１５量体のオリゴヌクレオチド；
（ｂ）（ｂ）ロックド核酸；
（ｃ）（ｃ）ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミド、およびボロノホスフェートから選択される結合；ならびに／または
（ｄ）（ｄ）ＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号１０）、ＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＴＡ（配列番号１１）、ＴＡＡ＾ＣＧＧＡ＾ＧＧＡ＾ＧＧＡ＾ＧＧＡ－３’（配列番号１２）、およびＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ－３’（配列番号１３）
から選択される配列を含む。
（ａ）（ａ）少なくとも９量体、少なくとも１２量体、または少なくとも１５量体のオリゴヌクレオチド；
（ｂ）（ｂ）ロックド核酸；
（ｃ）（ｃ）ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミド、およびボロノホスフェートから選択される結合；ならびに／または
（ｄ）（ｄ）ＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号１０）、ＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＴＡ（配列番号１１）、ＴＡＡ＾ＣＧＧＡ＾ＧＧＡ＾ＧＧＡ＾ＧＧＡ－３’（配列番号１２）、およびＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ－３’（配列番号１３）
から選択される配列を含む。
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物の少なくとも１つの実施形態では、化合物は以下から選択される：
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物の少なくとも１つの実施形態では、組成物は、ナノポアに連結されたポリメラーゼをさらに含み、任意に、ポリメラーゼがＰｏｌ６ポリメラーゼであり；任意に、前記ナノポアはワイドポア変異型α－ＨＬナノポアであり；任意に、前記ワイドポア変異型α－ＨＬナノポアは、Ｐ－０１、Ｐ－０２、Ｐ－０３、Ｐ－０４、Ｐ－０５、Ｐ－０５、Ｐ－０６、Ｐ－０７、Ｐ－０８、Ｐ－０９、Ｐ－１０、Ｐ－１１およびＰ－１２から選択される。
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物の少なくとも１つの実施形態では、化合物は：
（ａ）（ａ）少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、またはそれを超えるリード長を有するナノポアに連結されたポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得；かつ／または
（ｂ）（ｂ）５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、またはそれ未満の鋳型貫通速度を有するナノポアに連結されたポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得る。
（ａ）（ａ）少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、またはそれを超えるリード長を有するナノポアに連結されたポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得；かつ／または
（ｂ）（ｂ）５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、またはそれ未満の鋳型貫通速度を有するナノポアに連結されたポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得る。
少なくとも１つの実施形態では、本開示は、膜のシス側およびトランス側に電極を有する膜と；膜を貫通する孔を有するナノポア；前記ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼ；両電極と接触しているイオンを含む電解液；ならびに式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）の化合物を含むナノポア組成物であって、任意に、前記ナノポアがワイドポア変異型α－ＨＬナノポアであり、および／またはポリメラーゼがＰｏｌ６ポリメラーゼである、ナノポア組成物を提供する。
少なくとも１つの実施形態では、本開示は、シス側およびトランス側に電極を有する膜、膜を貫通する孔を有するナノポア、およびナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼを含むナノポアデバイス；４種のタグ付きヌクレオチドのセット、ならびに式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む、キットを提供する。
少なくとも１つの実施形態では、本開示は、核酸の配列を決定するための方法であって、（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、膜を貫通する孔を有するナノポア、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼ、両方の電極と接触しているイオンを含む電解質溶液、および式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物を含むナノポア組成物を提供すること；（ｂ）（ａ）のナノポア組成物を、（ｉ）核酸；および（ｉｉ）各々がポリメラーゼ基質として作用し得、各々が異なるタグに結合し、タグがナノポアに入ると、ナノポアを通過するイオンの異なる流れの変化をもたらす、４種のタグ付きヌクレオチドのセットと接触させること；ならびに（ｃ）ナノポア内への異なるタグの進入に起因するイオンの異なる流れの変化を経時的に検出し、核酸配列に相補的な、ポリメラーゼによって組み込まれた前異なる化合物のそれぞれと相関させ、それによって前記核酸配列を決定することを含む、方法を提供する。
詳細な説明
本明細書および添付の特許請求の説明では、単数形「ａ」および「ａｎ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は複数のタンパク質を含み、「化合物」への言及は複数の化合物を指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、交換可能であり、限定することを意図しない。様々な実施形態の説明が用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、当業者であれば、いくつかの特定の例において、実施形態は、語「から本質的になる」または「からなる」を用いて代替的に説明することができるということを理解するであろうことを、さらに理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の説明では、単数形「ａ」および「ａｎ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は複数のタンパク質を含み、「化合物」への言及は複数の化合物を指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、交換可能であり、限定することを意図しない。様々な実施形態の説明が用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、当業者であれば、いくつかの特定の例において、実施形態は、語「から本質的になる」または「からなる」を用いて代替的に説明することができるということを理解するであろうことを、さらに理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、値の各介在整数および値の各介在整数の各１０分の１は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、その範囲の上限と下限との間、およびその記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在する値は、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内のいずれかの具体的に除外された制限に従うことを条件として、本発明に包含される。記載された範囲が制限の一方または両方を含む場合は、包含された制限の（ｉ）一方または（ｉｉ）両方を除いた範囲もまた、本発明に含まれる。例えば、「１～５０」は、「２～２５」、「５～２０」、「２５～５０」、「１～１０」等を含む。
図面を含む前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はどちらも、例示的および説明的だけであり、本開示を制限するものではないことを理解されたい。
定義
本明細書で使用される「ヌクレオシド」は、糖部分（例えば、リボースまたはデオキシリボース）に結合した天然または非天然核酸塩基を含む分子部分を指す。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド－５’オリゴホスフェート化合物またはヌクレオシド－５’－オリゴホスフェートの構造類似体を指す。例示的なヌクレオチドとしては、これらに限定されないが、ヌクレオシド－５’－トリホスフェート（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＵＴＰ）；長さが４以上のホスフェート（例えば、５’－テトラホスホスフェート、５’－ペンタホスホスフェート、５’－ヘキサホスホスフェート、５’－ヘプタホスホスフェート、５’－オクタホスホスフェート）である５’－オリゴホスフェート鎖を有するヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＵ）；ならびに、修飾核酸塩基部分（例えば、５－エチニル－ｄＵなどの置換ピリミジン核酸塩基）、修飾糖部分（例えば、Ｏ－アルキル化糖、または２’－４’「ロックド」リボース）および／または修飾オリゴホスフェート部分（例えば、チオホスフェート、メチレン、および／またはホスフェート間の他の架橋を含むオリゴホスフェート）を有し得るヌクレオシド－５’－三リン酸の構造類似体が挙げられる。
「核酸」とは、本明細書で用いる場合、核酸塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、またはそれらのバリアントの１つを含む、１つ以上の核酸サブユニットの分子を指す。核酸は、ポリヌクレオチドとも呼ばれるヌクレオチド（例えば、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ）のポリマーを指し、一本鎖および二本鎖の両方の形態のＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのハイブリッドを含む。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドのオリゴマーを含む分子部分を指す。「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドではない１つ以上のモノマー単位（例えば、スペーサー、例えば、ＳｐＣ２、ＳｐＣ３、ｄＳｐ、Ｓｐ１８、または大きな基、例えば、スペルミン、ピレン）をも含むヌクレオチドのオリゴマーを含む分子部分を指し得ることが意図される。「オリゴヌクレオチド」は、モノマー単位間にホスホジエステル結合および／または他の非天然結合（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミド、ボロノホスフェート）を含む分子部分を指すことも意図される。
本明細書で使用される「オリゴホスフェート」は、ホスフェート基のオリゴマーを含む分子部分を指す。例えば、オリゴホスフェートは、２～２０個のホスフェートのオリゴマー、３～１２個のホスフェートのオリゴマー、３～９個のホスフェートのオリゴマーを含み得る。
「ポリメラーゼ」は、本明細書で用いる場合、核酸ポリマーを形成するためのヌクレオチド単量体の重合のような、重合反応を触媒することができる任意の天然または非天然の酵素または他の触媒を指す。ポリメラーゼという用語は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素を含むがこれらに限定されない様々な鎖伸長酵素を包含する。本開示の組成物および方法において使用され得る例示的ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．６またはＥＣ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ２．７．７．４９の酵素）、およびＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ６．５．１．１の酵素）などの核酸ポリメラーゼを含む。
本明細書で使用される「リード長」は、ポリメラーゼなどの鎖伸長酵素が鋳型から解離する前に鋳型依存的に核酸鎖に組み込まれるヌクレオチドの数を指す。
「鋳型ＤＮＡ分子」および「鋳型鎖」は、本明細書では互換的に使用され、例えばプライマー伸長反応において、相補的核酸鎖（またはコピー鎖）を合成するために鎖伸長酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって使用される核酸分子の鎖を指す。
本明細書で使用される「鋳型依存的様式」は、鎖伸長酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によるプライマー分子の伸長を指し、新しく合成された鎖の配列は、鋳型鎖に対する相補的塩基対合の周知の規則によって決定される（Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．（１９８７）を参照されたい）。
