CN117535377A - 转化胞嘧啶的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种转化核酸样本中胞嘧啶碱基的方法,所述方法包括对包含所述核酸样本和转化剂的反应混合物进行脱氨基处理,所述脱氨基处理为在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约1分钟至约20分钟以获得脱氨反应产物,且所述转化剂的质量占所述反应混合物总体积的约50%(w/v)至约70%(w/v)。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域,具体的涉及一种转化胞嘧啶的方法及其用途和产品。
背景技术
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,其通常是指在DNA甲基化转移酶的作用下,基因组5'-CpG-3'二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团,即5-甲基化胞嘧啶(5-mC),其含量占所有胞嘧啶残基的2-5%。DNA甲基化与人类发育、基因转录调节、遗传印记和肿瘤疾病有密切关系,特别是CpG岛异常甲基化与肿瘤抑制基因的转录失活有关,基因组中富含CpG的一段DNA称为CpG岛,CpG常成簇存在,长度在1~2kb左右。迄今为止,超过1000多个基因CpG高甲基化与癌症有关。癌细胞中特定基因的甲基化为癌症早期诊断提供了一种重要生物标志物,因而5-甲基化胞嘧啶的检测技术在肿瘤早筛等领域已经得到广泛的应用。目前对5-甲基化胞嘧啶的检测技术主要是通过亚硫酸氢盐处理,使未发生甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶,而被修饰的胞嘧啶则不发生改变,从而识别DNA分子中胞嘧啶残基的甲基化状态;DNA经亚硫酸氢盐转化处理后,可采用核酸测序、定量PCR和基因芯片等分析来确定碱基甲基化。
然而,亚硫酸氢盐促使DNA转化的原理很简单,实际操作并非易事,传统亚硫酸氢盐处理DNA存在一些致命缺点:为确保DNA高转化率以排除假阳性结果,转化反应是在高浓度亚硫酸氢盐溶液、高温、长时间反应以及严格的pH环境等条件下进行,但如此剧烈的反应条件往往导致DNA降解,从而降低后续分析技术的灵敏度。传统的亚硫酸氢盐处理往往导致84%~96%的起始DNA丢失,在需要进行分析的DNA量有限的情况下,高DNA降解率使得甲基化分析的适用性受到严重限制。特别是对来自体液,例如血液或者尿液的DNA进行分析时,样品DNA往往以很小的浓度存在于体液中;另外,传统的转化反应过夜(~18小时),反应时间长对实际工作带来诸多不便。因此,提高DNA的转化率,降低DNA的降解率以及缩短反应时间,一直是本领域研究人员致力于解决的问题。目前市场上有多家公司提供转化试剂盒,都对亚硫酸氢盐法进行了相应的技术改进,以市场上最为常用的ZYMO Research公司的EZ-DNA-Methylation-Gold试剂盒为例,其亚硫酸氢盐处理的过程需要2小时40分钟,但其数小时的反应过程依然使得实际操作的便捷程度和反应体系的稳定性存在较大挑战。
发明内容
本申请提供了一种快速转化胞嘧啶的方法及其用途,所述方法在保证了DNA样品较低损耗率的前提下,将现有方法中数个小时的处理程序缩短至数分钟至十数分钟内,并且所述方法使用的转化成分简单、易配制并且常温下即可稳定保存,而不需要即用即配。
一方面,本申请提供一种转化核酸样本中胞嘧啶碱基的方法,所述方法包括对反应混合物进行脱氨基处理,所述脱氨基处理为在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约1分钟至约20分钟以获得脱氨反应产物,所述反应混合物包含所述核酸样本和转化剂,所述转化剂的质量占所述反应混合物总体积的约50%(w/v)至约70%(w/v)。
在一些实施方案中,所述方法不包括在85℃或以下的温度下加热所述反应混合物的步骤。
在一些实施方案中,所述转化剂包含亚硫酸氢盐,且所述反应混合物中亚硫酸氢根离子的体积摩尔浓度为约7M至约12M。
在一些实施方案中,所述转化剂包含亚硫酸氢铵。
在一些实施方案中,所述转化剂为亚硫酸氢铵。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在约95℃至约98℃的温度下加热所述反应混合物以获得所述脱氨反应产物。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在约98℃的温度下加热所述反应混合物以获得所述脱氨反应产物。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在所述温度下加热所述反应混合物约5分钟至约15分钟以获得所述脱氨反应产物。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在所述温度下加热所述反应混合物约10分钟以获得所述脱氨反应产物。
