ES2285766T3 - Arn-polimerasa dependiente de arn que funciona preferentemente sobre molde de arn y procedimiento de transcripcion de arn bajo la dependencia de un promotor con dicha arn polimerasa dependiente de arn. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de amplificación de cualquier secuencia diana de ARN, mediante transcripción bajo la dependencia de un promotor, en una muestra de ARN que comprende dicha secuencia diana, en el que se pone en contacto dicha muestra - con un agente reactivo capaz de hibridarse con dicho ARN que comprende dicha secuencia diana, y - con un sistema enzimático que comprende una actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN, en condiciones que permiten la hibridación de dicho agente reactivo con dicho ARN que comprende dicha secuencia diana, y en condiciones que permiten el funcionamiento de dicha actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN; en el que dicho reactivo contiene: (i) una primera hebra nucleotídica que comprende: a) un primer segmento nucleotídico capaz de desempeñar la función de hebra sentido de un promotor para dicha actividad de ARN polimerasa, y b), en dirección 3¿ de dicho primer segmento, un segundo segmento nucleotídico que comprende una secuencia capaz de hibridarse con una región de dicho ARN, y (ii) en el estado hibridado sobre la primera hebra, una segunda hebra nucleotídica que comprende un tercer segmento nucleotídico capaz de hibridarse con dicho primer segmento a fin de formar un promotor bicatenario funcional; y en el que dicha actividad de ARN polimerasa es capaz de transcribir un molde de ARN, en presencia de dicho agente reactivo hibridado con dicho molde, en ausencia de factor proteico asociado y en ausencia de actividad de ligasa.
Description
ARN-polimerasa dependiente de
ARN que funciona preferentemente sobre molde de ARN y procedimiento
de transcripción de ARN bajo la dependencia de un promotor con dicha
ARN polimerasa dependiente de ARN.
La invención tiene por objeto un procedimiento
de transcripción, que permite sintetizar hebras de ARN
complementarias de un molde de ARN, así como nuevas ARN polimerasas
que permiten poner en práctica este procedimiento.
El procedimiento de la invención conduce a la
amplificación de ARN presente en bajas cantidades en una muestra
biológica, y permite así la detección y/o la cuantificación del ARN
de la muestra, o la secuenciación del producto de la amplificación,
especialmente en el campo de la microbiología y de la virología, y
más generalmente en el campo del diagnóstico médico. El
procedimiento de la invención se puede usar asimismo en la síntesis
de sondas de ARN.
Se sabe que en microbiología y en virología los
microorganismos buscados son frecuentemente bacterias viables (y
que contienen por lo tanto más ARN que ADN) o virus con ARN tal como
los virus VIH y HCV. Se sabe asimismo que, en varias patologías,
puede ser interesante seguir las variaciones de la expresión de los
genes y, por lo tanto, de la síntesis de ARN mensajero.
Por lo tanto, es importante poder disponer de un
procedimiento simple y eficaz de amplificación de una diana de
ARN.
El método PCR, que permite amplificar
cíclicamente una diana de ADN, usa una sola enzima, pero necesita la
realización de ciclos de temperaturas, generalmente a tres
temperaturas diferentes. El método PCR se puede adaptar a la
amplificación de una diana de ARN añadiendo una actividad enzimática
suplementaria de ADN polimerasa dependiente de ARN, lo que complica
todavía más este método.
El método de amplificación, denominado
NASBA/TMA, presenta la ventaja de ser un método isotérmico, pero
necesita el uso de tres actividades enzimáticas (ADN polimerasa
dependiente de ARN, ARNasa H y ARN polimerasa dependiente de ADN)
llevadas por dos o tres enzimas.
Por lo tanto, es deseable poder disponer de un
método simple y que se puede automatizar de amplificación de ARN, y
en particular de un método isotérmico que solamente usa una sola
enzima.
Para evitar los inconvenientes que acaban de ser
mencionados de las técnicas de amplificación conocidas parece por
lo tanto necesario usar, para la amplificación de ARN, una actividad
de ARN polimerasa dependiente de ARN.
Desgraciadamente, las ARN polimerasas
dependientes de ARN (ARNp ARNd) naturales conocidas no están
adaptadas para dicho uso, porque tienen exigencias específicas en
cuanto al molde de ARN, y su actividad necesita la presencia de
cofactores proteicos (denominados también factores proteicos
auxiliares o factores proteicos asociados).
Se ha descubierto ahora que ciertas ARN
polimerasas dependientes de ADN conocidas son capaces de transcribir
un ARN monocatenario en presencia de un promotor de ADN
bicatenario. Además, ciertas de estas enzimas, transformadas
mediante mutación, son capaces de sintetizar un producto de
transcripción con un mejor rendimiento cuando el molde está
constituido por ARN que cuando el molde está constituido por
ADN.
En la presente solicitud, el término
"transcripción" designa la síntesis de varias hebras de ARN en
presencia de un molde polinucleotídico y de ribonucleósidos
trifosfatos, en un medio de reacción apropiado y en condiciones que
permiten ejercer la actividad catalítica de una ARN polimerasa. La
transcripción se efectúa mediante síntesis de una copia,
complementaria y antiparalela, del molde. La hebra del molde que se
copia se denomina hebra transcrita o hebra molde. La síntesis del
ARN se desarrolla en el sentido 5' - 3'.
Se sabe que ciertas ARN polimerasas funcionan
bajo la dependencia de un promotor. Un promotor es una secuencia
nucleotídica bicatenaria reconocida por la ARN polimerasa y
necesaria para la iniciación de la transcripción.
Se debe recordar que cuando la hebra molde está
unida al promotor, el primer nucleótido transcrito sobre la hebra
molde, unido mediante su extremo 3' al extremo 5' de una de las
hebras del promotor, se denomina mediante el término "+1". La
hebra del promotor que está unida a la hebra molde se denomina hebra
antisentido. La otra hebra del promotor, complementaria de la hebra
antisentido, e hibridada a ésta, se denomina hebra sentido. Los
nucleótidos sucesivos situados en el lado del promotor, con respecto
al nucleótido +1, se numeran -1, -2, -3, etc partiendo de +1.
Por lo tanto, la posición -1 corresponde al
extremo 5' de la hebra antisentido del promotor, y al extremo 3' de
la hebra sentido. Sin embargo, algunos autores incluyen, en la
definición de la secuencia del promotor, la secuencia nucleotídica
que corresponde a la región en la que empieza la transcripción
(especialmente la secuencia desde +1 a +6, para la cual se puede
definir generalmente una secuencia de consenso).
En la hebra molde, las posiciones de los
nucleótidos sucesivos copiados, partiendo de +1, y, por lo tanto,
en la dirección 3' - 5', se numeran +2, +3, etc.
En la continuación, se habla generalmente de
hebra sentido y de hebra antisentido para el promotor propiamente
dicho (posiciones numeradas negativamente), y se habla de hebra no
molde para cualquier hebra unida al extremo 3' de la hebra sentido,
y de hebra molde para cualquier hebra unida al extremo 5' de la
hebra antisentido, o para cualquier hebra hibridada a la hebra no
molde. En una hebra polinucleotídica dada, se denomina "región
corriente arriba 5'" una región situada en el lado del extremo
5', y "región corriente abajo 3'" una región situada en el
lado del extremo 3'. Sin embargo, en el campo de la transcripción
bajo la dependencia de un promotor, y sin tomar en cuenta una hebra
en particular, se denomina tradicionalmente región "corriente
arriba 5'" la región que, en relación con la posición +1, se
encuentra en el lado del promotor (posiciones indicadas mediante
números negativos), y región "corriente abajo 3'" la región
situada en el lado del molde copiado (posiciones indicadas mediante
números positivos), de manera que la dirección corriente abajo 3'
corresponde entonces al sentido 3' - 5' en la hebra molde, y al
sentido 5' - 3' en la hebra de ARN neosintetizada.
La hebra molde no está necesariamente unida al
extremo 5' de la hebra antisentido del promotor. Pero, en este
caso, debe estar hibridada a una hebra complementaria y antiparalela
(hebra no molde) unida a su vez mediante su extremo 5' al extremo
3' de la hebra sentido del promotor; véase ZHOU W. y DOETSCH P.W.,
Biochemistry 33, 14926-14934 (1994) y
ZHOU W. et al., Cell 82,
577-585 (1995). En tal caso, la transcripción puede
empezar en cualquier posición, oscilando desde +1 hasta +24, que
corresponde al extremo 3' de la hebra molde o de la parte de la
hebra molde hibridada con la hebra no molde.
En comparación con las ARN polimerasas
bacterianas, eucariotas o mitocondriales, las ARN polimerasas
fágicas son enzimas muy sencillas. Entre ellas, las más conocidas
son las ARN polimerasas de los bacteriófagos T7, T3 y SP6. Se clonó
la ARN polimerasa del bacteriófago; véase especialmente la patente
US nº 4.952.496. Estas enzimas son muy homólogas entre sí, y
consisten en una sola subunidad. Se conocen bien los promotores
naturales específicos de las ARN polimerasas de los fagos T7, T3 y
SP6. La secuenciación del genoma completo del bacteriófago T7 (Dunn
et al., J. Mol. Biol. 166,
477-535 (1983)) permitió definir la existencia de 17
promotores sobre el ADN de este fago. La comparación de estas 17
secuencias muestra que 23 nucleótidos contiguos situados entre las
posiciones -17 y +6 con relación al sitio de iniciación (posición
+1) de la transcripción, están altamente conservados. Estos
nucleótidos son incluso idénticos en cinco promotores denominados de
clase III, que son los más eficaces, especialmente in vitro.
Además, numerosas secuencias promotoras específicas para la ARN
polimerasa T3 presentan asimismo una homología muy elevada,
especialmente entre las posiciones -17 y +6. Por otra parte, se
detectaron varias secuencias diferentes de promotor para la ARN
polimerasa del fago SP6, y presentan asimismo una alta homología;
véase Brown J. E., et al., Nucleic Acids Res.
14, 3521-3526 (1986).
Por lo tanto, es posible considerar que las
diversas ARN polimerasas fágicas mencionadas anteriormente
pertenecen a una familia de ARN polimerasas que reconocen
promotores que presentan una secuencia de consenso desde la
posición -17 a la posición +6, y especialmente desde la posición -17
a la posición -1.
