ES2966310T3 - Biocatalizador como componente de núcleo de un sistema redox catalizado por enzima para la reducción biocatalítica de cistina - Google Patents
Biocatalizador como componente de núcleo de un sistema redox catalizado por enzima para la reducción biocatalítica de cistina Download PDFInfo
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Abstract
La invención se refiere a una enzima para la reducción de cistina a cisteína, caracterizada porque la enzima es una proteína de fusión que comprende las actividades proteicas de tiorredoxina (proteína i) que tiene el número de base de datos KEGG EC 1.8.4.8 o EC 1.8.4.10 y tiorredoxina reductasa. (proteína ii) que tiene el número de base de datos KEGG EC 1.8.1.9, siendo la actividad de la proteína de fusión al menos el 100 % de la actividad de una mezcla de las mismas proteínas individuales i y ii, pero no combinadas. La invención también se refiere a un método para la reducción enzimática de cistina a cisteína en presencia de un cofactor mediante dicha proteína de fusión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Biocatalizador como componente de núcleo de un sistema redox catalizado por enzima para la reducción biocatalítica de cistina
La invención se refiere a una enzima para la reducción de cistina a cisteína, caracterizada porque en el caso de la enzima se trata de una proteína de fusión, que comprende las actividades proteicas de tiorredoxina (proteína i) con el número de la base de datos KEGG EC 1.8.4.8 o EC 1.8.4.10 y tiorredoxina-reductasa (proteína ii) con el número de la base de datos KEGG EC 1.8.1.9, ascendiendo la actividad de la proteína de fusión a al menos el 100% de la actividad de una mezcla de las mismas proteínas individuales i y ii, pero no fusionadas. Por lo demás, la invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática de cistina a cisteína en presencia de un cofactor usando esta proteína de fusión.
La cisteína, abreviada como Cys o C, es un a-aminoácido con la cadena lateral -CH<2>-SH. Dado que la forma enantiomérica que aparece de manera natural es L-cisteína y solo esta representa un aminoácido proteinogénico, en el marco de esta invención quiere decirse L-cisteína cuando se usa la expresión cisteína sin descriptor. Mediante la oxidación de los grupos sulfhidrilo, dos restos cisteína pueden formarse entre sí un puente disulfuro, con lo que se genera cistina, para la que es válido lo mismos, es decir sin descriptor en esta invención quiere decirse el enantiómero L (o R,R-cistina). La L-cisteína es para el ser humano un aminoácido semiesencial, dado que puede formarse a partir del aminoácido metionina.
El aminoácido L-cisteína se usa, por ejemplo, como aditivo alimentario (en particular en la industria de los productos de panadería y pastelería), como sustancia de utilización en cosmética, así como como producto de partida para la producción de principios activos farmacéuticos (en particular N-acetil-cisteína y S-carboxi-metil-cisteína) y es con ello de importancia económica. Se considera especialmente importan la utilización de cisteína como sustancia aromatizante en la industria alimentaria (por ejemplo, como aroma de pollo o de carne). Por lo demás, la L-cisteína se emplea para la modificación de la reología de masas y como antioxidante, por ejemplo, en zumos.
En todos los organismos, la L-cisteína adopta un papel clave en el metabolismo del azufre. Se usa para la síntesis de proteínas, metionina, biotina, ácido lipoico, glutatión y otros metabolitos que contienen azufre. Por lo demás, la L-cisteína sirve para la biosíntesis de coenzima-A. El grupo tiol desempeña en las enzimas con frecuencia un papel importante en la catálisis de reacciones o estabiliza proteínas mediante la configuración de puentes disulfuro intra- o intermoleculares.
La L-cisteína puede obtenerse por medio de hidrólisis a partir de materiales que contienen queratina tales como pelos, cerdas, uñas, pezuñas, plumas y cuernos. Sin embargo, estos procedimientos siempre albergan las cuestiones de la seguridad biológica y la protección medioambiental. Adicionalmente, estos presentan una productividad reducida. Alternativamente se han desarrollado procedimientos para la producción por medio de biotransformación a partir de precursores así como la producción fermentativa de L-cisteína (documentos US 6.218.168 B1, US 5.972.663 A, US 2004-038352 A, CA 2386 539 A2, EP 2 138585, EP 1769 080 y EP 2726 625 B1). En la producción fermentativa resulta desventajoso un bajo rendimiento de L-cisteína (también tras una gestión de la fermentación optimizada), que también se basa en que la cisteína se oxida en presencia de oxígeno del aire y entonces se encuentra o puede obtenerse principalmente como L-cistina de disulfuro.
La reacción de oxidación es reversible y así la L-cistina puede transformarse mediante una reducción dirigida de nuevo a L-cisteína. Sin embargo, si la L-cistina se reduce tras la separación de las células (por ejemplo, con un decantador) por medio de electrólisis de nuevo a L-cisteína, entonces esta conversión química condiciona que tal L-cisteína no pueda declararse como natural según el Reglamento sobre aromas.
