KR101776368B1

KR101776368B1 - 전령 ｒｎａ 나노입자 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101776368B1
Application number: KR1020140133218A
Authority: KR
Inventors: 이종범; 김혜진
Original assignee: 서울시립대학교 산학협력단
Priority date: 2014-10-02
Filing date: 2014-10-02
Publication date: 2017-09-07
Also published as: US20170216457A1; WO2016053033A1; KR20160039914A; US10300148B2

Abstract

본 발명은 세포 내로 유입되어 특정 단백질을 발현하는 나노입자 및 그 제조방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 단백질 발현을 위한 반복되는 염기서열을 포함하는 전령 RNA로 이루어지고, 단일 가닥의 전령 RNA가 꼬이고 엉키면서 형성되어, 세포의 면역 체계를 자극할 수 있는 특정 단백질의 발현을 촉진함으로써 세포 내 면역 반응을 일으켜 다양한 질병을 치료할 수 있고, 플라스미드 DNA를 자체를 전달하는 것이 아니라 전령 RNA를 전달함으로써 전사 후 핵막 통과 과정을 생략할 수 있어 단백질 발현 효율을 향상시킬 수 있으며, 생체물질인 전령 RNA로만 이루어져 체내 독성이 없어 안전하게 사용할 수 있고, 자가 조립되어 핵산분해에 대해 저항성을 가지며, 상대적으로 적은 플라스미드 DNA를 가지고 원스텝의 과정(RCT)을 통해 나노입자를 생성하여 제조공정의 편리성 및 경제성을 도모할 수 있는 전령 RNA 나노입자 및 그 제조방법에 대한 것이다.

Description

전령 ＲＮＡ 나노입자 및 그 제조방법{mRNA nanoparticles and manufacturing method thereof}

유전체 전달에 의한 목표 단백질 발현은 세포 내의 DNA 전사 과정 및 전령 RNA 번역 과정을 통해 이루어진다. 목표 단백질은 주로 세포의 면역 체계를 자극할 수 있는 물질이 선택되며, 그 단백질의 발현을 촉진함으로써 세포 내 면역 반응을 일으켜 다양한 질병의 치료 효과를 얻을 수 있다. 이를 위해 유전 정보를 담고 있는 플라스미드 DNA의 전달에 관한 연구가 널리 진행되고 있다. 하지만, 플라스미드 DNA 역시 전달한 플라스미드 DNA가 핵막 내부에서 전령 RNA로 전사된 후, 핵막을 다시 빠져나와 비로소 목표 단백질로 번역이 되기 때문에, 핵막을 통과하는 효율이 매우 낮을 뿐만 아니라 그러한 과정을 거치면서 발현 효율이 현저히 감소하게 된다. 또한, 세포 내 핵분열 작용 기전에 의해 새롭게 분열되는 세포도 주입해준 외부의 유전정보를 가지게 되면서 세포의 고유한 유전 정보가 변하게 되는 문제가 있다. 따라서, 플라스미드 DNA의 전달에 생기는 문제를 해결하기 위해 하기의 논문처럼 양전하를 띠는 고분자 물질 등의 코팅재료나 입자 구성요소로 지질 등을 사용하는 기술이 개발되고 있다.

<논문문헌>

R. Tachibana, H. Harashima, Y. Shinohara, H. Kiwada, Adv. Drug Delivery Rev. 2001, 52, 219-226.

하지만, 사용되는 유무기 재료들의 대부분은 생체 외부 물질로서 세포 내에 섭취되었을 때, 외부 물질로 인식되어 세포 내 독성을 가지게 되는 문제가 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,