El procedimiento de la invención permite
transcribir una secuencia cualquiera de ARN, porque las ARN
polimerasas, capaces de transcribir un ARN bajo la dependencia de
un promotor, que se describen en la presente solicitud, pueden
transcribir el ARN sin especificidad importante de secuencia. Sin
embargo, se sabe que ciertas secuencias de iniciación de la
transcripción, especialmente desde la posición +1 a la posición +6,
son más favorables que otras para obtener transcritos de longitud
esperada con una ARN polimerasa fágica dada, en el caso de la
transcripción de ADN; véase, por ejemplo, Milligan J. F. et
al., Nucleic Acids Research, 15,
8783-8798 (1987). Las ARN polimerasas capaces de
transcribir un ARN que se describen en la presente solicitud pueden
funcionar asimismo con rendimientos variables según la secuencia de
la región de iniciación de la transcripción. Las secuencias que son
más adecuadas para una ARN polimerasa dada se pueden determinar,
cuando sea apropiado, mediante experimentos sencillos habituales
análogos a los descritos por Milligan et al., en el artículo
que se acaba de mencionar. Además, tal como se verá a continuación,
el procedimiento de transcripción de la invención permite, cuando
sea apropiado, iniciar la transcripción en una región favorable del
ARN a transcribir, o bien suministrar un
reactivo-promotor que ya contiene una región de
iniciación de la transcripción que tiene una secuencia favorable
para una ARN polimerasa
dada.
dada.
Por lo tanto, la presente invención tiene por
objeto un procedimiento de amplificación de una secuencia diana
cualquiera de ARN mediante transcripción bajo la dependencia de un
promotor, en una muestra de ARN que comprende dicha secuencia
diana, en el que se pone en contacto dicha muestra:
- -
- con un agente reactivo capaz de hibridarse con dicho ARN que comprende dicha secuencia diana, y
- -
- con un sistema enzimático que comprende una actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN,
en condiciones que permiten la hibridación de
dicho agente reactivo con dicho ARN que comprende dicha secuencia
diana, y en condiciones que permiten el funcionamiento de dicha
actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN;
en el que dicho agente reactivo contiene:
- (i)
- una primera hebra nucleotídica que comprende: a) un primer segmento nucleotídico capaz de desempeñar la función de hebra sentido de un promotor para dicha actividad de ARN polimerasa, y b), en dirección 3' de dicho primer segmento, un segundo segmento nucleotídico que comprende una secuencia capaz de hibridarse con una región de dicho ARN, y
- (ii)
- en el estado hibridado sobre la primera hebra, una segunda hebra nucleotídica que comprende un tercer segmento nucleotídico capaz de hibridarse con dicho primer segmento a fin de formar con él un promotor bicatenario funcional;
y en el que dicha actividad de ARN polimerasa es
capaz de transcribir un molde de ARN, en presencia de dicho agente
reactivo hibridado con dicho molde, sin factor proteico asociado y
sin actividad de ligasa.
Se conocen las condiciones generales que
permiten la hibridación de hebras nucleotídicas, y las condiciones
particulares se pueden determinar fácilmente mediante experimentos
habituales para hebras de secuencia dada. También se pueden
determinar fácilmente mediante experimentos las condiciones que
permiten el funcionamiento de la actividad de ARN polimerasa, en
presencia de trifosfatos de ribonucleósidos, eventualmente con la
ayuda de las indicaciones suministradas en la parte experimental a
continuación.
El extremo 3' del primer segmento corresponde a
la posición -1 en el sistema de transcripción usado. El primer
segmento contiene un número suficiente de nucleótidos para poder, en
el estado hibridado, desempeñar la función de un promotor para una
ARN polimerasa. Según un modo de realización particular, el primer
segmento contiene al menos 9 nucleótidos.
En la patente FR 2.714.062, se demostró que
secuencias cortas de 6 a 9 nucleótidos consecutivos, seleccionados
de entre la región -12 a -4 de la hebra sentido de un promotor para
una ARN polimerasa fágica, son capaces de desempeñar la función de
promotores funcionales en la transcripción de una secuencia diana de
ADN.
El agente reactivo usado en el procedimiento de
la invención puede presentar asimismo al menos una de las
siguientes características:
- -
- dicho tercer segmento está flanqueado, en su extremo en dirección 5', por un cuarto segmento nucleotídico que es más corto que dicho segundo segmento de la primera hebra;
- -
- dicho cuarto segmento es capaz de hibridarse con una porción opuesta de dicho segundo segmento;
- -
- dichos primer y tercer segmentos están constituidos por ADN;
- -
- dichos tercer y cuarto segmentos están constituidos por ADN o de ARN.
El tercer segmento puede tener la misma longitud
que el primer segmento. También puede ser más corto o más largo,
pero su extremo 5' debe corresponder a la posición -1 (es decir a la
posición que precede inmediatamente la posición de iniciación de la
transcripción en el caso en el que la hebra molde está unida al
promotor), cuando se hibrida con el primer segmento.
Cuando la segunda hebra del agente reactivo no
contiene el cuarto segmento, el agente reactivo se puede usar
especialmente para transcribir un ARN cuya región de extremo 3', o
una región próxima al extremo 3', tiene una secuencia conocida y,
en ese caso, el segundo segmento nucleotídico de la primera hebra se
construye de manera que dicho ARN, en la vecindad de su extremo 3',
sea capaz de hibridarse con al menos una parte de la secuencia de
dicho segundo segmento nucleotídico. El extremo 3' de la parte del
ARN a transcribir que se hibrida al segundo segmento puede estar
contiguo al extremo 5' del tercer segmento, o bien puede estar
distante mediante un número x de nucleótidos (contados sobre el
segundo segmento), representando x cero o un número entero de 1 a
24. Por supuesto, la longitud del segundo segmento (en número de
nucleótidos) es superior a x, para poder asegurar la fijación del
molde de ARN a transcribir, mediante hibridación con una región
corriente abajo 3' del segundo segmento.
El cuarto segmento que contiene, por ejemplo, de
1 a 18 nucleótidos, y en particular de 1 a 12 nucleótidos, tiene
preferentemente una secuencia elegida para favorecer la iniciación
de la transcripción para una ARN polimerasa dada (véase
especialmente la parte experimental a continuación). El cuarto
segmento se puede producir especialmente en ADN. Su secuencia puede
ser complementaria a la región en dirección 5' del segundo segmento
que está enfrente y a la cual se hibrida entonces. En ese caso, la
elección de la secuencia de la región 5' del segundo segmento está
dictado por la elección de la secuencia del cuarto segmento. No es
necesario que el cuarto segmento esté unido al tercer segmento,
puesto que, en cualquier caso, su posicionamiento correcto a fin de
favorecer la iniciación de la transcripción se puede asegurar
mediante su hibridación al segundo segmento. Sin embargo, en un
modo de realización particular, el cuarto segmento está unido al
tercer segmento.
Tal como antes, el extremo 3' de la parte del
ARN diana que se hibrida con el segundo segmento puede estar
distante del extremo 5' del cuarto segmento mediante un número de
nucleótidos igual a x, como se define anteriormente.
Por razones evidentes, el segundo segmento
contiene un número de nucleótidos al menos igual a la suma del
número de nucleótidos del cuarto segmento, si está presente, y del
número de nucleótidos de dicha secuencia del segundo segmento que
es capaz de hibridarse con dicha región del ARN a transcribir.
El procedimiento de transcripción de la
invención se puede realizar con una ARN polimerasa de tipo salvaje
de virus o de fago, y en particular con una ARN polimerasa elegida
de la familia de las ARN polimerasas, mencionadas anteriormente,
que incluye ARN polimerasa de T7, ARN polimerasa de T3 y ARN
polimerasa de SP6.
En efecto, se ha descubierto que estas ARN
polimerasas, conocidas por ser dependientes de ADN, eran asimismo
capaces de transcribir un molde de ARN, eventualmente eligiendo (por
ejemplo gracias al cuarto segmento descrito anteriormente) una
secuencia que favorece la iniciación de la transcripción.
El descubrimiento de esta actividad de ARN
polimerasa dependiente de ARN permite disponer por primera vez de
ARN polimerasas capaces de transcribir un ARN bajo la dependencia de
un promotor, partiendo de la posición +1, y sin factor proteico
asociado.
También se puede llevar a cabo el procedimiento
de la invención con ARN polimerasas mutadas que se describirán más
en detalles a continuación. El interés de estas ARN polimerasas
mutadas es que algunas de ellas son capaces de efectuar la
transcripción con un mejor rendimiento cuando el molde está
constituido por ARN que cuando el molde está constituido por un ADN
comparable (es decir que contiene los desoxiribonucleótidos A, C, G
en lugar de los ribonucleótidos A, C, G, respectivamente, y que
contiene el desoxiribonucleótido T en lugar del ribonucleótido
U).
La invención se refiere asimismo al uso de una
ARN polimerasa capaz de transcribir un molde de ARN, bajo la
dependencia de un promotor, sin factor proteico auxiliar, en un
procedimiento de transcripción de una hebra molde que comprende una
secuencia diana de ARN en la que dicha ARN polimerasa se elige entre
ARN polimerasa de T7, ARN polimerasa de SP6 y las ARN polimerasas
mutadas tales como se definen anteriormente. La hebra molde puede
estar constituida por ARN, o también puede estar constituida por ADN
en la región para la iniciación de la transcripción, y después por
ARN.
La invención se refiere asimismo al uso de una
ARN polimerasa capaz de transcribir un molde de ARN, bajo la
dependencia de un promotor, sin factor proteico auxiliar, en un
procedimiento de transcripción de una hebra molde que comprende una
secuencia diana de ARN, en el que dicha hebra molde está constituida
por ARN al menos entre la posición +5 y el extremo 5' de la diana,
siendo dicha ARN polimerasa una ARN polimerasa salvaje de virus o
de fago. Por lo tanto, la hebra molde está constituida por ARN a
partir de una de las posiciones +1 a +5, y puede, por lo tanto,
estar constituida por ADN de la posición +1 a la posición +2, +3 o
+4. El artículo de S. Leary et al., mencionado a
continuación, describe la transcripción de un molde constituido por
ADN para las posiciones +1 a +6, y después por ARN para las
posiciones 7 y siguientes, con la ARN polimerasa de T3.
La invención se refiere asimismo a ARN
polimerasas dependientes de ARN (ARNpARNd), obtenidas mediante
modificación de ARN polimerasas dependientes de ADN, y que son
capaces de sintetizar hebras de ARN complementarias de un molde de
ARN. Se pueden usar, por ejemplo, en la secuenciación de ARN, en la
síntesis de sondas de ARN y en las técnicas de amplificación que
permiten, en particular, la detección y la cuantificación de
ARN.