在一些实施方案中,所述转化剂的质量占所述反应混合物总体积的约60%(w/v)至约70%(w/v)。
在一些实施方案中,所述转化剂的质量占所述反应混合物总体积的约61%(w/v)至约63%(w/v)。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理还包括添加辅助所述脱氨基处理的组分。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理还包括添加任选自下列所述的一种或多种保护剂:对苯二酚、海藻糖、精胺、奎诺二甲基丙烯酸酯、以及其类似物和衍生物。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理还包括添加硫化促进剂和/或适于进行所述脱氨基处理的缓冲液。
在一些实施方案中,所述方法还包括对所述脱氨反应产物进行去除亚硫酸基团的处理,以获得脱硫化产物。
在一些实施方案中,所述去除亚硫酸基团的处理包括使所述脱氨反应产物处于碱性环境,以获得所述脱硫化产物。
在一些实施方案中,所述碱性环境的pH值约为9至14。
在一些实施方案中,所述方法还包括回收所述脱氨反应产物和/或所述脱硫化产物中的核酸。
在一些实施方案中,所述回收包括下列步骤的一项或多项:使所述反应混合物在所述脱氨处理前与固相载体接触;使所述脱氨反应产物与固相载体接触;和使所述脱硫化产物与固相载体接触。
在一些实施方案中,所述固相载体选自聚苯乙烯、金属金、玻璃、磁性粒子和微粒子。
在一些实施方案中,与所述固相载体的接触是在偶联剂存在的条件下进行。
在一些实施方案中,所述回收还包括洗涤所述脱氨反应产物和/或所述脱硫化产物。
在一些实施方案中,所述回收还包括将所述接触固相载体的脱氨反应产物和/或所述接触固相载体的脱硫化产物中的核酸从所述固相载体上洗脱下来。
另一方面,本申请提供一种检测核酸样本中甲基化水平的方法,所述方法包括使用本申请所述的方法处理所述核酸样本以获得胞嘧啶转化产物。
在一些实施方案中,所述方法还包括下列步骤的一项或多项:对所述胞嘧啶转化产物中的核酸进行线性扩增;对所述胞嘧啶转化产物中的核酸进行指数扩增;对所述胞嘧啶转化产物中的核酸进行特定寡核苷酸的延伸处理以生成延伸产物;和分析所述延伸产物以鉴别所述核酸样本的甲基化水平。
另一方面,本申请提供经本申请所述的方法处理的核酸样本。
另一方面,本申请提供一种试剂盒,所述试剂盒包含能够转化核酸样本中胞嘧啶碱基的转化组分和使用说明书,所述使用说明书中包含进行所述胞嘧啶转化的方法,所述方法包括对所述试剂盒中的所述转化组分与所述核酸样本的反应混合物进行脱氨基处理,所述转化组分的质量占所述反应混合物总体积的约50%(w/v)至约70%(w/v),且所述脱氨基处理为在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约1分钟至约20分钟。
在一些实施方案中,所述胞嘧啶转化的方法不包括在85℃或以下的温度下加热所述反应混合物的步骤。
在一些实施方案中,所述转化组分包含亚硫酸氢盐,且所述反应混合物中亚硫酸氢根离子的体积摩尔浓度为约7M至约12M。
在一些实施方案中,所述转化组分包含亚硫酸氢铵。
在一些实施方案中,所述转化组分为亚硫酸氢铵。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在约95℃至约98℃的温度下加热所述反应混合物。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在约98℃的温度下加热所述反应混合物。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在所述温度下加热所述反应混合物约5分钟至约15分钟。
在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在所述温度下加热所述反应混合物约10分钟。
在一些实施方案中,所述转化组分的质量占所述反应混合物总体积的约60%(w/v)至约70%(w/v)。
在一些实施方案中,所述转化组分的质量占所述反应混合物总体积的约61%(w/v)至约63%(w/v)。
在一些实施方案中,所述试剂盒还包含纯化组分。