본 발명은 세포의 면역 체계를 자극할 수 있는 특정 단백질의 발현을 촉진함으로써, 세포 내 면역 반응을 일으켜 다양한 질병을 치료할 수 있는 전령 RNA 나노입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 플라스미드 DNA를 자체를 전달하는 것이 아니라 전령 RNA를 전달함으로써, 전사 후 핵막 통과 과정을 생략할 수 있어 단백질 발현 효율을 향상시킬 수 있는 전령 RNA 나노입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 생체물질인 전령 RNA로만 이루어져 체내 독성이 없어 안전하게 사용할 수 있는 전령 RNA 나노입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 전령 RNA 가닥들이 엉키고 꼬이는 과정을 통해 자가 조립되어 핵산분해효소인 RNase에 대해 저항성을 가지는 전령 RNA 나노입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상대적으로 적은 플라스미드 DNA를 가지고 원스텝의 과정(RCT)을 통해 나노입자를 생성하므로, 제조공정의 편리성 및 경제성을 도모할 수 있는 전령 RNA 나노입자 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자는 특정 단백질 발현을 위한 반복되는 염기서열을 포함하는 전령 RNA로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자는 구의 형태를 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자는 30 내지 200nm의 직경을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자는 단일 가닥의 전령 RNA가 꼬이고 엉키면서 형성되어, 핵산분해효소에 대해 저항성을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자의 제조방법은 특정 단백질 발현을 위한 유전정보를 담고 있는 염기서열을 포함하는 DNA를 생성하는 DNA생성단계와; 상기 DNA를 RNA중합효소를 사용하여 전사시킴으로써 특정 단백질의 발현을 위한 반복되는 염기서열을 포함하는 단일 가닥의 전령 RNA를 생성하는 전사단계와; 상기 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉키면서 자가 조립을 통해 전령 RNA 나노입자를 형성하는 자가조립단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자의 제조방법에 있어서 상기 DNA는 원형의 이중 가닥 플라스미드 DNA인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자의 제조방법에 있어서 상기 DNA는 RNA중합효소의 중합을 위한 프로모터 영역 염기서열과, 리보솜결합 염기서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자의 제조방법에 있어서 상기 DNA생성단계에서는 RNA중합효소의 중합을 위한 프로모터 영역 염기서열과, 리보솜결합 염기서열과, 특정 단백질 발현을 위한 유전정보를 담고 있는 염기서열을 순서대로 포함하는 원형의 이중 가닥 플라스미드 DNA가 생성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자의 제조방법에 있어서 상기 단일 가닥의 전령 RNA는 롤링 서클 전사에 의해 생성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자의 제조방법에 있어서 상기 플라스미드 DNA는 1 내지 5nM이 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.

본 발명은 세포의 면역 체계를 자극할 수 있는 특정 단백질의 발현을 촉진함으로써, 세포 내 면역 반응을 일으켜 다양한 질병을 치료할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 플라스미드 DNA를 자체를 전달하는 것이 아니라 전령 RNA를 전달함으로써, 전사 후 핵막 통과 과정을 생략할 수 있어 단백질 발현 효율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 생체물질인 전령 RNA로만 이루어져 체내 독성이 없어 안전하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 전령 RNA 가닥들이 엉키고 꼬이는 과정을 통해 자가 조립되어 핵산분해효소인 RNase에 대해 저항성을 가지는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 상대적으로 적은 플라스미드 DNA를 가지고 원스텝의 과정(RCT)을 통해 나노입자를 생성하므로, 제조공정의 편리성 및 경제성을 도모할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 플라스미드 DNA를 이용하여 전령 RNA 나노입자를 형성하는 과정을 설명하기 위한 개략도.
도 2는 플라스미드 DNA의 농도에 따른 전령 RNA 나노입자의 dynamic light scattering analysis 결과를 나타내는 도표.
도 3은 플라스미드 DNA의 농도에 따른 전령 RNA 나노입자의 현미경 사진.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 전령 RNA 나노입자의 현미경 사진.
도 5는 전령 RNA 나노입자의 구성성분을 확인하기 위한 gel electrophoresis 결과를 나타내는 도표.
도 6은 전령 RNA 나노입자의 구성성분을 확인하기 위한 image cytometry 결과를 나타내는 도표.
도 7은 전령 RNA 나노입자의 핵산효소 저항성을 확인 위한 gel electrophoresis 결과를 나타내는 도표.
도 8 및 9는 전령 RNA 나노입자의 단백질 발현능력을 확인하기 위한 형광현미경 사진.
도 10은 전령 RNA 나노입자의 단백질 발현능력을 확인하기 위한 Cytometry analysis 결과를 나타내는 도표.

