KR102122336B1 - 세포전환용 rna 나노입자를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법 - Google Patents

세포전환용 rna 나노입자를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유도만능줄기세포의 제조방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 유도하는 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA, 상기 역분화 과정을 촉진하는 마이크로 RNA, 작은 간섭 RNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 포함하는 자가조립된 RNA 나노입자를 이용하여 유도만능줄기세포를 제조함으로써 유전자의 변형 없이 효과적으로 세포전환을 수행할 수 있으며, 구조적 특성 및 활성도를 조절함으로써 iPSCs의 생산 효율을 극대화시킬 수 있고, 무한 복제 공정을 적용하여 RNA 나노입자에 고농도의 RNA를 포함시킴으로써 낮은 유전자 탑재 효율을 극복할 수 있는 세포전환용 RNA 나노입자를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법에 대한 것이다.

Description

세포전환용 RNA 나노입자를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법{Method for preparing iPSCs using RNA nanoparticle}
본 발명은 유도만능줄기세포의 제조방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 유도하는 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA, 상기 역분화 과정을 촉진하는 마이크로 RNA, 작은 간섭 RNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 포함하는 자가조립된 RNA 나노입자를 이용하여 유도만능줄기세포를 제조함으로써 유전자의 변형 없이 효과적으로 세포전환을 수행할 수 있으며, 구조적 특성 및 활성도를 조절함으로써 iPSCs의 생산 효율을 극대화시킬 수 있고, 무한 복제 공정을 적용하여 RNA 나노입자에 고농도의 RNA를 포함시킴으로써 낮은 유전자 탑재 효율을 극복할 수 있는 세포전환용 RNA 나노입자를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법에 대한 것이다.
유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)란 특정한 유전자를 인위적으로 발현시켜, 비만능세포인 성체 체세포를 인공적으로 만능성을 유도하여 만들어진 만능줄기세포로, 인간 체세포 또는 성체줄기세포의 iPSCs로의 역분화는 일반적으로 4종의 전사인자(Oct4, Sox2, cMyc, Klf4)를 포함하는 유전자의 전달로 이루어진다. 예컨대, 전사인자를 포함하는 유전자를 체세포에 전달하는 것은, 하기의 특허문헌에 기재된 것처럼 바이러스를 통해 상기 유전자를 체세포에 전달할 수 있다.
<특허문헌>
국제특허공개공보 WO2013177133(2012. 05. 21. 공개) "Generation of human iPS cells by a synthetic self-replicative RNA"
하지만, 바이러스를 이용하여 전사인자 유전자를 체세포에 전달하는 방법은, 대상 세포의 염색체 안으로 바이러스 유전자가 끼어 들어가게 되므로 예상치 못한 유전체 변이를 유발해 iPSCs를 임상에 적용할 때 암 발생 위험을 높이고, 생성된 iPSCs는 배아줄기세포에 비하여 원하는 계통의 세포로 분화되는 과정을 조절하기 어려운 문제가 있다. 위와 같은 문제를 해결하기 위해, episomal 플라스미드 DNA 또는 minicircle DNA를 전달하는 방법, 염색체 비삽입형 바이러스인 Sendai 바이러스를 이용하는 방법, 전령 RNA나 단백질을 직접 전달하는 방법 등을 고려할 수 있으나, 위 방법 역시 염색체 삽입 문제를 배제할 수 없거나, iPSCs의 생성 효율이 낮거나, 세포 독성을 유발하는 등의 문제가 발생한다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 유도하는 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA, 상기 역분화 과정을 촉진하는 마이크로 RNA, 작은 간섭 RNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 포함하는 RNA 나노입자를 이용하여 유도만능줄기세포를 제조함으로써, 유전자의 변형 없이 효과적으로 세포전환을 수행할 수 있는 세포전환용 RNA 나노입자를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 구조적 특성(나노입자 형태를 가짐) 및 활성도(다양한 기능을 하는 RNA가 동시에 포함)를 조절함으로써, iPSCs의 생산 효율을 극대화시킬 수 있는 세포전환용 RNA 나노입자를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 무한 복제 공정을 적용하여 RNA 나노입자에 고농도의 RNA를 포함시킴으로써, 낮은 유전자 탑재 효율을 극복할 수 있는 세포전환용 RNA 나노입자를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법은 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하거나 역분화를 촉진하는 세포전환용 RNA 나노입자를 체세포 또는 성체줄기세포에 전달하는 전달단계와, 상기 전달단계 후 세포전환용 RNA 나노입자가 전달된 세포를 배양함으로써 유도만능줄기세포를 생성하는 배양단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법에 있어서 상기 세포전환용 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA, 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법에 있어서 상기 세포전환용 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA 나노입자, 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 나노입자, 역분화를 촉진하는 작은 간섭 RNA 나노입자, 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 및 역분화를 촉진하는 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자, 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA 및 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자, 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA 및 역분화를 촉진하는 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자, 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA, 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 및 역분화를 촉진하는 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA 나노입자가 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법에 있어서 상기 세포전환용 RNA 나노입자는 구의 형태를 가지고 50 내지 200nm의 직경을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법에 있어서 상기 세포전환용 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA 나노입자, 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 및 역분화를 촉진하는 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자, 및 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA 및 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법에 있어서 상기 전령 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전사인자의 발현을 위한 반복되는 전령 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 플라스미드 DNA를 생성하는 pDNA생성단계와; 상기 플라스미드 DNA와 RNA 중합효소를 포함하는 반응 용액을 일정 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, 상기 RNA 중합효소를 통해 상기 플라스미드 DNA를 롤링 서클 전사시켜 전사인자 발현을 위한 반복되는 전령 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 전령 RNA를 생성하고, 생성된 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉기면서 자가 조립되도록 하여 나노입자를 형성하는 입자형성단계를 거쳐 생성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법에 있어서 상기 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 및 역분화를 촉진하는 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되는 것을 촉진하기 위한, 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열과, 