KR101188144B1 - ｈＡＲＤ1-단백질의 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 hARD1-113 단백질과 GB1 단백질과의 융합 단백질, hARD1-113 단백질의 특정 위치의 아미노산 잔기(Phe)를 가용성 아미노산 잔기인 Lys으로 치환한 단백질 변이체, 및 이의 GB1 단백질과의 융합 단백질을 제공한다. 상기 단백질 변이체 또는 융합 단백질은 생리학적 매질 중에서 가용성인 형태를 갖는다.

Description

ｈＡＲＤ1-단백질의 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질{Mutant of hARD1-protein and fusion protein comprising the same}
본 발명은 생리학적 매질(physiologically compatable medium) 중에서 가용성인 형태를 갖는 hARD1-113 단백질의 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
혈관 신생 억제제는 암세포를 증식시키는 내피세포를 표적으로 삼으며, 인체 내에 존재하는 유전자를 바탕으로 유전자 재조합 방식을 통해 대량 생산이 가능하기 때문에 기존 화학 항암제와는 달리 정상 조직에 대한 독성이 적으며 약제 내성이 거의 없다는 장점을 지니고 있어 유용한 항암 치료제로서 사용될 수 있을 것으로 전망되고 있다. 혈관 신생 억제제가 새로운 기전의 항암제로서 개발될 경우 기존의 항암제와 병용투여로 치료 효과를 높이고 항암제 시장을 크게 확대시킬 수 있을 것으로 기대되고 있다.
신생혈관형성 억제를 통한 항암 치료제와 관련된 대표적인 연구로서, 미국 제넨테크사는 푸코이단(Fucoidan)이 혈관신생유전자의 발현을 억제하여 암세포가 새로운 혈관을 형성하는 작용을 막아 암세포의 성장을 방해하는 것을 보고한 바 있으며, FDA으로부터 직장암 치료제('아바스틴(Avastin)')로서 허가된 바 있다. 또한, 국내 연구팀(목암생명공학연구소)에서도 신생혈관생성 억제 재조합 단백질인 그린스타틴(Greenstatin)이 혈관내피세포에 특이적으로 작용하여 세포의 이동과 혈관으로 분화되는 과정을 억제하고, 혈관내피세포의 사멸을 촉진하는 효과가 있다는 것을 보고한 바 있으며, 현재 임상 시험이 진행 중에 있다.
한편, Joo-Won Jeong 등은 마우스 유래의 ARD1 단백질이 HIF-1(hypoxia-inducable factor 1)의 알파(α)-서브유닛에 직접 결합하여 HIF-1에 의한 전사 활성화를 억제한다는 것을 보고한 바 있다(Joo-Won Jeong, et. al., Regulation and Destabilization of HIF-1α by ARD1-Mediated Acetylation, Cell, Vol 111, 709-720, 2002). 즉, 마우스 유래의 ARD1 단백질은 N-아세틸트랜스퍼라아제로서 작용하여 HIF-1을 불안정화시킨다는 것을 개시한 바 있다. 따라서 ARD1 단백질은 HIF-1의 음성 조절자로서 작용하여, 결과적으로 신생혈관형성 억제를 통한 항암제로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
마우스 유래의 ARD1 단백질(mARD1)은 225 또는 235개 아미노산 서열을 갖는 2개의 변이체(mARD1-225 또는 mARD1-235)가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 인간 유래의 ARD1 단백질(hARD1)도 131개 또는 235개 아미노산 서열을 갖는 2개의 변이체(hARD1-131 또는 hARD1-235)가 존재하는 것으로 알려져 있다. 마우스 및 인간 유래의 ARD1 단백질은 모두 N-말단 쪽에 잘 보존(conserve)되어 있는, 아세틸화에 관여하는 N-아세틸트랜스퍼라아제 도메인을 가지고 있으며, 이 도메인을 통하여 HIF-1α를 아세틸화시킴으로써 혈관신생억제에 관여한다. 상기 마우스 및 인간 유래의 4종의 ARD1 단백질에 있어서, N-말단의 1번부터 113번까지의 아미노산 잔기는 100% 일치하며(서열번호 1의 아미노산 서열 참조), 또한 N-아세틸트랜스퍼라아제 도메인을 포함하고 있다.