Según el Reglamento CE sobre aromas (1334/2008 artículo 22 del Reglamento para la reordenación de normas de identificación de legislación alimentaria), los aromas naturales se definen tal como sigue: las sustancias aromatizantes “naturales” son sustancia definidas químicamente con propiedades aromáticas, que aparecen de manera natural y se han comprobado en la naturaleza. Se obtienen mediante procedimientos físicos, enzimáticos o microbiológicos adecuados a partir de sustancias de partida vegetales, animales o microbiológicas, que se usan como tal o se procesan por medio de uno o varios procedimientos de preparación de alimentos convencionales para el consumo humano.
En este sentido, el término “natural” se utiliza también en la presente solicitud. Existe un gran interés en la utilización de materias primas naturales en la producción de aromas.
Una escisión enzimática posibilitaría una producción de una cisteínanaturalaprovechando los altos rendimientos de cistina fermentativos. Para la realización de un procedimiento enzimático de este tipo se requiere un sistema de cascada enzimática redox adecuada. Como enzimas de escisión de disulfuro se han descrito, por ejemplo, tiorredoxinas, glutarredoxinas y disulfuro isomerasas. Sin embargo, en la mayoría de los casos estas enzimas actúan sobre disulfuros, que se han configurado dentro de un polipéptido o entre dos subunidades de una proteína. La escisión de cistina libre se ha descrito solo para pocas proteínas, tal como, por ejemplo, para tiorredoxina bacteriana, que se regenera a su vez mediante la tiorredoxina-reductasa, que necesita NADPH como cofactor. Tales enzimas redox o cascadas enzimáticas necesitan con frecuencia NADH o NADPH como cofactor, que pone a disposición los electrones correspondientes para la reacción de reducción. Por tanto, una cistina-reductasa está caracterizada porque usa el sustrato cistina y con ayuda de un cofactor tal como NADPH o NADH transfiere dos electrones y finalmente se generan dos cisteínas.
Por tanto, correspondientemente, el cofactor tiene que añadirse de manera equimolar a la reacción, lo que es costoso y con ello es desfavorable desde el punto de vista económico. Esto puede evitarse mediante el acoplamiento con una segunda reacción para la regeneración del cofactor. Como sistema regenerativo pueden usarse deshidrogenasas, tales como, por ejemplo, alcohol deshidrogenasa o glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. Desde el punto de vista económica se suma que también estas enzimas tienen que poder producirse de manera fermentativa con un rendimiento correspondientemente alto.
Dado que el esfuerzo para la producción de las enzimas necesarias aumenta con su número, es económicamente razonable fusionar mediante técnica genética las enzimas individuales. Esto puede tener adicionalmente la ventaja de que, debido a la proximidad espacial, los sustratos pueden llegar más fácilmente de una enzima a la siguiente. Sin embargo, con frecuencia estas fusiones de enzimas conducen a una capacidad de producción fermentativa peor o la proteína de fusión presenta una actividad reducida o incluso ya no presenta ninguna. Para evitar una acción inhibidora de las dos enzimas una sobre otra en la proteína de fusión, con frecuencia se usan secuencias ligadoras más bien largas, que unen o separan las dos proteínas. Raramente se observan actividades comparables de las proteínas de fusión con respecto a mezclas de las proteínas de partida, cuando se usan secuencias ligadoras muy cortas o incluso ninguna secuencia ligadora. El documento CN101899460 da a conocer varias proteínas de fusión, que contienen las enzimas tiorredoxina (Trx) y tiorredoxina-reductasa (TrxR) deAspergillus niger,estando unidas entre sí las dos enzimas mediante un “ligador” de más de cinco aminoácidos. Las proteínas de fusión se expresan enE. coli,pero no contienen ninguna secuencia de aminoácidos que proceda deE. coli.
EnMycobacterium leprae(Wieles B.et al.1995, J. Biol. Chem. 270, págs. 25604-25606) se encuentra una proteína, que es activa como tiorredoxina y tiorredoxina-reductasa, siendo el extremo N-terminal de la proteína homólogo a la tiorredoxina-reductasa y el extremo C-terminal homólogo a tiorredoxina. Cuando se comparan las dos partes de proteína con las proteínas homólogas deE. coli,estas están unidas enM. lepraea través de un espaciador/ligador de 22 aminoácidos de longitud.
El objetivo de la presente invención es poner a disposición una proteína que pueda producirse de manera rentable para la reducción biocatalítica de cistina a cisteína, cuya actividad sea al menos tan alta como una mezcla de las proteínas conocidas en el estado de la técnica tiorredoxina y tiorredoxina-reductasa. Mediante la utilización de esta proteína en un procedimiento para la reducción enzimática de cistina a cisteína se pretende proporcionar un procedimiento especialmente eficiente y económico.
Este objetivo se alcanza mediante la provisión de una enzima para la reducción de cistina a cisteína, caracterizada porque en el caso de la enzima se trata de una proteína de fusión, que comprende las actividades proteicas de tiorredoxina (proteína i) con el número de la base de datos KEGG EC 1.8.4.8 o EC 1.8.4.10, tratándose en el caso de la tiorredoxina (proteína i) de la actividad proteica de tiorredoxina 1 deE. coli,y tiorredoxina-reductasa (proteína ii) con el número de la base de datos KEGG EC 1.8.1.9, tratándose en el caso de la tiorredoxina-reductasa (proteína ii) de la actividad proteica de la tiorredoxina-reductasa deE. coli,ascendiendo la actividad de la proteína de fusión a al menos el 100% de la actividad de una mezcla de la mismas proteínas individuales i y ii, pero no fusionadas, presentando la proteína de fusión la actividad enzimática de reducir cistina a cisteína y habiéndose fusionado las secuencias codificantes (cds) responsables de la actividad de proteína i y ii.