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열인 si 상보 염기 서열을 포함하는 ssDNA와, 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 제1원형의 DNA를 생성하는 제1원형DNA생성단계와; 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열과, 상기 si 상보 염기 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와, 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 제2원형의 DNA를 생성하는 제2원형DNA생성단계와; 상기 제1원형의 DNA, 제2원형의 DNA 및 RNA 중합효소를 포함하는 반응용액을 일정 온도에 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, RNA 중합효소를 통해 상기 제1원형의 DNA 및 제2원형의 DNA를 각각 롤링 서클 전사시켜, 반복되는 마이크로 RNA 염기서열 및 작은 간섭 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 제1RNA와, 반복되는 마이크로 RNA 염기서열 및 상기 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 제2RNA를 형성하고, 상기 제1RNA와 제2RNA가 부분적으로 상보 결합하여 엉기면서 자기조립되도록 하여 나노입자를 형성하는 입자형성단계;를 거쳐 생성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법에 있어서 상기 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA 및 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자는 전사인자의 발현을 위한 전령 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열, 및 마이크로 RNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열인 제1결합염기서열을 포함하는 플라스미드 DNA를 생성하는 pDNA생성단계와; 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열 및 제1결합염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 원형의 DNA를 생성하는 원형DNA생성단계와; 상기 플라스미드 DNA, 원형의 DNA 및 RNA 중합효소를 포함하는 반응용액을 일정 온도에 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, RNA 중합효소를 이용하여 상기 플라스미드 DNA 및 원형의 DNA를 각각 롤링 서클 전사시켜, 반복되는 전령 RNA 염기서열 및 제1결합염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 제1RNA와, 반복되는 마이크로 RNA 염기서열 및 제2결합염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 제2RNA를 형성하고, 상기 제1RNA와 제2RNA가 부분적으로 상보적 결합하여 엉기면서 자기조립되도록 하여 나노입자를 형성하는 입자형성단계;를 거쳐 생성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법에 있어서 상기 유도만능줄기세포의 제조방법은 상기 전달단계 전에 선천면역반응을 억제하는 단백질을 상기 RNA 나노입자에 로딩하는 로딩단계로 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유도만능줄기세포의 제조방법에 있어서 상기 전달단계는 전기 천공법 또는 양전하 고분자를 이용한 방법이 이용되며, 상기 전기 천공법은 체세포 또는 성체줄기세포를 재부유 버퍼로 부유시키고 RNA 나노입자를 첨가한 후 전기충격을 가하여 수행되고, 상기 양전하 고분자를 이용하는 방법은 체세포 또는 성체줄기세포를 배양 접시에 분주하고 성장배지를 첨가하여 일정 시간 배양한 후, RNA 나노입자를 양전하 고분자와 혼합하여 형성한 복합체를 성장배지에 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 유도하는 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA, 상기 역분화 과정을 촉진하는 마이크로 RNA, 작은 간섭 RNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 포함하는 RNA 나노입자를 이용하여 유도만능줄기세포를 제조함으로써, 유전자의 변형 없이 효과적으로 세포전환을 수행할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 구조적 특성(나노입자 형태를 가짐) 및 활성도(다양한 기능을 하는 RNA가 동시에 포함)를 조절함으로써, iPSCs의 생산 효율을 극대화시킬 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 무한 복제 공정을 적용하여 RNA 나노입자에 고농도의 RNA를 포함시킴으로써, 낮은 유전자 탑재 효율을 극복할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 전령 RNA 나노입자 제조단계를 설명하기 위한 참고도.
도 2는 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자 제조단계를 설명하기 위한 참고도.
도 3은 전령 RNA 나노입자의 전자주사현미경 이미지 및 나노입자추적시스템의 측정결과를 나타내는 도표.
도 4는 전령 RNA 나노입자의 전사인자 발현을 확인하기 위한 광학 현미경 이미지.
도 5 및 6은 전령 RNA 나노입자의 iPSCs 형성을 확인하기 위한 광학 현미경 이미지.
도 7은 마이크로 RNA 나노입자에 대한 젤 전기영동법 수행 결과를 나타내는 이미지.
도 8은 마이크로 RNA 나노입자에 대한 전자주사현미경 이미지 및 DLS를 이용한 분석 결과를 나타내는 도표.
도 9는 마이크로 RNA 나노입자의 체내 안정성을 확인하기 위한 젤 전기영동법 수행 결과를 나타내는 이미지.
도 10은 마이크로 RNA 나노입자의 Dicer 효소에 의한 마이크로 RNA 방출량을 확인하기 위한 젤 전기영동법 수행 결과를 나타내는 이미지.
도 11은 복합 RNA 나노입자의 세포 전환 촉진을 확인하기 위한 qPCR 분석결과를 나타내는 도표.
도 12는 복합 RNA 나노입자의 세포 전환 촉진을 확인하기 위한 젤 전기영동법 수행 결과를 나타내는 이미지.
이하에서는 본 발명에 따른 세포전환용 RNA 나노입자를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법을 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포전환용 RNA 나노입자를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법을 도 1 내지 12를 참조하여 설명하면, 상기 유도만능줄기세포의 제조방법은 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하거나 역분화를 촉진하는 세포전환용 RNA 나노입자를 제조하는 입자제조단계와, 상기 입자제조단계에서 제조된 세포전환용 RNA 나노입자를 체세포 또는 성체줄기세포에 전달하는 전달단계와, 상기 전달단계 후 세포전환용 RNA 나노입자가 전달된 세포를 배양함으로써 iPSCs를 생성하는 배양단계를 포함한다.
상기 입자제조단계는 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하거나 역분화를 촉진하는 세포전환용 RNA 나노입자를 제조하는 단계로, 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA, 상기 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 RNA를 포함하는 RNA 나노입자가 제조되게 된다. 상기 입자제조단계에서 제조된 RNA 나노입자는 예컨대, 전령 RNA 나노입자, 마이크로 RNA 나노입자, 작은 간섭 RNA 나노입자, 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자, 전령 RNA 및 마이크로 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자, 전령 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자, 전령 RNA, 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자를 포함하며, 체세포 및 성체줄기세포에 도입되어 상기 세포를 iPSCs로 전환하거나 그 전환을 촉진하게 된다. 상기 세포전환용 RNA 나노입자는 일정한 형태와 크기를 가지나 바람직하게는 전체적으로 구의 형태를 가지고 50 내지 200nm의 직경을 가지며, 생체물질로만 이루어져 체내 독성이 없으며, 체내 환경에서 안정하여 오랫동안 지속적으로 기능성 RNA(mRNA, miRNA, siRNA)를 방출할 수 있다. 상기 입자제조단계는 전령 RNA 나노입자의 제조단계, 마이크로 RNA 나노입자의 제조단계, 작은 간섭 RNA 나노입자의 제조단계, 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자의 제조단계, 전령 RNA 및 마이크로 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자의 제조단계, 전령 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자의 제조단계, 전령 RNA, 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자의 제조단계 등을 포함한다.