Las ARNpARNd naturales conocidas no son
adecuadas para servir de polimerasas en varias aplicaciones, debido
a que han adquirido una alta capacidad de discriminación frente a su
molde de ARN específico. Además, estas enzimas no se caracterizan
bien. En su mayoría, forman complejos
supra-moleculares compuestos al mismo tiempo por
factores víricos y celulares; estos complejos, generalmente
asociados con las membranas, son difíciles de purificar y son
inestables durante el aislamiento (B. N. Fields, D. M. Knipe,
Virology. Volúmenes 1 y 2, Raven Press, New York, (1990); G.
P. Pfeifer, R. Drouin, G. P. Holmquist, Mutat. Res. Fundam. Mol.
Mech. Mutagen. 288, 39 (1993)).
Se han clonado, secuenciado y expresado pocos
ARNpARNd. La enzima Q\beta replicasa es la mejor caracterizada.
Esta enzima está compuesta por 4 subunidades, de las cuales 3 son
factores del hospedante (M. Kajitani, A. Ishihama, Nucleic Acids
Res. 19, 1063 (1991)). La enzima Q\beta se ha aislado;
muestra una buena procesabilidad, y es capaz de realizar reacciones
cíclicas (P. M. Lizardi, C. E. Guerra, H. Lomeli, I.
Tussie-Luna, F. R. Kramer, Bio/Technology
6, 1197 (1988)). Sin embargo, esta enzima sigue siendo muy
limitada en sus aplicaciones porque reconoce como molde solamente
una clase restringida de moléculas de ARN altamente estructuradas
(V. D. Axelrod, E. Brown, C. Priano, D. R. Mills, Virology
184, 595 (1991)).
Se ha caracterizado parcialmente otra ARNpARNd.
Se trata de la enzima del virus L-A de
Saccharomyces cerevisiae. Esta polimerasa, que se ha
clonado, es necesaria para el ensamblaje de la partícula vírica; se
fija en primer lugar a la hebra de ARN +; y después induce el
ensamblaje de las proteínas de la partícula (T. Fujimura, R.
Esteban, L. M. Esteban, R. B. Wickner, Cell 62, 819
(1990)). Se conocen al menos tres factores para asociarse con las
partículas víricas. Estos factores son necesarios para la
replicación del ARN, para la transcripción, y para el mantenimiento
coherente de la partícula (T. Fujimura, R. B. Wickner, Molec.
Cell. Biol 7, 420 (1987)). Los estudios in vitro
han mostrado que se necesita una partícula vírica intacta para la
síntesis de la hebra menos (replicación) (T. Fujimura, R. B.
Wickner, Cell 55, 663 (1988)) y para la síntesis de la
hebra más (transcripción) (T. Fujimura, R. B. Wickner, J. Biol.
Chem. 264, 10872 (1989)). Así, la complejidad de este
sistema no le hace fácilmente adaptable para un sistema de
transcripción in vitro. Además, tal como el sistema Q\beta,
este sistema es muy discriminatorio, aceptando solamente los ARN
víricos L-A y M como molde (T. Fujimura, R. B.
Wickner, Cell 55, 663 (1988)).
Una ARNpARNd para la cual se demostró una
capacidad extensa de aceptación de molde es la enzima del virus de
la poliomielitis (J. Plotch, O. Palant, Y. Gluzman, J. Virol.
63, 216 (1989)). Sin embargo, existen varios problemas con
este sistema enzimático: el cebado depende de un factor del
hospedante no identificado o bien de la adición de un
oligonucleótido poli(U). Sin embargo, puesto que el cebado
mediante un oligonucleótido poli(U) no es selectivo con
respecto al molde, se sintetizan numerosos productos de diferentes
tamaños, especialmente productos que tienen dos veces la longitud
del molde. Además, no se demostró la síntesis secuencial de las
hebras más o menos (S. J. Plotch, O. Palant, Y. Gluzman, J.
Virol. 63, 216 (1989), T. D. Hey, O. C. Richards, E.
Ehrenfeld, J. Virol. 61, 802 (1987), J. M. Lubinski,
L. J. Ransone, A. Dasgupta, J. Virol. 61, 2997
(1987)).
Entre las ARNpADNd, las enzimas de los
bacteriófagos T3 y T7 son capaces de usar el ARN como molde en
condiciones particulares. Por ejemplo, la ARNpADNd de T3 puede
transcribir un molde de ARN monocatenario (es decir, el ARN
mensajero del gen de la resistencia a la neomicina) si está unida a
la hebra antisentido del promotor T3, incluyendo la secuencia de
iniciación desde +1 a +6 (S. Leary., H. J. Baum, Z. G. Loewy,
Gene 106, 93 (1991)). Se sabe asimismo que la ARN
polimerasa de T7 puede transcribir, de un extremo a otro, un molde
de ARN en ausencia de la secuencia promotora (M. Chamberlin., J.
Ring, J. Biol. Chem. 248, 2235 (1973)). Además, se
demostró que la ARN polimerasa de T7 puede transcribir eficazmente
dos pequeños moldes de ARN específicas, los ARN "X" e
"Y", produciendo al mismo tiempo copias de ARN más y menos.
Esta replicación, obtenida sin secuencia promotora de consenso,
parece dependiente de la presencia de una estructura secundaria
específica (M. M. Konarska, P. A. Sharp, Cell 57, 423
(1989), M. M. Konarska, P. A. Sharp, Cell 63, 609
(1990)). Sin embargo, los ARN "X" e "Y" no están
replicados por la ARN polimerasa de T3, y no se sabe si esta enzima
no es capaz de replicar ARN altamente estructurados, o si la
especificidad de secuencia de esta enzima impide su reconocimiento
de los ARN "X" e "Y". En ausencia de un promotor, se
demostró asimismo que la ARNpADNd de T7 era capaz de efectuar la
elongación de dos hebras de ARN que se solapan en antisentido (C.
Cazenave y O.C. Ulhlenbeck, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91, 6972 (1994)). Asimismo, se demostró que la ARNpADNd de T7
salvaje es capaz de efectuar la elongación de un cebador de ARN
sobre un molde de ADN monocatenario, sin promotor (S.S. Daube y P.H.
von Hippel, Biochemistry 33, 340 (1994)).
La enzima de los bacteriófagos mejor
caracterizada es la ARN polimerasa de T7, una enzima monómera de 98
kDa (B. A. Moffatt, J. J. Dunn, F. W. Studier, J. Mol. Biol.
173, 265 (1984)). Esta polimerasa monómera posee todas las
propiedades esenciales de una ARN polimerasa, es decir,
reconocimiento de un promotor, iniciación de la transcripción,
elongación y terminación (M. Chamberlin, T. Ryan, The Enzymes
XV, 87 (1982)). Además, la actividad catalítica necesita
pocos elementos, a saber, un molde, trifosfatos de ribonucleósidos y
el ión divalente Mg^{2+}, y no necesita ningún factor auxiliar
proteico para la iniciación o terminación de la transcripción, al
contrario de otras ARN polimerasas (M. Chamberlin, T. Ryan, The
Enzymes XV, 87 (1982)).
La mutagénesis del gen de la ARN polimerasa de
T7 permitió identificar y definir regiones o restos implicados en
la función de polimerasa. Una estrategia de mutagénesis consistió en
intercambiar elementos entre la ARN polimerasa de T7 y su familiar
más próximo la ARN polimerasa de T3, cuya secuencia de aminoácidos
es un 82% idéntica (K. E. Joho, L. B. Gross, N. J. McGraw, C.
Raskin, W. T. McAllister, J. Mol. Biol. 215, 31
(1990)). Esta estrategia condujo a la identificación de elementos
de la polimerasa implicados en el reconocimiento del promotor. Se
demostró, por ejemplo, que la sustitución de un solo aminoácido en
la enzima de T3 (o de T7) permite que la enzima mutada reconozca
específicamente el promotor de T7 (o de T3) heterólogo (C. A.
Raskin, G. Diaz, K. Joho, W. T. McAllister, J. Mol. Biol.
228, 506 (1992)). De la misma manera, sustituciones
recíprocas en las secuencias promotoras respectivas confieren al
promotor mutado la capacidad de ser reconocido por la enzima
heteróloga (C. A. Raskin, G. Diaz, K. Joho, W. T. McAllister, J.
Mol. Biol. 228, 506 (1992)).
La ARN polimerasa de T7 se cristalizó y se
determinó su estructura con una resolución de 3,3 \ring{A} (R.
Sousa, Y. J. Chung, J. P. Rose, B. -C. Wang, Nature
364, 593 (1993)). A partir de este estudio estructural de las
alineaciones de secuencias (K. E. Joho, L. B. Gross, N. J. McGraw,
C. Raskin, W. T. McAllister, J. Mol. Biol. 215, 31
(1990); S. Mungal, B. M. Steinberg, L. B. Taichman, J. Virol.
66, 3220 (1992), W. T. McAllister, C. A. Raskin, Molec.
Microbiol. 10, 1 (1993)) y de los estudios de mutagénesis
(D. Patra, E. M.Lafer, R. Sousa, J. Mol. Biol. 224,
307 (1992); L. Gross, W-J. Chen, W. T. McAllister,
J. Mol. Biol. 228, 1 (1992)), se pudo correlacionar
los elementos funcionales de la enzima de T7 con los elementos
estructurales. La ARN polimerasa de T7 se puede dividir en dos
campos funcionales: un campo de reconocimiento del promotor y un
campo catalítico (R. Sousa, Y. J. Chung, J. P. Rose, B. -C. Wang,
Nature 364, 593 (1993), W. T. McAllister, Cell.
Molec. Biol. Res. 39, 385 (1993)).
Se demostró que la asparagina 748 de la ARN
polimerasa de T7 interactúa con los nucleótidos -10 y -11 en la
secuencia promotora, una interacción mostrada como responsable de la
especificidad de promotor (C.A. Raskin, G. Diaz, K. Joho, W.T.
McAllister, J. Mol. Biol. 228, 506 (1922)). Se ha
mencionado la posibilidad de que una interacción de tipo sigma
entre la polimerasa de T7 y su promotor pudiese existir en el
sistema del bacteriófago. En efecto, una secuencia de tipo sigma,
que corresponde a la región 2.4 de sigma, es decir, la región de
sigma que interactúa con la "caja de Pribnow" (secuencia
TATAATG reconocida por el factor de transcripción 70 sigma de E.
coli) (C. Waldburger, T. Gardella, R. Wong, M.M. Susskind, J.