在一些实施方案中,所述纯化组分包含下列成分的一种或多种:能够去除经所述脱氨基处理的产物中亚硫酸基团的组分;洗涤组分;和回收所述核酸的组分。
在一些实施方案中,所述回收组分包含固相载体和洗脱组分。
在一些实施方案中,所述回收组分还包含偶联剂。
在一些实施方案中,所述试剂盒还包含选自下列所述的一种或多种其他组分:对苯二酚、海藻糖、精胺、奎诺二甲基丙烯酸酯、以及其类似物和衍生物;硫化促进剂、和适于进行所述脱氨基处理的缓冲液。
在一些实施方案中,所述使用说明书包含实体形式和/或可机读的电子形式。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的,本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地,本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的,而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下:
图1A-1B显示的是本申请所述方法和EZ-DNA-Methylation-Gold试剂盒分别处理核酸样本后的胞嘧啶转化率情况;图1C显示的是两种不同方法处理核酸样本后的胞嘧啶转化率对比情况。
图2A-2B显示的是本申请所述方法和EZ-DNA-Methylation-Gold试剂盒分别处理核酸样本后的胞嘧啶未转化率情况;图2C显示的是两种不同方法处理核酸样本后的胞嘧啶未转化率对比情况。
图3A-3C显示的是本申请所述方法采用不同转化剂的胞嘧啶转化率对比情况。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中,术语“样本”通常是指包含所关注的待分析物质的标本,例如,微生物、病毒、核酸(如基因),或者它们的组分,所述组分可包含分析物中的或者从分析物取得的核酸。样本可来自任何来源,例如生物标本或者环境来源。生物标本包括从活生物体或死亡生物体取得的任何组织或材料,该组织或材料可包含分析物或者分析物中的或从分析物取得的核酸。生物样本的例子包括呼吸组织、渗出物(例如,支气管肺泡灌洗液)、活组织标本、痰、外周血、血浆、血清、淋巴结、胃肠组织、粪便、尿液、脑脊液、组织液(例如,胸腹水)、灌洗液(例如,肺泡)或者其他流体、组织或材料。环境来源样本的例子包括水、冰、土壤、混悬液、残渣、生物膜、大气尘粒子以及气溶胶。样本可为经处理的标本或材料,例如通过使用过滤、离心、沉淀或者吸附至介质(例如,基体或载体)处理样品而获得。样品的其他处理可包括物理或机械地破碎组织、细胞凝聚体或细胞的处理,从而将包括核酸在内的细胞内组分释放到可包含其他组分的溶液中,所述其他组分诸如酶、缓冲液、盐、洗涤剂等等。所述样本也可以包括组织,例如活检的组织(如液体活检的组织)、福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的组织等。
在本申请中,术语“核酸”与“核酸分子”或“多核苷酸”可互换使用,其通常是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或其DNA或RNA的组合及其聚合物。术语“核酸”还包括基因、基因组DNA的有义链或反义链以及二者的合成形式和混合聚合物、cDNA和/或mRNA。例如,核酸分子可以是合成的(例如化学合成的)或重组的。除非特别限定,否则该术语还可包括含有天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸,其具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式进行代谢。除非另有说明,特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP、互补序列以及明确指出的序列。具体地,简并密码子取代可以通过产生序列来实现,所述序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer et al.,NucleicAcid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语“核酸”还可经化学或生物化学修饰,如本领域的技术人员将容易了解。此类修饰包括(例如)标记、甲基化、用类似物对一个或多个天然核苷酸的取代、核苷酸间修饰,例如不带电连接(例如,甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电连接(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧接部分(例如,多肽)、嵌入剂(例如,吖啶、补骨脂内酯(psoralen)等)、螯合剂、烷基化剂及经修饰连接(例如,α变旋异构核酸等)。上述术语还意欲包括任何拓扑构象,包括单链构象、双链构象、部分双螺旋构象、三螺旋构象、发卡构象、环形构象及挂锁构象。