Según la invención, en el caso de la enzima para la reducción de cistina a cisteína se trata de una proteína de fusión, que comprende las actividades proteicas de proteína i y ii deE. coli.Esto significa que se fusionan las secuencias codificantes (cds) responsables de la actividad de proteína i (Trx, descrita en el número de la base de datos KEGG EC 1.8.4.8 o EC 1.8.4.10) y la actividad de proteína ii (TR, descrita en el número de la base de datos KEGG EC 1.8.1.9). Mediante la eliminación del codón de parada detrás de la primera cds se expresan ambas cds conjuntamente como una cds.
La actividad proteica de Trx es una oxidorreductasa, que presenta un puente disulfuro en el centro activo y puede encontrarse en un estado reducido u oxidado.
En la reacción se transfieren dos electrones de los dos grupos sulfhidrilo a un puente disulfuro (intra- o intermolecular). A ese respecto se forma un puente disulfuro intramolecular en Trx. El estado reducido de la Trx se restablece entonces mediante la actividad catalítica de la oxidorreductasa TR. Para ello son necesarios electrones, que se transfieren a la Trx con escisión del puente disulfuro.
Si una proteína como Trx y/o TR es activa con respecto a la cistina (cuando la proteína presenta ambas actividades denominada en lo sucesivo cistina reductasa/actividad CR) puede comprobarse con ayuda de la siguiente prueba: Por un lado, puede medirse fotométricamente el consumo de NADPH a 340 nm. En un enfoque con la proteína de fusión, el sustrato cistina y el cofactor NADPH se transfieren entonces electrones de NADPH a la cistina y se forma cisteína. Entonces puede hacerse un seguimiento fotométricamente del consumo de NADPH.
Alternativamente puede medirse también la cisteína que se genera en un enfoque de este tipo (a partir de proteína de fusión, cistina y NADPH). A ese respecto se aprovecha que el grupo -SH libre de la cisteína reacciona con DTNB (ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico; reactivo de Ellman) y forma un colorante. Esta unión de color Cys-TNB puede medirse a 412 nm. Por consiguiente, por medio de la evolución temporal puede medirse la actividad enzimática de la proteína de fusión con respecto a cistina.
En el caso de la tiorredoxina (proteína i) se trata de la actividad proteica de tiorredoxina 1 deE. coli.(abreviada en el marco de esta invención con TrxA).
En el caso de la tiorredoxina-reductasa (proteína ii) se trata de la actividad proteica de la tiorredoxina-reductasa deE. coli(abreviada en el marco de esta invención con TrxB).
En particular se prefiere que la proteína de fusión comprenda dos secuencias de aminoácidos, teniendo una secuencia de aminoácidos una identidad de al menos el 50%, preferiblemente al menos el 70% y de manera especialmente preferible al menos el 90% con respecto a SEQ ID n° 7 y la otra secuencia de aminoácidos una identidad de al menos el 50%, preferiblemente al menos el 70% y de manera especialmente preferible al menos el 90% con respecto a SEQ ID n.° 8 y presentando la proteína de fusión actividad CR.
Correspondientemente, la proteína de fusión se designa con TrxAB o TrxBA o TrxB5A, encontrándose en la proteína de fusión TrxAB la proteína TrxA de manera N-terminal con respecto a TrxB. Por el contrario, en la proteína de fusión TrxBA o TrxB5A la proteína TrxB se encuentra de manera N-terminal con respecto a TrxA. Se prefiere que en el caso de la proteína de fusión se trate de TrxAB, TrxBA o TrxB5A. En el caso de la proteína de fusión se trata de una fusión de las secuencias de aminoácidos de tiorredoxina A y tiorredoxina B deE. coli,preferiblemente de una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID mo 9, SEQ ID n ° 10 y SEQ ID mo 28.
En una forma de realización especialmente preferida, en el caso de la proteína de fusión se trata de TrxBA, en particular preferiblemente de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID mo 10.
El grado de identidad de ADN se determina mediante el programa “nucleotide blast”, que puede encontrarse en la página http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, que se basa en el algoritmo blastn. Como parámetros de algoritmo para una alineación de dos o más secuencias de nucleótidos se utilizaron los parámetros ajustados previamente. Los parámetros generales ajustados previamente son: secuencias diana máximas = 100; consultas cortas = “ajustar automáticamente parámetros para secuencias de entrada cortas”; umbral esperado = 10; tamaño de palabra = 28; ajustar automáticamente parámetros para secuencias de entrada cortas = 0. Los parámetros de puntuación ajustados previamente correspondientes son: puntuaciones de coincidencia/no coincidencia = 1 ,-2; costes de hueco = lineal.