Mol. Biol. 215, 267 (1990); D.A. Siegele, J.C. Hu, W.A.
Walter, C.A. Gross, J. Mol. Biol. 206, 591 (1989)),
existe en la región N-terminal de la ARN polimerasa
de T7 entre los aminoácidos 137 y 157 (L. Gross,
W-J. Chen, W.T. McAllister, J. Mol. Biol.
228, 1 (1992)). Por otra parte, aunque no se le pudo
atribuir ninguna función, la región 230 a 250 presenta homologías
de secuencia con el represor \lambda de E. coli (McGraw,
N.J., Bailey, J.N., Cleaves, G.R., Dembinski, D.R., Gocke, C.R.,
Joliffe, L.K., MacWright, R.S. y McAllister, W.T. Nucleic Acids
Res. 13, 6753 (1985)).
El campo catalítico consiste en una bolsa que
resulta de la aproximación de varias regiones dispersadas sobre la
estructura primaria (R. Sousa, Y.J. Chung, J.P. Rose, B.-C. Wang,
Nature 364, 593 (1993), W.T. McAllister, C.A. Raskin,
Molec. Microbiol. 10, 1 (1993); D. Moras,
Nature 364, 572 (1993)). Esta bolsa contiene
especialmente varios motivos conservados, entre los cuales los
motivos A y C son los mejores conservados en las polimerasas (Poch,
O., Sauvaget, I., Delarue, M. y Tordo, N. EMBO J. 8, 3867
(1989); Delarue, M., Poch, O., Tordo, N. y Moras, D. Protein
Engineering 3, 461 (1990); W.T. McAllister, C.A. Raskin,
Molec. Microbiol. 10, 1 (1993)). Un tercer motivo, el
motivo B, se conserva en las ARN y ADN polimerasas dependientes de
ADN, mientras que un motivo B' que es diferente (tanto para la
secuencia como para la estructura aparente) existe en las ARN y ADN
polimerasas dependientes de ARN (Poch, O., Sauvaget, I., Delarue, M.
y Tordo, N. EMBO J. 8, 3867 (1989); Delarue, M., Poch, O.,
Tordo, N. y Moras, D. Protein Engineering 3, 461
(1990); L.A. Kohlstaedt, J. Wang, J.M. Friedman, P.A. Rice, T.A.
Steitz, Science 256, 1783 (1992); W.T. McAllister,
C.A. Raskin, Molec. Microbiol. 10, 1 (1993)).
SOUSA R ET AL: "A mutant T7 RNA
polymerase as a DNA polymerase". EMBO (EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY
ORGANIZATION) JOURNAL 14 (18), 1995. 4609-4621 da a
conocer ARN polimerasas mutadas.
Uno de los aspectos de la presente invención se
basa en el descubrimiento de que ciertas ARN polimerasas
dependientes de ADN mutadas son capaces de transcribir un ARN
monocatenario o bicatenario en presencia de un promotor de ADN
bicatenario. Además, estas enzimas mutantes son poco capaces o
incapaces de transcribir un ADN monocatenario o bicatenario en
presencia de un promotor de ADN bicatenario. Por lo tanto, son
preferentemente o estrictamente dependientes de ARN. Su uso es
particularmente interesante en el caso en el que se desea
transcribir selectivamente el ARN, en particular cuando la muestra
biológica de partida contiene o tiene el riesgo de contener un ADN
que tiene una secuencia idéntica o parecida a la del ARN a
amplificar.
Por lo tanto, la invención tiene por objeto una
ARN polimerasa capaz de transcribir un segmento polinucleotídico de
interés de cualquier secuencia contenido en un molde
polinucleotídico, sintetizando, en presencia de dicho molde y bajo
la dependencia de un promotor, un producto de transcripción que
contiene una secuencia de ARN complementaria a la secuencia de
dicho segmento polinucleotídico de interés, caracterizada porque
está mutada y es capaz de sintetizar dicho producto de
transcripción con un mejor rendimiento cuando dicha secuencia de
interés contenida en el molde está constituida por ARN que cuando
dicha secuencia de interés contenida en el molde está constituida
por ADN.
La invención se refiere en particular a una ARN
polimerasa definida como anteriormente tal que la relación entre el
rendimiento del producto de transcripción de un molde de ADN y el
rendimiento del producto de transcripción del molde de ARN,
expresado en %, es menor que 95%, especialmente menor que 85% y en
particular menor que 70%.
La invención tiene especialmente por objeto una
ARN polimerasa tal como la definida anteriormente, caracterizada
porque la relación entre el rendimiento de producto de transcripción
del molde de ARN y el rendimiento de producto de transcripción del
molde de ADN es al menos igual a 2, y en particular al menos igual a
10.
El "rendimiento" de la transcripción es la
relación molar entre la cantidad de producto de transcripción y la
cantidad de molde polinucleotídico presente al principio. Este
rendimiento se puede determinar fácilmente mediante un experimento,
introduciendo en el medio de reacción una cantidad determinada del
molde polinucleotídico. Para la comparación de los rendimientos
obtenidos con un molde de ADN y un molde de ARN, se necesita
evidentemente que las condiciones distintas a las de la naturaleza
del molde sean comparables.
La ARN polimerasa de la invención es capaz de
transcribir un molde poliribonucleotídico de cualquier secuencia, y
en eso se distingue de la Q\beta-replicasa. Ella
transcribe preferente o exclusivamente un molde de ARN, y en eso se
distingue de las ARN polimerasas dependientes de ADN de fagos
conocidas.
Las ARN polimerasas de la invención,
contrariamente a las ARNp ARNd naturales conocidas, son
especialmente unas ARN polimerasas capaces de funcionar sin
cofactor(es) proteico(s) asociado(s). Sin
embargo, se pueden presentar en forma de multimeros, y en
particular de dímeros.
Las ARN polimerasas mutadas de la invención se
obtienen generalmente, por lo tanto, a partir de ARN polimerasas
capaces de funcionar sin cofactores proteicos.
Las ARN polimerasas de la invención pueden ser
especialmente ARN polimerasas que derivan mediante mutación de una
ARN polimerasa dependiente de ADN de virus o de fago, y en
particular de una ADN polimerasa de un fago de E. coli.
Entre los fagos de E. coli, se pueden citar especialmente T3,
T7 y SP6.
Una ARN polimerasa según la invención puede
poseer una homología de secuencia proteica superior a 50%, en
particular superior a 80% con una ARN polimerasa de tipo salvaje de
la familia de las ARN polimerasas dependientes de ADN, incluyendo
la ARN polimerasa de T7, la ARN polimerasa de T3 y la ARN polimerasa
de SP6.
Se conoce la familia de las ARN polimerasas
dependientes de ADN mencionada anteriormente; véase, por ejemplo,
el artículo de R. Sousa, TIBS 21, 186-190 (1996), y
las referencias citadas en este artículo.
Entre las polimerasas de la invención se pueden
citar particularmente las que contienen al menos una mutación en
una región que corresponde a la secuencia de aminoácidos
625-652 de la ARN polimerasa de T7, y especialmente
las que tienen la composición de una ARN polimerasa dependiente de
ADN de tipo salvaje, con la excepción del hecho de que contienen al
menos una mutación en dicha región. Se entiende en este caso por
"mutación" la sustitución, supresión o inserción de un
aminoácido.
Se citarán, por ejemplo, las ARN polimerasas que
comprenden al menos una mutación en una posición que corresponde a
una de las posiciones 627, 628, 631, 632 y 639 de la secuencia de
aminoácidos de la ARN polimerasa de T7; en particular dicha
mutación puede comprender la sustitución de un resto de aminoácido,
seleccionado de entre la arginina, la lisina, la serina y la
tirosina, de la ARN polimerasa de tipo salvaje por otro resto de
aminoácido. El aminoácido sustituido es, por ejemplo, una arginina
o una lisina. El aminoácido de sustitución se puede seleccionar
especialmente de entre la alanina, la valina, la leucina, la
isoleucina, la glicina, la treonina o la serina. Se entiende que la
expresión "aminoácido" designa en este caso, por abuso de
lenguaje, un resto de aminoácido comprometido en una unión
peptídica.
Se ha hecho referencia anteriormente a la
secuencia peptídica de la ARN polimerasa de T7. La numeración de
los restos de aminoácidos adoptada aquí es la descrita por Dunn, J.
J. y Studier, F. W. J. Mol. Biol. 148(4),
303-330 (1981), y por Stahl, S. J. y Zinn, K., J.
Mol. Biol. 148(4), 481-485 (1981).
La invención se refiere asimismo:
- -
- a un gen que codifica para una ARN polimerasa tal como la definida anteriormente; dicho gen se puede obtener según, por ejemplo, un método análogo al descrito a continuación en la parte experimental;
- -
- a un vector de expresión en el que se inserta dicho gen, siendo dicho vector capaz de expresar dicha ARN polimerasa en una célula hospedante; este vector se puede obtener de manera conocida en sí;
- -
- a una célula hospedante que contiene dicho vector.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de obtención de una ARN polimerasa tal como la
definida anteriormente, caracterizado porque: a) se obtiene de
manera conocida un gen que codifica una ARN polimerasa de tipo
salvaje, b) se efectúa al menos una mutación sobre dicho gen, c) se
inserta el gen mutado obtenido en un vector de expresión, d) se
expresa dicho vector en una célula hospedante para obtener una ARN
polimerasa mutada, y e) se selecciona, entre las ARN polimerasas
mutadas obtenidas, las que presentan una al menos de las
propiedades de una ARN polimerasa tal como se ha definido
anteriormente.
A continuación se dará una descripción más
detallada de un modo de realización particular del procedimiento de
la invención, en el caso del uso de la ARN polimerasa de T7 como
producto de partida.
Se preparó un gen modular de la ARNpADNd de T7,
resultando este gen del ensamblaje de diferentes casetes (véase el
ejemplo 1 y la figura 1).
El gen modular así definido se caracteriza
porque contiene 10 casetes flanqueados por sitios de restricción
únicos, en el vector de clonación.
En particular, estos casetes, flanqueados por
sitios de restricción únicos, se caracterizan porque cada casete
comprende una región de interés, especialmente los implicados en el
reconocimiento del promotor (región que presenta una homología con
el factor \sigma de E. coli; región que presenta una
homología con el represor \lambda de E. coli; región que
confiere la especificidad de promotor) y los implicados en el sitio
catalítico (motivo A; motivo B; motivo C).