本明細書で使用される「プライマー」は、天然に存在するか、または合成的に生成されるかにかかわらず、例えばヌクレオチドの存在下、適切な緩衝液中、および適切な温度で、鋳型鎖（またはコピー鎖）に相補的なプライマー伸長産物の合成に適した条件下で、鎖伸長酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）による鋳型依存性核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。プライマーの長さは、鋳型鎖の標的配列の複雑さに依存し得、プライマーオリゴヌクレオチドは、典型的には１５～２５ヌクレオチドを含有するが、それより多いまたは少ないヌクレオチドを含有し得る。
本明細書で使用される「酵素－ナノポア複合体」は、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼ）などの鎖伸長酵素と会合、カップリング、または連結されたナノポアを指す。いくつかの実施形態では、ナノポアは、鎖伸長酵素に可逆的または不可逆的に結合し得る。
「部分」とは、本明細書で用いる場合、分子の一部を指す。
「リンカー」とは、本明細書で用いる場合、２つ以上の分子、分子基、および／または分子部分の間のいくらかの空間との結合付着を提供する任意の分子部分を指す。
「タグ」とは、本明細書で用いる場合、タグにカップリングされた分子または分子複合体を直接的または間接的に検出および／または同定する能力を可能にするかまたは増強する部分または分子の一部を指す。例えば、タグは、立体的なバルクまたは体積、静電荷、電気化学ポテンシャル、光学的、および／または分光学的特徴などの検出可能な性質または特徴を提供することができる。
「ナノポア」とは、本明細書で用いる場合、約１オングストローム～約１０，０００オングストロームの特徴的な幅または直径を有する膜または他の障壁材料内に形成されるか、または他の方法で提供される、ポア、チャネル、または通路を指す。ナノポアは、黄色ブドウ球菌由来のα－溶血素などの天然に存在する細孔形成タンパク質、またはα－ＨＬ－Ｃ４６などの非天然の（すなわち、操作された）もしくは天然に存在する、野生型細孔形成タンパク質の変異体もしくは変形から作ることができる。膜は、脂質二重層のような有機膜、または天然に存在しないポリマー材料から作られた合成膜であり得る。ナノポアは、センサ、センシング回路、または例えば相補型金属酸化膜半導体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｔａｌ－ｏｘｉｄｅ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ＣＭＯＳ）回路もしくは電界効果トランジスタ（ｆｉｅｌｄ ｅｆｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ：ＦＥＴ）回路のようなセンシング回路に結合された電極に隣接して、または近接して配置することができる。
本明細書で使用される「ワイドポア変異体」は、膜に埋め込まれたときに孔のシス側の最も広い部分から測定して約６５オングストロームの深さに位置する直径約１３オングストロームの狭窄部位を有するように設計されたナノポアを指す。例示的なワイドポア変異体としては、本明細書の他の箇所に記載されているように、６：１の比の変異α－ＨＬサブユニットを含むα－ＨＬヘプタマーが挙げられる。
「ナノポア検出性タグ」とは、本明細書で用いる場合、ナノポアに入り、ナノポアに位置付けられ、ナノポアに捕捉され、ナノポアを通って移動し、および／またはナノポアを横切り、これにより、ナノポアを通じて電流の検出可能な変化をもたらすことができるタグを指す。例示的なナノポア検出性タグとしては、天然または合成ポリマー、例えばポリエチレングリコール、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、ペプチド核酸ポリマー、ロックド核酸ポリマーが挙げられる、これらに限定されず、これらのいずれも、検出可能なナノコア電流の変化をもたらすことができる、色素部分またはフルオロフォアなどの化学基で任意に修飾または連結されてもよい。
「イオン流」とは、本明細書で用いられる場合、陽極と陰極との間の電位などの起電力に起因する、典型的には溶液中でのイオンの移動を指す。イオン流は、典型的には、電流または静電ポテンシャルの減衰として測定することができる。
「イオン流変化」とは、ナノポア検出に関連して本明細書で用いる場合、その「開口チャネル」（ｏｐｅｎ ｃｈａｎｎｅｌ：Ｏ．Ｃ．）状態でナノポアを通るイオン流に対して、ナノポアを通るイオン流の減少または増加をもたらす特徴を指す。
「開口チャネル電流」、「Ｏ．Ｃ．電流」、または「バックグラウンド電流」とは、本明細書で用いる場合、電位が印加され、ナノポアが開いている際に（例えば、ナノポア中にタグは存在しない）、ナノポアを横切って測定される電流レベルを指す。
「タグ電流」とは、本明細書で用いる場合、電位が印加され、タグがナノポアに存在する場合、ナノポアを横切って測定される電流レベルを指す。例えば、タグの特定の特徴（例えば、全体的な電荷、構造等）に応じて、ナノポア内のタグの存在は、ナノポアを通るイオン流を減少させることができ、それによって、測定されたタグ電流レベルの減少をもたらす。
発明を実施するための形態
Ａ．貫通遮断剤プライマー化合物
本開示は、ナノポア（例えば、α－ヘモリシン）に隣接して位置する鎖伸長酵素（例えば、ポリメラーゼ）を有するプライマーとして使用される場合、有害な鋳型貫通を低減するように最適化された化合物を提供する。これらの化合物は、ナノポアに隣接して位置するタグ付きヌクレオシドおよびポリメラーゼなどの鎖伸長酵素を利用する核酸の検出および／または配列決定のためのナノポアベースの方法に有用である。
一般に、ナノポアベースの核酸検出および／または配列決定は、膜包埋ナノポア（例えば、α－ＨＬ）に隣接して位置する鎖伸長酵素（例えば、Ｐｏｌ６ ＤＮＡポリメラーゼ）、ならびに鎖伸長酵素によって成長鎖に組み込まれ得る４種のヌクレオチド類似体（例えば、ｄＡ６Ｐ、ｄＣ６Ｐ、ｄＧ６Ｐ、およびｄＴ６Ｐ）の混合物を使用する。各ヌクレオチド類似体は、ナノポアで検出された場合に同定可能かつ識別可能なサインをもたらす共有結合タグ部分を有する。鎖伸長酵素は、鋳型核酸鎖とプライマーとの複合体を形成し、鋳型核酸鎖に相補的なタグ付きヌクレオチド類似体に特異的に結合する。次いで、鎖伸長酵素は、タグ付きヌクレオチド類似体のヌクレオチド部分をプライマーの３’末端に触媒的にカップリングする（すなわち、組み込む）。触媒的取り込み事象の完了は、タグ部分の放出をもたらし、次いで隣接するナノポアが通過する。しかしながら、組み込まれたヌクレオチドからそれを放出する触媒プロセスを受ける前であっても、ａのタグ部分は、膜に埋め込まれたナノポアの細孔に入る。ナノポアが印加電位下にあるとき、タグ部分のこの進入は、ナノポアを通るイオン流を変化させ、検出可能なタグ電流信号をもたらす。
膜包埋ナノポアに隣接する鎖伸長酵素を含む様々なナノポアシステム、ならびに核酸配列決定のためにプライマーおよびタグ付きヌクレオチドと共にそれらを使用するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０２９８０７２号、第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０３６８７１０号、および第２０１８／００５７８７０号、ならびに国際公開第２０１３／１５４９９９号第２０１５／１４８４０２号、第２０１７／０４２０３８号、および第２０１９／１６６４５７号を参照されたい。
上記および本明細書の他の箇所で記載されるように、タグ付きヌクレオチドの組み込みはまた、核酸鎖の伸長をもたらす。ナノポアに隣接するポリメラーゼに関連して、メカニズムによって結合されることを意図せずに、伸長鎖は近くのナノポアに貫通し、重合が進行するにつれてタグ部分のさらなる検出を妨げることができると考えられる。さらに、この鋳型の貫通現象は、配列リードの短縮およびナノポアを使用した核酸検出および／または配列決定の全体的なスループットの低下をもたらし得ると考えられる。本開示の予想外の結果および驚くべき利点は、ブロッキング部分などの特定の構造を含むプライマーの使用が、有害な鋳型貫通を低減または防止し得、ナノポアを使用した核酸検出および／または配列決定のスループットが大幅に改善されることである。
一般に、本開示の貫通遮断剤プライマーは、式（Ｉ）：
５’－［ブロッキング部分］－［プライマー］－３’（Ｉ）
（式中、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み、該塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；プライマーは、ナノポアに連結したポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む）の化合物を含む。本開示の貫通遮断剤プライマーのブロッキング部分として有用な例示的なポリカチオン性基、かさ高い基、および塩基修飾ヌクレオシドを、実施例を含めて本明細書中にさらに記載する。
５’－［ブロッキング部分］－［プライマー］－３’（Ｉ）
（式中、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み、該塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；プライマーは、ナノポアに連結したポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む）の化合物を含む。本開示の貫通遮断剤プライマーのブロッキング部分として有用な例示的なポリカチオン性基、かさ高い基、および塩基修飾ヌクレオシドを、実施例を含めて本明細書中にさらに記載する。
式（Ｉ）の貫通遮断剤プライマー化合物のさらなる実施形態は、本明細書で以下に開示されるような下部構造および他の特性の範囲によって記載され、実施例に記載される特定の実施形態を含む。
ブロッキング部分は、当技術分野で周知のオリゴヌクレオチド合成を使用してプライマーの５’末端に結合されることが意図される。そのような方法により、プライマーに対するブロッキング部分の間のホスホジエステル、ホスホロチオエート、Ｈ－ホスホネートまたはメチルホスホネート結合の形成が可能になる。したがって、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の貫通遮断剤プライマーは、式（Ｉａ）
（式中、ｎは１～１０であり、Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ＲはＯ－であり、結合はホスホジエステルであり、すなわち、ブロッキング部分はプライマーの５’末端にホスホジエステル結合している。
式（Ｉａ）の化合物が下部構造である式（Ｉ）のプライマー化合物について上述したように、式（Ｉａ）のプライマー化合物のブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基、または塩基修飾ヌクレオシドを含み得、塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み、プライマーは、ナノポアに連結されたポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む。しかしながら、式（Ｉａ）によって示されるように、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基またはかさ高い基などのブロッキング部分基のオリゴマーを包含し、そのようなオリゴマーは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、Ｈ－ホスホネートまたはメチルホスホネート結合を含み得ることがさらに意図される。本明細書の他の箇所に記載されるように、これらのオリゴマーブロッキング部分は、市販の試薬および標準的な自動オリゴヌクレオチド合成技術を使用して調製し得る。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）または（Ｉａ）の貫通遮断剤プライマーは、式（Ｉｂ）
（式中、ｎは１～１０であり、Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物を含む。例示的なポリカチオン性基は、実施例を含めて本明細書にさらに記載される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）または（Ｉａ）の貫通遮断剤プライマーは、式（Ｉｃ）
（式中、ｎは１～１０であり、Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物を含む。例示的なかさ高い基は、実施例を含めて本明細書にさらに記載される。
上記のように、式（Ｉ）または（Ｉａ）の貫通遮断剤プライマーのブロッキング部分は、塩基修飾ヌクレオシドを含み得、塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含むことが意図される。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の貫通遮断剤プライマーは、式（Ｉｄ）：
（式中、Ｂは修飾核酸塩基であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択され、ｎは１～１０である）の化合物を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の貫通遮断剤プライマーは、式（Ｉｅ）：
（式中、Ｂは修飾核酸塩基であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択され、ｎは１～１０である）の化合物を含む。式（Ｉｄ）および（Ｉｅ）の貫通遮断剤プライマーのいくつかの実施形態では、ブロッキング部分はオリゴマーではなく、一塩基修飾ヌクレオシドを含む。例示的な塩基修飾ヌクレオシドは、実施例を含めて本明細書にさらに記載される。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）または（Ｉａ）～（Ｉｅ）（式中、化合物は、表１に列挙されたものから選択される）の貫通遮断剤プライマー化合物を提供する。