在本申请中,术语“为……”通常代表一种封闭式限定或者代表指定的含义或对象,例如,在本申请中,“所述转化剂为亚硫酸氢铵”意指不包含除了亚硫酸氢铵以外的其他亚硫酸氢盐,或者指在某些实施方式中,所述转化剂由亚硫酸氢铵组成。
在本申请中,术语“包含”和“包括”可互换使用,其通常是指包括明确指定的特征,但不排除其他要素。
在本申请中,术语“亚硫酸氢盐”通常是指一种可以区分具有修饰状态和不具有修饰状态的DNA区域的试剂。例如,亚硫酸氢盐可以包括亚硫酸氢盐、或其类似物或上述的组合。例如,亚硫酸氢盐可以使未修饰的胞嘧啶的氨基脱氨基化,以使其与修饰的胞嘧啶区分。在本申请中,术语“类似物”通常是指具有类似结构和/或功能的物质。例如亚硫酸氢盐的类似物可以与亚硫酸氢盐具有类似的结构。例如,亚硫酸氢盐的类似物可以是指一种同样可以区分具有修饰状态和不具有修饰状态的DNA区域的试剂。
在本申请中,术语“固相载体”通常是指不溶于本申请发明的混合物的基质(substrate)。优选的固相是一种其表面能与核酸主链的磷酸根基团相互作用的基质。该固相可采取多孔或无孔颗粒、粉末化颗粒或纤维的形式。由包含大量非织造纤维的羊毛状材料组成的固相也包括在内。优选的固相由玻璃组成。优选的固相为多孔或无孔矿物基质,例如,硅石、石英、C盐(celite)或其他具有氧化表面(包括,例如,氧化锆、氧化铝和其他金属氧化物)的材料或其混合物。还有,术语“固相载体”可涵盖包覆有硅石、玻璃、石英或C盐的磁性-可吸引颗粒。另外,本领域的技术人员应理解,“粉末”或“粉末化”材料形式的基质指的是一种精细分散的材料,当分散在本发明液体组合物中时,生成一种悬浮体。术语“粉末”或“粉末化”材料意在涵盖这样的片剂,其中粉末化材料虽已经聚集在一起,但当与液相混合时依然产生悬浮体。
在本申请中,术语“接触”通常是指使两种或更多种组分至少部分地相互混合。可以通过在流体或半流体混合物中混合各组分来实现接触。当一种或多种组分在固体表面上与一种或多种其他组分发生物理接触时也可实现接触,该固体表面例如固体组织切片或者基质。
在本申请中,术语“回收”和“分离”或“纯化”可互换地使用,通常是指移除混合物(例如,样品)中的一种或多种组分,以与该混合物中的一种或多种其他组分分离。样品组分包括核酸,所述样品组分可包括细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质,以及其他化合物。
在本申请中,术语“选自”通常是指包括选择的对象以及其所有组合。例如“选自(:)A、B和C”意指包括A、B和C的所有组合,例如,A、B、C、A+B、A+C、B+C或A+B+C。
在本申请中,术语“洗脱”通常是指从底物或溶液中移除生物材料的动作。在一些方面,所述的移除可以通过使用液体或流体,例如适宜的缓冲液体系来进行。
在本申请中,术语“线性扩增”通常是指经设计以在反应中与靶核酸的含量成线性比例地使靶核酸数量产生增长的扩增过程。例如,可使用转录相关的反应从靶DNA制备多个RNA拷贝,其中拷贝数量的增加可用线性因子(例如,模板的起始拷贝×100倍)来描述。例如,在多阶段扩增程序中,第一阶段的线性扩增可使得在第二阶段扩增反应开始前,靶核酸链或该靶核酸链的互补链的起始数量增加至少10倍,例如增加至少100倍,例如增加10至1000倍。线性扩增体系的一个示例性实施方案是基于T7的DNA线性扩增。本申请中还记载了其他线性扩增方法。因此,术语“线性扩增”是指不会导致靶核酸序列的指数级扩增的扩增反应。术语“线性扩增”并非是指仅制备靶核酸链的单拷贝的方法。
在本申请中,术语“指数扩增”通常是指经设计以在反应中与靶核酸的含量成几何比例地使靶核酸数量产生增长的扩增过程。例如,PCR针对每一原始靶链以及针对存在的每一合成链产生一条DNA链。类似地,转录相关的扩增针对每一原始靶链以及针对每一随后合成的链产生多个RNA转录物。该扩增是指数级的,因为所合成的链被用作后续轮扩增中的模板。扩增反应不需要实际上产生指数级增长量的核酸才能被视为指数级扩增,只要该扩增反应被设计为应产生此类增长即可。