이하에서는 본 발명에 따른 전령 RNA 나노입자 및 그 제조방법을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 세포 내로 유입되어 특정 단백질의 발현을 촉진하는 전령 RNA 나노입자에 대한 것으로, 상기 전령 RNA 나노입자는 특정 단백질 발현을 위한 반복되는 염기서열을 포함하며, 상기 전령 RNA 나노입자는 일정한 형태와 크기를 가지나 바람직하게는 전체적으로 구의 형태를 가지고 30 내지 200nm의 직경을 가진다. 상기 전령 RNA 나노입자는 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉키면서 형성되게 된다. 상기 전령 RNA 나노입자가 발현을 촉진하는 단백질은 세포의 면역 체계를 자극하므로, 결국 상기 전령 RNA 나노입자 주입을 통해 세포 내 면역 반응을 일으켜 다양한 질병을 치료할 수 있게 된다. 상기 전령 RNA 나노입자는 생체물질로만 이루어져 체내 독성이 없으며, 단백질 발현과정에서 핵막 통과 과정을 생략할 수 있고 핵산분해효소(RNase)에 대해 저항성을 가지므로 단백질 발현 효율을 향상시킬 수 있다.

상기와 같은 전령 RNA 나노입자를 제조하는 방법을 이하에서 설명하기로 한다. 상기 전령 RNA 나노입자는 이하의 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 전령 RNA 나노입자의 제조방법은 전사시 RNA 중합효소가 중합을 시작하게 되는 결합부위인 프로모터(promoter)와, 생성된 전령 RNA의 리보솜 결합부인 리보솜결합부위(ribosomal binding site, RBS) 및 목표 단백질을 엔코딩(encoding)하고 있는 DNA 염기서열을 순서대로 포함하는 원형의 이중 가닥 플라스미드 DNA을 생성하는 DNA생성단계와; 상기 플라스미드 DNA를 RNA중합효소(RNA polymerase)를 사용하여 전사시킴으로써 특정 단백질의 발현을 위한 반복되는 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 전령 RNA를 생성하는 전사단계와; 상기 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉키면서 자가 조립을 통해 전령 RNA 나노입자를 형성하는 자가조립단계;를 포함한다.

상기 DNA생성단계는 발현하고자 하는 단백질의 유전정보를 담고 있는 DNA를 생성하는 단계로, 상기 DNA생성단계에서는 RNA중합효소의 중합을 위한 프로모터 영역(promoter region)과, 리보솜결합 염기서열(ribosomal binding sequence)과, 특정 단백질(예를 들어, green fluorescence protein, GFP) 발현을 위한 유전정보를 담고 있는 염기서열을 순서대로 포함하는 원형의 이중 가닥 플라스미드 DNA가 생성되게 된다. 특정 단백질 발현을 위한 플라스미드 DNA는 전사되고 자가 조립되어 전령 RNA 나노입자를 형성하게 되고, 상기 전령 RNA 나노입자는 사람의 세포에 유입되어 특정 단백질을 발현하게 된다.

상기 전사단계는 상기 DNA생성단계에서 생성된 상기 플라스미드 DNA를 RNA중합효소(RNA polymerase)를 사용하여 롤링 서클 전사(rolling circle transcription, RCT)시킴으로써 특정 단백질의 발현을 위한 반복되는 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 전령 RNA를 생성하는 단계이다.