本明細書の他の箇所に記載されるように、本開示の貫通遮断剤プライマーは、ポリメラーゼ連結ナノポアデバイスを使用した核酸検出および配列決定中に起こり得る有害な貫通を低減および／または防止するという利点を提供する。そのようなナノポアをベースとする方法は、核酸の精製、分離および単離のためにビオチンを利用する当技術分野で周知の広範囲のプロセスの一部であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の貫通遮断剤プライマーは、これらのプライマーを組み込んだ核酸鎖の精製、分離、および／または単離を容易にするビオチンタグを含み得ることが意図される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物（例えば、式（Ｉａ）～（Ｉｅ）の化合物のいずれか）を含む本開示の貫通遮断剤プライマーは、ブロッキング部分の５’末端に結合したビオチンタグをさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、「ビオチンタグ」という用語は、ブロッキング部分の５’末端に直接またはリンカー部分を介して間接的に結合したビオチン部分、デスチオビオチン部分またはイミノビオチン部分を含むことを意図している。すなわち、「ビオチンタグ」という用語は、ビオチン、デスチオビオチン、またはイミノビオチン部分をリンカー部分と共に含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の貫通遮断剤プライマー（例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）および（Ｉｂ）～（Ｉｅ）の化合物）は、式（ＩＩ）：
５’－［ビオチンタグ］－［ブロッキング部分］－［プライマー］－３’（ＩＩ）
（式中、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み；該塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；ビオチンタグはチオチンタグを含み；プライマーは、ナノポアに連結したポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む）の化合物を含み得る。本開示の貫通遮断剤プライマーのブロッキング部分として有用な例示的なポリカチオン性基、かさ高い基、および塩基修飾ヌクレオシドを、実施例を含めて本明細書中にさらに記載する。式（ＩＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の貫通遮断剤プライマーのブロッキング部分の５’末端に結合したビオチンタグは、ビオチン部分およびリンカー部分、またはデスチオビオチン部分およびリンカー部分を含み得る。
５’－［ビオチンタグ］－［ブロッキング部分］－［プライマー］－３’（ＩＩ）
（式中、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み；該塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；ビオチンタグはチオチンタグを含み；プライマーは、ナノポアに連結したポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む）の化合物を含み得る。本開示の貫通遮断剤プライマーのブロッキング部分として有用な例示的なポリカチオン性基、かさ高い基、および塩基修飾ヌクレオシドを、実施例を含めて本明細書中にさらに記載する。式（ＩＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の貫通遮断剤プライマーのブロッキング部分の５’末端に結合したビオチンタグは、ビオチン部分およびリンカー部分、またはデスチオビオチン部分およびリンカー部分を含み得る。
式（ＩＩ）の貫通遮断剤プライマー化合物のさらなる実施形態は、本明細書で以下に開示されるような下部構造および他の特性の範囲によって記載され、実施例に記載される特定の実施形態を含む。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の貫通遮断剤プライマーは、式（ＩＩａ）
（式中、ｎは１～１０であり、Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物を含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｏ－であり、結合は、ホスホジエステルであり、すなわち、ブロッキング部分は、プライマーの５’末端にホスホジエステル結合している。
式（ＩＩａ）が部分構造である式（ＩＩ）のプライマー化合物について上述したように、式（ＩＩａ）のプライマー化合物のブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基、または塩基修飾ヌクレオシドを含み得、塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；プライマーは、ナノポアに連結されたポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む。しかしながら、式（ＩＩａ）によって示されるように、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基またはかさ高い基などのブロッキング部分基のオリゴマーを包含し、そのようなオリゴマーは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、Ｈ－ホスホネートまたはメチルホスホネート結合を含み得ることがさらに意図される。本明細書の他の箇所に記載されるように、これらのオリゴマーブロッキング部分は、市販の試薬および標準的な自動オリゴヌクレオチド合成技術を使用して調製し得る。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の貫通遮断剤プライマーは、式（ＩＩｂ）
（式中、ｎは１～１０であり、Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物を含む。例示的なポリカチオン性基は、実施例を含めて本明細書にさらに記載される。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の貫通遮断剤プライマーは、式（ＩＩｃ）
（式中、ｎは１～１０であり、Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）の化合物を含む。例示的なかさ高い基は、実施例を含めて本明細書にさらに記載される。
上記のように、式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の貫通遮断剤プライマーのブロッキング部分は、塩基修飾ヌクレオシドを含み得、塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含むことが意図される。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の貫通遮断剤プライマーは、式（ＩＩｄ）：
（式中、Ｂは修飾核酸塩基であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択され、ｎは１～１０である）の化合物を含む。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の貫通遮断剤プライマーは、式（ＩＩｅ）：
（式中、Ｂは修飾核酸塩基であり；Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択され、ｎは１～１０である）の化合物を含む。式（ＩＩｄ）および（ＩＩｅ）の貫通遮断剤プライマーのいくつかの実施形態では、ブロッキング部分はオリゴマーではなく、一塩基修飾ヌクレオシドを含む。例示的な塩基修飾ヌクレオシドは、実施例を含めて本明細書にさらに記載される。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（ＩＩ）または（ＩＩａ）～（ＩＩｅ）（式中、化合物は表２に列挙されたものから選択される）の貫通遮断剤プライマー化合物を提供する。
本明細書の他の箇所に記載されるように、本開示の貫通遮断剤プライマーへの５’ビオチンタグの付加は、様々な周知の核酸プロセスまたはアッセイにおいて、精製、分離および／または単離など、プライマーを組み込んだ伸長された核酸鎖のさらなるプロセシングを促進し得る。いくつかの方法では、核酸を使用する他の方法またはアッセイを容易にするために、例えば鎖伸長重合後に、伸長された核酸鎖からビオチンタグを切断することが望ましいことがさらに意図される。
したがって、本開示の貫通遮断剤プライマー（例えば、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）のいくつかの実施形態では、ブロッキング部分の５’末端に結合したビオチンタグは、選択的に切断可能な配列（例えば、酵素的に切断可能である）のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ビオチンタグは、配列ＴＴＴＴＵＵＵ（配列番号１４）などの酵素によって選択的に切断可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の任意の貫通遮断剤プライマー化合物は、ブロッキング部分の５’－末端に結合したビオチンタグを含み得、ビオチンタグは、以下から選択される配列を有するオリゴヌクレオチド：ＴＴＴＴＵＵＵ（配列番号：１５）；ＴＴＴＴＵＵＵＴ（配列番号：１６）；ＴＴＴＴＵＵＵＴＴ（配列番号：１７）；ＴＴＴＴＵＵＵＴＴＴ（配列番号：１８）；ＴＴＴＴＵＵＵＴＴＴＴ（配列番号：１９）；ＴＴＴＴＵＵＴＴＴＴＴＵＵＴ（配列番号：２０）；ＴＵＵＴＴＴＴＵＵ（配列番号：２１）；ＴＵＵＴＴＴＴＴＵＵ（配列番号：２２）；およびＴＴＴＴＵＵＵＵＵＵ（配列番号：２３）を含む。
ブロッキング部分（例えば、式（ＩＩ）および（ＩＩａ）～（ＩＩｅ）の化合物）の５’末端に結合したビオチンタグを含む本明細書に開示される貫通遮断剤プライマー化合物の任意の実施形態では、ビオチンタグは、式（ＩＩＩ）：
Ｂ－Ｌ－［（Ｎ）ｘ－（Ｕ）ｙ－（Ｎ）ｚ］ｗ（ＩＩＩ）
（式中、Ｂはビオチンまたはデスチオビオチンであり；Ｌはリンカーであり；Ｎはヌクレオチドであり；Ｕはウラシルであり；ｘおよびｚは少なくとも１であり；ｙは少なくとも３であり；ｗは０または１である）の構造を含み得る。
Ｂ－Ｌ－［（Ｎ）ｘ－（Ｕ）ｙ－（Ｎ）ｚ］ｗ（ＩＩＩ）
（式中、Ｂはビオチンまたはデスチオビオチンであり；Ｌはリンカーであり；Ｎはヌクレオチドであり；Ｕはウラシルであり；ｘおよびｚは少なくとも１であり；ｙは少なくとも３であり；ｗは０または１である）の構造を含み得る。
ブロッキング部分（例えば、式（ＩＩ）および（ＩＩａ）の化合物）の５’末端に結合したビオチンタグを含む本明細書に開示される貫通遮断剤プライマー化合物の任意の実施形態では、ビオチンタグは、５’－（ビオチン）－（Ｓｐ１８）－ＴＴＴＵＵＵＴＴ－３’；５’－（デスチオビオチン）－（Ｓｐ１８）－ＴＴＴＵＵＵＴＴ－３’；５’－（ビオチンＴＥＧ）－（Ｓｐ１８）２－ＴＴＴＵＵＵＴＴ－３’；５’－（デスチオビオチンＴＥＧ）－（Ｓｐ１８）２－ＴＴＴＵＵＴＴ－３’；５’－（ビオチンＴＥＧ）－（Ｓｐ１８）３－３’；５’－（デスチオビオチンＴＥＧ）－（Ｓｐ１８）３－ＴＴＴＵＵＵＴＴ－３’；または５’－（ビオチン）２－（Ｓｐ１８）－ＴＴＴＵＵＵＴＴ－３’から選択される。
ビオチンタグを調製および／または本開示の貫通遮断剤プライマーの５’末端に取り付けるために使用し得る広範囲のホスホラミダイト試薬が利用可能である。例えば、以下の表３に示す市販のホスホラミダイト試薬（例えば、米国バージニア州スターリングのＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を標準的な自動オリゴヌクレオチド合成に使用して、ビオチン部分またはデスチオビオチン部分を直接またはスペーサーもしくはリンカー（例えば、Ｓｐ１８）を介して、貫通遮断剤プライマーの５’末端に結合させ得る。
本明細書で他の箇所に記載されるように、本開示の貫通遮断剤プライマー（例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物）の一般的な構造的特徴は、プライマー構造の５’末端に結合したブロッキング部分構造を含む。ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み得、塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含む。理論または機構に拘束されることを意図するものではないが、ナノポアに近接して結合した鎖伸長酵素（例えば、Ｐｏｌ６ ＤＮＡポリメラーゼ）の鎖置換活性により、プライマー伸長鎖のナノポアへの貫通が起こり、この貫通は、酵素によって組み込まれているタグ付きヌクレオチドを検出する際のナノポアの継続的な機能に有害であり、短いプロセシングのみの後にナノポアデバイスがさらなる「リード」を生成するのを効果的に停止させると考えられる。プライマー配列の５’末端に結合したブロッキング部分の存在により、この有害な鋳型貫通現象が効果的に低減または防止される。上記のように、有効なブロッキング部分は、（ａ）ポリカチオン性基；（ｂ）かさ高い基；または（ｃ）塩基修飾ヌクレオシドであって、前記ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含む、塩基修飾ヌクレオシドから選択される様々な異なる構造を有し得る。本開示の貫通遮断剤プライマー化合物に有用なブロッキング部分の様々な実施形態は、本明細書で以下に開示されるような一連のサブ構造および他の特性を含み、実施例に記載される特定の実施形態を含み得る。