在本申请中,术语“寡核苷酸”通常是指由多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或其相关的结构变体或合成类似物)通过磷酸二酯键(或其相关的结构变体或合成类似物)连接组成的聚合物。因此,虽然术语“寡核苷酸”一般指其中核苷酸残基和它们之间的连接是天然产生的核苷酸聚合物,但应理解,该术语的范围也包括各种类似物,包括但不限于:肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核酸等。寡核苷酸的确切大小可取决于具体应用,通常是长度较短的、单链的和合成的多核苷酸,通常但不一定少于约200个核苷酸残基,但该术语也可指任何长度的分子,尽管术语“多核苷酸”或“核酸”一般用于较大的寡核苷酸。例如,所述寡核苷酸可通过使用任何公知的体外化学或酶促方法合成制备的,并且可在合成之后通过使用标准方法而纯化,所述标准方法包括例如高效液相色谱(HPLC)。在本申请中,代表性的寡核苷酸包括,例如引物,启动子,检测探针寡核苷酸,靶捕获寡核苷酸等。
“延伸处理”在本申请中,术语“延伸处理”与“延伸反应”可互换使用,其通常是指将特定核苷酸加入靶核酸中,产生更长的用于直接或间接检测的、或者用于以后的扩增循环的靶的核酸或“延伸产物”,例如,可以加入特定核苷酸来延伸靶核酸的5’或3’末端。
发明详述
一方面,本申请提供一种转化核酸样本中胞嘧啶碱基的方法,所述方法包括对反应混合物进行脱氨基处理,所述脱氨基处理为在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约1分钟至约20分钟以获得脱氨反应产物,所述反应混合物包含所述核酸样本和转化剂,所述转化剂的质量占所述反应混合物总体积的约50%(w/v)至约70%(w/v)。
脱氨基处理的加热程序
为使得所述核酸样本中的胞嘧啶碱基脱去氨基基团以生成所述脱氨反应产物,具体地,本申请所述的脱氨基处理可在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟或约20分钟。在一些实施方案中,所述脱氨基处理可在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约5分钟至约15分钟以获得所述脱氨反应产物,即可以是加热约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟或约15分钟。例如,所述脱氨基处理为在所述温度下加热所述反应混合物约10分钟以获得所述脱氨反应产物。在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃、约100℃或者更高的温度下加热所述反应混合物。在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在约95℃至约98℃的温度下加热所述反应混合物以获得所述脱氨反应产物。具体而言,所述脱氨基处理可以是在约95℃、约96℃、约97℃或约98℃的温度下加热所述反应混合物以获得所述脱氨反应产物。更具体地,例如,所述脱氨基处理为在约98℃的温度下加热所述反应混合物以获得所述脱氨反应产物。在本申请方法所述的在至少90℃的温度下加热约1分钟至约20分钟的期间,可维持相同的温度,也可使温度发生变化,但所述方法不包括在85℃或以下的温度下加热所述反应混合物的步骤。
脱氨基处理的转化剂
本申请方法所述的反应混合物包含所述核酸样本和转化剂,具体而言,所述转化剂的质量可占所述反应混合物总体积的约50%(w/v)、约51%(w/v)、约52%(w/v)、约53%(w/v)、约54%(w/v)、约55%(w/v)、约56%(w/v)、约57%(w/v)、约58%(w/v)、约59%(w/v)、约60%(w/v)、约61%(w/v)、约62%(w/v)、约63%(w/v)、约64%(w/v)、约65%(w/v)、约66%(w/v)、约67%(w/v)、约68%(w/v)、约69%(w/v)或约70%(w/v)。在一些实施方案中,所述转化剂的质量占所述反应混合物总体积的约60%(w/v)至约70%(w/v)。具体地,所述转化剂的质量可占所述反应混合物总体积的约60%(w/v)、约61%(w/v)、约62%(w/v)、约63%(w/v)、约64%(w/v)、约65%(w/v)、约66%(w/v)、约67%(w/v)、约68%(w/v)、约69%(w/v)或约70%(w/v)。在一些实施方案中,所述转化剂的质量占所述反应混合物总体积的约61%(w/v)至约63%(w/v)。例如,所述转化剂的质量可占所述反应混合物总体积的约60%(w/v)、约60.1%(w/v)、约60.2%(w/v)、约60.3%(w/v)、约60.4%(w/v)、约60.5%(w/v)、约60.6%(w/v)、约60.7%(w/v)、约60.8%(w/v)、约60.9%(w/v)、约61%(w/v)、约61.1%(w/v)、约61.2%(w/v)、约61.3%(w/v)、约61.4%(w/v)、约61.5%(w/v)、约61.6%(w/v)、约61.7%(w/v)、约61.8%(w/v)、约61.9%(w/v)、约62%(w/v)、约62.1%(w/v)、约62.2%(w/v)、约62.3%(w/v)、约62.4%(w/v)、约62.5%(w/v)、约62.6%(w/v)约62.7%(w/v)、约62.8%(w/v)、约62.9%(w/v)或约63%(w/v)。