Para la definición de los motivos A, B y C,
véase, por ejemplo, R. Sousa, TIBS 21, 186-190
(1996).
Estos casetes, derivados del gen 1 de la
ARNpADNd de T7, se obtuvieron con la ayuda de técnicas de biología
molecular convencionales (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston,
D. D. Moore, J. G. Seidman, et al, Current Protocols in
Molecular Biology (Current Protocols, 1993)), especialmente la
PCR, que permitió introducir sitios de restricción mediante
mutagénesis dirigida silenciosa, y la subclonación en un vector de
clonación.
El gen modular así obtenido se caracteriza
porque presenta sitios de restricción que flanquean los casetes,
siendo estos sitios de restricción NcoI (-2, +4), BclI (218, 223),
HindIII (539, 544), SacI (776, 781), PstI (1587, 1592), BgIII
(1811, 1816), NdeI (1865, 1870), XhoI (1951, 1956), ClaI (2305,
2310), SalI (2497, 2502), XbaI (2660, 2665); la posición 1, en
ácidos nucleicos, corresponde a la adenina del codón ATG iniciador,
y la posición 2652 corresponde a la tercera base del codón
terminador TAA. El sitio NdeI (2504, 2509) ha sido destruido. Todas
las mutaciones que inducen estos sitios de restricción son
silenciosas, salvo la mutación que genera el sitio NcoI que induce
la sustitución de la asparagina en posición +2 por una glicina. La
posición 1, en aminoácidos, corresponde a la primera metionina, la
posición 883 corresponde a la alanina carboxi terminal.
El gen modular, clonado en un vector de
clonación pGNEX derivado del pGEM-1 en el que el
poliligador se sustituyó por un adaptador que contiene los sitios
de restricción NcoI, EcoRI, XbaI, constituye el soporte base de las
mutagénesis posteriores. Esto es posible debido a que cada casete
que contiene una región de interés está flanqueado por sitios de
restricción únicos, en el vector de clonación.
La introducción de mutaciones no silenciosas,
con la ayuda de técnicas de PCR, en uno o varios casetes del gen
modular previamente definido, condujo a genes que codifican para
polimerasas que presentan una secuencia de aminoácidos que difieren
en al menos un aminoácido con respecto a la T7 expresada a partir
del gen modular. En particular, se prepararon genes mutantes que
codifican para al menos un aminoácido modificado en el motivo B de
la enzima salvaje, por ejemplo con una alanina (A) en lugar de una
arginina (R) en posición 627 y/o una alanina (A) en lugar de una
serina (S) en posición 628 y/o una alanina (A) en lugar de una
lisina (K) en posición 631 y/o una alanina (A) en lugar de una
arginina (R) en posición 632 y/o una alanina (A) en lugar de una
tirosina (Y) en posición
639.
639.
Se obtuvieron asimismo genes mutantes que
codifican para una polimerasa cuya región 625VTRSVTKRSVMT
LAYGSKEFGFRQQVLD652 que comprende el motivo B se sustituyó totalmente o en parte por la región homóloga B' presente en ciertas polimerasas dependientes de ARN, especialmente las de las polimerasas del virus de la hepatitis C (NCGYRRCRASGVLTTSCGNTLTCYI), y de la integrasa 32 de levadura (HNTTLGIPQGSVVSPILCNIFLDKL).
LAYGSKEFGFRQQVLD652 que comprende el motivo B se sustituyó totalmente o en parte por la región homóloga B' presente en ciertas polimerasas dependientes de ARN, especialmente las de las polimerasas del virus de la hepatitis C (NCGYRRCRASGVLTTSCGNTLTCYI), y de la integrasa 32 de levadura (HNTTLGIPQGSVVSPILCNIFLDKL).
Los genes descritos anteriormente se clonaron en
un vector pMR que resulta de la unión del fragmento SspI del
pMal-c (Biolabs) que contiene especialmente el
represor lacI^{q}, y del fragmento SspI del pMH (V. Cheynet, B.
Verrier, F. Mallet, Protein expression and purification
4, 367 (1993)) que contiene un minicistrón que permite
alcanzar un alto nivel de expresión, así como una secuencia que
codifica para una cola de poli-histidina fusionada
con el extremo terminal del gen clonado (ejemplo 1, figura 2). La
expresión de las proteínas recombinantes ARNp de T7 en la cepa
bacteriana BL21 representa hasta 30% de las proteínas totales de la
bacteria. Las proteínas solubilizadas en un tampón de desoxicolato
que contiene una alta concentración salina se depositan sobre una
columna TALON (Clontech) que permite la purificación específica
mediante quelación con el ión de proteínas que presentan una cola
de polihistidina. Se obtienen así 130 a 2200 \mug de polimerasas
por 20 ml de cultivo, con una pureza superior a 95% tal como se
indica (i) mediante una coloración con azul de Coomassie (ejemplo
1, figura 3), (ii) mediante un análisis de transferencia western con
un anticuerpo policlonal de cobaya anti-ARNp de T7
(bioMérieux), y un anticuerpo monoclonal de ratón (Qiagen)
anti-MRGSHHHHHH, (iii) mediante la ausencia de
actividad endonucleasa, exonucleasa monocatenaria y bicatenaria,
ribonucleasa, tal como se determina esencialmente según el método
de He et al. (B. A. He, M. Rong, D. L. Lyakhov, H.
Gartenstein, G. Diaz, et al., Protein Expr Purif
9, 142 (1997)). Este resultado refleja los rendimientos del
par hospedante-vector pMR-BL21 y del
procedimiento de purificación con respecto a la cola
MRGSHHHHHSVLE.
La invención tiene asimismo por objeto el uso de
una ARN polimerasa tal como se ha definido anteriormente, en un
procedimiento de transcripción de un segmento polinucleotídico de
interés que tiene una secuencia cualquiera, estando dicho segmento,
del tipo ARN, contenido en un molde polinucleotídico, para
sintetizar, en presencia de dicho molde, un producto de
transcripción que contiene una secuencia de ARN complementaria a la
secuencia de dicho segmento polinucleotídico de interés.
Según un modo de realización particular, dicho
uso se caracteriza porque dicho molde polinucleotídico comprende,
corriente arriba 5' de dicho segmento polinucleotídico de interés,
un promotor reconocido por dicha ARN polimerasa, y porque dicho
producto de transcripción es un ARN complementario a una secuencia
del molde que empieza en un sitio de iniciación de la transcripción
para dicho promotor.
Las ARN polimerasas de la invención se pueden
usar especialmente para realizar (i) una amplificación de una diana
de ARN de manera isotérmica, (ii) una secuenciación directa de ARN y
(iii) la síntesis de ARN de particular interés (por ejemplo sondas,
ribozimas, etc.). Además, las ARN polimerasas de la invención son
capaces de incorporar bases modificadas en la hebra
neo-sintetizada, lo que facilita especialmente la
cuantificación o el uso de dicha hebra.
La invención se refiere especialmente al uso de
estas enzimas recombinantes así expresadas y purificadas en un
método de síntesis de ARN a partir de un molde de ARN, bajo la
dependencia de un promotor.
Se evaluaron las enzimas así purificadas, en un
contexto bajo la dependencia de un promotor, sobre distintos moldes
(ejemplo 2, figura 4 por una parte, y ejemplo 3, figura 6 por otra
parte), en particular sobre un molde que comprende un ARN
monocatenario. Se demostró que una polimerasa mutada obtenida según
la invención era capaz de generar una transcripción específica del
tamaño correcto especialmente sobre un molde de ARN monocatenario.
En el ejemplo 2, se indica que la enzima salvaje producida de la
misma forma no parece poder realizar este fenómeno. Sin embargo, el
ejemplo 3 muestra que la enzima salvaje posee realmente la propiedad
de transcribir un molde de ARN. Estos resultados aparentemente
divergentes se explican debido a que las condiciones experimentales
en estos dos casos son diferentes. En efecto, en el ejemplo 2, la
presencia del transcrito se demuestra mediante la técnica de
incorporación de un UTP, marcado con fósforo radioactivo, mientras
que en el ejemplo 3 la técnica usada es la transferencia northern
para los moldes de grupo 2 y, en ese último caso, la detección del
transcrito mediante la técnica de transferencia northern es 40
veces más sensible que la detección mediante la incorporación de
fósforo radioactivo. El ejemplo 2 siguiente muestra por lo tanto que
una polimerasa mutada obtenida según la invención es capaz de
generar un transcrito específico del tamaño correcto sobre un molde
de ARN monocatenario, y el ejemplo 3 muestra que realmente la
polimerasa salvaje correspondiente es capaz de generar un transcrito
específico del tamaño correcto sobre moldes de ARN
independientemente de su secuencia.
Además, dicha polimerasa mutada es incapaz,
contrariamente a la polimerasa salvaje, de generar un transcrito
del tamaño correcto sobre un molde de ADN monocatenario o
bicatenario. Si se sustituye el ión Mg^{2+} presente en el medio
de reacción por el ión Mn^{2+}, la enzima mutada, sobre un molde
de ARN monocatenario, no genera, en esas condiciones, ningún
transcrito específico del tamaño correcto, pero, sin embargo, es
capaz de generar grandes cantidades de productos abortivos. Dicha
polimerasa mutada es, además, capaz de desplazar un híbrido
ARN/ARN.