그러나, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 hARD1-113 단백질을 발현벡터에 클로닝하여 단백질을 발현시킬 경우, 생성되는 단백질이 불용성의 봉입체(inclusion body) 형태로 얻어지게 되어, NMR을 이용한 용액상에서의 단백질의 3차원 구조 결정을 위한 연구를 더이상 진행하기가 곤란한 문제점이 있다. 특히, 용액상 단백질의 구조를 얻기 위해서는 생리학적 매질(physiologically compatable medium), 예를 들어 생리식염수 등의 완충액 중에 적어도 1mM 이상의 농도에서 안정하게 가용화된 형태로 존재할 것이 요구된다. 따라서, hARD1-113 단백질을 생리학적 매질 중에서 가용성인 형태로 얻기 위한 방법을 개발하는 것이 요구되고 있다.
본 발명은 생리학적 매질 중에서 가용성인 형태를 갖는 hARD1-113 단백질의 변이체를 제공한다. 상기 변이체는 hARD1-113 단백질과 가용성 단백질과의 융합 단백질, hARD1-113 단백질 자체의 변이체, 또는 상기 hARD1-113 단백질 자체의 변이체와 가용성 단백질과의 융합 단백질을 포함한다.
따라서, 본 발명은 hARD1-113 단백질과 가용성 단백질과의 융합 단백질, hARD1-113 단백질 자체의 변이체, 또는 상기 hARD1-113 단백질 자체의 변이체와 가용성 단백질과의 융합 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질과의 융합 단백질이 제공된다. 상기 융합 단백질은 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질이다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질로부터 유래된 단백질 변이체로서, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 32번째, 또는 102번째, 또는 32번 및 102번째 아미노산인 Phe(페닐알라닌)이 Lys(라이신)으로 치환된 단백질 변이체가 제공된다. 상기 단백질 변이체는 바람직하게는 서열번호 12, 14, 및 16의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 서열번호 16의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 상기 단백질 변이체와 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질과의 융합 단백질이 제공된다. 상기 융합 단백질은 바람직하게는 서열번호 13, 15, 및 17의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 17의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 hARD1-113 단백질과 GB1 단백질과의 융합 단백질, hARD1-113 단백질의 특정 위치의 아미노산 잔기(Phe)를 가용성 아미노산 잔기인 Lys으로 치환한 단백질 변이체, 및 이의 GB1 단백질과의 융합 단백질은 생리학적 매질 중에서 가용성이다. 특히, hARD1-113 단백질의 102번째 아미노산 잔기(Phe)를 Lys으로 치환한 단백질 변이체 및 이의 GB1 단백질과의 융합 단백질은 100% 가용성인 단백질로서 얻어질 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 상기 단백질 변이체 및 이의 GB1 단백질과의 융합 단백질은 신생혈관형성 억제를 통한 항암제로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 hARD1-113 단백질과 GB-1 단백질과의 융합 단백질 형태로 발현시켰을 때, 얻어진 단백질에 대한 전기영동 결과를 나타낸다. 도 1에서 레인 1은 단백질 크기 마커(Protein size marker)이며, 레인 2는 37℃에서 배양한 후 상등액에 대하여 전기영동을 수행한 결과이고, 레인 3은 37℃에서 배양한 후 펠렛에 대하여 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
도 2는 모델링 프로그램을 사용하여 hARD1-113 단백질의 모델링을 실시한 결과로서, a는 상기 모델링을 통하여 얻어진 hARD1-113 단백질의 모식도이고, 도 2의 b는 소수성 아미노산인 Phe을 표기한 hARD1-113 단백질의 모식도이다.
도 3은 F32K&F102K 변이체(32번째 및 102번째 Phe을 각각 Lys으로 치환한 GB1-hARD1-113 변이체, 서열번호 14)를 각각 37℃ 또는 20℃에서 배양한 후, 얻어진 배양액(상등액) 및 재현탁액(펠렛)에 대하여 전기영동을 수행한 결과이다. 도 3에서, 레인(Lane) 1 및 레인 2는 37℃에서 배양하였을 때 상등액(레인 1) 및 펠렛(레인 2)에 대한 전기영동 결과를 나타내고, 레인 3 및 레인 4는 20℃에서 배양하였을 때 상등액(레인 3) 및 펠렛(레인 4)에 대한 전기영동 결과를 나타낸다.