いくつかの実施形態では、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基を含む。本開示の化合物においてブロック部分として有用な例示的なポリカチオン性基としては、スペルミン、スペルミジン、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、アリルアミンなどのカチオン性アミノアルキル基のオリゴマーを挙げられ得る。したがって、いくつかの実施形態では、ブロッキング部分は、ポリ（スペルミン）、ポリ（スペルミジン）、ポリ（エチレンジアミン）、ポリ（プロピレンジアミン）、ポリ（アリルアミン）から選択されるポリカチオン性基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のプライマー化合物において有用なブロッキング部分には、以下のオリゴマーを含むスペルミンのオリゴマーが含まれる：（スペルミン）２、（スペルミン）３、（スペルミン）４、および（スペルミン）５。
一般に、ブロッキング部分がポリカチオン性基を含む場合、基はカチオン性基のオリゴマー（例えば、スペルミン）を含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、カチオン基のこれらのオリゴマーは、ホスホジエステル結合オリゴマーをもたらす標準的な自動オリゴヌクレオチド合成を使用して調製し得ることが意図される。カチオン性アミノアルキル基であるホスホジエステル結合オリゴマーをもたらす広範囲のホスホラミダイト試薬が利用可能である。例えば、試薬であるスペルミンホスホラミダイト（以下に示す）は市販されており（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能である）、１種以上のスペルミンポリカチオン性基を本開示の貫通遮断剤プライマーに結合させるための標準的な自動オリゴヌクレオチド合成に使用し得る。
（化学名：Ｎ１－［４－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ブチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２－テトラキス（トリフルオロアセチル）－スペルミン－Ｎ１２－ブチル－４－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト）
スペルミンホスホラミダイトを使用してオリゴヌクレオチドに組み込まれる１つ以上のスペルミンカチオン基は、標準的なホスホラミダイト合成で形成されるホスホジエステル結合を介して結合される。したがって、ブロッキング部分がスペルミン基のオリゴマーを含むいくつかの実施形態では、オリゴマーはホスホジエステル結合している。
いくつかの実施形態では、ブロッキング部分は、カチオン性アミノ酸のオリゴマーであるポリカチオン性基を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ブロッキング部分は、リジン、ε－リジン、オルニチン、（アミノエチル）グリシン、アルギニン、ヒスチジン、メチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジン、および／またはアミノプロリンから選択されるカチオン性アミノ酸のオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性アミノ酸のオリゴマーをベースとする本開示のプライマー化合物において有用なブロッキング部分には、［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）８］、［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）１２］、［（Ｌｙｓ）８－εＬｙｓ－Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）］、［（Ｌｙｓ）１２－εＬｙｓ－Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）］、［ＰＡＭＡＭ Ｇｅｎ１アミノ］が含まれる。
いくつかの実施形態では、ブロッキング部分は、かさ高い基を含む。本開示のプライマー化合物に有用な例示的なかさ高い基としては、アリール基、アリールアルキル基、ヘテロアリール基、ヘテロアリールアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、またはこれらのかさ高い基のいずれかの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、かさ高い基は、ピレン、コレステリル、ペリレン、ペリレンジイミド、ククルビチュリル、ベータ－シクロデキストリン、高ポリ（エチレングリコール）ポリマー、またはこれらのかさ高い基のいずれかの組み合わせから選択し得る。
いくつかの実施形態では、ブロッキング部分はかさ高い基を含み、ここで、かさ高い基は、かさ高い基のオリゴマー、例えば、ピレン、コレステリル、ペリレン、ペリレンジイミド、ククルビチュリル、ベータ－シクロデキストリン、高ポリ（エチレングリコール）ポリマー（例えば、ＰＥＧポリマー）、またはそれらの任意の組み合わせを含むことが意図される。本明細書の他の箇所に記載されるように、かさ高い基のオリゴマーを含み得るホスホジエステル結合オリゴマーをもたらす広範囲のホスホラミダイト試薬が利用可能である。したがって、ブロッキング部分がかさ高い基のオリゴマーを含むいくつかの実施形態では、かさ高い基はホスホジエステル結合したかさ高い基であり得る。
（化学名：１－ジメトキシトリチルオキシ－３－Ｏ－（Ｎ－コレステリル－３－アミノプロピル）－トリエチレングリコール－グリセリル－２－Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ，－ジイソプロピル）－ホスホラミダイト）
１つ以上のかさ高い基、コレステリルは、標準的なホスホラミダイト合成で形成されたホスホジエステル結合を介して結合したコレステリル－ＴＥＧホスホラミダイトを使用してオリゴヌクレオチドに組み込み得る。したがって、ブロッキング部分が１つ以上のかさ高い基を含むいくつかの実施形態では、オリゴマーはホスホジエステル結合したコレステリルである。
本明細書の他の箇所に記載されるように、本開示の化合物のプライマー（例えば、式（Ｉ）の化合物）は、ナノポアに連結されたポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの実施形態では、プライマーの５’末端に結合したブロッキング部分は、ヌクレオシドではない標準的な自動化オリゴヌクレオチド合成を用いて調製されたホスホジエステル結合基のオリゴマーであり得る。例えば、ホスホジエステル結合ポリカチオン性基またはかさ高い基のオリゴマー。しかしながら、ブロッキング部分は塩基修飾ヌクレオシドを含み得ることも意図される。塩基修飾（または塩基修飾可能）ヌクレオシドは周知であり、標準的な自動オリゴヌクレオチド合成を使用してオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に容易に結合させ得る。
したがって、本開示の化合物のいくつかの実施形態では、ブロッキング部分は、ポリカチオン性基またはかさ高い基を含む塩基修飾ヌクレオシドを含む。本明細書中に開示されるポリカチオン性基またはかさ高い基のいずれもまた、塩基修飾されたヌクレオシドの実施形態において使用され得ることが意図される。したがって、いくつかの実施形態では、塩基修飾は、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリ（アミノエチル）グリシン、ポリメチルリジン、ポリジメチルリジン、ポリトリメチルリジン、ポリアミノプロリンおよびポリεリジンから選択されるポリカチオン性基を含み得る。いくつかの実施形態では、塩基修飾は、ペリレン、コレステリルおよびベータ－シクロデキストリンから選択されるかさ高い基を含み得る。
塩基修飾ヌクレオシドを調製するための方法は、当技術分野で周知である。アジドとアルキンとの間の銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）反応を使用して、ホスホラミダイト試薬を使用する標準的な自動合成によって調製されたオリゴヌクレオチドに予め組み込まれたアルキン修飾核酸塩基への共有１，２，３トリアゾール結合を形成し得る。アルキン修飾核酸塩基をもたらす様々なホスホラミダイト試薬が市販されている（例えば、米国バージニア州スターリングのＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈを参照されたい）。これらの試薬のいずれも、ＣｕＡＡＣ修飾に続く標準的な自動オリゴヌクレオチド合成法と共に使用して、ポリカチオン性基またはかさ高い基で塩基修飾された修飾Ｔ（またはｄＵ）を有するオリゴヌクレオチドを提供し得る。塩基修飾ブロッキング部分を有する貫通遮断剤プライマーの調製に有用な例示的なホスホラミダイト試薬を表４に示す。
このタイプのＣｕＡＡＣ反応の一般的な例を図１に概略的に示す。オリゴヌクレオチド内の単一の５－エチニル－ｄＵヌクレオシド（配列の残りは図示せず）を、５－エチニル－ｄＵ－ＣＥホスホラミダイト試薬を使用して調製する。次いで、アジド修飾ペリレン化合物を、標準的なＣｕＡＡＣ反応条件下でこのアルキン修飾オリゴヌクレオチドと反応させて、かさ高いペリレン基で修飾された単一の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを得る。核酸塩基に対する短いリンカーをもたらすこのタイプの修飾は、オリゴヌクレオチド配列式において「－（ｄＵ－［ペリレン］）－」モノマー単位として示される。
本開示の貫通遮断剤プライマーを調製するための例示的なＣｕＡＡＣ反応を図２に示す。出発オリゴヌクレオチド５’－（ビオチン）－（Ｓｐ１８）－ＴＴＴＴＵＵＵＴＴＴ－（Ｃ８－アルキン－ｄＴ）－ＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ－３’は、Ｃ８－アルキン修飾ｄＴ単位（本明細書では「Ｔ＊」とも称される）を挿入するために、試薬Ｃ８－アルキン－ｄＴ－ＣＥホスホラミダイトを使用して標準的なオリゴヌクレオチド合成によって調製される。次いで、アジド修飾８－リジンポリペプチド、Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）８を、標準的なＣｕＡＡＣ反応条件下でアルキン修飾オリゴヌクレオチドと反応させる。得られた生成物は、５’－（ビオチン）－（Ｓｐ１８）－ＴＴＴＴＵＵＵＴＴＴ－（Ｔ＊－［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）８］）－ＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ－３’である。例示的なブロッキング部分は、トリアゾール基を介して８個のリジンポリカチオン性基に共有結合した８個の炭素リンカーで塩基修飾されたＴヌクレオシド［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）８］を含む。
図３および図４は、ブロッキング部分を含み、該ブロッキング部分が塩基修飾ヌクレオシドを含み、該塩基修飾がポリカチオン性基である例示的な貫通遮断剤プライマー化合物を示す。図３は、プライマー化合物５’－（ビオチン）－（Ｓｐ１８）－ＴＴＴＵＵＵＴＴ－（Ｔ＊－［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－（ε－Ｌｙｓ）－（Ｌｙｓ）１２］）－ＴＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ－３’を示す。この化合物は、Ｔ＊ヌクレオシドを含むブロッキング部分を特徴とし、これは、Ｃ８リンカー（例えば、「Ｃ８－アルキン－ｄＴ－ＣＥホスホラミダイト」を使用する）で５位が塩基修飾され、次いでＣｕＡＡＣ形成トリアゾールを介してポリカチオン性基にさらに結合したＴヌクレオシド、［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－（ε－Ｌｙｓ）－（Ｌｙｓ）１２］である。図３は、プライマー化合物５’－（ビオチン）－（Ｓｐ１８）－ＴＴＴＵＵＵＴＴ－（Ｔ＊－［ＰＡＭＡＭ Ｇｅｎ１アミノ］）－ＴＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ－３’を示す。この化合物は、「ＰＡＭＡＭ Ｇｅｎ１アミノ」ポリカチオン性基へのトリアゾール結合を介して塩基修飾されたＴ＊ヌクレオシドも含むブロッキング部分を特徴とし、これは図３に示すように７個の正に荷電したアミン基を含む樹状構造を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の貫通遮断剤プライマー化合物を提供し、化合物は、表５に列挙された例示的な化合物から選択される。
一般に、本開示の貫通遮断剤プライマーに有用なプライマー部分は、鋳型鎖に相補的なプライマー伸長産物（すなわち、コピー鎖）の合成に適した条件下でポリメラーゼによる鋳型依存性核酸合成の開始点として作用し得る任意のプライマーを含み得る。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）または（ＩＩ）の貫通遮断剤プライマーのプライマー部分は、少なくとも９量体、少なくとも１２量体、または少なくとも１５量体のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プライマー部分は、天然に存在する核酸塩基および糖部分ならびにモノマー単位間のホスホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチドを含む。例えば、少なくとも１つの実施形態では、プライマー部分は、ＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号５３）またはＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＴＡ（配列番号５４）から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、プライマー部分は、天然に存在しない核酸塩基および／または糖部分を含み得ることも意図される。例えば、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のロックド核酸単位（例えば、リボース配座を「ロック」する２’－４’結合を有するヌクレオシド単位）を含み得る。いくつかの実施形態では、プライマー部分オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミドおよびボロノホスフェートから選択される結合を含む。