상기 자가조립단계는 상기 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉키면서 자가 조립(self assembly)을 통해 전령 RNA 나노입자를 형성하는 단계이다. 상기 자가조립단계에서 전령 RNA 가닥들이 엉키고 꼬이는 과정을 통해 자가 조립되어 핵산분해효소인 RNase에 대해 저항성을 가지게 된다. 상기 전령 RNA 나노입자를 제조하는 과정에서 플라스미드 DNA의 양의 조절을 통해 원하는 목표 단백질에 대한 유전정보를 포함하고 있는 전령 RNA 나노입자의 직경을 조절할 수 있게 된다. 하기에서 자세히 살펴보겠으나, 플라스미드 DNA와 RNA중합효소를 혼합하고 일정 시간 및 온도에서 반응시키면, 도 1에 도시된 바와 같이 RNA중합효소가 RCT과정을 통해 긴 단일 가닥의 전령 RNA를 형성하게 되고 이들이 점차 서로 꼬이고 엉키면서 자가 조립을 하여 전령 RNA 나노입자가 생성되므로, 즉 원스텝(one-step)의 RCT를 이용하여 적은 플라스미드 DNA를 가지고 간편하게 전령 RNA 나노입자를 생성할 수 있다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 플라스미드 DNA의 제조

녹색형광단백질(green fluorescent protein) 발현을 위한 유전정보를 담고 있는 염기서열(서열번호:1)과, 코작 염기서열(Kozak sequence)로 알려진 진핵 리보솜 결합 염기서열(eukaryotic ribosomal binding sequence, RBS)(서열번호:2) 및 T7 RNA 중합효소를 위한 프로모터 영역(promoter region) 염기서열(서열번호:3)을 포함하는 하기의 플라스미드 DNA를 디자인하여 생성하였다.

<플라스미드 DNA의 염기서열>

<실시예 2> 전령 RNA 나노입자의 제조

실시예 1에서 생성된 플라스미드 DNA 1nM, ribonucleotide solution mix(Bioline) 4mM, Reaction buffer(8mM Tris-HCl, 0.4mM spermidine, 1.2mM MgCl₂, and 2mM dithiothreitol), 50 units ml^-1of T7 RNA polymerase(New England Biolabs)를 튜브에 넣어 혼합하고, 상기 튜브를 인큐베이터에 넣고 37℃에서 20시간 반응시켜 전령 RNA 나노입자(이하, 'mRNA-NPs' 라 함)를 제조하였다.

<실시예 3> 플라스미드 DNA의 농도에 따른 전령 RNA 나노입자의 크기 및 분포 확인

1) 실시예 2의 제조방법에서 플라스미드 DNA의 농도를 0.05nM, 0.11nM, 0.57nM, 5.00nM, 25.00nM로 바꾸어가면서 전령 RNA 나노입자를 제조하였다.

2) 상기 실시예 2 및 3의 1)에서 제조된 전령 RNA 나노입자에 대해 dynamic light scattering analysis(Particle Size Analyzer WI30i)를 통해 그 결과를 도 2에 나타내고, 1nM, 5nM, 25nM의 플라스미드 DNA를 사용하여 제조한 나노입자에 대한 SEM사진을 도 3에 나타내었다.

2) 도 2 및 3을 통해 플라스미드 DNA의 농도가 0.05nM 이하일 때는 나노입자가 형성되지 않고, 플라스미드 DNA의 농도가 0.11nM 이상에서 나노입자는 30 내지 200nm의 직경을 가지며 플라스미드 DNA의 농도가 증가할수록 대체로 직경이 증가하나, 플라스미드 DNA의 농도가 5nM을 초과한 이후에는 나노입자 직경 및 개수의 증가량이 크지 않음을 알 수 있다. 본원발명은 적은 플라스미드 DNA을 사용하여 나노입자를 생성하는 것을 일 목적으로 하고, 100nm 근방의 직경을 가지는 나노입자가 세포 침투 및 약리적 효과에 있어 선호되므로 플라스미드 DNA가 1 내지 5nM이 사용되는 것이 바람직함을 알 수 있다.

<실시예 4> 전령 RNA 나노입자의 크기 및 형태 확인

실시예 3의 1)에서 제조된 전령 RNA 나노입자(5.00nM의 플라스미드 DNA 사용)를 SEM(scanning electron microscope, XL30-FEG(FEI)), AFM(atomic force microscope, Park NX10(Park Systems))을 통해 확인하였다. 도 4의 a)의 SEM사진(scale bar, 100nm)으로부터 100~200nm의 직경을 갖는 구형의 나노입자를 확인할 수 있다. 도 4의 b)의 AFM사진으로부터 SEM사진에서 확인한 결과와 일관된 입자의 형태를 가짐을 확인할 수 있다.