도 4는 F32K 변이체(32번째 Phe을 Lys로 치환한 GB1-hARD1-113 변이체, 서열번호 16) 및 F102K 변이체(102번째 Phe을 Lys로 치환한 GB1-hARD1-113 변이체, 서열번호 18)를 각각 37℃ 또는 20℃에서 배양한 후, 얻어진 배양액(상등액) 및 재현탁액(펠렛)에 대하여 전기영동을 수행한 결과이다. 도 4에서, 레인 1 내지 레인 4는 F32K 변이체에 대한 전기영동 결과(레인 1- 37℃, 상등액; 레인 2- 37℃, 펠렛; 레인 3- 20℃, 상등액; 레인 4- 20℃, 펠렛)이고, 레인 5 내지 8은 F102K 변이체에 대한 전기영동 결과(레인 5- 37℃, 상등액; 레인 6- 37℃, 펠렛; 레인 7- 20℃, 상등액; 레인 8- 20℃, 펠렛)이다.
본 발명자들은 hARD1-113을 코딩하는 DNA(서열번호 2)를 발현벡터에 클로닝하여, BL21DE3 competent cell(Stratagene 사)에 형질전환한 후, 얻어진 형질전환된 세포를 배양하여 단백질을 발현시켰으나, 봉입체(inclusion body) 형태 즉, 불용성 형태로 발현되어, 이후의 시험을 지속하기가 곤란하였다. 이에 본 발명자들은 가용성 단백질로 알려져 있는 GB-1 단백질과의 융합 단백질을 설계하였으며, 그 결과 약 30% 정도의 가용성 단백질 즉, hARD1-113과 GB-1 단백질과의 융합 단백질을 얻을 수 있었다.
더욱 증가된 가용성 단백질 분획을 얻기 위하여, 본 발명자들은 hARD1-113 단백질의 3차원 구조를 분석하였으며, 그 결과 2개의 위치 즉 32번 및 102번째 위치에서 소수성 아미노산인 Phe이 표면에 노출되어 있음을 발견하였다. 이러한 발견을 근거로, 상기 소수성 아미노산인 Phe을 라이신(Lys) 잔기로 치환한 단백질 변이체를 설계하였으며, 얻어진 변이체 중 102번째 위치의 Phe을 Lys으로 치환한 단백질 변이체가 거의 100%에 가깝게 가용성 단백질로서 얻어진다는 것을 밝혀냈다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질과의 융합 단백질을 제공한다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질, hARD1-113 단백질은 131개 또는 235개 아미노산 서열을 갖는 hARD1-131 또는 hARD1-235의 N-말단의 1번 내지 113번째 아미노산 서열을 갖는 단백질로서, 아세틸화에 관여하는 N-아세틸트랜스퍼라아제 도메인을 포함하고 있어, 이 도메인을 통하여 HIF-1α를 아세틸화시킴으로써 혈관신생억제에 관여한다. 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 GB-1 단백질로서, 가용성 단백질로서 알려져 있다(A Novel, Highly Stable Fold of the Immunoglobulin Binding Domain of Streptococcal Protein G, Angela M et al, Science, 1991, 657-661. Effect of N-terminal solubility enhancing fusion proteins on yield of purified target protein, Martin Hammarstrom et al, Journal of Structural and Functional Genomics, 2006, 7:1-14). 본 발명에 의해, hARD1-113 단백질을 GB-1 단백질과의 융합 단백질 형태로 변환할 경우, 융합 단백질을 약 30% 정도의 가용성 형태로 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 상기 융합 단백질로는 hARD1-113 단백질의 N-말단 부위에 GB-1 단백질이 결합된 형태, 즉, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질이 바람직하다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질로부터 유래된 단백질 변이체로서, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 32번째, 또는 102번째, 또는 32번 및 102번째 아미노산인 Phe(페닐알라닌)이 Lys(라이신)으로 치환된 단백질 변이체를 제공한다.
상기 단백질 변이체는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 32번째 및 102번째 아미노산인 Phe(페닐알라닌)이 Lys(라이신)으로 치환된 변이체(서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체); 혹은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 32번째 아미노산인 Phe(페닐알라닌)이 Lys(라이신)으로 치환된 변이체(서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체)이거나; 혹은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 102번째 아미노산인 Phe(페닐알라닌)이 Lys(라이신)으로 치환된 변이체(서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체)일 수 있다. 특히 바람직하게는, 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체이다.
본 발명은 또한, 상기 단백질 변이체와 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질(즉, GB-1 단백질)과의 융합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은 바람직하게는 서열번호 13, 15, 및 17의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 특히 바람직하게는 서열번호 17의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.