少なくとも１つの実施形態では、プライマー部分はオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは、１つ以上のロックド核酸単位を含み；オリゴヌクレオチドは、任意に配列５’－ＴＡＡ＾ＣＧＧＡ＾ＧＧＡ＾ＧＧＡ＾ＧＧＡ－３’（配列番号５５）を含む（式中、Ａ＾は、Ａヌクレオシドがロックド核酸単位であることを示す）。
少なくとも１つの実施形態では、プライマー部分はオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは、３’－末端にホスホロチオエート連結ヌクレオシド単位の部分配列を含み、オリゴヌクレオチドは、任意に配列５’－ＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ－３’（配列番号５６）を含む（式中、＊はホスホロチオエート結合を示す）。
本明細書の他の箇所に記載されたように、修飾核酸塩基および３’－キャッピング単位の略語は、市販のアミダイト試薬（例えば、：Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２８２５ Ｄａｖｉｓ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ；またはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．，３３ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｗａｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡから入手可能なアミダイト試薬カタログを参照されたい）を用いた自動オリゴヌクレオチド合成に一般的に使用されるものである。したがって、「ＳｐＣ２」は、脱塩基性の炭素２個のスペーサーを指し；「ＳｐＣ３」は、脱塩基性の炭素３個のスペーサーを指し；「ｄＳｐ」は、脱塩基性リボーススペーサーを指し；「Ｃ３」は、３’－プロパノールを指し；「Ｎ３ＣＥｄＴ」は、３－Ｎ－シアノエチル－ｄＴアミダイト（Ｎ３位にシアノエチル基を有するｄＴ）から得られる修飾核酸塩基を指し；「Ｎ３ＭｅｄＴ」は、３－Ｎ－メチル－ｄＴアミダイト（Ｎ３位にメチル基を有するｄＴ）から得られる修飾核酸塩基を指し；「５ＭｅｄＣ－ＰｈＥｔ」は、Ｎ４－フェニルエチル－５－メチル－ｄＣアミダイト（４位アミンにフェニルエチルを有する５－メチル－ｄＣ）から得られる修飾核酸塩基を指し；「エテノ－ｄＡ」は、１，Ｎ６－エテノ－ｄＡアミダイト（Ｎ１をアミン６位に連結するエチレンを有するｄＡ）から得られる修飾核酸塩基を指し；「ｄＣｂ」は、Ｎ４－（Ｏ－レブリニル－６－オキシヘキシル）－５－メチル－ｄＣアミダイト（Ｏ－レブリニル－６－オキシヘキシル「分枝剤」を４位アミンに有する５－メチル－ｄＣ）から得られる修飾核酸塩基を指し；「Ｔｍｐ」は、メチルホスホネート結合を有するチミジンを指し；「Ｉｍｐ」は、メチルホスホネート結合を有するイノシンを指す。
Ｂ．貫通遮断剤プライマーの使用
本開示の貫通遮断剤プライマー化合物は、ヌクレオチド部分がナノポアの近位に位置する鎖伸長酵素（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ）によって組み込まれる（または組み込まれ、放出された後）ときに、ナノポアデバイスを使用してタグ付きヌクレオチドのタグを検出する、有用なナノポア検出および／または配列決定方法である。本開示の貫通遮断剤プライマーは、ナノポアをベースとする合成による配列決定（ＳＢＳ）方法のためのナノポア－ポリメラーゼコンジュゲートおよびタグ付きヌクレオチド化合物との使用について例示されているが、本明細書に開示される貫通遮断剤プライマーは、ナノポア、特にワイドポアナノポアに隣接して位置する鎖伸長酵素による標的配列のプライマー伸長を必要とする任意の方法で使用すし得ることが意図される。本明細書の他の箇所に記載されているように、鎖伸長酵素の鎖置換活性は、伸長されたプライマーまたは標的配列の相補鎖のナノポアへの貫通を起こし得ることが観察されている。このナノポアへの貫通は、本方法で使用されるタグ付きヌクレオチドの検出を妨害し、したがって、短いプロセシングの後にのみナノポアデバイスが配列を検出するのを効果的に停止させ得るので、ナノポアデバイスの機能に有害である。
本明細書の実施例に示されているように、本開示の貫通遮断剤プライマーは、特にワイドポア変異体が使用される場合、ナノポアデバイスによる再現性のある検出のため特性が改善されており、貫通遮断剤部分を含まない対応するプライマー化合物よりも有害な貫通を減少させ、はるかに長い配列リードをもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の貫通遮断剤プライマー（例えば、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物）は、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐまたはそれを超えるリード長を有するナノポアに連結されたポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得る。また、いくつかの実施形態では、本開示の貫通遮断剤プライマー（例えば、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物）は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、またはそれ未満の鋳型貫通率でナノポアに連結されたポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得る。
一般に、本開示の貫通遮断剤プライマー化合物を使用してナノポアをベースとする検出および／または配列決定を実施するのに有用な方法、材料、装置およびシステムは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０１１９２５９号、第２０１５／０３６８７１０号、および第２０１８／００５７８７０号、ならびに国際公開第２０１９／１６６４５７号に開示されている。
少なくとも１つの実施形態では、本開示は、核酸の配列を決定するための方法であって、（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、膜を貫通して延在する孔を有するナノポア、両方の電極と接触している電解液、ナノポアに隣接して位置している活性ポリメラーゼ、およびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含むナノポアシーケンシング組成物を提供すること；（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を（ｉ）核酸の鎖；および（ｉｉ）各々がタグに共有結合した異なるヌクレオシド－５’－オリゴホスフェート部分を含む化合物のセットであって、化合物のセットの各メンバーが、タグがナノポアに入ると、ナノポアを通過するイオンの異なる流れをもたらす異なるタグを有し、異なるタグの少なくとも１つが、イオンの存在下でナノポアに入るとナノポアを通過するイオンの異なる流れの変化をもたらす、負に荷電したポリマー部分を含む、化合物のセットと接触させること；ならびに（ｃ）ナノポア内への異なるタグの進入に起因する異なるイオンの流れを経時的に検出し、核酸配列に相補的な、ポリメラーゼによって組み込まれた異なる化合物のそれぞれと相関させ、それによって核酸配列を決定することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、核酸の配列を決定するための方法であって：（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側にある電極、膜を貫通して延在する孔を有するナノポア、両方の電極と接触している電解液、ナノポアに隣接して位置している活性ポリメラーゼ、およびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含むナノポアシーケンシング組成物を提供すること；および（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖、および（ｉｉ）各々が異なるタグを有するタグ付きヌクレオチドのセットであって、各異なるタグは、本明細書の別の箇所に記載されているように、それがナノポア内に位置するときに電極の全体に異なるタグ電流レベルを引き起こすセットと接触させることを含む、方法を提供する。
１．ナノポア
ナノポア、ナノポアを含むデバイス、ならびに本開示の貫通遮断剤プライマーを使用したナノポアシーケンシングなどのナノポア検出用途でそれらを調製および使用するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，００５，２６４号；第７，８４６，７３８号；第６，６１７，１１３号；第６，７４６，５９４号；第６，６７３，６１５号；第６，６２７，０６７号；第６，４６４，８４２号；第６，３６２，００２号；第６，２６７，８７２号；第６，０１５，７１４号；第５，７９５，７８２；ならびに米国特許出願公開第２０１５／０１１９２５９号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１３／０２４４３４０号、第２００４／０１２１５２５号および第２００３／０１０４４２８号）。ナノポア、およびナノポア検出を測定するために有用なナノポアデバイスも、本明細書に開示される実施例に記載されている。一般に、ナノポアデバイスは、脂質二重層膜に埋め込まれたナノポアを含み、膜は、ウェルまたはリザーバを含む固体基板に固定化または付着している。ナノポアのポアは膜を貫通して延び、膜のシス側とトランス側との間に流体接続を形成する。典型的には、固体基板は、ポリマー、ガラス、シリコン、およびそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む。加えて、固体基板は、ナノポア、センサ、センシング回路、または、任意に相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路もしくは電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路のようなセンシング回路に結合された電極に隣接して配置することができる。典型的には、ナノポアのポアを通るベースライン電流流（またはＯ．Ｃ．電流レベル）を生成する膜を横切って、ＤＣまたはＡＣ電圧電位を設定することを可能にする、膜のシス側およびトランス側に電極がある。ナノポア内にイオン流変更タグが存在すると、ナノポアを通る正イオン流が変化し、それにより、ナノポアのＯ．Ｃ．電流に対する電極の全体で電流レベルの測定可能な変化が生じる。
本開示の貫通遮断剤プライマーを含む組成物および方法は、天然に存在する細孔形成タンパク質および天然に存在しない（例えば、設計されたまたは組換えの）細孔形成タンパク質の両方によって生成されたナノポアを含む広範囲のナノポアデバイスと共に使用し得ることが意図される。組成物および方法に有用な代表的な細孔形成タンパク質としては、α－ヘモリシン、β－ヘモリシン、γ－ヘモリシン、エアロリシン、細胞溶解素、ロイコシジン、メリチン、ＭｓｐＡポリンおよびポリンＡが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、黄色ブドウ球菌由来の細孔形成タンパク質α－ヘモリシン（本明細書では「α－ＨＬ」とも呼ばれる）を使用してナノポアを形成し得る。α－ＨＬは、細孔形成タンパク質のクラスの最も研究されているメンバーの１つであり、ナノポアデバイスのナノポアとして広く使用されている。（例えば、米国特許公開第２０１５／０１１９２５９号、同第２０１４／０１３４６１６号、同第２０１３／０２６４２０７号、および同第２０１３／０２４４３４０号を参照されたい。）α－ＨＬはまた、部位特異的突然変異誘発および化学標識を含む広範囲の技術を用いて、シーケンシングされ、クローン化され、構造的および機能的に広範に特徴づけられている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１年）およびそこで引用されている参考文献を参照）。天然に存在する（すなわち、野生型）α－ＨＬポア形成タンパク質サブユニットのアミノ酸配列を以下に示す。
野生型α－ＨＬアミノ酸配列（配列番号５７）
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305
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配列番号５７の野生型α－ＨＬアミノ酸配列は、大腸菌でのクローニング時に通常に存在する最初のメチオニン残基を含まず、α－ＨＬアミノ酸置換の配列位置の同定に使用される。
種々の非天然α－ＨＬポア形成タンパク質が製造されており、これには、以下の置換の１つ以上を含むバリアントα－ＨＬサブユニットが含まれるが、これらに限定されない：Ｈ３５Ｇ、Ｅ７０Ｋ、Ｈ１４４Ａ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａ、Ｄ１２７Ｇ、Ｄ１２８Ｇ、Ｄ１２８Ｋ、Ｔ１２９Ｇ、Ｋ１３１Ｇ、Ｋ１４７ＮおよびＶ１４９Ｋ。これらの種々の操作されたα－ＨＬポアポリペプチドの特性は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国公開特許出願第２０１７／００８８５８８号、同第２０１７／００８８８９０号、同第２０１７／０３０６３９７号、および同第２０１８／０００２７５０号に記載されている。