상기 전령 RNA 나노입자 제조단계는 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전사인자(예컨대, Oct4, Sox2, cMyc, LMyc, Klf4, Lin28 등)의 발현을 위한 반복되는 전령 RNA를 포함하는 전령 RNA 나노입자를 제조하는 단계로, 전사인자의 발현을 위한 전령 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열, RNA로부터 단백질이 번역될 때 필수적인 요소인 리보솜 결합 염기서열 및 T7 RNA 중합효소를 위한 프로모터 염기서열을 포함하는 원형의 이중 가닥 플라스미드 DNA를 생성하는 pDNA생성단계와, 상기 플라스미드 DNA와 RNA 중합효소 등을 포함하는 반응 용액을 일정 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, RNA 중합효소를 이용하여 상기 플라스미드 DNA를 롤링 서클 전사(Rolling circle transcription, RCT)시켜 전사인자 발현을 위한 반복되는 전령 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 전령 RNA를 생성하고, 생성된 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉기면서 자가 조립을 통해 전령 RNA 나노입자를 형성하는 입자형성단계를 등을 포함한다.
상기 마이크로 RNA 나노입자 제조단계는 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되는 것을 촉진하기 위한 반복되는 마이크로 RNA(예컨대, miRNA-302a/b/c/d, 367, 369 등)를 포함하는 마이크로 RNA 나노입자를 제조하는 단계로, 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 원형의 DNA를 생성하는 원형DNA생성단계와, 상기 원형의 DNA와 RNA 중합효소 등을 포함하는 반응 용액을 일정 온도에 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, RNA 중합효소를 이용하여 상기 원형의 DNA를 롤링 서클 전사(Rolling circle transcription, RCT)시켜 반복되는 마이크로 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 마이크로 RNA를 생성하고, 생성된 단일 가닥의 마이크로 RNA가 서로 꼬이고 엉기면서 자가 조립을 통해 마이크로 RNA 나노입자를 형성하는 입자형성단계를 등을 포함한다.
상기 작은 간섭 RNA 나노입자 제조단계는 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되는 것을 촉진하기 위한 반복되는 작은 간섭 RNA(예컨대, p53 siRNA 등)를 포함하는 작은 간섭 RNA 나노입자를 제조하는 단계로, 헤어핀 형태의 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 헤어핀 형태의 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 원형의 DNA를 생성하는 원형DNA생성단계와, 상기 원형의 DNA와 RNA 중합효소 등을 포함하는 반응 용액을 일정 온도에 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, RNA 중합효소를 이용하여 상기 원형의 DNA를 롤링 서클 전사(Rolling circle transcription, RCT)시켜 반복되는 헤어핀 형태의 작은 간섭 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 작은 간섭 RNA를 생성하고, 생성된 단일 가닥의 작은 간섭 RNA가 서로 꼬이고 엉기면서 자가 조립을 통해 작은 간섭 RNA 나노입자를 형성하는 입자형성단계를 등을 포함한다. 상기 마이크로 RNA 및/또는 작은 간섭 RNA는 그 자체로 역분화를 일으키지는 않지만, 종래의 방법에 의해 또는 전령 RNA 나노입자를 이용하는 방법 등에 추가적으로 사용될 경우 역분화를 촉진하게 된다.
상기 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자 제조단계는 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되는 것을 촉진하기 위한 반복되는 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자를 제조하는 단계로, 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되는 것을 촉진하기 위한, 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열과, 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열(이하, 'si 상보 염기 서열'이라 함)을 포함하는 ssDNA와, 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 제1원형의 DNA를 생성하는 제1원형DNA생성단계와, 추가적인 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열과, 상기 si 상보 염기 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와, 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 제2원형의 DNA를 생성하는 제2원형DNA생성단계와, 상기 제1원형의 DNA, 제2원형의 DNA 및 RNA 중합효소 등을 포함하는 반응용액을 일정 온도에 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, RNA 중합효소를 이용하여 상기 제1원형의 DNA 및 제2원형의 DNA를 각각 롤링 서클 전사(Rolling circle transcription, RCT)시켜, 반복되는 마이크로 RNA 염기서열 및 작은 간섭 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 제1RNA와, 반복되는 마이크로 RNA 염기서열 및 상기 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 제2RNA를 형성하고, 상기 제1RNA와 제2RNA가 부분적으로 상보 결합하여(상기 제1RNA와 제2RNA의 작은 간섭 RNA 부분이 선택적으로 상보 결합이 이루어짐) 엉기면서 자기조립을 통해 나노입자를 형성하는 입자형성단계를 포함한다.
상기 전령 RNA 및 마이크로 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자 제조단계는 체세포 및 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전령 RNA 및 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자를 제조하는 단계로, 전사인자의 발현을 위한 전령 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열, RNA로부터 단백질이 번역될 때 필수적인 요소인 리보솜 결합 염기서열, T7 RNA 중합효소를 위한 프로모터 염기서열 및 마이크로 RNA와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열(이하, '제1결합염기서열'이라 함)을 포함하는 원형의 이중 가닥 플라스미드 DNA를 생성하는 pDNA생성단계와, 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열 및 제1결합염기서열과 상보적인 염기서열(이하, '제2결합염기서열'이라 함)을 포함하는 원형의 DNA를 생성하는 원형DNA생성단계와, 상기 플라스미드 DNA, 원형의 DNA 및 RNA 중합효소 등을 포함하는 반응용액을 일정 온도에 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, RNA 중합효소를 이용하여 상기 플라스미드 DNA 및 원형의 DNA를 각각 롤링 서클 전사(Rolling circle transcription, RCT)시켜, 반복되는 전령 RNA 염기서열 및 제1결합염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 제1RNA와, 반복되는 마이크로 RNA 염기서열 및 제2결합염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 제2RNA를 형성하고, 상기 제1RNA와 제2RNA가 부분적으로 상보적 결합하여(상기 제1RNA의 제1결합염기서열과 제2RNA의 제2결합염기서열 부분이 선택적으로 상보 결합이 이루어짐) 엉기면서 자기조립을 통해 나노입자를 형성하는 입자형성단계를 포함한다.