Para la comparación de secuencias de proteínas se utiliza el programa “protein blast”, en la página http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/. Este programa recurre al algoritmo blastp. Como parámetros de algoritmo para una alineación de dos o más secuencias de proteínas se utilizaron los parámetros ajustados previamente. Los parámetros generales ajustados previamente son: secuencias diana máximas = 100; consultas cortas = “ajustar automáticamente parámetros para secuencias de entrada cortas”; umbral esperado = 10; tamaño de palabra = 3; ajustar automáticamente parámetros para secuencias de entrada cortas = 0. Los parámetros de puntuación ajustados previamente son: matriz = BLOSUM62; costes de hueco = existencia: 11 extensión: 1; ajustes composicionales = ajuste de matriz de puntuación composicional condicional.
En el marco de esta invención, las proteínas tales como TrxA, TrxB, TrxAB, TrxBA, TrxB5A o Ml-TrxBA empiezan con una letra en mayúscula, mientras que las secuencias que codifican estas proteínas (también abreviadas con cds) se denominan con una letra en minúscula (trxA, trxB, trxAB, trxBA, trxB5A o Ml-trxBA).
El término proteína de fusión significa en el marco de la invención que la proteína comprende las dos proteínas individuales tiorredoxina (Trx) y tiorredoxina-reductasa (TR). Se codifica por un gen, cuya región codificante comprende la región codificante para Trx y la región codificante de TR, de modo que estas se transcriben conjuntamente como una unidad y se traducen a un polipéptido.
Una ventaja especial en el uso de una proteína de fusión, que contiene Trx y TR, con respecto al uso de las dos proteínas individuales Trx y TR radica en la posición espacial de las dos proteínas: TR transfiere electrones a Trx, no teniendo que encontrarse Trx y TR hasta un proceso de difusión tridimensional, sino estando unidas entre sí en la proteína de fusión. Es decir, debido a la proximidad espacial, los electrones pueden llegar más fácilmente de una enzima a la otra. Mientras las proteínas individuales tienen que purificarse por separado, las actividades enzimáticas en la proteína de fusión se aíslan conjuntamente, lo que es igualmente una gran ventaja económica.
Preferiblemente, la proteína de fusión comprende adicionalmente una secuencia como ayuda para la purificación como de manera especialmente preferible una etiqueta de polihistidina (etiqueta His). Una etiqueta His es un apéndice de proteína, que puede usarse para la purificación de proteínas y para la detección de proteínas marcadas. La secuencia de aminoácidos de la etiqueta de polihistidina es una sucesión de al menos seis histidinas (6HIS), cuya secuencia génica se clona de manera N-terminal tras el codón de inicio de metionina o de manera C-terminal antes del codón de parada en la cds. De esa manera se genera una proteína de fusión con una etiqueta de polihistidina. Una proteína de fusión de las proteínas Trx y TR puede purificarse clonando solo una etiqueta His. Es decir, no solo son necesarias menos etapas de reacción para la purificación, sino que también se simplifica la estrategia de clonación.
Además es posible insertar una interfaz para una proteasa o una inteína entre la secuencia polipeptídica y la etiqueta His, para posibilitar una escisión de la etiqueta His tras una purificación de proteína.
Se prefiere que en la proteína de fusión la secuencia de aminoácidos de la proteína situada en el extremo N-terminal esté acortada de manera C-terminal en de uno a como máximo cinco aminoácidos. Se prefiere especialmente que en la proteína de fusión la secuencia de aminoácidos de la proteína situada en el extremo N-terminal esté acortada de manera C-terminal en un aminoácido.
Se prefiere que en la proteína de fusión la secuencia de aminoácidos de la proteína situada en el extremo C-terminal esté acortada de manera N-terminal en de uno a como máximo cinco aminoácidos, de manera especialmente preferible en un aminoácido. De manera especialmente preferible, a la proteína situada de manera C-terminal en la proteína de fusión le falta el codón de inicio. Esto último tiene la ventaja de que no existe el peligro de que en este punto se empiece de nuevo con la traducción.
Además se prefiere que en la proteína de fusión las secuencias de aminoácidos de las actividades proteicas fusionadas de tiorredoxina (proteína i) y tiorredoxina-reductasa (proteína ii) estén unidas mediante una secuencia ligadora de desde uno hasta como máximo cinco aminoácidos, de manera especialmente preferible de un aminoácido.
En particular se prefiere que en la proteína de fusión las secuencias de aminoácidos de las proteínas fusionadas tiorredoxina (proteína i) y tiorredoxina-reductasa (proteína ii) se sucedan directamente, es decir no hay ninguna secuencia ligadora.
Como ya se ha expuesto anteriormente, es ventajoso juntas las proteínas que actúan conjuntamente en una proteína de fusión, para mejorar su clonación, purificación y actividad. Sin embargo, para no obstaculizar el plegado o la interacción necesaria en este caso de las dos proteínas de fusión es apropiado el uso de una secuencia ligadora larga. Sin embargo, sorprendentemente se ha encontrado que en este caso una fusión directa de las dos proteínas (Trx, TR) conducía a un par de enzimas funcional. Esto se respalda mediante la constatación de que la actividad de la proteína de fusión depende del orden de la fusión. Así, la proteína de fusión TrxAB presentaba una actividad comparable con una mezcla de las proteínas individuales.