２．ワイドポア変異型α－ＨＬナノポア
本明細書に記載の貫通遮断剤プライマーを含む組成物および方法は、α－ＨＬのワイドポア変異体を有するナノポアデバイスと共に使用し得ることが意図される。ワイドポア変異体は、膜に埋め込まれたときに孔のシス側の最も広い部分から測定して約６５オングストロームの深さに位置する直径約１３オングストロームの狭窄部位を有する七量体ナノポアを形成するように設計された、天然に存在しないα－ＨＬタンパク質である。いくつかの実施形態では、ワイドポア変異体は、少なくともアミノ酸置換Ｅ１１１ＮおよびＭ１１３Ａを含むα－ＨＬサブユニットを含む。いくつかの態様では、ワイドポア変異体は、アミノ酸置換Ｅ１１１ＮおよびＭ１１３Ａを含み、Ｄ１２７Ｇ、Ｄ１２８Ｇ、Ｄ１２８Ｋ、Ｔ１２９Ｇ、Ｋ１３１Ｇ、Ｋ１４７Ｎ、およびＶ１４９Ｋから選択される１以上のアミノ酸置換をさらに含むα－ＨＬサブユニットを含む。本発明の化合物、組成物および方法で有用な例示的なワイドポア変異体の６：１の七量体サブユニット組成物を以下の表６に開示する。
表６に示すように、いくつかの実施形態では、α－ＨＬのワイドポア変異体サブユニットは、アミノ酸Ｎ２９３において切断型であってもよい さらに、ワイドポア変異体は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／１２５５６５号に開示されており、以下にさらに記載されているＣ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合物および／またはＨｉｓタグをさらに含み得る。Ｎ２９３位で切断されたα－ＨＬ細孔形成タンパク質サブユニットのアミノ酸配列を以下に示す。
Ｎ２９３で切断されたα－ＨＬアミノ酸配列サブユニット（配列番号５８）
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３．ナノポアへのコンジュゲーション
α－ＨＬ単量体の七量体複合体は、脂質二重層膜に埋め込まれ、脂質二重層膜によりポアを形成するナノポアを、自発的に形成することはよく知られている。天然型α－ＨＬと変異型α－ＨＬとの比が６：１であるα－ＨＬサブユニットを含むα－ＨＬのヘプタマーがナノポアを形成し得ることが示されている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）’’Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐｔａｍｅｒｉｃ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ａｌｐｈａ－ｔｏｘｉｎ ｐｏｒｅ－Ａ ｄｏｍｉｎｏ－ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｉｓ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ，’’Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１８）：１４８３５－１４８４１、およびそこに引用されている参考文献）。七量体細孔の１つのα－ＨＬモノマーサブユニット（すなわち、「１ｘサブユニット」）は、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／１４８４０２号および国際公開第２０１７／１２５５６５号に記載されているようなＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーション法を用いてＤＮＡポリメラーゼと共有結合的にコンジュゲートし得る（ＺａｋｅｒｉおよびＨｏｗａｒｔｈ（２０１０），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２：４５２６－７も参照されたい）。簡単に説明すると、ＳｐｙＴａｇペプチドをα－ＨＬの１×サブユニットのＣ末端に組換え融合物としてα結合させ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質断片を鎖伸長酵素、例えばＰｏｌ６ ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端に組換え融合物として結合させる。ＳｐｙＴａｇペプチドおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質断片は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質のリジン残基とＳｐｙＴａｇペプチドのアスパラギン酸残基との反応を受け、２つのα－ＨＬサブユニットを酵素に結合させる共有結合を生じる。
一般に、ワイドポア変異型α－ＨＬサブユニットは、当技術分野で公知の野生型または他の操作されたα－ＨＬタンパク質と共に使用されるのと同じ方法で七量体α－ＨＬナノポアを調製するために使用される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の貫通遮断剤プライマー化合物は、ナノポアがワイドポア変異体であるナノポアデバイスと共に使用し得る。表６の例示的なワイドポア変異体によって示されるように、６：１の比の七量体α－ＨＬワイドポアナノポアは、表６に開示されるような突然変異のセットをそれぞれ有する６つのサブユニット（すなわち、「６ｘサブユニット」）と、表６に示されるようなわずかに異なる突然変異のセットを有する１ｘサブユニットとを有する（例えば、Ｈ１４４Ａを含まない）。
いくつかの実施形態では、６×サブユニットは、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）の６４アミノ酸のＤＮＡ結合タンパク質７ｄ（または「Ｓｓ０７ｄ」）を含むＣ末端融合物を含むように設計され、その配列はＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ ３９４７６に記載されている（例えば、２００７年１月２３日に公開されたｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ３９４７６；配列バージョン２を参照されたい）。Ｓｓ０７ｄ融合は、加工性を高めるために近くのポリメラーゼのポリメラーゼ－テンプレート複合体を安定化するように作用し得る。
ＤＮＡポリメラーゼのコンジュゲーションを容易にするために、１ｘサブユニットは、ＳｐｙＴａｇペプチド、例えばＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫ（配列番号５９）を含むＣ末端融合物（切断型野生型配列の２９３または２９４位で始まる）を含む。ＳｐｙＴａｇペプチドは、Ｐｏｌ６ ＤＮＡポリメラーゼなどのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ修飾鎖伸長酵素へのナノポアのコンジュゲーションを可能にする。いくつかの実施形態では、ワイドポア変異体のＣ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合物は、リンカーペプチド、例えばＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧ（配列番号６０）、ＳｐｙＴａｇペプチド、例えばＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号６１）、および末端Ｈｉｓタグ、例えばＫＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２）を含む。したがって、Ｃ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合体は、次のアミノ酸配列を含む：ＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫＫＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号６３）。いくつかの実施形態（例えば、表６に開示されているもの）では、配列番号５７のＣ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合物は、配列番号５７のように野生型α－ＨＬサブユニット配列と比較して切断されている１ｘサブユニットのＮ２９３位に結合されている。Ｎ２９３における配列番号５７のＳｐｙＴａｇペプチド融合物との１ｘα－ＨＬサブユニットの調製およびコンジュゲーションのさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７１２５５６５号に記載されている（例えば、ＷＯ２０１７１２５５６５号に開示されている配列番号２のＣ末端ＳｐｙＴａｇペプチド融合物を有するα－ＨＬサブユニットを参照されたい）。
あるいは、α－ＨＬ単量体は、多数の位置に挿入されたシステイン残基置換を用いて設計し得、マレイミド・リンカー・ケミストリーを介してタンパク質の共有結合修飾を可能にする（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１年）を参照されたい）。例えば、単一のα－ＨＬサブユニットはＫ４６Ｃ変異で修飾することができ、次いで、この変異は、テトラジン－トランス－シクロオクテン・クリック・ケミストリーの使用を可能にするリンカーで容易に修飾されて、ＤＮＡポリメラーゼのＢｓｔ２．０バリアントを七量体６：１ナノポアに共有結合的に結合させ得る。そのような実施形態は、２０１５年３月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１３０，３２６号および米国公開特許出願第２０１７／０１７５１８３号に記載されており、それぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
鎖伸長酵素をナノポアに結合させるための他の方法には天然化学ライゲーション（Ｔｈａｐａら、「Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」第１９巻第１４４６１－１４４８３頁（２０１４年）、ソルターゼ系（ＷｕおよびＧｕｏ、「Ｊ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｃｈｅｍ」、第３１巻第４８～６６頁（２０１２年）；Ｈｅｃｋら、「Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」、第９７巻第４６１～４７５頁（２０１３年））、トランスグルタミナーゼ系（Ｄｅｎｎｌｅｒら、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ」、第２５巻第５６９～５７８頁（２０１４年））、ホルミルグリシン連結（Ｒａｓｈｉｄｉａｎら、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ」、第２４巻第１２７７～１２９４頁（２０１３年））、または当該技術分野で公知の他の化学的ライゲーション技術を挙げ得る。
４．鎖伸長酵素
本明細書で提供されるナノポア貫通遮断剤プライマー組成物および方法は、当技術分野で公知のＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼなどの広範囲の鎖伸長酵素と共に使用し得る。
ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して相補的ＤＮＡ鎖を合成する酵素のファミリーである。ＤＮＡポリメラーゼは、新たに形成される鎖の３’末端に遊離ヌクレオチドを付加して、５’から３’方向への新しい鎖の伸長をもたらす。ほとんどのＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性をも有する。例えば、多くのＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。そのような多官能性ＤＮＡポリメラーゼは、誤って組み込まれたヌクレオチドを認識し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を使用して、誤ったヌクレオチドを切除し得、これはプルーフリーディングとして知られる活性である。ヌクレオチド切除後、ポリメラーゼは正しいヌクレオチドを再挿入し得、鎖伸長を継続し得る。一部のＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をも有する。
ＤＮＡポリメラーゼは、ナノポアをベースとする合成による配列決定を含む多くのＤＮＡ配列決定技術で使用されている。しかしながら、ＤＮＡ鎖は、ナノポア（例えば、１塩基当たり１～５μｓの速度で）を通って急速に移動し得、これにより、各ポリメラーゼ触媒による取り込み事象のナノポア検出が測定困難になり、高いバックグラウンドノイズが発生しやすくなり、単一ヌクレオチド分解能を得ることが困難になり得る。ＤＮＡポリメラーゼ活性の速度を制御する能力、ならびに正しい取り込みからシグナルレベルを増加させる能力は、合成による配列決定中、特にナノポア検出を使用する場合に重要である。実施例に示すように、本開示の貫通遮断剤プライマー化合物は、リード長をより長くし、有害な貫通の割合を低くし、それによってより正確なナノポアをベースとする核酸検出および配列決定を可能にする。
いくつかの実施形態では、本開示の貫通遮断剤プライマー化合物、組成物および方法において有用なポリメラーゼは、Ｐｏｌ６ ＤＮＡポリメラーゼ、または変異Ｄ４４Ａを有するエキソヌクレアーゼ欠損Ｐｏｌ６変異体などのＰｏｌ６の変異体、または変異Ｙ２４２Ａおよび／またはＥ５８５Ｋを有する伸長速度が増加したＰｏｌ６変異体である。本開示の様々な実施形態で有用なポリメラーゼ特性を提供する変異を有する一連のＰｏｌ６ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０２２２３６３号、第２０１６／０３３３３２７号、第２０１７／０２６７９８３号、第２０１８／００９４２４９号、第２０１８／０２４５１４７号に記載されている。