<실시예 5> 전령 RNA 나노입자의 구성성분 확인

1) 실시예 2의 제조방법에서 Cyanine 3-UTP(Enzo)가 포함된 ribonucleotide solution mix를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 동일하게 하여 나노입자를 제조하였다. 사용된 Cyanine 3-UTP의 농도는 각각 5, 20, 100μM이다.

2) 실시예 5의 1)에 의해 제조된 나노입자를 실온에서 100V로 1.2wt% agarose gel in Tris-acetate-EDTA(TAE) buffer(40mM Tris-acetate and 1mM EDTA, pH 8.0 Biosesang)의 조건에서 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 실시하여, 도 5의 a)에 표시하였다. 또한, 실시예 5의 1)에 의해 제조된 나노입자를 실온에서 100V로 1.2wt% agarose gel in Tris-acetate-EDTA(TAE) buffer(40mM Tris-acetate and 1mM EDTA, pH 8.0 Biosesang)의 조건에서 시약(GelRed)으로 염색한 후 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 실시하여, 도 5의 b)에 표시하였다. 도 5의 a), b)에서 Lane 1은 1kb DNA ladder를 지시하고, Lane 2는 플라스미드 DNA를 지시하고, Lane 3, 5 및 7은 나노입자를 첨가하지 않은 시료의 결과를 나타내고, Lane 4, 6 및 8은 각각 농도가 100, 20, 5μM인 Cyanine 3-UTP가 첨가된 나노입자 시료(실시예 5의 1)에서 제조된 나노입자 시료)의 결과를 나타낸다.

3) 실시예 5의 1)과 같은 방법으로 제조된 나노입자의 image cytometry를 이용하여 도 6에 나타내었다. 사용된 Cyanine 3-UTP의 농도는 각각 0(control), 5, 20μM이다.

4) Cy3-UTP와 연계하여 RCT반응을 수행하는 것에 의해 오렌지 형광파장을 띄는 Cy3-UTP를 가지고 상기 나노입자는 라벨링(labelling)되어, 상기 나노입자는 자외선 하에서 쉽게 시각적으로 인지되게 된다. 도 5의 a) 및 b)에서 보는 바와 같이 Cyanine 3-UTP를 첨가한 나노입자는 시각적으로 인식이 가능하여(Lane 4, 6 및 8 참조), 나노입자가 RNA로 이루어졌음을 알 수 있다. 또한, 도 6의 image cytometry를 통해 Cyanine 3-UTP의 농도가 증가할수록 강한 형광 강도를 가지는 것을 알 수 있어, 상기 나노입자가 RNA로 이루어졌음을 알 수 있다.

<실시예 6> 핵산분해효소에 대한 저항성 확인

1) Xef-1 단백질 발현을 위한 염기서열을 포함하는 capped mRNA(1800bp)(이하, 'Naked'라 함) 50ng과, 전령 RNA 나노입자(mRNA-NPs) 0.54 amole(12㎍)에 2, 10% FBS(fetal bovine serum, 핵산분해효소를 가짐)을 혼합하고 37℃에서 5min, 1hr 반응 조건에서 배양한 후, 1% agarose gel에서 겔 전기영동을 실시하여, 도 7에 나타내었다(Lane 1(control(cntl))은 아무 처리하지 않고, Lane 2는 5분 동안 2%의 FBS에서 배양하고, Lane 3은 5분 동안 10%의 FBS에서 배양하고, Lane 4는 1시간 동안 2%의 FBS에서 배양하고, Lane 5는 1시간 동안 10%의 FBS에서 배양한 시료의 결과).