在一些实施方案中,所述转化剂可包含亚硫酸氢盐,且所述反应混合物中亚硫酸氢根离子的体积摩尔浓度为约7M至约12M。例如,所述反应混合物中亚硫酸氢根离子的体积摩尔浓度可以是约7.0M、约8.0M、约9.0M、约10.0M、约11.0M或约12.0M。在一些实施方案中,所述转化剂包含亚硫酸氢铵。在一些实施方案中,所述转化剂为亚硫酸氢铵。
本申请所述的方法还可包括添加辅助所述脱氨基处理的组分。例如,所述辅助可以是指促进目标反应(例如,本申请中的胞嘧啶碱基脱氨反应)的进行或提高其反应速率、引入保护基团以避免非目标反应物发生副反应或避免目标反应物(例如,核酸分子)被降解,提供适于目标反应进行的pH环境,以及促进目标反应产物的分离纯化等。在一些实施方案中,所述脱氨基处理还可包括添加任选自下列所述的一种或多种保护剂:对苯二酚、海藻糖、精胺、奎诺二甲基丙烯酸酯、以及其类似物和衍生物。在一些实施方案中,所述脱氨基处理还可包括添加硫化促进剂和/或适于进行所述脱氨基处理的缓冲液。
本申请所述的方法还可包括回收所述脱氨反应产物中的核酸。在一些实施方案中,所述回收可包括使所述反应混合物在所述脱氨处理前与固相载体接触,和/或使所述脱氨反应产物与固相载体接触。例如,所述固相载体可选自聚苯乙烯、金属金、玻璃、磁性粒子和微粒子。在一些实施方案中,与所述固相载体的接触是在偶联剂存在的条件下进行。在一些实施方案中,所述回收还可包括洗涤所述脱氨反应产物。在一些实施方案中,所述回收还可包括将所述接触固相载体的脱氨反应产物中的核酸从所述固相载体上洗脱下来。
脱硫化产物的获得和回收
在一些实施方案中,所述方法还可包括对所述脱氨反应产物进行去除亚硫酸基团的处理,以获得脱硫化产物。例如,所述去除亚硫酸基团的处理可包括使所述脱氨反应产物处于碱性环境,以获得所述脱硫化产物。具体地,在一些实施方案中,所述碱性环境的pH值约为9至14;例如,所述碱性环境的pH可约为9、10、11、12、13或14。
本申请所述的方法还可包括回收所述脱硫化产物中的核酸。在一些实施方案中,所述回收可包括下列步骤的一项或多项:使所述反应混合物在所述脱氨处理前与固相载体接触;使所述脱氨反应产物与固相载体接触;和使所述脱硫化产物与固相载体接触。例如,所述固相载体可选自聚苯乙烯、金属金、玻璃、磁性粒子和微粒子。在一些实施方案中,与所述固相载体的接触是在偶联剂存在的条件下进行。在一些实施方案中,所述回收还可包括洗涤所述脱硫化产物。在一些实施方案中,所述回收还可包括将所述接触固相载体的脱硫化产物中的核酸从所述固相载体上洗脱下来。
另一方面,本申请提供一种检测核酸样本中甲基化水平的方法,所述方法包括使用本申请所述的方法处理所述核酸样本以获得胞嘧啶转化产物。该胞嘧啶转化产物可以是根据本申请所述方法获得的所述脱氨反应产物(例如,所述回收之前、所述回收之后和/或经过其他处理或反应的),和/或根据本申请所述方法获得的脱硫化产物(例如,所述回收之前、所述回收之后和/或经过其他处理或反应的)。在一些实施方案中,所述方法还包括下列步骤的一项或多项:对所述胞嘧啶转化产物中的核酸进行线性扩增;对所述胞嘧啶转化产物中的核酸进行指数扩增;对所述胞嘧啶转化产物中的核酸进行特定寡核苷酸的延伸处理以生成延伸产物;和分析所述延伸产物以鉴别所述核酸样本的甲基化水平。
另一方面,本申请提供经本申请所述的方法处理的核酸样本。
另一方面,本申请提供一种试剂盒,所述试剂盒包含能够转化核酸样本中胞嘧啶碱基的转化组分和使用说明书,所述使用说明书中包含进行所述胞嘧啶转化的方法,所述方法包括对所述试剂盒中的所述转化组分与所述核酸样本的反应混合物进行脱氨基处理,所述转化组分的质量占所述反应混合物总体积的约50%(w/v)至约70%(w/v),且所述脱氨基处理为在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约1分钟至约20分钟。