En los dibujos anexos
- la figura 1 ilustra la estrategia de
amplificación, descrita en detalle en el ejemplo 1 a continuación,
para la construcción de un gen modular para la ARN polimerasas de
T7,
- la figura 2 ilustra la estructura del vector
de expresión pMR que contiene este gen modular,
- la figura 3 representa perfiles de
electroforesis de las proteínas expresadas con la ayuda de este
vector, tal como se describe en detalle en el ejemplo 1 a
continuación,
- la figura 4 representa esquemáticamente los
sistemas de moldes usados en los ensayos de transcripción del
ejemplo 2 a continuación,
- la figura 5 representa los perfiles de
electroforesis de los productos de transcripción obtenidos en el
ejemplo 2 a continuación, y
- la figura 6 representa esquemáticamente los
sistemas de moldes usados en los ensayos de transcripción del
ejemplo 3 a continuación.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Ejemplo
1
El gen de la ARN polimerasa de T7 se construyó
en forma modular, teniendo en cuenta regiones de homologías con las
demás polimerasas, así como las funciones asociadas con ciertos
campos de la ARN polimerasa de T7. Se dividió en 10 regiones o
casetes (Figura 1-A), estando cada región delimitada
por sitios de restricción únicos en el vector de clonación. Seis
casetes son característicos por cuanto que contienen respectivamente
un campo que tiene una similitud con una parte del factor sigma de
E. coli, un campo que tiene una homología con el represor
lambda de E. coli, un campo implicado en la especificidad del
promotor de las polimerasas fágicas, los motivos A y C conservados
en las polimerasas dependientes de moldes, y el motivo B conservado
en las polimerasas dependientes de ADN. Se amplifica cada región
mediante PCR (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore,
J. G. Seidman, et al., Current Protocols in Molecular
Biology (Current Protocols, 1993)) (Figura
1a-B1) a partir del gen salvaje (gen 1)
usando cebadores que se definen según lo siguiente:
- (i)
- estos cebadores contienen mutaciones silenciosas que permiten la introducción de sitios de restricción que delimitan los casetes;
- (ii)
- el cebador situado en la posición 3' de una región y el cebador situado en la posición 5' de la región contigua se solapan parcialmente. Los productos de amplificación contiguos se mezclan y se vuelven a amplificar usando los cebadores externos (Figura 1a-B1). Los 5 fragmentos generados se clonan en el vector PCRII (Invitrogen) (Figura 1-B2). A partir de los 5 fragmentos clonados, se reconstruye el gen de la ARN polimerasa de T7 desde el extremo 5' hacia el extremo 3', mediante subclonaciones sucesivas en el vector de clonación pGNEX (Figura 1-B3). Este vector deriva del plásmido pGEM-1 (Promega) en el que el poliligador se sustituye por un adaptador que contiene los sitios de restricción NcoI-EcoRI-XbaI. El gen modular para la ARN polimerasa de T7 (ARN pol de T7) así obtenido contiene 17 sitios únicos de clonación en el pGNEX, de los cuales 11 son sitios nuevamente introducidos (Figura 1-C). Después, este gen se subclona en el vector de expresión pMR (Figura 2). Este vector, derivado del vector pMH (V. Cheynet, B. Verrier, F. Mallet, Protein expression and purification 4, 367 (1993)), contiene el promotor fuerte tac regulado por IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido), un minicistrón corto rodeado por 2 sitios de unión a ribosomas que constituyen un contexto eficaz para la iniciación de la traducción, y una cola de polihistidina fusionada con el extremo N-terminal de la proteína expresada, que permite su purificación mediante cromatografía de afinidad con ión metálico. El gen que codifica para el represor lacI^{q} que permite una mejor dependencia de la expresión está asimismo presente en pMR. Este vector de expresión se transforma según los métodos clásicos (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, et al., Current Protocols in Molecular Biology (Current Protocols, 1993)) en la cepa bacteriana de E. coli BL21. Se usa un precultivo para inocular 30 ml de medio de cultivo. La expresión de las proteínas se induce mediante IPTG durante 4 horas a 37ºC directamente cuando la densidad óptica a 600 nm del cultivo llegue a 0,6. La ARN pol de T7 así expresada representa 30% de las proteínas bacterianas totales (Figura 3). Después, se extrae de las bacterias mediante lisis (ultrasonidos) en presencia de un detergente. A partir de la fracción de extracción soluble, la ARN pol de T7 se purifica mediante cromatografía de afinidad con ión Co^{2+}, y se eluye mediante un gradiente de imidazol. Se analiza sobre gel de SDS-PAGE y se visualiza mediante tinción con azul de Coomassie (Figura 3). La ausencia de productos de degradación se verifica mediante transferencia western con un anticuerpo policlonal anti ARN pol de T7 producido en cobayas, y un anticuerpo monoclonal anti MRGSH_{6} comercial (Qiagen). La ausencia de actividades espurias de endonucleasas, exonucleasas y ARNasas se verifica según el protocolo descrito por He et al., Protein Expr Purif 9, 142 (1997)). A partir de 20 ml de cultivo, se obtienen 700 a 800 \mug de enzimas, de pureza superior a 95%, de manera reproducible. El rendimiento de purificación es de 75%.
Las mutaciones de puntos se crean mediante PCR
secuencial (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore,
J. G. Seidman, et al., Current Protocols in Molecular
Biology (Current Protocols, 1993)) (o doble PCR), de la misma
manera como se introdujeron los sitios de restricción: los cebadores
internos contienen la mutación a introducir; los cebadores externos
flanquean la región a mutar y contienen los sitios de restricción
que delimitan esta región en el gen modular. Después, este casete
así mutado se clona en el gen modular. Los oligonucleótidos
sintéticos también pueden sustituir un casete completo.
Figura 1: ilustra la estrategia de amplificación
para la construcción del gen modular para la ARN polimerasa de T7.
(A): División del gen de la ARN polimerasa de T7 (flechas
verticales) con respecto a las regiones de interés. Las regiones
numeradas de 1 a 6 son: 1, homología con parte del factor sigma de
E. coli; 2, homología con el represor lambda de E.
coli; 3, motivo A; 4, motivo B; 5, especificidad del promotor de
las polimerasas fágicas; 6, motivo C. (B): (1) Posición de los
cebadores que contienen las mutaciones silenciosas para la creación
de los sitios de restricción (-\bigbox-); Nc, NcoI; Bc, BclI; H,
HindIII; Sc, SacI, P, PstI; Bg, BgIII; Nd, NdeI; Xo, XhoI; C, ClaI;
SI, SaII; Xb, XbaI. La extensión mediante PCR que solapa lleva a 5
fragmentos que contienen 3 sitios de restricción (F1 a F5). (2)
Cada fragmento así generado (F1 a F5) se clona en el vector
pCRII.E, EcoRI. (3) Reconstrucción del gen modular desde extremo 5'
hacia el extremo 3', usando en cada etapa el sitio de restricción
común a 2 fragmentos y el sitio de restricción EcoRI del vector
pCRII y del vector de clonación pGNEX; el sitio de restricción XbaI
común al último fragmento y al vector pGNEX se usa para la última
subclonación. (C) Estructura del gen modular de la ARN polimerasa de
T7, y posición de los sitios de restricción únicos en el vector
pGNEX ya existentes (abajo) y creados mediante mutagénesis
(arriba).
Figura 2: Ilustra la estructura del vector de
expresión pMR que contiene el gen modular de la ARN polimerasa de
T7. Ptac: promotor tac (caja negra);
RBS1-MC-RBS2, minicistrón flanqueado
por 2 sitios de unión a ribosomas (flecha blanca);
(His)6T7RNAPcas, gen modular de la ARN polimerasa de T7
(flecha gris); rrnB T1 T2, terminadores de transcripción fuertes
(caja con líneas con puntos); bla, gen de resistencia a la
ampicilina (flecha negra); pMB1 ori/M 132 ori-, orígenes de
replicación (caja blanca delgada); lacI^{q}, gen que codifica para
el represor lacI^{q} (flecha rayada); se indican algunos sitios
de restricción, incluyendo los nuevos sitios introducidos mediante
mutagénesis
(subrayados).
(subrayados).
Figura 3: muestra los perfiles electroforéticos
obtenidos que permiten el análisis de la expresión y de la
purificación de la ARN polimerasa de T7. Los lisados bacterianos se
preparan a partir de 1 ml recogido de 30 ml de cultivo, para
verificar la expresión de la ARN polimerasa de T7 en presencia (+) o
ausencia (-) de IPTG. La ARN polimerasa de T7 se extrae a partir de
20 ml del mismo cultivo. La fracción soluble se carga sobre una
columna de purificación (línea L), y la ARN polimerasa de T7 se
eluye (línea E) mediante un gradiente de imidazol. M, marcador de
peso molecular. Las proteínas se visualizan sobre 10% de gel de
SDS-PAGE mediante tinción con azul de Coomassie. La
flecha indica la posición de la ARN polimerasa de T7.
Ejemplo
2
Los sistemas de moldes usados en este ejemplo se
presentan esquemáticamente en la figura 4. El sistema de
transcripción de ADN monocatenario comprende una hebra molde (a) de
50 bases de secuencia 3'ATTATGCTGA
GTGATATCCCAACCGGCGTCACAAGTGAGTACCAATACCG5' e hibridada desde las posiciones -17 a +1 con la hebra promotora no de molde (b) de secuencia 5'TAATACGACTCACTATAG3' (bloqueada en su extremo 3'). El sistema de transcripción de ADN bicatenario comprende la hebra de molde (a) hibridada con la hebra no de molde (c) que tiene la secuencia 5'TAATACGACTCACTATAGGGTTGGCCGCAGTGTTCACTCATGTTATGGC3'.
GTGATATCCCAACCGGCGTCACAAGTGAGTACCAATACCG5' e hibridada desde las posiciones -17 a +1 con la hebra promotora no de molde (b) de secuencia 5'TAATACGACTCACTATAG3' (bloqueada en su extremo 3'). El sistema de transcripción de ADN bicatenario comprende la hebra de molde (a) hibridada con la hebra no de molde (c) que tiene la secuencia 5'TAATACGACTCACTATAGGGTTGGCCGCAGTGTTCACTCATGTTATGGC3'.
El sistema de transcripción de ARN monocatenario
está constituido por una hebra híbrida de ADN desde las posiciones
-17 a -1, y de ARN desde las posiciones +1 a +33 de secuencia
3'ATTATGCTGAGTGATATCCCAACCGGC
GUCACAAGUGAGUACCAAUACCG5', hibridada con la hebra promotora no de molde (b). Los transcritos completos esperados en los tres sistemas tienen 33 bases.
GUCACAAGUGAGUACCAAUACCG5', hibridada con la hebra promotora no de molde (b). Los transcritos completos esperados en los tres sistemas tienen 33 bases.
Las reacciones se realizan en 20 \mul de un
tampón derivado del descrito por J. F. Milligan, D. R. Groebe, G.