2) 도 7을 통해 긴 가닥 형태의 Naked는 핵산분해효소 농도 및 반응시간에 따라 쉽게 분해됨을 알 수 있으나, RNA 가닥이 서로 꼬이고 엉키면서 형성된 mRNA-NPs는 분해효소에 의해 어느 정도 분해되기는 하였지만 여전히 상대적으로 많은 양이 남아있는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 전령 RNA 나노입자가 분해효소에 대해 저항성을 지니고 있음을 확인할 수 있다.

<실시예 7> 전령 RNA 나노입자의 단백질 발현 능력 평가

1) PC-3 세포는 10%의 fetal bovine serum(Gibco), 100 units ml^-1 of penicillin, 100 ㎍ ml^-1of streptomycin 및 1% antibiotic-antimycotic(Gibco)이 첨가된 RPMI 1640(Welgene)에서 5% CO₂를 가진 humidified atmosphere에서 37℃의 온도로 성장된다. 형질주입(transfection) 전 24시간, 상기 세포는 fresh medium(3×10⁵cells ml^-1)을 가지고 트립신처리되고 희석된 후, 24-well plates(500μl per well)로 옮겨진다.

2) 실시예 2에 의해 제조된 전령 RNA 나노입자는 OPTI-MEMI(Gibco)를 가지고 희석된 후, transfection reagent인 TransIT-X2(Mirus)가 추가로 첨가되어, 실온에서 15min동안 배양되어, mRNA-NPs와 TransIT-X2가 결합한 mRNA-NPs complex를 형성하게 된다.

3) mRNA-NPs complex를 형성한 후 2.10×10⁵mRNA-NPs를 세포의 각 well에 희석시키고, 상기 세포를 5% CO₂를 가진 humidified atmosphere에서 37℃의 온도로 3 내지 48시간 동안 배양한다.

4) GFP를 발현하는 PC-3 세포의 이미지를 얻기 위해, 상기 세포는 8-well cell culture chamber slides(SPL Life Science)에서 성장된다. 모든 세포는 4% paraformaldehyde(MBiotech)로 고정되고, 세포핵의 위치를 확인하기 위해서 5㎍ ml^-1농도의 DAPI로 염색된다. 형질주입된 세포의 이미지를 얻기 위해 형광현미경(fluorescent microscope, Eclipse Ti(Nikon))이 사용되어, 그 결과는 도 8 및 9에 도시된다. 도 8의 a)와 b)는 서로 다른 필터를 사용한 형광 현미경 사진으로 a)의 푸른색으로부터 핵의 위치를 알 수 있고 b)의 녹색 신호로부터 GFP 단백질 발현을 알 수 있다. 도 8의 a) 및 b)에서 top(mRNA-NPs)은 1nM의 플라스미드 DNA를 사용하여 0.6fM의 mRNA-NPs complex가 사용된 세포의 형광현미경 사진이고, middle(Plasmid)은 top과 같은 양의 플라스미드 DNA complex가 사용된 세포의 형광현미경 사진이고, bottom(Control)은 mRNA-NPs complex 및 플라스미드 DNA complex가 사용되지 않은 세포의 형광현미경 사진이다. 도 9는 5nM의 플라스미드 DNA를 사용된 0.1fM의 mRNA-NPs complex가 사용된 형광현미경 사진으로 다른 필터를 사용하여 촬영한 사진을 합성한 것이다.

5) 도 8을 통해, 전령 RNA 나노입자가 사용되어 형질주입된 세포는 녹색 빛을 발산하는 빈도가 높아 녹색형광단백질이 많이 생성되었음을 알 수 있다(mRNA-NPs 참조), 플라스미드 DNA가 사용되어 형질주입된 세포는 녹색 빛을 발산하는 빈도가 상대적으로 낮아 녹색형광단백질이 적게 생성되었음을 알 수 있다(Plasmid 참조). 도 9를 통해 전령 RNA 나노입자가 사용되어 형질주입된 세포는 핵(푸른색) 주위에 녹색형광단백질(녹색)이 생성되었음을 알 수 있다.