상기 전령 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자는 마이크로 RNA와 상보적인 염기서열 대신에 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 사용하는 것을 제외하고는 다른 조건을 상기 전령 RNA 및 마이크로 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자 제조단계와 동일하게 하여 제조될 수 있다.
상기 전령 RNA, 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자의 제조방법은 상기 플라스미드 DNA, 제1원형의 DNA 및 제2원형의 DNA를 제조하고 RNA 중합효소를 사용하여 롤링 서클 전사시켜 자가조립되도록 하여 나노입자를 형성할 수 있다.
상기 전달단계는 상기 입자제조단계에서 제조된 세포전환용 RNA 나노입자를 체세포 또는 성체줄기세포에 전달하는 단계로, 예컨대 전기 천공법 또는 양전하 고분자를 이용하여 세포전환용 RNA 나노입자를 세포에 전달할 수 있다.
상기 전기 천공법은 체세포 또는 성체줄기세포를 resuspension buffer로 부유시키고 RNA 나노입자를 첨가한 후 Neon Transfection System을 전기충격을 가하여 수행될 수 있으며, 상기 양전하 고분자를 이용하는 방법은 체세포 또는 성체줄기세포를 배양 접시에 분주하고 성장배지를 첨가하여 일정 시간 배양한 후, RNA 나노입자를 양전하 고분자인 기반 transfection reagent(TransIT- X2 Delivery System, Mirus)와 혼합하여 복합체를 생성시키고 이를 세포 배양 배지에 첨가하여 수행될 수 있다.
상기 배양단계는 상기 전달단계 후 세포전환용 RNA 나노입자가 전달된 세포를 일정 온도에서 일정 시간 배양함으로써 iPSCs를 생성하는 배양단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예는 입자제조단계와 전달단계 사이에 선천면역반응을 억제하는 단백질을 상기 RNA 나노입자에 로딩하는 로딩단계로 추가로 포함할 수 있다. 상기 로딩단계에서 상기 단백질은 종래의 여러 방법에 의해 상기 나노입자에 로딩될 수 있는데, 예컨대 입자제조단계에서 형성된 나노입자를 세포막 수용체에 결합하여 IFN-β 신호전달경로에 따른 선천면역반응을 억제하는 단백질이 분산된 용액에 일정 시간 담지하여 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포전환용 전령 RNA 나노입자의 제조
1. T7 RNA 중합효소를 위한 프로모터 염기서열(서열번호:1), RNA로부터 단백질이 번역될 때 필수적인 요소인 리보솜 결합 염기서열(서열번호:2), 및 전사인자 중 핵심적인 역할을 하는 Oct4의 발현을 위한 전령 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:3)을 포함하는 플라스미드 DNA(TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCAAATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCATCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCAACGCGATGACGATGGATAGCGATTCATCGATGAGCTGACCCGATCGCCGCCGCCGGAGGGTTGCGTTTGAGACGGGCGACAGATGAGGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCGAACCCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGC-TAATACGACTCACTATAG(서열번호:1)-GGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA-GCCACCATGG(서열번호:2)-
ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTTGGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTGGGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCTGAGGGATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTACCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC)를 설계하였다.
2. 상기 플라스미드 DNA 1nM, ribonucleotide solution mix(New England Biolabs) 1mM, Reaction buffer(8mM Tris-HCl, 0.4mM spermidine, 1.2mM MgCl2, and 2mM dithiothreitol), 50 units ml-1 of T7 RNA polymerase(New England Biolabs)를 튜브에 넣어 혼합하고, 상기 튜브를 인큐베이터에 넣고 37℃에서 20시간 반응시켜 세포전환용 전령 RNA 나노입자를 제조하였다.
<실시예 2> 세포전환용 전령 RNA 나노입자의 형태, 크기 및 분포 확인
실시예 1에서 제조된 세포전환용 전령 RNA 나노입자를 전자주사현미경을 이용하여 크기 및 형태를 측정한 결과를 도 3에 나타내었고, 개개의 입자의 브라운 운동(Brownian motion)을 기록하여 나노입자의 농도, 크기 및 크기 분포를 확인할 수 있는 나노입자추적시스템(NTA; Nanoparticle tracking analysis)을 이용하여 측정한 결과를 함께 도 3에 나타내었다. 도 3으로부터, 100 ~ 200nm의 직경을 가지며 구형의 형태를 가지는 나노입자를 확인할 수 있다.
<실시예 3> 세포전환용 전령 RNA 나노입자의 전사인자 발현의 확인
1. 인간 섬유아세포(Human dermal fibroblast, HDF)를 resuspension buffer R(Thermo Fisher)로 부유시키고 특정 전사인자를 encoding하는 플라스미드 벡터들을 첨가한 후 Neon Transfection System(Thermo Fisher)를 이용하여 전기충격(pulse voltage, pulse width, pulse number는 각각 1650V, 10ms, 3임)을 가하고, 전기천공을 거친 HDF를 젤라틴이 코팅된 배양 접시에 분주하고 실시예 1에서 제조된 세포전환용 전령 RNA 나노입자와 TransIT-X2 reagent를 혼합하여 만든 복합체를 처리한 후, 면역염색법을 이용하여 Oct4 단백질 발현을 확인하였다. Oct4 단백질 발현은 벡터 또는 나노입자 최종 전달 후 48시간이 지난 후 광학 현미경을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 (a)는 전사인자 Oct4, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들이 전달된 HDF를 측정한 결과를 나타내며, 도 4의 (b)는 전사인자 Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들이 전달된 HDF를 측정한 결과를 나타내고, 도 4의 (c)는 Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들이 전달된 후 실시예 1에서 제조된 세포전환용 전령 RNA 나노입자가 추가적으로 전달된 HDF를 측정한 결과를 나타낸다.