(1) hARD1-113의 클로닝 및 발현
131개 및 235개의 아미노산 서열로 이루어진 hARD1와 마우스 유래의 mARD1는 모두 N-말단으로부터 1부터 113번째까지의 아미노산이 동일한 것으로 알려져 있으며, 또한 N-말단으로부터 1부터 113번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 hARD1는 N-아세틸틀랜스퍼라아제(N-acetyltransferase) 도메인을 포함하고 있다. 따라서, 본 발명자들은 N-말단으로부터 1부터 113번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 hARD1(즉, hARD1-113, 서열번호 1)의 클로닝을 수행하여 발현을 유도하였다. hARD1-113 단백질을 코딩하는 DNA(서열번호 2)(서울대학교 약학대학, 생화학 연구실, 김규원 교수)를 pET21a 벡터(Novagen 사, 미국)에 클로닝하여, BL21DE3 competent cell(Stratagene 사)에 형질전환시켰다. 얻어진 형질전환된 세포를 LB 배지(제조사: Merck, USA) 중에서 배양하여 단백질을 발현시켰으나, 봉입체(inclusion body) 형태 즉, 불용성 형태로 발현되었다(data not shown).
(2) GB1 및 hARD1-113의 융합단백질의 제작
구조적으로 안정하고 또한 생리학적 매질에 용해성인 단백질을 얻기 위하여, 용해성(soluble)인 공지의 단백질 즉, 서열번호 3의 GB1 단백질과의 융합단백질을 다음과 같이 제작하였다.
<1> hARD1-113 유전자 증폭
hARD1-113 유전자를 갖는 세포주(즉, (1)에서 얻어진 형질전환된 세포)를 LB 배지에 접종한 후, 37℃에서 진탕배양기(shaking incubator) 중에서 밤새 인큐베이션한 다음, DNA plasmid miniprep kit (Bioneer사, 한국)를 사용하여, 제조자 지침서에 따라 hARD1-113 주형(template) DNA를 얻었다. PCR를 위한 프라이머로서, 하기 표 1의 염기서열을 갖는 프라이머를 제작하였으며, 제한효소 부위로는 BamHI(GGATCC) 및 XhoI 부위(CTCGAG)를 사용하였다. 상기 프라이머머는 Bioneer사(한국, www.bioneer.co.kr)에 의뢰하여 제작하였다.
서열번호 프라이머 서열
3 정방향 GGA TCC ATG AAC ATC CGC AAT GCG AGG CCA G
4 역방향 CTC GAG CTT CCT GAC ATG CAG GGA GAC ATA TTT G
PCR은 Bioneer사의 PCR premix를 사용하여 수행하였으며, PCR 반응을 위한 샘플 조성 및 반응 조건은 각각 표 2 및 표 3과 같다.
성분 함량
hARD1-113 주형 DNA 1㎕
정방향 프라이머 1㎕
역방향 프라이머 1㎕
A.D.W 17㎕
총 20㎕
* A.D.W는 Autoclaved Distilled Water를 의미한다.
조건
변성 94℃, 10분
30 사이클 94℃, 1분
55℃, 1분 30초
72℃, 1분 30초
연장 72℃, 10분
정지 4℃
PCR 산물은 Bioneer사의 PCR purification kit를 사용해서 정제하였으며, 2% DNA 아가로오즈 겔을 이용한 전기영동으로 확인하였다.
<2> 제한효소 처리
GB1 유전자(서열번호 6)가 pET30a 벡터(Novagen 사, 미국)에 클로닝된 발현 벡터로 형질전환시킨 세포주(하버드 의과대학교 와그너교수 실험실로부터 제공받음, http://gwagner.med.harvard.edu/)를 5ml의 LB 배지에 접종하고, 5㎕의 카나마이신(kanamycin)을 첨가한 후, 진탕배양기 중에서 밤새 인큐베이션하였다. Bioneer사의 DNA plasmid miniprep kit를 이용하여 정제된 DNA 플라스미드를 얻었다.
상기 <1>에서 얻어진 hARD1-113 유전자 및 상기에서 얻어진 GB1 유전자를 포함하는 DNA 플라스미드를 각각 제한 효소, 즉 BamHI 및 XhoI(New England Biolab사, www.neb.com)로 처리하였으며, 제한효소 샘플 조성은 다음 표 4와 같다. 표 4에서, BSA 및 NEBuffer는 상기 제한효소 구입시 함께 포함되어 있는 시료를 사용하였다.
성분 함량
hARD1-113 DNA 또는 GB1-pET30a 벡터 25㎕
BamHI 제한효소 3㎕
XhoI 제한효소 3㎕
100X BSA 1㎕
10X NEBuffer 2 10㎕
A.D.W 83㎕
총 100㎕
상기 제한효소 처리는 37℃에서 3시간 동안 수행하였으며, 반응 수행 후 Bioneer사의 PCR purification kit를 이용해서 정제하였다.