本開示の貫通遮断剤プライマー化合物、組成物および方法と共に使用され得るさらなる例示的なポリメラーゼとしては、核酸ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．６またはＥＣ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ２．７．７．４９の酵素）およびＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ６．５．１．１の酵素）が挙げられる。いくつかの実施形態では、貫通遮断剤プライマー化合物と共に用いるのに有用なポリメラーゼは、９ｏＮポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、シーケンナーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮポリメラーゼ（ｅｘｏ－）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９ＶまたはＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）である。いくつかの実施形態では、貫通遮断剤プライマーを伸長する鎖伸長酵素は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼの大きな断片。一実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ ２．０（米国マサチューセッツ州、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．から市販されている）である。
５．タグ付きヌクレオチドのセット
一般に、本開示のナノポア連結ポリメラーゼおよび貫通遮断剤プライマーを使用して核酸の配列を決定するためのナノポアをベースとする方法はまた、それぞれがポリメラーゼの基質であり得、種々のナノポア検出可能タグをも含む４種のタグ付きヌクレオチドのセットの使用を必要とする。これらの方法において有用なタグ付きヌクレオチドは、典型的には、構造式（ＩＶ）
（式中、「塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルから選択される核酸塩基であり；Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され；ｎは１～４であり；「リンカー」は、２～１００個の原子の共有結合した鎖を含むリンカー基であり；「タグ」はポリマー部分である）の化合物を含む。例えば、式（ＩＶ）のタグ付きヌクレオチド化合物は、表７から選択されるタグを含み得る。
ＤＮＡ鎖のナノポアをベースとする配列決定のための方法の標準的な実施形態では、この方法は、少なくとも４種の標準的なデオキシヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴのセットを必要とし、ここで、各異なるヌクレオチドは、ヌクレオチドが近位鎖伸長酵素によって組み込まれると検出され得る異なるタグに結合しており、さらに、各タグのナノポア検出可能シグナル（例えば、タグ電流）は、他の３種のタグのそれぞれのナノポア検出可能シグナルと区別可能であり、それにより、酵素によって組み込まれる特定のヌクレオチドの同定が可能になる。一般に、セット中の異なるタグ付きヌクレオチドのそれぞれは、鎖伸長酵素によって新たな相補鎖に組み込まれたときにタグが生成する特有の検出可能なタグ電流シグナルによって区別される。したがって、ワイドポアナノポアデバイスを使用して検出されたときに十分に分離され、分解されたタグ電流シグナルを提供する４種のタグ付きデオキシヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴのセットが望ましい。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本方法は、各々が異なるタグを有する４種のタグ付きヌクレオチド（例えば、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）のセットを含む組成物の使用を必要とし、各異なるタグは、ナノポアデバイスのナノポアに入ると異なる検出可能なタグ電流レベルをもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、イオン流変更タグ付きヌクレオチドのセットは、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０１１９２５９号、第２０１５／０３６８７１０号、および第２０１８／００５７８７０号、ならびに国際公開第２０１９／１６６４５７記載されたオリゴヌクレオチドタグを含み得る）。核酸配列を決定するための本開示のナノポアをベースとする方法において有用なタグ付きヌクレオチドの７つの例示的なセットを以下の表８に提供する。
上記の表８に示されるように、各セット中の４種のタグ付きヌクレオチドのそれぞれについてのワイドポア変異体で決定された平均タグ電流レベルは、ワイドポアナノポアを有するナノポアデバイスにおける良好な分解能および検出を可能にするために適切に十分に分離されている。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、タグ付きヌクレオチドのセットが表８のセット１、セット２、セット３、セット４、セット５、セット６およびセット７から選択される方法を提供する。さらに、タグ電流レベルおよび／または滞留時間などのナノポア検出可能シグナル特性を決定するための方法および技術は、当技術分野で公知である。（例えば、それぞれが、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０１１９２５９号、第２０１５／０３６８７１０号、および第２０１８／００５７８７０号、ならびに国際公開第２０１９／１６６４５７号を参照されたい。）
本開示の様々な特徴および実施形態は、以下の代表的な例に示されており、これらは例示的であり、限定的ではないことを意図している。当業者は、特定の実施例が、その後に続く特許請求の範囲においてより完全に記載されるような本発明の単なる例示であることを容易に理解するであろう。本出願に記載されている全ての実施形態および特徴は、内部に含まれる全ての実施形態と交換可能であり、組み合わせ得ると理解されるべきである
Ｅｘａｍｐｌｅ １：ナノポア貫通遮断剤プライマーのアッセイ
Ｅｘａｍｐｌｅ １：ナノポア貫通遮断剤プライマーのアッセイ
本実施例は、Ｐｏｌ６ポリメラーゼに連結したワイドポア変異体ナノポアデバイスを使用した式（Ｉ）および（ＩＩ）のナノポア貫通遮断剤プライマー化合物のアッセイを示す。本アッセイは、ナノポア配列決定測定中の有害な鋳型貫通の低減およびリード長の中央値の増加における貫通遮断剤プライマー効果を実証する。
材料および方法
アッセイで使用した貫通遮断剤プライマーを以下の表９に示す。プライマーは、標準的な自動オリゴヌクレオチド合成および市販のホスホラミダイト試薬を使用して調製されるオリゴヌクレオチドである。例えば、ブロッキング部分としてスペルミンを含む貫通遮断剤プライマーは、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖にスペルミンを組み込むスペルミンホスホラミダイト試薬を使用して調製される。
塩基修飾核酸塩基を介して結合したブロッキング部分を有する貫通遮断剤プライマーを、図２の一般的な反応スキームに従って調製した。オリゴヌクレオチドは、配列中の所望の点でＣ８－アルキン修飾ｄＴホスホラミダイト試薬を使用する標準的な自動オリゴヌクレオチド合成によって調製される。得られたオリゴヌクレオチドは、アルキン修飾ｄＴヌクレオシドを含み、次いで、標準的なＣｕＡＡＣアジド－アルキンのクリック化学を用いてさらに修飾される。
簡単に説明すると、図２に示すように、自動オリゴヌクレオチド合成を使用してオリゴヌクレオチド５’－ＤＭＴ－（ビオチン）－（Ｓｐ１８）－ＴＴＴＴＵＵＵＴＴＴ－（Ｔ＊）－ＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ－３’を合成し、次いでアンモニア処理によって脱保護し、合成樹脂から切断した。（本明細書の他の箇所に記載されているように、「Ｔ＊」は、ホスホラミダイト試薬Ｃ８－アルキン－ｄＴ－ＣＥホスホラミダイトを使用してオリゴヌクレオチドに導入される位置でＣ８－アルキン結合で修飾されたｄＴヌクレオシドを示す。）アンモニアを真空下で除去した後、０．６μｍｏｌの粗ＤＭＴ保護オリゴを１２０μＬの水に懸濁した。６０μＬの５Ｍ ＮａＣｌを添加し、懸濁液をボルテックスした。別に、ＤＭＳＯ／ｔＢｕＯＨ（３：１）中０．１Ｍ ＣｕＢｒ １５０μＬを、水中０．１Ｍ ＴＨＰＴＡ ２２０μＬに添加した。３００μＬのＣｕＢｒ／ＴＨＰＴＡ溶液をオリゴヌクレオチドの懸濁液に添加し、続いてＫ８ペプチド、アジドブチリル－４ＮＰＡ－Ｌｙｓ－（Ｌｙｓ）８－ＮＨ２の１０ｍＭ水溶液（０．９μｍｏｌ）９０μＬを添加した。反応物を１５μＬの１Ｍ ＮａＨＣＯ３水溶液で約７．５のｐＨに調整し、２５℃で２日間振盪した。次いで、反応溶液を０．４ｍＬのアンモニアおよび１ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌで希釈した。次いで、懸濁液を１５０－ｍｇ ｇｌｅｎ－ｐａｋカラムを使用して精製した。５’ビオチン上のＤＭＴ基を４％ＴＦＡで１０分間処理することによって除去し、得られたオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、５０％アセトニトリル水溶液（「ＡＣＮ」）中０．５％アンモニアを使用して溶出させた。質量分析により、約９５％超の所望のオリゴヌクレオチドコンジュゲート（ｍｗ約１０３５８）が示された。これを減圧濃縮し、凍結乾燥した。次いで、さらに精製するために、凍結乾燥濃縮物を７００μＬの１Ｍトリエチルアンモニウムアセテートに溶解し、Ｓｅｍｉ－ｐｒｅｐ Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×１０ｍｍ）に注入し、５％～２５％溶媒Ｂを用いて４０分間にわたって３ｍＬ／分で溶出した（溶媒Ａ＝１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７．８、溶媒Ｂ＝アセトニトリル）。最も純粋な画分を合わせ、減圧濃縮し、凍結乾燥した。次いで、これを１ｍＬの水に溶解し、再凍結乾燥した。５０ｎｍｏｌの純粋なコンジュゲートが得られた。
Ｐｏｌ６－ナノポアコンジュゲートは、個別にアドレス指定可能な集積回路チップのアレイ上に形成された膜に埋め込まれる。このナノポアデバイスを、ＤＮＡ鋳型、本開示の貫通遮断剤プライマー、および表８に列挙されたものから選択されるタグ付きヌクレオシド基質のセットに曝露する。両実験において、ポリメラーゼ複合体は、ナノポア連結ポリメラーゼと形成され、プライマー、鋳型、およびＤＮＡ鋳型に相補的なタグ付きヌクレオチドが捕捉され、Ｐｏｌ６ポリメラーゼ活性部位に結合され、タグポリマー部分は、近くにコンジュゲートされたα－ＨＬワイドポア変異体ナノポアに配置される。印加されたＡＣ電位の下では、細孔内にタグが存在すると、Ｏ．Ｃ．電流（すなわち、ナノポア内にタグを有さない電流）よりもナノポアを通るイオンの流れが変化し、ナノポアデバイス電極で測定される特有のタグレベルの電流が得られる。相補的ＤＮＡ伸長鎖のＰｏｌ６合成中に異なるタグ部分がナノポアに入るときに測定される特有のタグ電流レベルを使用して、ＤＮＡ鋳型を検出および同定し得る。鋳型貫通による配列決定における早期トランケーションは、ソフトウェアがタグ結合事象に関連しないと判定した長期間にわたって、かつ配列決定タグの現在のレベルとは異なる別のレベルで、深層電流遮断を表示する細胞の数として決定される。
ナノポア検出システム：ナノポアイオン流測定は、ｓｈａｌｌｏｗ ｗｅｌｌｓ（米国カリフォルニア州サンタクララのＲｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓによって製造されたチップ）内に約８，０００，０００個の窒化チタン電極のアレイを有するＣＭＯＳマイクロチップを含むナノポアアレイマイクロチップを使用して実行される。そのようなナノポアアレイマイクロチップを製造および使用するための方法は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０３６８７１０号、および第２０１８／００５７８７０号、ならびに国際公開第２０１９／１６６４５７号にも見出し得る。アレイ内の各ウェルは、生体試薬と導電性塩との一定の接触を可能にする表面修飾を有する標準的なＣＭＯＳプロセスを使用して製造される。各ウェルは、ナノポアポリメラーゼコンジュゲートが埋め込まれたリン脂質二重層膜を支持し得る。各ウェルの電極は、コンピュータインターフェースによって個別にアドレス指定可能である。使用される全ての試薬は、コンピュータ制御されたシリンジポンプを使用してアレイマイクロチップの上方の単純なフローセルに導入される。チップは、アナログデジタル変換をサポートし、１０００ポイント／秒を超えるレートで全ての電極から独立して電気計測値を報告する。ナノポアタグ電流の計測は、少なくとも１ミリ秒（ｍｓｅｃ）毎に１回、アレイ内の８Ｍのアドレス指定可能なナノポア含有膜のそれぞれで非同期的に行われ、インターフェースされたコンピュータに記録され得る。