2. 도 4를 보면, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들이 전달된 경우(도 4의 (b) 참조)와는 다르게, 전령 RNA 나노입자가 추가적으로 전달된 경우(도 4의 (c) 참조)에는 Oct4를 플라스미드 벡터로 전달한 경우(도 4의 (a) 참조)와 유사하게 Oct4의 발현(녹색 형광)이 관찰되어, 세포전환용 전령 RNA 나노입자가 전사인자를 발현시킴을 알 수 있다.
<실시예 4> 세포전환용 전령 RNA 나노입자의 전달을 통한 iPSCs 형성의 확인 1
1. 전사인자를 encoding하는 플라스미드 벡터들과 함께 실시예 1에서 제조된 전령 RNA 나노입자(18ug)를 전기천공법으로 전달한 HDF를 10% 소혈청(fetal bovine serum, FBS)를 포함하는 DMEM(성장배지)에서 배양하고, HDF를 Matrigel이 코팅된 배양접시에 분주하고 E8 medium을 매일 교체해주며 iPSCs 형성을 확인하였다. iPSCs 형성은 벡터 또는 나노입자 최종 전달 후 10일 지난 후 광학 현미경을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 (a)는 전사인자 Oct4, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들이 전달된 HDF를 측정한 결과를 나타내며, 도 5의 (b)는 전사인자 Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들이 전달된 HDF를 측정한 결과를 나타내고, 도 5의 (c)는 Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들과 함께 세포전환용 전령 RNA 나노입자가 추가적으로 전달된 HDF를 측정한 결과를 나타낸다.
2. 도 5를 보면, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들이 전달된 경우(도 5의 (b) 참조)와는 다르게, 전령 RNA 나노입자가 추가적으로 전달된 경우(도 5의 (c) 참조)에는 Oct4를 플라스미드 벡터로 전달한 경우(도 5의 (a) 참조)와 유사하게 역분화 과정 중 변형된 세포 집단인 fake colonies가 관찰됨을 확인할 수 있어(도 5의 (a) 및 (c)에서 화살표 참조), 상기 세포전환용 전령 RNA 나노입자를 이용하여 유도만능줄기세포의 생산이 가능함을 알 수 있다.
<실시예 5> 세포전환용 전령 RNA 나노입자의 전달을 통한 iPSCs 형성의 확인 2
1. 전사인자를 encoding하는 플라스미드 벡터들과 함께 실시예 1에서 제조된 전령 RNA 나노입자(30ug)를 전기천공법으로 전달한 HDF를 10% 소혈청(fetal bovine serum, FBS)를 포함하는 DMEM(성장배지)에서 배양하고, HDF를 MEF feeder 세포 위에 분주하고 E8 medium을 매일 교체해주며 iPSCs 형성을 확인하였다. iPSCs 형성은 벡터 또는 나노입자 최종 전달 후 5일 지난 후 광학 현미경을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6의 (a)는 전사인자 Oct4, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들이 전달된 HDF를 측정한 결과를 나타내며, 도 6의 (b)는 전사인자 Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들이 전달된 HDF를 측정한 결과를 나타내고, 도 6의 (c)는 Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들과 함께 세포전환용 전령 RNA 나노입자가 추가적으로 전달된 HDF를 측정한 결과를 나타낸다.
2. 도 6을 보면, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 encoding하는 플라스미드 벡터들이 전달된 경우(도 6의 (b) 참조)와는 다르게, 전령 RNA 나노입자가 추가적으로 전달된 경우(도 6의 (c) 참조)에는 Oct4를 플라스미드 벡터로 전달한 경우(도 6의 (a) 참조)와 유사하게 역분화 과정에서 관찰되는 MET(mesenchymal-epithelial transition)가 관찰됨을 확인할 수 있어(도 6의 (c)에서 화살표 참조), 상기 세포전환용 전령 RNA 나노입자를 이용하여 유도만능줄기세포의 생산이 가능함을 알 수 있다.
3. 한편, Oct4는 역분화의 핵심적인 역할을 하는 전사 인자(master regulator)로서 여러 연구에서 Sox2, cMyc, Klf4, Lin28 등과 같은 다른 요소들에 비해 대체가 불가능하고 역분화 과정 중 비교적 높은 양이 유지되어야 하는 것으로 알려진 바 있는 만큼, 실시예 1 내지 5를 통해 Oct4를 전령RNA 나노입자로 전달하여 역분화가 가능함을 확인하였으므로, 나머지 전사인자 모두를 전령RNA 나노입자로 전달하여 iPSCs를 생성시키는 것이 가능할 것으로 판단된다.
<실시예 6> 세포전환용 마이크로 RNA 나노입자의 제조 및 특성 확인
1. 마이크로 RNA 34a 나노입자의 제조
(1) 양 말단에 프로모터와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 중앙에 마이크로 RNA 34a 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:5)을 가지는 ssDNA[5'-Phosphate--ATAGTGAGTCGTATTA(서열번호:4)-ACGTACCAAAGGGCAGTATACTTGCTGATTGTTACTTGAAACAACCAGCTAAGACACTGCCATTGAGGCA(서열번호:5)-ATCCCT(서열번호:6)-3']를 설계하였다. 또한, 프로모터[5'-TAATACGACTCACTATAGGGAT-3'(서열번호:7)]를 설계하였다.
(2) 상기 ssDNA 1μM과 프로모터 DNA 1μM을 뉴클라아제 프리 워터(nuclease free water)에 혼합하고, PCR thermal cycler를 사용하여 95℃로 2분 동안 가열하고 1시간 동안 점진적으로 25℃까지 냉각한다. 상기 과정에서 ssDNA의 양 말단은 프로모터 DNA와 상보적으로 결합하여 원형의 DNA가 형성되게 된다. 이후, 원형의 DNA에서 닉(nick)을 리게이트(ligate) 하기 위해, T4 Ligase 006Uμl-1, Ligase buffer(50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT and 1mM ATP)를 혼합하고 상온에서 하루 밤 동안 배양하여 완전한 원형의 DNA(Circular DNA)를 생성하였다.