En la proteína de fusión TrxAB (SEQ ID n ° 9) falta en la secuencia TrxA (SEQ ID n.° 7) el codón de parada, mientras que de TrxB (SEQ ID mo 8) se delecionó el primer aminoácido (metionina, M). Además, la proteína porta una etiqueta His (aminoácido 1-12 en la SEQ ID mo 9). Entre el último aminoácido de TrxA (Ala) y el primer aminoácido de TrxB (Gly) tras la eliminación del codón de parada no hay ninguna secuencia ligadora.
En la proteína de fusión TrxBA (SEQ ID mo 10) falta en la secuencia TrxB (SEQ ID n ° 8) el último aminoácido (lisina) y el codón de parada, mientras que de TrxA (SEQ ID n ° 7) se deleción el primer aminoácido (metionina, M). Además, la proteína porta una etiqueta His (aminoácido 1-12 en la SEQ ID n° 10). Entre el penúltimo aminoácido de TrxB (Ala) y el primer aminoácido de TrxA (Ser) hay una secuencia ligadora de un aminoácido (Gly).
Para la proteína de fusión TrxB5A (SEQ ID n° 28) es válido lo mismo que se ha descrito para TrxBA, con la excepción de que hay una secuencia ligadora de cinco aminoácidos (Gly-Pro-Ala-Pro-Gly) entre TrxB y TrxA.
La región que codifica para la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión, que se encuentra entre un codón de inicio y uno de parada, se denomina secuencia codificante(coding sequence,cds). Las cds están rodeadas por regiones no codificantes. Se denomina gen al fragmento de ADN que contiene todas las informaciones básicas para la producción de una proteína biológicamente funcional. Un gen contiene el fragmento de ADN, a partir del que mediante transcripción se produce una copia de ARN monocatenaria y las señales de expresión, que están implicadas en la regulación de esta operación de copiado. A las señales de expresión pertenecen, por ejemplo, al menos un promotor, un inicio de transcripción, uno de traducción y un sitio de unión al ribosoma. Por lo demás es posible una regulación de la expresión mediante un terminador y uno o varios operadores.
Para un promotor funcional es válido que la cds que se encuentra bajo la regulación de este promotor se transcribe a un ARN.
El fragmento de ADN que codifica proteína i de la proteína de fusión (tiorredoxina) puede amplificarse en primer lugar por medio de PCR usando oligonucleótidos como cebador y una matriz de ADN, que codifica tiorredoxina, por ejemplo, ADN genómico aislado deE. coli,y a continuación unirse con técnicas de biología molecular habituales en cada caso con la molécula de ADN, que comprende la secuencia de proteína ii de la proteína de fusión (tiorredoxina-reductasa) y que se generó de manera análoga, de tal manera que se genere una fusión en marco. El segundo codón de inicio, presente en la proteína de fusión entre las proteínas i y ii, del compañero de fusión situado de manera C-terminal puede delecionarse para evitar un marco de lectura alternativo. En el sitio de transición de los dos compañeros de fusión pueden insertarse secuencias ligadoras de diferente longitud.
Alternativamente a la fusión a través de sitios de clonación puede producirse toda la molécula de ADN por medio de síntesis génica. Esta molécula de ADN puede introducirse entonces o bien en un vector, por ejemplo, un plásmido, o bien integrarse directamente según métodos conocidos en el cromosoma de la cepa bacteriana. Preferiblemente, la molécula de ADN se introduce en un plásmido, tal como, por ejemplo, un derivado de vectores de expresión conocidos tales como pJF118EH, pKK223-3, pUC18, pBR322, pACYC184, pASK-IBA3, pGJ3477 o pET.
Se prefiere que la molécula de ADN porte principalmente la secuencia codificante de la proteína de fusión y pocos nucleótidos adicionales y se clone en el plásmido de modo que esta se clone a una determinada distancia del promotor y terminador, es decir la molécula de ADN se clona en el sentido de 3’ de una región que codifica el promotor y en el sentido de 5’ de una región que codifica el terminado en el plásmido.
Como promotores son adecuados todos los promotores conocidos por el experto en la técnica, tal como promotores constitutivos, por ejemplo, el promotor GAPDH, o promotores inducibles tales como, por ejemplo, el promotor lac, tac, trc, lambda PL, araB, cumato o tet o secuencias derivadas de los mismos. La proteína de fusión se expresa de manera especialmente preferible bajo el control del promotor araB inducible mediante arabinosa (P<bad>).
Los plásmidos utilizados pueden portar marcadores de selección. Como marcadores de selección son adecuados los genes, que codifican para una resistencia frente a antibióticos tales como, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, kanamicina u otros. Preferiblemente, el plásmido contiene un gen, cuya expresión media en la resistencia a ampicilina. Además los marcadores auxotróficos son adecuados como marcadores de selección, dado que estos codifican para un gen esencial en el metabolismo, que está delecionado en la respectiva cepa bacteriana, que contiene el plásmido.