W. Witherell, O. C. Uhlenbeck, Nucleic Acids Res. 25, 8783 (1987), a
saber, 40 mM de Tris-HCl, pH 8,1, 1 mM de
espermidina, PEG al 8% \mug/v), tritón al 0,01% (v/v), 5
\mug/100 \mul de BSA, 1 \mul (40 u) de RNAguard porcine
(Pharmacia Biotech), 12,5 \muM de UTP, un 32P UTP 0,5 \muCi
(Amersham, 10 mCi/ml 400 Ci/mmol) 0,4 mM de los tres trifosfatos de
ribonucleótidos A, G, C, 6 mM de Mg(OAc)_{2}. La
concentración de molde se fija a 1011 copias de cada hebra en 20
\mul de reacción. La ARN polimerasa de T7 salvaje se usa a 0,5
\muM (100 ng/20 \mul), la ARN polimerasa de T7 mutada R627A a
3,65 \muM (730 ng/20 \mul). Antes de añadir las enzimas, las
reacciones se desnaturalizan durante 5 minutos a 65ºC en un bloque
de calefacción, y después se deja volver progresivamente hasta 37ºC.
Las reacciones se inician mediante adición de las polimerasas,
incubadas durante 1 hora a 37ºC, y después se detienen mediante
adición de un volumen igual de azul de formamida 2x (formamida al
90%, 25 mM de EDTA, cianol de xileno al 0,02%, azul de bromofenol
al 0,02%), y se desnaturalizan durante 5 minutos a 95ºC. Se
depositan 20 \mul de cada reacción sobre un gel desnaturalizante
(20% de acrilamida, 7 M de urea, TBE 1X), y después de la migración
el gel se autorradiografía a -70ºC sobre una película Biomax MR
(Kodak). Los resultados (perfiles de electroforesis) se representan
en la figura 5, y en particular los resultados de transcripción
obtenidos con la ARN polimerasa de T7 mutada R627A (pocillos
1-3), y la ARN polimerasa de T7 salvaje (pocillos
4-6), sobre los moldes de ARN monocatenario
(pocillos 1 y 4), de ADN bicatenario (pocillos 2 y 5), y de ADN
monocatenario (pocillos 3 y 6). La transcripción sobre ARN
monocatenario, detectada mediante detección de un transcrito
completo de 33 bases, es posible usando la ARN polimerasa de T7
mutada R627A (pocillo 1), y no la enzima salvaje (pocillo 4), que
produce por otro lado numerosos transcritos abortivos; véase, sin
embargo, los resultados diferentes obtenidos en el ejemplo 3 a
continuación. La ARN polimerasa de T7 mutada R627A presenta una
actividad de transcripción residual sobre un ADN bicatenario
(pocillo 2), caracterizado por la presencia de un transcrito
mayoritario de tamaño inferior al transcrito esperado, y la
presencia de una pequeña cantidad de productos abortivos. En un ADN
monocatenario (pocillo 3) este transcrito de tamaño anormal
desaparece, mientras que la cantidad de productos abortivos
aumenta. Por el contrario, la enzima salvaje permite la obtención
de transcritos específicos en presencia de moldes de ADN (pocillos 5
y 6), presentando esta enzima, por otra parte, una mejor actividad
de transcripción sobre el molde de ADN bicatenario (pocillo 5) que
sobre el molde de ADN monocatenario (pocillo 6); para estos dos
moldes, la enzima salvaje induce la síntesis de numerosos
transcritos abortivos. Estos resultados muestran que la sustitución
de la arginina 627 por una alanina confiere a la enzima mutante la
posibilidad de sintetizar un ARN a partir de un molde de ARN, e
induce la pérdida de capacidad de sintetizar un ARN a partir de un
molde de ADN.
Ejemplo
3
La ARN polimerasa de T7, obtenida como en el
ejemplo 1, se purifica mediante cromatografía de afinidad según el
método descrito por Arnaud N. et al., Gene,
199, 149-156 (1997).
La ARN polimerasa de T7 purificada tiene una
actividad específica de aproximadamente 200 U/\mug.
Las secuencias de los moldes usados para la
transcripción se describen en la tabla 1 siguiente.
En los ensayos descritos a continuación, los
moldes de secuencia 1, 2 y 3 de la tabla 1 se denominan moldes del
grupo 1, del grupo 2 y del grupo 3, respectivamente.
La secuencia de las sondas usadas se representa
en la tabla 1 (secuencia nº 4 y 5).
La secuencia nº 4 reconoce el extremo 3' de los
productos de transcripción obtenidos con los moldes de los grupos 1
y 3, y la secuencia nº 5 reconoce el extremo 3' de los productos de
transcripción del molde del grupo 2.
Se marcan las sondas con \gamma^{32}P ATP
mediante la polinucleótido quinasa de T4 o con \alpha^{32}P
ddATP mediante una desoxinucleótido terminal transferasa.
Las reacciones se efectúan en un volumen de 20
\mul que contiene 40 m/M de Tris-HCl, 1 mM de
espermidina, 50 \mug/ml de seroalbumina bovina, 0,01% (v/v) de
Triton X100, 80 mg/ml de PEG 8000, 1 \mul de RNAguard (Pharmacia),
6 mM de acetato de magnesio, 10^{11} copias de hebras de molde y
no de molde, los trifosfatos de nucleósidos necesarios para la
transcripción y los trifosfatos de nucleósidos marcados según se
indicó. Cuando el trifosfato de nucleósido marcado es
\alpha^{32}P ATP, se usan concentraciones de 0,4 mM de UTP, CTP
y GTP, 12,5 \muM de ATP y 0,5 \muCi de \alpha^{32}P ATP
(New England Nuclear-Dupont, 800 Ci/mmol). Cuando el
trifosfato de nucleósido marcado es \alpha^{32}P UTP, se usan
concentraciones de 0,4 mM de ATP, CTP y GTP, 12,5 \muM de ATP y
0,5 \muCi de \alpha^{32}P UTP (Amersham, 400 Ci/mmol). Cuando
el trifosfato de nucleósido marcado es \gamma^{32}P GTP, se usan
concentraciones de 0,4 mM de ATP, UTP, CTP y GTP, y 20 \muCi de
\gamma^{32}P GTP (Amersham, 5000 Ci/mmol).
Las muestras se calientan durante 5 minutos a
70ºC, y después se dejan enfriar hasta 37ºC para permitir la
hibridación de las hebras de molde y no de molde. Después, se añaden
260 ng de ARN polimerasa de T7, y se deja incubar durante 1 hora a
37ºC. Las reacciones se detienen añadiendo un volumen igual de
tampón 2X (90% de formamida, 25 mM de EDTA, 0,02% de cianol de
xileno, 0,02% de azul de bromofenol). Los productos de transcripción
se analizan mediante eletroforesis, después de calentar durante 5
minutos a 95ºC, sobre un gel desnaturalizante al 20% de
poliacrilamida, y se examinan mediante autorradiografía.
Para el análisis de transferencia northern, las
reacciones se efectúan en las mismas condiciones, pero sin los
nucleótidos marcados. Las muestras, después de la migración sobre un
gel desnaturalizante al 20% de poliacrilamida, se transfieren sobre
una membrana de nylon (Appligene), y los productos de transcripción
se detectan mediante la sonda marcada apropiada, y se examinan
mediante autorradiografía.
Se definieron tres tipos de moldes sintéticos
cortos, que contienen un promotor de ADN bicatenario, a fin de
verificar si la ARN polimerasa de T7 es capaz de usar un molde de
ARN en una reacción de transcripción.
Se definió el primer tipo de molde (ARN+18) a
fin de estudiar la capacidad de la ARN polimerasa de T7 para
transcribir un molde de ARN durante la fase denominada progresiva.
Este primer tipo de molde comprende un promotor bicatenario
seguido, corriente abajo 3', de una secuencia quimérica
ADN-ARN cuya transición se sitúa 18 bases corriente
abajo 3' del sitio de iniciación de la transcripción.
Se definió el segundo tipo de molde (ARN+1) a
fin de estudiar la capacidad de la ARN polimerasa de T7 para
transcribir un molde de ARN durante el comienzo de la fase de
transcripción. Este segundo tipo de moldes comprende un promotor
bicatenario seguido de una secuencia de ARN.
El tercer tipo de moldes (ADN), que sirve de
comparación, comprende un promotor bicatenario seguido corriente
abajo 3' de una secuencia de ADN.
Con el fin de estudiar la influencia de la hebra
no molde, los moldes de ADN, de ARN+18 y de ARN+1 pueden ser
monocatenarios (m), o bien heterodúplex bicatenarios (bhe), o
también homodúplex bicatenarios (bho). El molde homodúplex
bicatenario ARN+18 forma un dúplex ARN-ARN a partir
de la posición +18. Asimismo, el molde homodúplex bicatenario ARN+1
forma un dúplex ARN-ARN a partir del sitio de
comienzo de la transcripción.
Conviene observar que en la tabla 1, se han
representado los diferentes nucleótidos mediante las letras A, T,
C, G. Cuando el molde, o una parte del molde, es ADN, estas letras
representan desoxiribonucleótidos. Cuando el molde, o parte del
molde, es ARN, estas letras representan ribonucleótidos, y se debe
entender que el símbolo T se usa entonces en sustitución del
símbolo U.
Los diferentes sistemas de transcripción que se
acaban de mencionar se representan esquemáticamente en la figura 6
anexa, en la que, para cada sistema bicatenario, la hebra superior
es la hebra no molde, y la hebra inferior es la hebra molde. La
región promotora de ADN bicatenario se representa mediante una línea
gruesa. Las hebras de ADN se representan mediante una línea fina,
las hebras de ARN se representan mediante una línea discontinua. La
indicación +1 corresponde al sitio de comienzo de la transcripción.
La indicación +18 corresponde a la decimoctava base corriente abajo
3' del sitio de comienzo de la transcripción. En la designación de
estos diferentes sistemas de transcripción, la letra m significa
monocatenario; la letra b significa bicatenario; bhe significa
heterodúplex bicatenario; y bho significa homodúplex
bicatenario.
Los sistemas de transcripción de la figura 6 se
usaron con cada uno de los moldes, o, según el caso, con ciertos
moldes de la tabla 1. Los moldes del grupo 1, que usan la secuencia
nº 1, corresponden a una secuencia promotora de ADN bicatenario
seguida de una región de iniciación +1 a +6 de consenso (Dunn y
Studier, J. Mol. Biol., 166, 477-535, 1983),
seguidas a su vez de una secuencia de veintiséis bases corriente
abajo 3'.
Los moldes del grupo 2 corresponden a una
secuencia promotora de ADN bicatenario seguido de una secuencia no
favorable, debido a que puede permitir la terminación precoz de la
transcripción (Martin et al., Biochemistry,
27, 3966-3974, 1988).
Los moldes del grupo 3 corresponden a la misma
secuencia de iniciación no favorable que el grupo 2, seguido de la
misma secuencia corriente abajo 3' que el grupo 1.