(3) 상기 원형의 DNA 0.03μM, Ribonucleotide Solution Mix(25mM of each NTP) 2mM each, 2X Reaction buffer(400mM Tris-HCl, 20mM spermidine, 60mM MgCl2, 100mM dithiothreitol), T7 RNA polymerase 5 unit μl-1을 혼합하여 반응용액을 생성하고, 상기 반응용액을 20시간 동안 37℃의 온도로 배양하여 마이크로 RNA 나노입자(miR34a-NP)를 제작하였다.
2. 마이크로 RNA 302a 나노입자의 제조
양 말단에 프로모터와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 중앙에 마이크로 RNA 302a 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:8)을 가지는 ssDNA[5'-Phosphate--ATAGTGAGTCGTATTA(서열번호:4)-ACTCCTACTAAAACATGGAAGCACTTACTTTTAAAGTCACAGAAAGCACTTCCATGTTAAAGTTGAAGGGAGC(서열번호:8)-ATCCCT(서열번호:6)-3']를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 6의 1과 동일하게 하여 마이크로 RNA 나노입자를 제작하였다.
3. 마이크로 RNA의 특성 확인
(1) 실시예 6의 1에서 제조된 원형의 DNA(Circular DNA), 마이크로 RNA 나노입자(miR34a-NP)에 대해 젤 전기영동법을 수행하여 도 7에 나타내었다. 또한, 실시예 6의 1에서 제조된 마이크로 RNA 나노입자에 대해, 전자 주사 현미경으로 확인하여 도 8의 (a)에 나타내었고, 동적빛산란(Dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 분석한 결과를 도 8의 (b)에 나타내었다. 또한, 마이크로 RNA의 체내 안정성을 확인하기 위해, FBS가 10% 포함된 세포 배양 환경에서 실시예 6의 1에서 제조된 마이크로 RNA 나노입자를 인큐베이션한 뒤 젤 전기영동법을 수행하여 그 결과를 도 9에 나타내었다(도 9에서 M은 dsRNA ladder의 결과, 1은 miR34a-NP를 0시간 배양 결과(band intensity는 1.00임), 2는 12시간 배양 결과(band intensity는 0.81임), 3은 24시간 배양 결과(band intensity는 0.87임)를 나타냄). 또한, 마이크로 RNA 나노입자가 Dicer 효소에 의해 잘려 기능성 마이크로 RNA가 방출되는지 확인하기 위해, 실시예 6의 1에서 제조된 마이크로 RNA 나노입자와 Dicer를 함께 인큐베이션한 후 젤 전기영동법을 수행하여 그 결과를 도 10에 나타내었다(도 10에서 M은 siRNA marker의 결과, 1은 miR34a-NP를 0시간 배양 결과(band intensity는 1.00임), 2는 12시간 배양 결과(band intensity는 0.80임), 3은 24시간 배양 결과(band intensity는 0.62임), 4는 48시간 배양 결과(band intensity는 0.55)를 나타냄).
(2) 도 7를 통해 나노입자 형태로 다량체의 마이크로 RNA가 자가조립되어 분자량이 크게 증가된 것을 확인할 수 있으며, 도 8을 통해 마이크로 RNA 입자는 세포 내 섭취가 용이한 약 100nm 의 크기를 가지며 표면이 매끄러운 구형의 형태임을 확인할 수 있고 분산도 값이 약 0.2로 입자들이 고른 크기 분포를 가지는 것을 확인할 수 있고, 도 9를 통해 RNA 가닥들은 체내 환경에서 수 분 내에 분해되나 마이크로 RNA 나노입자의 경우 24시간 후에도 80% 이상이 분해되지 않고 분자량이 큰 상태를 유지하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 10을 통해, Dicer 효소 처리 후 시간이 지남에 따라 마이크로RNA 나노입자는 RNA를 방출하고 분자량이 낮아지는 것을 확인할 수 있으며, 특히, 48시간이 지난 뒤에도 약 40% 이상의 마이크로 RNA 나노입자가 높은 분자량을 유지하고 있음을 알 수 있어 마이크로 RNA 나노입자가 세포 내 환경에서 오랫동안 지속적으로 마이크로 RNA를 방출할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 7> 세포전환용 복합 RNA 나노입자의 제조
1. miRNA-302a 및 p53 siRNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자의 제조
(1) 양 말단에 프로모터와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 중앙에 siRNA p53 염기서열과 상보적인 염기서열(si 상보염기서열, 서열번호:9)이 두 차례 반복되는 사이에 마이크로 RNA 302a-5p 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:10)을 가지는 ssDNA[5'-Phosphate-ATAGTGAGTCGTATTA(서열번호:4)-AAGTAGATTACCACTGGAGTCTT(서열번호:9)-AGCAAGTACATCCACGTTTAAGT(서열번호:10)-AAGTAGATTACCACTGGAGTCTT(서열번호:9)-ATCCCT(서열번호:6)-3']를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 6의 1의 (1) 및 (2)와 동일하게 하여 원형의 DNA(제1원형 DNA)를 제조하였다.
(2) 양 말단에 프로모터와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 중앙에 si 상보염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:11)이 두 차례 반복되는 사이에 마이크로 RNA 302a-3p 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:12)을 가지는 ssDNA[5'-Phosphate-ATAGTGAGTCGTATTA(서열번호:4)-AAGACTCCAGTGGTAATCTACTT(서열번호:11)-TCACCAAAACATGGAAGCACTTA(서열번호:12)-AAGACTCCAGTGGTAATCTACTT(서열번호:11)-ATCCCT(서열번호:6)-3']를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 6의 1의 (1) 및 (2)와 동일하게 하여 원형의 DNA(제2원형 DNA)를 제조하였다.
(3) 제1원형 DNA 2.5μM, 제2원형 DNA 2.5μM, Ribonucleotide Solution Mix(25mM of each NTP) 2mM each, 2X Reaction buffer(400mM Tris-HCl, 20mM spermidine, 60mM MgCl2, 100mM dithiothreitol), T7 RNA polymerase 80 unit μl-1을 혼합하여 반응용액을 생성하고, 상기 반응용액을 20시간 동안 37℃의 온도로 배양하여 마이크로 RNA 및 si RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자를 제작하였다.