6) 도 10은 Cytometry analysis를 나타내는 그래프로, 사용되는 세포에 형질주입되는 시료(12pM(navy) and 2pM(green) of plasmid DNA complex, 0.6fM(red) and 0.1fM(orange) of mRNA-NPs complex transcribed with 1nM of the plasmid DNA)에 따라 발산되는 빛의 강도 및 발현시간이 달라짐을 알 수 있다. 도 10을 통해, mRNA-NPs complex 0.6fM이 형질주입되는 경우 24시간 후에 빛의 강도가 가장 강하고, 40시간 이후에도 상대적으로 강한 강도의 빛을 발산함을 알 수 있다(red line 참고). 즉, 플라스미드 DNA를 형질주입시킨 경우보다 전령 RNA 나노입자를 형질주입시킨 경우 빛의 강도가 강하고 발현되는 시간이 길어짐을 알 수 있다.

이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University of seoul Industry Coopreation Foundation <120> mRNA nanoparticles and manufacturing method thereof <130> PDAHJ-14140 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of plasmid DNA for protein generation <400> 1 ctatttgtat agttcatcca tgccatgtgt aatcccagca gctgttacaa actcaagaag 60 gaccatgtgg tctctctttt cgttgggatc tttcgaaagg gcagattgtg tggacaggta 120 atggttgtct ggtaaaagga cagggccatc gccaattgga gtattttgtt gataatggtc 180 tgctagttga acgcttccat cttcaatgtt gtgtctaatt ttgaagttaa ctttgattcc 240 attcttttgt ttgtctgcca tgatgtatac attgtgtgag ttatagttgt attccaattt 300 gtgtccaaga atgtttccat cttctttaaa atcaatacct tttaactcga ttctattaac 360 aagggtatca ccttcaaact tgacttcagc acgtgtcttg tagttcccgt catctttgaa 420 aaatatagtt ctttcctgta cataaccttc gggcatggca ctcttgaaaa agtcatgccg 480 tttcatatga tctgggtatc ttgaaaagca ttgaacacca taagagaaag tagtgacaag 540 tgttggccat ggaacaggta gttttccagt agtgcaaata aatttaaggg taagttttcc 600 gtatgttgca tcaccttcac cctctccact gacagaaaat ttgtgcccat taacatcacc 660 atctaattca acaagaattg ggacaactcc agtgaaaagt tcttctcctt tactcat 717 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of plasmid DNA for binding eukaryotic ribosomal <400> 2 ccatggtggc 10 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter region of plasmid DNA for RNA polymerase <400> 3 atccctatag tgagtcgtat ta 22

Claims

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특정 단백질 발현을 위한 유전정보를 담고 있는 염기서열을 포함하는 DNA를 생성하는 DNA생성단계와; 상기 DNA를 RNA중합효소를 사용하여 전사시킴으로써 특정 단백질의 발현을 위한 반복되는 염기서열을 포함하는 단일 가닥의 전령 RNA를 생성하는 전사단계와; 상기 단일 가닥의 전령 RNA를 포함하는 반응용액을 37℃로 20시간 동안 인큐베이팅하여, 상기 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉키면서 자가 조립을 통해 전령 RNA 나노입자를 형성하도록 하는 자가조립단계;를 포함하며,
상기 DNA는 원형의 이중 가닥 플라스미드 DNA이고,
상기 플라스미드 DNA는 1 내지 5nM이 사용되는 것을 특징으로 하는 전령 RNA 나노입자의 제조방법.
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제5항에 있어서, 상기 DNA는
RNA중합효소의 중합을 위한 프로모터 영역 염기서열과, 리보솜결합 염기서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 전령 RNA 나노입자의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 DNA생성단계에서는
RNA중합효소의 중합을 위한 프로모터 영역 염기서열과, 리보솜결합 염기서열과, 특정 단백질 발현을 위한 유전정보를 담고 있는 염기서열을 순서대로 포함하는 원형의 이중 가닥 플라스미드 DNA가 생성되는 것을 특징으로 하는 전령 RNA 나노입자의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 단일 가닥의 전령 RNA는
롤링 서클 전사에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 전령 RNA 나노입자의 제조방법.
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