<3> GB1 유전자 및 hARD1-113 유전자의 접합(ligation)
정제된 hARD1-113 DNA (즉, cuttung된 ARD1-113 DNA) 및 GB1-pET30a (즉, cutting된 GB1-pET30a)를 15℃ 항온조에서 20시간 동안 반응시켜 접합(ligation)시켰으며, 이때 상기 접합 반응을 위한 조성은 다음 표 5와 같다. T4 DNA Ligase 및 10X T4 DNA Ligase reaction buffer는 모두 Takara사로부터 구입하였다.
성분 함량
cutting된 ARD1-113 DNA 5㎕
cutting된 GB1-pET30a 1㎕
T4 DNA Ligase 1㎕
10X T4 DNA Ligase reaction buffer 1㎕
A.D.W 2㎕
총 10㎕
<4> 형질전환
상기 <3>에서 얻어진 접합(Ligation)된 샘플 5㎕를 200㎕의 DH5α competent cell(Stratagene 사)에 가하여 혼합한 후, 15분간 얼음에 넣어 두었다. 얻어진 세포-샘플을 42℃의 항온조에 1분간 넣어준 다음(heat shock), 다시 5분간 얼음에 넣어두었다. LB 배지 800㎕를 배양관(culture tube, Falcon사)에 넣고, 상기 세포-샘플을 37℃에서 진탕 배양기 중에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 얻어진 샘플을 1.5ml의 에펜도르프 튜브에 옮긴 후, 8000rpm에서 1분간 원심분리하고, 상등액의 배지(즉, LB)를 제거한 다음, 나머지 200㎕와 아래에 모인 세포를 가볍게 재현탁(resuspension)시켰다. 이를 카나마이신이 함유된 LB 아가 플레이트에 도말한 후, 37℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 생성된 콜로니를 5㎕ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 5ml에 접종한 다음, Bioneer 사의 DNA plasmid miniprep kit를 이용하여 제조사 지침에 따라 처리하여 정제된 GB1-hARD1-113 DNA 플라스미드를 얻었다. 얻어진 플라스미드를 사용하여 DNA 서열분석을 수행한 다음, -20℃에서 보관하였다.
또한, 상기와 유사한 방법으로 BL21DE3 competent cell(Stratagene 사)을 형질전환시켰다. 즉, 상기 -20℃에서 보관한 GB1-hARD1-113 DNA 플라스미드 샘플 5㎕를 200㎕의 BL21DE3 competent cell(Stratagene 사)에 가하여 혼합한 후, 15분간 얼음에 넣어 두었다. 얻어진 세포-샘플을 42℃의 항온조에 1분간 넣어준 다음(heat shock), 다시 5분간 얼음에 넣어두었다.이를 카나마이신이 함유된 LB 아가 플레이트에 도말한 후, 37℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 생성된 콜로니를 5㎕ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 5ml에 접종한 다음, Bioneer 사의 DNA plasmid miniprep kit를 이용하여 제조사 지침에 따라 처리하여 정제된 GB1-hARD1-113 DNA 플라스미드를 얻었다. 얻어진 샘플로부터 일부를 취하여 DNA 서열분석을 수행하였으며, 나머지 샘플은 50% 글리세롤을 첨가하여 -80℃에서 cell stock으로서 보관하였다.
<5> 단백질 발현
상기 <4>에서 cell stock으로 보관중인 샘플을 5㎕ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 5ml에 접종한 후, 37℃에서 진탕배양기 중에서 밤새 배양하였다. 미리 LB 배지 100ml를 채우고 멸균한 배양병에, 상기 배양액 중 3ml를 취하여 가한 다음, 37℃에서 진탕배양기 중에서 O.D.600 (600nm에서의 광학 밀도(Optical density)) 가 0.5가 될때까지 인큐베이이션하였다. 0.5M IPTG(β-D-이소프로필-티오갈락토피라노오즈, IPTG, Sigma사)를 100㎕ 접종하여, 0.5mM 농도도 한 후, 37℃에서 진탕배양기 중에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 얻어진 배양액을 8000rmp에서 15분간 원심분리하여, 상등액을 제거한 후, 세포를 수확하였다.