Los plásmidos pueden introducirse empleando métodos conocidos por el experto en la técnica en las células de una cepa bacteriana (transformación). La cepa bacteriana está caracterizada preferiblemente porque en el caso de la cepa bacteriana se trata de bacterias gram negativas, de manera especialmente preferible de una cepa bacteriana del géneroEnterobacteriaceae,en particular preferiblemente de una cepa de la especieEscherichia coli (E. coli).
La cepa bacteriana que contiene el plásmido puede usarse en un procedimiento de fermentación, es decir las células bacterianas pueden multiplicarse en medio, preferiblemente en medio LB selectivo (correspondientemente al marcador de selección contenido en el plásmido), separarse del medio tras el cultivo mediante sedimentación y desechado del sobrenadante y lisarse. La proteína de fusión expresada puede aislarse entonces, por ejemplo, por medio de cromatografía de afinidad (por ejemplo, a través de una etiqueta His, véase anteriormente).
La enzima según la invención tiene la ventaja de que puede producirse de manera fermentativa en alto rendimiento y por tanto de manera económica. La producción también es especialmente efectiva desde el punto de vista económico y ventajosa porque solo tiene que producirse, purificarse y aislarse una proteína de fusión en lugar de dos proteínas independientes.
Es ventajoso que la enzima pueda regenerarse mediante un cofactor tal como NADPH o NADH como donador de electrones y con ello como agente reductor, dado que ya existen sistemas regeneradores de NADPH o NADH.
Las actividades enzimáticas de Trx y TR pueden determinarse a través de la conversión del cofactor, por ejemplo, fotométricamente a 340 nm. Esto es posible dado que el coeficiente de extinción varía significativamente a 340 nm durante la transición del estado reducido (NADPH/NADH) al oxidado (NADP/NAD).
Durante la medición de las actividades enzimáticas de los diferentes constructos (proteínas de fusión) o de las diferentes relaciones de mezclado de las proteínas individuales fue sorprendente y no predecible para el experto en la técnica que la actividad de la proteína de fusión ascendiese al menos al 100%, preferiblemente al menos al 150% y en particular preferiblemente al menos al 200% de la actividad de una mezcla de las mismas proteínas individuales, pero no fusionadas, tiorredoxina y tiorredoxina-reductasa. Esto significa que la actividad de la proteína de fusión es igual de alta o mayor, en comparación con la actividad de una mezcla de las mismas proteínas individuales, pero no fusionadas, i y ii.
En detalle, esto significa que en cada caso, aparte de los controles negativos sin cofactor o sustrato, se dispuso previamente la misma mezcla básica de reacción a partir de sustrato, cofactor y sistema de tampón. Tras la adición de la misma cantidad de proteína de fusión en una mezcla básica o de las proteínas individuales i (Trx) y ii (TR) en otra mezcla básica se determinó la conversión de cofactor, en el mismo tiempo usando las mismas condiciones de reacción. Alternativamente, es igualmente posible detectar la cantidad de sustrato decreciente o la cantidad de producto creciente.
Preferiblemente, la enzima está caracterizada porque el gen de la proteína de fusión comprende una secuencia de ADN, de la una presenta una identidad de al menos el 50%, preferiblemente al menos el 70% y de manera especialmente preferible al menos el 90% con respecto a SEQ ID n.° 2 y la otra una identidad de al menos el 50%, preferiblemente al menos el 70% y de manera especialmente preferible al menos el 90% con respecto a SEQ ID n° 3.
En una forma de realización especialmente preferida, en el caso de la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión se trata de SEQ ID mo 5.
Un objeto adicional de la invención es un procedimiento para la reducción enzimática de cistina a cisteína, caracterizado porque se reduce cisteína con la enzima según la invención en presencia de un cofactor.
En la reducción enzimática de cistina a cisteína se transforma un disulfuro (-S-S-) a dos grupos sulfhidrilo (-SH), es decir a partir de una molécula del compuesto químico cistina se generan dos moléculas de L-cisteína. La proteína de fusión según la invención cataliza la reducción y transfiere electrones al disulfuro de la cistina.
A ese respecto fue sorprendente que en particular la actividad de la proteína de fusión TrxBA era claramente mayor que la actividad de una mezcla de las mismas proteínas individuales, pero no fusionadas, TrxA y TrxB (véase el ejemplo 4, Fig. 4).
Una ventaja especial del procedimiento según la invención radica en que la cisteína producida con el procedimiento puede declararse como cisteína natural según el Reglamento sobre aromas.
Un reto adicional para un procedimiento económico consistía en la mala solubilidad de la cistina en sistemas de tampón en un intervalo de pH neutro (o en un intervalo de pH fisiológico, es decir a un valor de pH de ~ pH 7,4).
El procedimiento tiene lugar preferiblemente en un intervalo de pH de desde 4 hasta 11, de manera especialmente preferible desde 5 hasta 10 y en particular preferiblemente desde 6 hasta 9.
Es especialmente ventajoso y por tanto se prefiere además especialmente que la enzima según la invención se utilice en un procedimiento para la reducción enzimática de cistina a cisteína a un valor de pH fisiológico.
El procedimiento tiene lugar preferiblemente a una temperatura de desde 20 hasta 40°C, de manera especialmente preferible desde 25 hasta 30°C.