例如,所述的脱氨基处理可在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟或约20分钟。在一些实施方案中,所述脱氨基处理可在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约5分钟至约15分钟以获得所述脱氨反应产物,即可以是加热约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟或约15分钟。例如,所述脱氨基处理为在所述温度下加热所述反应混合物约10分钟以获得所述脱氨反应产物。在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃、约100℃或者更高的温度下加热所述反应混合物。在一些实施方案中,所述脱氨基处理为在约95℃至约98℃的温度下加热所述反应混合物以获得所述脱氨反应产物。具体而言,所述脱氨基处理可以是在约95℃、约96℃、约97℃或约98℃的温度下加热所述反应混合物以获得所述脱氨反应产物。更具体地,例如,所述脱氨基处理为在约98℃的温度下加热所述反应混合物以获得所述脱氨反应产物。例如,所述脱氨基处理在至少90℃的温度下加热约1分钟至约20分钟的期间,可维持相同的温度,也可使温度发生变化,但所述方法不包括在85℃或以下的温度下加热所述反应混合物的步骤。
在一些实施方案中,所述转化组分包含亚硫酸氢盐,且所述反应混合物中亚硫酸氢根离子的体积摩尔浓度为约7M至约12M。例如,所述反应混合物中亚硫酸氢根离子的体积摩尔浓度可以是约7.0M、约8.0M、约9.0M、约10.0M、约11.0M或约12.0M。在一些实施方案中,所述转化组分包含亚硫酸氢铵。在一些实施方案中,所述转化组分为亚硫酸氢铵。
在一些实施方案中,所述试剂盒还可包含纯化组分。例如,所述纯化组分可包含下列成分的一种或多种:能够去除经所述脱氨基处理的产物中亚硫酸基团的组分;洗涤组分;和回收所述核酸的组分。例如,所述回收组分可包含固相载体和洗脱组分。在一些实施方案中,所述回收组分还可包含偶联剂。
在一些实施方案中,所述试剂盒还包含选自下列所述的一种或多种其他组分:对苯二酚、海藻糖、精胺、奎诺二甲基丙烯酸酯、以及其类似物和衍生物;硫化促进剂、和适于进行所述脱氨基处理的缓冲液。
在一些实施方案中,所述转化组分、所述去亚硫酸基团组分、所述洗涤组分、所述回收组分以及所述其他组分互相不混合。例如,所述转化组分、所述去亚硫酸基团组分、所述洗涤组分、所述回收组分以及所述其他组分各自独立地存在于单独的包装或装置中。
在一些实施方案中,所述使用说明书可包含实体形式和/或可机读的电子形式。
不欲被任何理论所限,下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的方法、产品和用途等,而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1
本申请方法处理DNA样本的效果评价
1.取10ng RKO(人结肠腺癌细胞系)来源的DNA样本,分成两份并且向这两份样本加水,将体积补齐至20uL。
2.分别在两份样本中加入180uL体积的70%的亚硫酸氢铵溶液混匀;对照组则采用与1中相同处理的两份样本并加入130uL EZ-DNA-Methylation-Gold试剂盒提供的胞嘧啶转化处理液混匀。
3.使用70%的亚硫酸氢铵处理样本时采用98℃下加热10分钟的处理程序,使用EZ-DNA-Methylation-Gold转化试剂处理样本时的处理程序为95℃下加热10分钟,以及64℃下加热2小时30分钟。
4.完成上一步处理后的DNA样本均采用EZ-DNA-Methylation-Gold试剂盒中的纯化柱、结合液、洗涤液和脱硫液,以及洗脱液进行纯化,纯化的具体步骤如下:
(1)将完成转化的样本加入到纯化柱中,加入450uL结合液,颠倒混匀,然后13000g离心30s,弃滤液;
(2)加入100uL洗涤液到纯化柱中,然后13000g离心30s,弃滤液;
(3)加入200uL脱硫液(配方为30ml 1.3% NaOH溶液+70ml异丙醇)到纯化柱中,然后室温静置20分钟,后13000g离心30s,弃滤液;
(4)加入200uL洗涤液到纯化柱中,然后13000g离心30s,弃滤液;
(5)加入200uL洗涤液到纯化柱中,然后13000g离心1分钟,弃滤液;
(6)加入25uL洗脱液到纯化柱中,然后13000g离心1分钟,收集滤液,即为完成胞嘧啶转化的核酸;
5.使用qPCR检测DNA样本的胞嘧啶转化效率:
(1)根据人基因组上ACTB基因的序列,寻找一段仅含C的片段合成引物和荧光标记探针(命名为UNT,SEQ ID NO:1-3),然后再按照胞嘧啶转化为胸腺嘧啶的规则合成一套转化后的引物和荧光标记探针(命名为T,SEQ ID NO:4-6);
(2)按照下表的配方,配制反应体系:
(3)按照下面的程序进行qPCR反应,qPCR仪为Roche light cycler 480II,
6.检测结果如下表和图1-2所示,其中qPCR的cutoff值结果如下表:
从结果来看,亚硫酸氢铵与EZ-DNA-Methylation-Gold试剂盒的胞嘧啶的转化效率一致,但是所需的时间大大缩短。
实施例2
本申请方法采用不同转化剂处理DNA样本的效果评价
1.取45ng RKO肠癌细胞的DNA,分成9份;将9份DNA样本均加水,将体积补齐至20uL。
2.将9份样本分为三组,每组3个样本,对三组样本的每个样本分别加入180uL体积的70%的亚硫酸氢铵溶液,或者180uL体积的5M亚硫酸氢钠溶液,或者180uL体积的4M亚硫酸铵溶液混匀。
3.采用98℃10分钟的加热处理程序。
4.完成上一步处理后,均采用DNA-Clean&Concentrator试剂盒中的纯化柱、洗涤液和自制脱硫剂(pH=13的70%异丙醇溶剂),以及洗脱液进行纯化;具体步骤如下:
(1)将完成转化的样本加入到纯化柱中,然后13000g离心30s,弃滤液;
(2)加入100uL洗涤液到纯化柱中,然后13000g离心30s,弃滤液;
(3)加入200uL自制脱硫剂到纯化柱中,然后室温静置20分钟,后13000g离心30s,弃滤液;
(4)加入200uL洗涤液到纯化柱中,然后13000g离心30s,弃滤液;
(5)加入200uL洗涤液到纯化柱中,然后13000g离心1分钟,弃滤液;
(6)加入25uL洗脱液到纯化柱中,然后13000g离心1分钟,收集滤液,即为完成胞嘧啶转化的核酸;
5.使用qPCR检测样本的胞嘧啶转化效率:
(1)根据人基因组上ACTB基因的序列,寻找一段仅含C的片段,然后再按照胞嘧啶转化为胸腺嘧啶的规则合成一套转化后的引物和荧光标记探针(如实施例1的5.(1)步骤所述)。
(2)按照下表的配方,配制反应体系:
(3)按照下面的程序进行qPCR反应,qPCR仪为Roche light cycler 480II,
6.检测结果如图3A-3C所示,其中qPCR的cutoff值结果如下表:
试剂名 | 重复1 | 重复2 | 重复3 |
亚硫酸氢铵 | 32.83 | 33.18 | 32.18 |
亚硫酸氢钠 | 无扩增 | 无扩增 | 无扩增 |
亚硫酸铵 | 无扩增 | 无扩增 | 无扩增 |
从结果来看,70%亚硫酸氢铵可以高效的完成胞嘧啶的转化,但是4M亚硫酸氢钠溶液与5M亚硫酸铵溶液转化的产物通过PCR方法无法检测到。
Claims (10)
1.一种转化核酸样本中胞嘧啶碱基的方法,所述方法包括对反应混合物进行脱氨基处理,所述脱氨基处理为在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约1分钟至约20分钟以获得脱氨反应产物,所述反应混合物包含所述核酸样本和转化剂,所述转化剂的质量占所述反应混合物总体积的约50%(w/v)至约70%(w/v)。
2.根据权利要求1所述的方法,所述方法不包括在85℃或以下的温度下加热所述反应混合物的步骤。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,所述转化剂包含亚硫酸氢盐,且所述反应混合物中亚硫酸氢根离子的体积摩尔浓度为约7M至约12M。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,所述转化剂为亚硫酸氢铵。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,所述方法还包括对所述脱氨反应产物进行去除亚硫酸基团的处理,以获得脱硫化产物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,所述方法还包括回收所述脱氨反应产物和/或所述脱硫化产物中的核酸。
7.一种检测核酸样本中甲基化水平的方法,所述方法包括使用权利要求1-6中任一项所述的方法处理所述核酸样本以获得胞嘧啶转化产物。
8.根据权利要求7所述的方法,所述方法还包括下列步骤的一项或多项:
对所述胞嘧啶转化产物中的核酸进行线性扩增;
对所述胞嘧啶转化产物中的核酸进行指数扩增;
对所述胞嘧啶转化产物中的核酸进行特定寡核苷酸的延伸处理以生成延伸产物;和
分析所述延伸产物以鉴别所述核酸样本的甲基化水平。
9.经权利要求1-8中任一项所述的方法处理的核酸样本。
10.一种试剂盒,所述试剂盒包含能够转化核酸样本中胞嘧啶碱基的转化组分和使用说明书,所述使用说明书中包含进行所述胞嘧啶转化的方法,所述方法包括对所述试剂盒中的所述转化组分与所述核酸样本的反应混合物进行脱氨基处理,所述转化组分的质量占所述反应混合物总体积的约50%(w/v)至约70%(w/v),且所述脱氨基处理为在至少90℃的温度下加热所述反应混合物约1分钟至约20分钟。
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