얻어진 세포에 pH 7.9 20mM Tris 완충액(sigma), 0.5M NaCl(머크사) 완충액 100ml을 가하여 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기(Sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄주었다(2분 초음파, 1분 휴식으로 총 15회). 이후, 20㎕를 취하여, 1.5ml 에펜도르프 튜브에 넣은 후, 13000rmp으로 10분간 원심 분리하였다. 상등액 20㎕을 따로 분리하고, 튜브 아래에 모인 세포에 20㎕의 A.D.W를 가하여 재현탁시켰다. 얻어진 상등액 및 펠렛으로 떨어진 세포를 재현탁한 튜브에 각각 5㎕ 의 5X SDS-PAGE Glycine loading buffer(Promega사, 미국)을 가하고 1시간 동안 전기영동을 수행하였다. 전기용동 기기는 일본 ATTO사의 제품을 이용하였으며, Gel은 Glycine gel을 이용하였고, 사이즈 마커는 고마 바이오텍사의 Protein Marker를 사용하였다. 전기영동 후, 겔을 DS-PAGE gel 염색액(코마씨 블루 분말:1g, 아세트산 100ml, 메탄올 500ml, 및 증류수 400ml)으로 염색한 후, 탈색액(아세트산 75ml, 메탄올 50ml, 및 증류수 875ml)으로 탈색시켰다. 그 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 레인 1은 단백질 크기 마커(Protein size marker)이며, 레인 2는 37℃에서 배양한 후 상등액에 대하여 전기영동을 수행한 결과이고, 레인 3은 37℃에서 배양한 후 펠렛에 대하여 전기영동을 수행한 결과를 나타낸다.
단백질이 용해성일 경우 상등액 부분에 단백질이 발현되며, 비용해성 즉, 봉입체 형태로 생성될 경우 침전물 부분(상기 세포 재현탁액) 부분에 발현되게 된다. 도 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 100% 봉입체 형태로 얻어지는 hARD1-113 단백질을 GB1과 융합단백질(즉, 서열번호 7) 형태로 제조할 경우, 약 30% 정도가 용해성으로 얻어짐을 알 수 있다.
실시예 2. 단백질 변이체의 제조 및 평가
(1) hARD1-113의 구조 모델링
hARD1-113 단백질에 대하여, 모델링 프로그램(http://modbase.compbio.ucsf.edu/ModWeb20-html/modweb.html)을 사용하여 3차원 구조의 모델링을 실시한 다음, 단백질 구조 분석을 수행하였다. 그 결과, 2개의 소수성 아미노산인 Phe이 32번 및 102번 위치에서 표면에 노출되어 있는 것으로 밝혀졌다. 도 2의 a는 상기 모델링을 통하여 얻어진 hARD1-113 단백질의 모식도이고, 도 2의 b는 소수성 아미노산인 Phe을 표기한 hARD1-113 단백질의 모식도이다.
(2) hARD1-113의 변이체 제조 및 평가
32번 및/또는 102번 위치의 Phe을 친수성 아미노산인 라이신(Lysine) 잔기로의 변이체화를 수행하여, 용해성 hARD1-113 변이체를 얻을 수 있는지 여부를 평가하였다.
<1> 변이체의 제조
F32K 변이체(32번째 Phe을 Lys로 치환한 GB1-hARD1-113 변이체) 및 F102K 변이체(102번째 Phe을 Lys로 치환한 GB1-hARD1-113 변이체)를 제조하기 위하여, 표 6과 같이 변이체 제조를 위한 프라이머 세트를 제작하였다. F32K&F102K 변이체(32번째 및 102번째 Phe을 각각 Lys로 치환한 GB1-hARD1-113 변이체)는 F32K 변이체 및 F102K 변이체 제조용 프라이머 세트를 순차적으로 사용하여 변이체를 제조하였다.
변이체 서열번호 프라이머 서열
F32K 8 정방향 CTA CCA GAT GAA ATA CTA CAA ATA CCA TGG CCT TTC CTG GCC C
9 역방향 GGG CCA GGA AAG GCC ATG GTA TTT GTA GTA TTT CAT CTG GTA G
F102K 10 정방향 CGA GCC ATG ATA GAG AAC AAA AAT GCC AAA TAT GTC TCC CTG
11 역방향 CAG GGA GAC ATA TTT GGC ATT TTT GTT CTC TAT CAT GGC TCG
실시예 1에서 얻어진 GB1-hARD1 단백질의 cell stock를 5㎕ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 5ml에 접종한 후, 37℃에서 진탕배양기 중에서 밤새 배양하였다. 배양액으로부터, Bioneer사의 DNA plasmid miniprep kit를 이용해서 주형 DNA를 얻었다. 얻어진 주형 DNA를 이용하여, 표 6에 따라 제작한 프라이머쌍을 이용하여, 변이체를 얻기 위한 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응을 위한 샘플 조성 및 반응 조건은 각각 표 7 및 표 8과 같다. 표 7에서, dNTP mixture는 Takara 사 제품을 이용하였으며, Quick solution 및 10X reaction buffer는 각각 Stratagene사의 QuikChange XL Site-Directied Mutagenesis Kit (catalog number #200516)에 포함된 시약을 사용하였다.