El procedimiento está caracterizado preferiblemente porque en el caso del cofactor se trata de una sustancia seleccionada del grupo que consiste en NADPH y NADH. De manera especialmente preferible, en el caso del cofactor se trata de NADPH.
Preferiblemente, el procedimiento está caracterizado porque tras la reducción se aísla la cisteína formada. Para la purificación adicional del producto diana pueden utilizarse las siguientes etapas/procedimientos:
- aislamiento de la L-cisteína mediante adsorción de intercambio iónico
- cristalización por precipitación
Tales procedimientos se conocen por el estado de la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 2013/000864). En la reducción de cistina a cisteína se oxida la enzima según la invención, es decir transfiere electrones de cistina configurando un puente disulfuro. Dado que los electrones los cofactor presente NADPH o NADH se transfieren mediante la actividad de la proteína de fusión (parte TR) a la proteína de fusión (parte Trx), se genera NADP+ o NAD+. Por este motivo se prefiere que el procedimiento contenga una enzima regeneradora de cofactor. De manera especialmente preferible, en el caso de la enzima regeneradora de cofactor se trata de una deshidrogenasa, teniendo lugar la reducción adicionalmente en presencia de un donador de electrones adicional.
En el caso de la enzima regeneradora de cofactor puede tratarse de una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y/o la alcohol deshidrogenasa. En una forma de realización especialmente preferida, en el caso de la deshidrogenasa se trata de la alcohol deshidrogenasa, usándose isopropanol como donador de electrones.
La invención se explica a continuación más detalladamente mediante ejemplos de realización.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación del sistema de cistina reductasa TrxA, TrxB, TrxBA y TrxAB
Preparación del vector de expresión:
Como vector para la expresión de las secuencias de ADN que codifican para las proteínas candidatas correspondientes TrxA, TrxB, TrxAB, TrxBA, TrxB5A o Ml-TrxBA se selección el plásmido de expresión pGJ3477. A ese respecto se trata de un plásmido de copia media a alta (50-60 copias por célula) basado en el origen de replicación ColE1. El mapa de plásmidos se representa en la Fig. 1, indicándose las posiciones de enzimas de restricción habituales, que cortan solo una vez (con secuencia de reconocimiento de 6 bases), en el mapa de plásmidos. La secuencia se indica en SEQ ID n .o 11.
En este plásmido se puso la secuencia codificante del respectivo candidato bajo el control del promotor inducible mediante arabinosa P<bad>.
En primer lugar se amplificó todo el plásmido de expresión por medio de PCR inversa:
- 50 ng de ADN de pGJ3477, 0,5 pmol del respectivo cebador 3477-directo (SEQ ID n.° 12) y 3477-inverso (SEQ ID mo 13), tampón de reacción Q5® (New England Biolabs, NEB), 1 unidad de ADN polimerasa Q5® (NEB) en un volumen final de 50 ul.
- Programa de PCR: 1 min 98°C, entonces 30 ciclos con 30 s 98°C, 30 s 65°C (hibridación) y 2 min 72°C (síntesis).
Tras la finalización de la reacción se añadió a la mezcla de reacción la enzima de restricción Dpnl (10 unidades, NEB) y se incubó la mezcla básica durante 1 hora a 37°C. A continuación tuvo lugar la purificación cromatográfica del ADN (Macherey & Nagel: gel NucleoSpin® y kit de purificación de PCR).
Clonación de trxA y trxB:
Para la clonación de las secuencias codificantes de proteína trxA (SEQ ID mo 2) y trxB (SEQ ID n ° 3) se determinaron cebadores oligonucleotídicos, cuyas secuencias específicas del gel diana se prolongaron en al menos 15 nucleótidos, que se solapaban con las secuencias en el extremo del ADN de vector. Los genes se amplificaron por medio de PCR a partir del genoma deE. co lide BL21 (PCR de colonias).
Para la amplificación por medio de PCR se seleccionaron las siguientes mezclas básicas:
- 50 ng del ADN de BL21 deE. co ligenómico (NEB), 0,5 pmol del respectivo cebador trxA-directo (SEQ ID n° 14) y trxA-inverso (SEQ ID mo 15) o trxB-directo (SEQ ID mo 16) y trxB-inverso (SEQ ID n° 17), tampón de reacción Q5® (NEB), 1 unidad de ADN polimerasa Q5® (NEB) en un volumen final de 50 pl.
- Programa de PCR: 1 min 98°C, entonces 30 ciclos con 30 s 98°C, 30 s 60°C (hibridación) y 15 s (trxA) o 30 s (trxB) 72°C (síntesis).
Tras la finalización de la reacción se añadió a la mezcla de reacción la enzima de restricción DpnI (10 unidades, NEB) y se incubó la mezcla básica durante 1 hora a 37°C. A continuación tuvo lugar la purificación cromatográfica del ADN (Macherey & Nagel: gel NucleoSpin® y kit de purificación de PCR).
LIC-PCR:
En general se introdujeron las secuencias de ADN que codifican proteína a través de LIC-PCR (clonación independiente de ligación de productos de PCR) tal como se describe en Aslanidis C. y de Jong P. J., Nucleic Acids Res. 18, S. 6069-6074) de manera exacta en cuanto a las bases en el vector de expresión básico pGJ3477.