2. miRNA-302a/b/c/d, 367, 369 및 p53 siRNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자의 제조
(1) 양 말단에 프로모터와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, siRNA p53-sense 염기서열과 상보적인 염기서열(siP53-sense 상보염기서열), 마이크로 RNA 302a-3p 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:12), siP53-sense 상보염기서열, 마이크로 RNA 302b 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:13), siP53-sense 상보염기서열, 마이크로 RNA 367 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:14), siP53-sense 상보염기서열이 순서대로 반복된 ssDNA[5'-Phosphate-ATAGTGAGTCGTATTA(서열번호:4)-AAGTAGATTACCACTGGAGTCTT(서열번호:9)-TCACCAAAACATGGAAGCACTTA(서열번호:12)-AAGTAGATTACCACTGGAGTCTT(서열번호:9)-CTACTAAAACATGGAAGCACTTA(서열번호:13)-AAGTAGATTACCACTGGAGTCTT(서열번호:9)-TCACCATTGCTAAAGTGCAATTC(서열번호:14)-AAGTAGATTACCACTGGAGTCTT(서열번호:9)-ATCCCT(서열번호:6)-3']를 사용하여 원형의 DNA(제1원형 DNA)를 제조하고, 양 말단에 프로모터와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, siRNA p53-antisense 염기서열과 상보적인 염기서열(siP53-antisense 상보염기서열), 마이크로 RNA 302d 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:15), siP53-antisense 상보염기서열, 마이크로 RNA 369 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:16), siP53-antisense 상보염기서열, 마이크로 RNA 302c 염기서열과 상보적인 염기서열(서열번호:17), siP53-antisense 상보염기서열이 순서대로 반복된 ssDNA[5'-Phosphate-ATAGTGAGTCGTATTA(서열번호:4)-AAGACTCCAGTGGTAATCTACTT(서열번호:11)-ACACTCAAACATGGAAGCACTTA(서열번호:15)-AAGACTCCAGTGGTAATCTACTT(서열번호:11)-GAAAAGATCAACCATGTATTATT(서열번호:16)-AAGACTCCAGTGGTAATCTACTT(서열번호:11)-CCACTGAAACATGGAAGCACTTA(서열번호:17)-AAGACTCCAGTGGTAATCTACTT(서열번호:11)-ATCCCT(서열번호:6)-3']를 사용하여 원형의 DNA(제2원형 DNA)를 제조한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 7의 (1)과 동일하게 하여 마이크로 RNA 및 작은 간섭 RNA를 포함하는 복합 RNA 나노입자를 제작하였다. 이때, 작은 간섭 RNA 부분을 제외한 마이크로 RNA 부분은 기능성을 유지하기 위해 상보결합이 최소화되도록 배치되었다.
<실시예 8> 복합 RNA 나노입자의 세포 전환 촉진의 확인 1
1. HDF를 배양 접시에 분주한 후 confluency가 약 70%에 이르렀을 때, 실시예 7의 1에서 제조된 복합 RNA 나노입자와 양전하 고분자 물질인 TransIT-X2 reagent와 혼합하여 형성시킨 복합체를 24시간 동안 처리하여 세포 내로 전달하고, 성장배지로 교체하고 72시간 후, 세포를 수거하여 total RNA를 분리한 뒤 p53 유전자의 발현량을 qPCR법으로 분석하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다. 상기 p53 유전자 발현량은 house-keeping 유전자인 β-actin의 발현량으로 표준화(normalization)하여 비교하였다.
2. 도 11을 통해, 복합 RNA 나노입자가 HDF로 전달된 후 세포 내 기작에 의해 마이크로 RNA 단량체와 함께 siRNA가 방출되어 유전자 발현 억제 현상이 일어났음을 확인할 수 있다. p53의 발현을 억제한 경우 세포의 역분화 효율이 향상된다고 알려져 있으므로, 상기 복합 RNA 나노입자가 세포 전환을 촉진할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 9> 복합 RNA 나노입자의 세포 전환 촉진의 확인 2
1. HDF에 전기천공법을 통해 야마나카 요소를 발현할 수 있는 종래의 플라스미드 DNA를 삽입하고, 24시간 뒤 TransIT-X2로 코팅한 실시예 7의 2에서 제조된 복합 RNA 나노입자(1ug/ml)를 4시간 동안 처리하고 4일 동안의 회복 기간을 거친 후, 세포를 MEF feeder 위에 안치하였다. 하루 뒤, 세포의 배양 배지를 E8 배지로 교환한 후 시간에 따른 세포의 전환 과정을 광학현미경을 확인하여 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12의 (a)는 종래의 플라스미드 DNA만 사용한 결과를 나타내며, 도 12의 (b)는 종래의 플라스미드 DNA에 추가적으로 복합 RNA 나노입자를 처리한 결과를 나타낸다.