성분 함량
dsDNA GB1-ARD1-113 template (10ng) 1㎕
정방향 프라이머(125ng) 1㎕
역방향 프라이머(125ng) 1㎕
dNTP mixture 1㎕
Quick Solution 3㎕
10X reaction buffer 5㎕
PfuTurbo Polymerase(2.5U/㎕) 1㎕
A.D.W 37㎕
총 50㎕
조건
변성 95℃, 1분
18 사이클 95℃, 50초
63℃, 50초
72℃, 6분
연장 72℃, 7분
정지 4℃
PCR 산물은 NEB사의 DPN I enzyme을 1㎕ 첨가하여 혼합한 후, 37℃ 항온조에서 2시간 반응시켜, 변이되지 않은 메틸화된 DNA를 제거(digestion)하였다.
<2> 형질전환
상기 <1>에서 얻어진 샘플 즉, DPN I enzyme 처리 후, 37℃에서 2시간 반응시켜 얻어진 샘플 5㎕를 200㎕의 DH5α competent cell(Stratagene 사)에 가하여 혼합한 후, 15분간 얼음에 넣어 두었다. 얻어진 세포-샘플을 42℃의 항온조에 1분간 넣어준 다음(heat shock), 다시 5분간 얼음에 넣어두었다. LB 배지 800㎕를 배양관(culture tube, Falcon사)에 넣고, 상기 세포-샘플을 37℃에서 진탕 배양기 중에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 얻어진 샘플을 1.5ml의 에펜도르프 튜브에 옮긴 후, 8000rpm에서 1분간 원심분리하고, 상등액의 배지(즉, LB)를 제거한 다음, 나머지 200㎕와 아래에 모인 세포를 가볍게 재현탁(resuspension)시켰다. 이를 카나마이신이 함유된 LB 아가 플레이트에 도말한 후, 37℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 생성된 콜로니를 5㎕ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 5ml에 접종한 다음, Bioneer 사의 DNA plasmid miniprep kit를 이용하여 제조사 지침에 따라 처리하여 정제된 GB1-hARD1-113 DNA 플라스미드를 얻었다. 얻어진 플라스미드를 사용하여 DNA 서열분석을 수행한 다음, -20℃에서 보관하였다.
또한, 상기와 유사한 방법으로 BL21DE3 competent cell(Stratagene 사)을 형질전환시켰다. 즉, 상기 -20℃에서 보관 중인 샘플 5㎕를 200㎕의 BL21DE3 competent cell(Stratagene 사)에 가하여 혼합한 후, 15분간 얼음에 넣어 두었다. 얻어진 세포-샘플을 42℃의 항온조에 1분간 넣어준 다음(heat shock), 다시 5분간 얼음에 넣어두었다.이를 카나마이신이 함유된 LB 아가 플레이트에 도말한 후, 37℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 생성된 콜로니를 5㎕ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 5ml에 접종한 다음, Bioneer 사의 DNA plasmid miniprep kit를 이용하여 제조사 지침에 따라 처리하여 정제된 GB1-hARD1-113 DNA 플라스미드를 얻었다. 얻어진 샘플로부터 일부를 취하여 DNA 서열분석을 수행하였으며, 나머지 샘플은 50% 글리세롤을 첨가하여 -80℃에서 cell stock으로서 보관하였다.
<3> 단백질 발현
상기 <2>에서 cell stock으로 보관중인 샘플을 5㎕ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 5ml에 접종한 후, 37℃에서 진탕배양기 중에서 밤새 배양하였다. 미리 LB 배지 100ml를 채우고 멸균한 배양병에, 상기 배양액 중 3ml를 취하여 가한 다음, 37℃에서 진탕배양기 중에서 O.D.600 (600nm에서의 광학 밀도(Optical density)) 가 0.5가 될때까지 인큐베이이션하였다. 0.5M IPTG(β-D-이소프로필-티오갈락토피라노오즈, IPTG, Sigma사)를 100㎕ 접종하여, 0.5mM 농도도 한 후, 37℃ 또는 20℃에서 진탕배양기 중에서 인큐베이션하였다. 37℃에서의 인큐베이션은 4시간 동안 수행하였으며, 20℃에서의 인큐베이션은 밤새(overnight) 수행하였다. 얻어진 배양액 각각을 8000rmp에서 15분간 원심분리하여, 상등액을 제거한 후, 세포를 수확하였다.