チップ上での脂質二重層の形成：チップ内のそれぞれに、まず、５１０ｍＭ酢酸カリウム、１８ｍＭ酢酸マグネシウム、１５ｍＭ酢酸リチウム、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０９％プロクリン３００および１％トレハロースで構成されるランニング緩衝液を充填し、電流を印加して緩衝液の存在を測定する。チップ上のリン脂質二重層膜は、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ、Ａｖａｎｔｉ極性脂質）を使用して調製される。脂質の粉末をシリコーンオイルＡＲ２０：ヘキサデカンの４：１混合物に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、次いでチップ上のウェルの全体に急速に流す。次いで、アレイウェルのシス側を通ってランニングバッファーをポンピングすることによって薄化プロセスが開始され、それによって、多層脂質膜が単一の二重層に低減される。
膜へのα－ＨＬ－Ｐｏｌ６コンジュゲートの挿入：脂質二重層がアレイチップのウェル上に形成された後、全て２０℃の４００ｍＭ酢酸カリウム、１８ｍＭ酢酸マグネシウム、１５ｍＭ酢酸リチウム、５ｍＭ ＴＣＥＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８％トレハロース、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０９％プロクリン３００ ｐＨ７．８の希釈緩衝液中の、予備結合ＤＮＡ鋳型を有する１ｎＭの６：１のワイドポア変異型α－ＨＬ－Ｐｏｌ６コンジュゲートをチップのシス側に添加する。混合物中のナノポアポリメラーゼコンジュゲートは、電気穿孔されるか、または脂質二重層に自然に挿入される。非ポリメラーゼ修飾α－ＨＬサブユニット（すなわち、６：１七量体の６つのサブユニット）は、Ｈ１４４Ａ変異を含む。
以下の結果に記載されるように、上記の表６に開示されるワイドポア変異体は、６：１ヘプタマーを形成するのに使用される。
ＤＮＡ鋳型は、以下に示す５９４ｂｐのインデックス１およびインデックス２ヌクレオチド配列を含むｐＵＣ２５０環状配列である。
ｐＵＣ２５０インデックス１（配列番号６４）
ＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ
ＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ
ｐＵＣ２５０インデックス２（配列番号６５）
ＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ
ＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ
ナノポアイオン流測定：複合体を膜に挿入した後、シス側の溶液をモル浸透圧濃度緩衝液：４００ｍＭ酢酸カリウム、１８ｍＭ酢酸マグネシウム、１５ｍＭ酢酸リチウム、５ｍＭ ＴＣＥＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０９％プロクリン３００ ｐＨ７．８で置換する。４種の異なるヌクレオチド基質のセットを含有する配列決定溶液を添加する（各配列決定タグ３μＭ）。５００μＭの４種の異なるヌクレオチド基質のセットの各々を添加する。トランス側緩衝液は：４００ｍＭ酢酸カリウム、１８ｍＭ酢酸マグネシウム、１５ｍＭ酢酸リチウム、５ｍＭ ＴＣＥＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８％トレハロース、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０９％プロクリン３００ ｐＨ７．８である。これらの緩衝溶液をナノポアイオン流測定のための電解質溶液として使用する。Ｐｔ／Ａｇ／ＡｇＣｌ電極構成を使用し、１８０、２１０、２２０または２８０ｍＶのｐｋ－ｔｏ－ｐｋ波形のＡＣ電流を９７６Ｈｚまたは１４２９Ｈｚで印加する。ＡＣ電流は、タグがナノポアに繰り返し配向され、次いでナノポアから排出されることを可能にし、それにより、ナノポアを通るイオン流から生じるシグナルを測定するより多くの機会を提供するので、ナノポア検出のための特定の利点を有する。また、正および負のＡＣ電流サイクル間のイオン流は、互いに反作用して、シス側からのイオン枯渇の正味速度を減少させ、この枯渇から生じるシグナルに対して起こり得る有害な影響を減少させる。
簡単に説明すると、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０２２２３６３号、第２０１６／０３３３３２７号、第２０１７／０２６７９８３号、第２０１８／００９４２４９号および第２０１８／０２４５１４７号に記載されているように、伸長速度が増加したエキソヌクレアーゼ欠損Ｐｏｌ６変異体などのＰｏｌ６ポリメラーゼ変異体にそれぞれコンジュゲートされたワイドポア変異型α－ＨＬナノポアのアレイを使用して、貫通遮断剤プライマーのナノポアアッセイを行う。
各々の異なるポリマー部分タグから生じる別の変化したイオン流事象を表すタグ電流レベルシグナルは、タグ付けされたヌクレオチドがＤＮＡ鋳型でプライミングされたα－ＨＬ－Ｐｏｌ６ナノポア－ポリメラーゼコンジュゲートによって捕捉される際に、観察される。これらの事象のプロットを経時的に記録し、分析する。一般に、１０ｍｓより長く続く事象は、鋳型鎖に相補的な正しい塩基のポリメラーゼ取込みと同時に、生産的なタグ捕捉が起こることを示す。
貫通遮断剤プライマーのリード長および貫通割合特性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｔｈｒｅａｄｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を、本明細書に記載のナノポアシーケンシング条件下でナノポアアッセイで評価した。配列決定および分析の完了時に、高品質リードに基づくリード長の中央値を収集し、時期尚早に終了した全高品質リードの割合を、全高品質リードに対する高品質リードの配列決定における早期終了の割合として決定した。
リード長および貫通の％を示すナノポアアッセイの結果を、コントロールプライマーおよび種々の貫通遮断剤プライマーについて以下の表９に示す。読み取り遮断剤プライマーは、対照プライマーと比較して、実質的に読み取り長の増加、および貫通割合の減少を示す傾向がある。
Claims (15)
- 式（Ｉ）：
５’－［ブロッキング部分］－［プライマー］－３’（Ｉ）
（式中、
ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み、前記塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；
プライマーは、ナノポアに連結したポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む）
の化合物を含む、組成物。 - 前記式（Ｉ）の化合物が、
（Ｉａ）：
ｎは１～１０であり；
Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）
（Ｉｂ）：
ｎは１～１０であり；
Ｒは、Ｏ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）
（Ｉｃ）：
ｎは１～１０であり；
Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）
（Ｉｄ）：
ｎは１～１０であり、
Ｂは修飾核酸塩基であり；
Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）および
（Ｉｅ）：
ｎは１～１０であり、
Ｂは修飾核酸塩基であり；
Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）
からなる群から選択される式の化合物を含む、請求項１に記載の組成物。 - 前記式（Ｉ）の化合物が、前記ブロッキング部分の５’末端に結合したビオチンタグをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 式（ＩＩ）：
５’－［ビオチンタグ］－［ブロッキング部分］－［プライマー］－３’（ＩＩ）
（式中、
ビオチンタグはビオチンタグを含み；
ブロッキング部分は、ポリカチオン性基、かさ高い基または塩基修飾ヌクレオシドを含み、前記塩基修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基に結合したポリカチオン性基またはかさ高い基を含み；
プライマーは、ナノポアに連結したポリメラーゼによるコピー鎖の重合をプライミングし得るオリゴヌクレオチドを含む）
の化合物を含む、組成物。 - 前記式（ＩＩ）の化合物が、
（ＩＩａ）：
ｎは１～１０であり；
Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）
（ＩＩｂ）：
ｎは１～１０であり；
Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）
（ＩＩｃ）：
ｎは１～１０であり；
Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）
（ＩＩｄ）：
ｎは１～１０であり、
Ｂは修飾核酸塩基であり；
Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）および
（ＩＩｅ）：
ｎは１～１０であり、
Ｂは修飾核酸塩基であり；
Ｒは、Ｏ－、Ｓ－、ＣＨ３およびＨから独立して選択される）
から選択される式の化合物を含む、請求項８に記載の組成物。 - 前記ビオチンタグが、式（ＩＩＩ）：
Ｂ－Ｌ－［（Ｎ）ｘ－（Ｕ）ｙ－（Ｎ）ｚ］ｗ（ＩＩＩ）
（式中、
Ｂはビオチンまたはデスチオビオチンであり；
Ｌはリンカーであり；
Ｎはヌクレオチドであり：
Ｕはウラシルであり；
ｘおよびｚは少なくとも１であり；ｙは少なくとも３であり；ｗは０または１である）
の構造を含む、請求項３のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記ビオチンタグが、ビオチン部分とリンカー部分、またはデスチオビオチン部分とリンカー部分を含み、前記リンカー部分が前記ブロッキング部分の５’末端に結合している、請求項３または４に記載の組成物。
- 前記ブロッキング部分がポリカチオン性基を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ポリカチオン性基が、スペルミン、スペルミジン、［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）８］、［Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）－εＬｙｓ－（Ｌｙｓ）１２］、［（Ｌｙｓ）８－εＬｙｓ－Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）］、［（Ｌｙｓ）１２－εＬｙｓ－Ｐｈｅ（４－ＮＯ２）］、［ＰＡＭＡＭ Ｇｅｎ１アミノ］、ポリ（エチレンジアミン）、ポリ（プロピレンジアミン）、ポリ（アリルアミン）、カチオン性アミノ酸のオリゴマー、およびカチオン性アミノアルキルのオリゴマーから選択される、請求項８に記載の組成物。
- 前記ポリカチオン性基が、リジン、ε－リジン、オルニチン、（アミノエチル）グリシン、アルギニン、ヒスチジン、メチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジン、および／またはアミノプロリンのオリゴマーから選択されるカチオン性アミノ酸のオリゴマーである、請求項８に記載の組成物。
- 前記ポリカチオン性基がスペルミン基のオリゴマーである、請求項８に記載の組成物。
- 前記ブロッキング部分がかさ高い基を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
- シス側およびトランス側に電極を有する膜；前記膜を貫通して延在する孔を有するナノポア；
前記ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼ；
両方の電極と接触しているイオンを含む電解質溶液；
および
式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、または請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物を含む、ナノポア組成物。 - シス側およびトランス側に電極を有する膜；前記膜を貫通して延在する孔を有するナノポア、および前記ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼを含むナノポアデバイス；
４種のタグ付きヌクレオチドのセット；ならびに
式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、または請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。 - 核酸の配列を決定するための方法であって、
（ａ）膜、前記膜のシス側およびトランス側の電極、前記膜を貫通して延在する孔を有するナノポア、前記ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼ、両方の電極と接触しているイオンを含む電解質溶液、および式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、または請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物を含むナノポア組成物を提供することと；
（ｂ）（ａ）の前記ナノポア組成物を、（ｉ）核酸；および（ｉｉ）各々がポリメラーゼ基質として作用し得、各々が異なるタグに結合し、前記タグが前記ナノポアに入ると、前記ナノポアを通過するイオンの異なる流れの変化をもたらす、４種のタグ付きヌクレオチドのセットと接触させることと；
（ｃ）前記ナノポア内への前記異なるタグの進入に起因する前記イオンの異なる流れの変化を経時的に検出し、核酸配列に相補的な、前記ポリメラーゼによって組み込まれた前記異なる化合物のそれぞれと相関させ、それによって前記核酸配列を決定することと
を含む、方法。
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