Los resultados se resumen en la tabla 2
siguiente.
Se observa que la transición
ADN-ARN sobre el molde ARN+18 ha pasado eficazmente
por el complejo de elongación, tal como lo muestra la ausencia de
crecimiento de las terminaciones precoces alrededor de la posición
+18, en comparación con el ADN testigo.
La ARN polimerasa de T7 es capaz de iniciar la
transcripción sobre diferentes moldes de ARN, y es capaz de
transcribir totalmente estos moldes. La detección de transcritos que
tienen el tamaño esperado, para todos los grupos de moldes, muestra
que el uso del molde de ARN no depende de la secuencia, aunque la
eficacia global depende de la composición base, tal como se observa
también sobre los moldes de ADN testigos.
Los diferentes resultados mencionados en el
ejemplo 2 anterior, proceden del hecho de que la detección mediante
la técnica de transferencia northern es, en el presente caso, 40
veces más sensible que la técnica de detección usada en el ejemplo
1, tal como se señaló anteriormente en la descripción.
La ARN polimerasa de T7 es capaz de transcribir
un dúplex de ARN-ARN. No se observa ningún
crecimiento del número de productos de transcripción abortivos con
el molde de homodúplex de ARN+1.
La transcripción de los moldes bicatenarios homo
o heterodúplex es globalmente similar. En el caso de los moldes
ARN+18 del grupo 2, se obtienen más transcritos del tamaño esperado
con el sistema de homodúplex que con el sistema de
heterodúplex.
La presencia de la hebra no molde influye sobre
la eficacia de la transcripción. En efecto, el rendimiento de
transcripción aumenta en los moldes monocatenarios, tal como lo
muestra, por una parte, el aumento del número de transcritos de
tamaño correcto y, por otra parte, el hecho de que un evento de
iniciación esté más frecuentemente asociado con la síntesis de un
transcrito completo. Sin embargo, con los moldes del grupo 2, el
sistema monocatenario no da mejores resultados.
Así, la ARN polimerasa de T7 posee una actividad
de transcripción sobre el molde de ARN, en presencia de un promotor
de ADN bicatenario. El rendimiento de transcripción observado es
sólo 10 a 100 veces más bajo que sobre un molde de ADN.
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Claims (31)
1. Procedimiento de amplificación de cualquier
secuencia diana de ARN, mediante transcripción bajo la dependencia
de un promotor, en una muestra de ARN que comprende dicha secuencia
diana, en el que se pone en contacto dicha muestra
- -
- con un agente reactivo capaz de hibridarse con dicho ARN que comprende dicha secuencia diana, y
- -
- con un sistema enzimático que comprende una actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN,
en condiciones que permiten la hibridación de
dicho agente reactivo con dicho ARN que comprende dicha secuencia
diana, y en condiciones que permiten el funcionamiento de dicha
actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN; en el que dicho
reactivo contiene:
- (i)
- una primera hebra nucleotídica que comprende: a) un primer segmento nucleotídico capaz de desempeñar la función de hebra sentido de un promotor para dicha actividad de ARN polimerasa, y b), en dirección 3' de dicho primer segmento, un segundo segmento nucleotídico que comprende una secuencia capaz de hibridarse con una región de dicho ARN, y
- (ii)
- en el estado hibridado sobre la primera hebra, una segunda hebra nucleotídica que comprende un tercer segmento nucleotídico capaz de hibridarse con dicho primer segmento a fin de formar un promotor bicatenario funcional; y
en el que dicha actividad de ARN polimerasa es
capaz de transcribir un molde de ARN, en presencia de dicho agente
reactivo hibridado con dicho molde, en ausencia de factor proteico
asociado y en ausencia de actividad de ligasa.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho tercer segmento está flanqueado, en su extremo
corriente arriba 5', por un cuarto segmento nucleotídico más corto
que dicho segundo segmento de la primera hebra.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicho cuarto segmento es capaz de hibridarse con una parte
opuesta de dicho segundo segmento.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 y 3, en el que dicho cuarto segmento de dicha
segunda hebra se selecciona de entre aquéllos cuya secuencia
facilita la iniciación de la transcripción para dicha ARN
polimerasa.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho segundo segmento de dicha
primera hebra contiene un número de nucleótidos al menos igual a la
suma del número de nucleótidos de dicho cuarto segmento, si está
presente, y del número de nucleótidos de dicha secuencia del segundo
segmento que es capaz de hibridarse con dicha región de dicho
ARN.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichos primer y tercer
segmentos están constituidos por ADN.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho cuarto segmento está
constituido por ADN.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha ARN polimerasa es una
ARN polimerasa de tipo salvaje de virus o de fago.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dicha ARN polimerasa se selecciona de la familia de las ARN
polimerasas que incluye ARN polimerasa de T7, ARN polimerasa de T3 y
ARN polimerasa de SP6.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dicha ARN polimerasa deriva, mediante mutación, de una ARN
polimerasa seleccionada de la familia de las ARN polimerasas que
incluye ARN polimerasas de T7, T3 y SP6.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicha ARN polimerasa contiene al menos una mutación en la
región que corresponde a la secuencia de aminoácidos 625 a 652 de la
ARN polimerasa de T7.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que dicha ARN polimerasa es capaz de transcribir una secuencia
diana polinucleotídica con un mejor rendimiento cuando dicha
secuencia diana está constituida por ARN que cuando está
constituida por ADN.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho sistema enzimático
contiene únicamente una actividad de ARN polimerasa.
14. ARN polimerasa que se debe utilizar en el
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
capaz de transcribir, bajo la dependencia de un promotor, una diana
polinucleotídica de interés de cualquier secuencia contenida en un
molde polinucleotídica, sintetizando, en presencia de dicho molde y
en ausencia de factor proteico asociado, un producto de
transcripción que contiene una secuencia de ARN complementaria de
dicha secuencia, siendo dicha ARN polimerasa mutada y capaz de
sintetizar dicho producto de transcripción con un mejor rendimiento
cuando dicha secuencia diana de dicho molde está constituida por ARN
que cuando está constituida por ADN.
15. ARN polimerasa según la reivindicación
anterior, en la que la relación del rendimiento de producto de
transcripción del molde de ARN al rendimiento de producto de
transcripción del molde de ADN es superior a 2, en particular
superior a 10.
16. ARN polimerasa según cualquiera de las
reivindicaciones 14 y 15, caracterizada porque deriva,
mediante mutación, de una ARN polimerasa de virus o de fago.
17. ARN polimerasa según la reivindicación 16,
caracterizada porque dicho fago es un fago de E.
coli.
18. ARN polimerasa según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, caracterizada porque posee una
homología de secuencia proteica superior a 50%, en particular
superior a 80%, con una ARN polimerasa de tipo salvaje de la
familia de las ARN polimerasas dependientes de ADN, incluyendo ARN
polimerasa de T7, ARN polimerasa de T3 y ARN polimerasa de SP6.
19. ARN polimerasa según la reivindicación 18,
caracterizada porque contiene al menos una mutación en una
región que corresponde a la secuencia de aminoácidos 625 a 652 de la
ARN polimerasa de T7.
20. ARN polimerasa según la reivindicación 19,
caracterizada porque tiene la composición de una ARN
polimerasa dependiente de ADN de tipo salvaje, salvo por el hecho
de que comprende al menos una mutación en dicha región.
21. ARN polimerasa según la reivindicación 19 ó
20, caracterizada porque comprende al menos una mutación en
una posición que corresponde a una de las posiciones 627, 628, 631 y
639 de la secuencia de aminoácidos de la ARN polimerasa de T7.
22. ARN polimerasa según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, caracterizada porque dicha mutación
comprende la sustitución de un resto de aminoácido, seleccionado de
entre la arginina, la lisina, la serina y la tirosina, de la ARN
polimerasa de tipo salvaje, por otro resto de aminoácido.
23. ARN polimerasa según la reivindicación 22,
caracterizada porque dicho aminoácido sustituido es una
arginina o una lisina y/o porque dicho otro resto de aminoácido es
un resto de alanina, de valina, de leucina, de isoleucina, de
glicina, de treonina o de serina.
24. ARN polimerasa según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 23, caracterizada porque dicha mutación
comprende la sustitución de la totalidad o parte de dicha región
por una región homóloga presente en una polimerasa dependiente de
ARN de tipo salvaje.
25. Gen que codifica para una ARN polimerasa tal
la definida en cualquiera de las reivindicación 14 a 24.
26. Vector de expresión en el que se inserta un
gen tal como el definido en la reivindicación anterior, siendo
dicho vector capaz de expresar dicha ARN polimerasa en una célula
hospedante.
27. Célula hospedante que contiene un vector de
expresión tal como el definido en la reivindicación anterior.
28. Procedimiento de obtención de una ARN
polimerasa tal como la definida en cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 24, caracterizado porque: a) se
obtiene, de manera conocida, un gen que codifica para una ARN
polimerasa de tipo salvaje, b) se efectúa al menos una mutación
sobre dicho gen, c) se inserta el gen mutado obtenido en un vector
de expresión, d) se expresa dicho vector en una célula hospedante
para obtener una ARN polimerasa mutada y e) se seleccionan, de
entre las ARN polimerasas mutadas obtenidas, las que presentan las
propiedades de una ARN polimerasa tal como la definida en una de
las reivindicaciones 14 ó 15.
29. Uso de una ARN polimerasa capaz de
transcribir un molde de ARN, bajo la dependencia de un promotor, en
ausencia de factor proteico auxiliar, en un procedimiento de
transcripción de una hebra molde que comprende una secuencia diana
de ARN, en la que dicha ARN polimerasa se selecciona de entre ARN
polimerasa de T7, ARN polimerasa de SP6 y las ARN polimerasas tales
como las definidas en cualquiera de las reivindicaciones 14 a
24.
30. Uso de una ARN polimerasa capaz de
transcribir un molde de ARN, bajo la dependencia de un promotor, en
ausencia de factor proteico auxiliar, en un procedimiento de
transcripción de una hebra molde que comprende una secuencia diana
de ARN, en el que dicha hebra molde está constituida por ARN por lo
menos entre la posición +5 y el extremo 5' de la diana, siendo
dicha ARN polimerasa una ARN polimerasa salvaje de virus o de
fago.
31. Uso según la reivindicación anterior, en el
que dicha ARN polimerasa se selecciona de entre la ARN polimerasa
de T7, T3 y SP6.
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