2. 도 12를 통해, 방출된 p53 siRNA 및 6종의 마이크로 RNA의 작용으로 인해 대조군에 비해 iPSC 콜로니가 단시간 내에 더욱 효율적으로 생산되는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 상기 복합 RNA 나노입자가 세포 전환을 촉진할 수 있음을 알 수 있다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University of seoul Industry Cooperation Foundation <120> Method for preparing iPSCs using RNA nanoparticle <130> PDAHJ-18125 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter region of plasmid DNA for RNA polymerase <400> 1 taatacgact cactatag 18 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of plasmid DNA for binding ribosome <400> 2 gccaccatgg 10 <210> 3 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of plasmid DNA for Oct4 generation <400> 3 atggcgggac acctggcttc ggatttcgcc ttctcgcccc ctccaggtgg tggaggtgat 60 gggccagggg ggccggagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggctaag cttccaaggc 120 cctcctggag ggccaggaat cgggccgggg gttgggccag gctctgaggt gtgggggatt 180 cccccatgcc ccccgccgta tgagttctgt ggggggatgg cgtactgtgg gccccaggtt 240 ggagtggggc tagtgcccca aggcggcttg gagacctctc agcctgaggg cgaagcagga 300 gtcggggtgg agagcaactc cgatggggcc tccccggagc cctgcaccgt cacccctggt 360 gccgtgaagc tggagaagga gaagctggag caaaacccgg aggagtccca ggacatcaaa 420 gctctgcaga aagaactcga gcaatttgcc aagctcctga agcagaagag gatcaccctg 480 ggatatacac aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tatttgggaa ggtattcagc 540 caaacgacca tctgccgctt tgaggctctg cagcttagct tcaagaacat gtgtaagctg 600 cggcccttgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca atgaaaatct tcaggagata 660 tgcaaagcag aaaccctcgt gcaggcccga aagagaaagc gaaccagtat cgagaaccga 720 gtgagaggca acctggagaa tttgttcctg cagtgcccga aacccacact gcagcagatc 780 agccacatcg cccagcagct tgggctcgag aaggatgtgg tccgagtgtg gttctgtaac 840 cggcgccaga agggcaagcg atcaagcagc gactatgcac aacgagagga ttttgaggct 900 gctgggtctc ctttctcagg gggaccagtg tcctttcctc tggccccagg gccccatttt 960 ggtaccccag gctatgggag ccctcacttc actgcactgt actcctcggt ccctttccct 1020 gagggggaag cctttccccc tgtctctgtc accactctgg gctctcccat gcattcaaac 1080 tga 1083 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for binding promoter DNA <400> 4 atagtgagtc gtatta 16 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for miRNA 34a generation <400> 5 acgtaccaaa gggcagtata cttgctgatt gttacttgaa acaaccagct aagacactgc 60 cattgaggca 70 <210> 6 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for binding promoter DNA <400> 6 atccct 6 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter DNA for circular DNA generation <400> 7 taatacgact cactataggg at 22 <210> 8 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for miRNA 302a generation <400> 8 actcctacta aaacatggaa gcacttactt ttaaagtcac agaaagcact tccatgttaa 60 agttgaaggg agc 73 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for siRNA p53 generation <400> 9 aagtagatta ccactggagt ctt 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for miRNA 302a-5p generation <400> 10 agcaagtaca tccacgttta agt 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for siRNA p53 generation <400> 11 aagactccag tggtaatcta ctt 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for miRNA 302a-3p generation <400> 12 tcaccaaaac atggaagcac tta 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for miRNA 302b generation <400> 13 ctactaaaac atggaagcac tta 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for miRNA 367 generation <400> 14 tcaccattgc taaagtgcaa ttc 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for miRNA 302d generation <400> 15 acactcaaac atggaagcac tta 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for miRNA 369 generation <400> 16 gaaaagatca accatgtatt att 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> region of ssDNA for miRNA 302c generation <400> 17 ccactgaaac atggaagcac tta 23

Claims (10)

  1. 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하거나 역분화를 촉진하는 세포전환용 RNA 나노입자를 체세포 또는 성체줄기세포에 전달하는 전달단계와, 상기 전달단계 후 세포전환용 RNA 나노입자가 전달된 세포를 배양함으로써 유도만능줄기세포를 생성하는 배양단계를 포함하며,
    상기 세포전환용 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전사인자를 발현을 위한 전령 RNA 나노입자와; 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 나노입자와; 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 및 역분화를 촉진하는 작은 간섭 RNA를 가지는 복합 RNA 나노입자;를 포함하고,
    상기 세포전환용 RNA 나노입자는 RNA로 이루어지며, 구의 형태를 가지고, 50 내지 200nm의 직경을 가지며,
    상기 전령 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되도록 하는 전사인자의 발현을 위한 전령 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 플라스미드 DNA를 생성하는 pDNA생성단계와; 상기 플라스미드 DNA와 RNA 중합효소를 포함하는 반응 용액을 일정 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, 상기 RNA 중합효소를 통해 상기 플라스미드 DNA를 롤링 서클 전사시켜 전사인자 발현을 위한 반복되는 전령 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 전령 RNA를 생성하고, 생성된 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉기면서 자가 조립되도록 하여 나노입자를 형성하는 입자형성단계;를 거쳐 생성되고,
    상기 마이크로 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되는 것을 촉진하기 위한 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 원형의 DNA를 생성하는 원형DNA생성단계와; 상기 원형의 DNA와 RNA 중합효소를 포함하는 반응 용액을 일정 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, 상기 RNA 중합효소를 통해 상기 원형의 DNA를 롤링 서클 전사시켜 반복되는 마이크로 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 마이크로 RNA를 생성하고, 생성된 단일 가닥의 마이크로 RNA가 서로 꼬이고 엉기면서 자가 조립되도록 하여 나노입자를 형성하는 입자형성단계;를 거쳐 생성되며,
    상기 역분화를 촉진하는 마이크로 RNA 및 역분화를 촉진하는 작은 간섭 RNA를 가지는 복합 RNA 나노입자는 체세포 또는 성체줄기세포가 유도만능줄기세포로 역분화되는 것을 촉진하기 위한, 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열과, 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열인 si 상보 염기 서열을 포함하는 ssDNA와, 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 제1원형의 DNA를 생성하는 제1원형DNA생성단계와; 마이크로 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열과, 상기 si 상보 염기 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 ssDNA와, 프로모터를 상보적으로 결합시킴으로써 제2원형의 DNA를 생성하는 제2원형DNA생성단계와; 상기 제1원형의 DNA, 제2원형의 DNA 및 RNA 중합효소를 포함하는 반응용액을 일정 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, RNA 중합효소를 통해 상기 제1원형의 DNA 및 제2원형의 DNA를 각각 롤링 서클 전사시켜, 반복되는 마이크로 RNA 염기서열 및 작은 간섭 RNA 염기서열을 가지는 긴 단일 가닥의 제1RNA와, 반복되는 마이크로 RNA 염기서열 및 상기 작은 간섭 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 제2RNA를 형성하고, 상기 제1RNA와 제2RNA가 부분적으로 상보 결합하여 엉기면서 자기조립되도록 하여 나노입자를 형성하는 입자형성단계;를 거쳐 생성되고,
    상기 전사인자는 Oct4, Sox2, cMyc, LMyc, Klf4 및 Lin28으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 상기 마이크로 RNA는 miRNA 302a, miRNA 302b, miRNA 302c, miRNA 302d, miRNA 367 및 miRNA 369로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 작은 간섭 RNA는 p53 siRNA인 것을 특징으로 하는 유도만능줄기세포의 제조방법.
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'자기조립 핵산 나노입자를 이용한 유도 만능 줄기세포 개발'과제보고서, 이화여자대학교(2014)*

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