얻어진 각각의 세포에 pH 7.9 20mM Tris 완충액(sigma), 0.5M NaCl(머크사) 완충액 100ml을 가하여 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기(Sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄주었다(2분 초음파, 1분 휴식으로 총 15회). 이후, 20㎕를 취하여, 1.5ml 에펜도르프 튜브에 넣은 후, 13000rmp으로 10분간 원심 분리하였다. 상등액 20㎕을 따로 분리하고, 튜브 아래에 모인 세포에 20㎕의 A.D.W를 가하여 재현탁시켰다. 얻어진 상등액 및 펠렛으로 떨어진 세포를 재현탁한 튜브에 각각 5㎕ 의 5X SDS-PAGE Glycine loading buffer(Promega사, 미국)을 가하고 1시간 동안 전기영동을 수행하였다. 전기용동 기기는 일본 ATTO사의 제품을 이용하였으며, Gel은 Glycine gel을 이용하였고, 사이즈 마커는 고마 바이오텍사의 Protein Marker를 사용하였다. 전기영동 후, 겔을 DS-PAGE gel 염색액(코마씨 블루 분말:1g, 아세트산 100ml, 메탄올 500ml, 및 증류수 400ml)으로 염색한 후, 탈색액(아세트산 75ml, 메탄올 50ml, 및 증류수 875ml)으로 탈색시켰다.
F32K&F102K 변이체(32번째 및 102번째 Phe을 각각 Lys으로 치환한 GB1-hARD1-113 변이체, 서열번호 14)를 각각 37℃ 또는 20℃에서 배양한 후, 얻어진 배양액(상등액) 및 재현탁액(펠렛)에 대하여 전기영동을 수행한 결과는 도 3과 같다. 도 3에서, 레인(Lane) 1 및 레인 2는 37℃에서 배양하였을 때 상등액(레인 1) 및 펠렛(레인 2)에 대한 전기영동 결과를 나타내고, 레인 3 및 레인 4는 20℃에서 배양하였을 때 상등액(레인 3) 및 펠렛(레인 4)에 대한 전기영동 결과를 나타낸다. 도 3의 결과로부터, 32번째 및 102번째 Phe을 모두 Lys으로 치환할 경우, 불용성 펩타이드의 형태의 단백질 변이체의 함량이 여전히 높은 것을 알 수 있다.
F32K 변이체(32번째 Phe을 Lys로 치환한 GB1-hARD1-113 변이체, 서열번호 16) 및 F102K 변이체(102번째 Phe을 Lys로 치환한 GB1-hARD1-113 변이체, 서열번호 18)를 각각 37℃ 또는 20℃에서 배양한 후, 얻어진 배양액(상등액) 및 재현탁액(펠렛)에 대하여 전기영동을 수행한 결과는 도 4와 같다. 도 4에서, 레인 1 내지 레인 4는 F32K 변이체에 대한 전기영동 결과(레인 1- 37℃, 상등액; 레인 2- 37℃, 펠렛; 레인 3- 20℃, 상등액; 레인 4- 20℃, 펠렛)이고, 레인 5 내지 8은 F102K 변이체에 대한 전기영동 결과(레인 5- 37℃, 상등액; 레인 6- 37℃, 펠렛; 레인 7- 20℃, 상등액; 레인 8- 20℃, 펠렛)이다. 놀랍게도, F102K 변이체에서 레인 8의 펠렛의 경우 단백질 밴드가 관찰되지 않은 반면, 레인 7의 경우에만 단백질 밴드가 관찰되었다. 이는 상대적으로 낮은 온도 즉, 20℃에서 F102K 변이체를 배양할 경우 서서히 단백질 구조화(folding)가 일어나, 100% 용해성으로 얻어진다는 것을 나타낸다. 따라서, 102번째 Phe을 Lys으로 치환한 F102K 변이체는 혈관 신생 억제 단백질로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
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  5. 서열번호 16의 아미노산 서열로 구성된 단백질 변이체.
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  8. 서열번호 17의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질.
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