Con este fin se utilizaron 50 ng del ADN codificante purificado de la respectiva proteína candidata junto con 50 ng del ADN de vector preparado en la reacción de LIC-PCR.
La mezcla básica de LIC-PCR se transformó entonces con métodos estándar en células XL1-blue deE. coliy se sembraron en placa sobre medio LB selectivo (LB 100 mg/l de ampicilina) y se incubaron durante 18 h a 37°C. Para la identificación de clones correctos se aisló ADN de plásmido de las colonias obtenidas y se secuenció completamente el casete de expresión.
Los plásmidos resultantes, que se componían del vector de expresión pGJ3477 y de la secuencia de ADN codificante trxA o trxB, se denominaron en lo sucesivo vector de expresión de trxA o trxB.
Clonación de trxAB y trxBA:
La clonación de las trxAB y trxBA de ADN que codifican las proteína de fusión TrxAB o TrxBA correspondiente tuvo lugar de manera análoga a la clonación de trxA y trxB tal como se describió anteriormente mediante la inserción de la secuencia trxA en el vector de expresión de trxB por medio de LIC-PCR entre la etiqueta his N-terminal y la secuencia trxB que codifica la proteína TrxB o mediante la inserción de la secuencia trxB en el vector de expresión de trxA por medio de LIC-PCR entre la etiqueta his y la secuencia trxA que codifica la proteína TrxA:
Para la amplificación por medio de PCR se seleccionaron las siguientes mezclas básicas:
- El ADN de vector (vector de expresión de trxA o trxB) se amplificó por medio de PCR inversa con los cebadores vtrxA-directo (SEQ ID n.° 18) y 3477-inverso (SEQ ID n.° 13) o vtrxB-directo (SEQ ID n° 21) y 3477-inverso (SEQ ID n ° 13), seleccionándose el siguiente programa de PCR: 2 min 98°C, entonces 30 ciclos con 45 s 98°C/30 s 602C/2,5 min 72°C.
- Los fragmentos génicos de trxA o trxB para las proteínas de fusión se amplificaron por medio de PCR con los cebadores ftrxA-directo (SEQ ID n ° 22) y ftrxA-inverso (SEQ ID mo 23) o ftrxB-directo (SEQ ID mo 19) y ftrxB-inverso (SEQ ID n° 20), seleccionándose el siguiente programa de PCR: 2 min 98°C -> entonces 30 ciclos con 45 s 98°C/30 s 60°C/15 s 72°C. Como molde se usó ADN genómico de BL21.
Tras la finalización de las reacciones de PCR se añadió a la respectiva mezcla de reacción la enzima de restricción DpnI (10 unidades, NEB) y se incubó la mezcla básica durante 1 hora a 37°C. A continuación tuvo lugar la purificación cromatográfica del ADN de inserto (Macherey & Nagel; gel NucleoSpin® and kit de purificación de PCR).
Para la reacción de LIC-PCR se usaron 50 ng del ADN de vector amplificado del vector de expresión de trxA o trxB y 75 ng del ADN de inserto (trxB o trxA). La mezcla básica de LIC-PCR se transformó entonces con métodos estándar en células XL1 -blue deE. co liy se sembró en placa sobre medio LB selectivo (LB 100 mg/l de ampicilina) y se incubó durante 18 h a 37°C. Para la identificación de clones correctos se aisló ADN de plásmido de las colonias obtenidas y se secuenció completamente el casete de expresión.
Las SEQ ID n° 9 o SEQ ID n ° 10 indican las secuencias de aminoácidos, que resultante de la expresión de las secuencias SEQ ID mo 4 o SEQ ID n ° 5, de las proteínas de fusión TrxBA y TrxAB.
Ejemplo 2: Clonación de la cistina reductasa Ml-TrxBA
Como se ha descrito al principio,Mycobacterium lepraepresenta un fragmento génico, que codifica para la proteína con homología a tiorredoxina (Trx) y tiorredoxina-reductasa (TR) (Wieles B.et al.1995, J. Biol. Chem. 270, págs.
25604-25606). La secuencia puede extraerse de las bases de datos públicas (secuencia de referencia NCBI: WP_010909042.1).
La secuencia extraída de las bases de datos públicas se adaptóin silicoa la utilización de codón del huéspedE. coli.Para esto se utilizó el servidor web de la empresa IDT (www.idtdna.com). Para la clonación en el vector diana pGJ3477 se prolongó la región codificante en el extremo 5’y 3’ con secuencias, que se solapan con la secuencia de vector (véase también Clonación de trxA y trxB). La secuencia completa de ADN resultante se produjo sintéticamente por la empresa Geneart (www.thermofisher.com) (indicada en SEQ ID mo 24) y se designa con Ml-trxBA (sinónimo ml-trxBA).
La clonación de la secuencia Ml-trxBA sintética tuvo lugar en el vector pGJ3477 en analogía con la clonación de los vectores de expresión de trxA y trxB por medio de LIC-PCR.
Para la clonación de la secuencia que codifica proteína Ml-trxBA (SEQ ID n° 24) se determinaron cebadores oligonucleotídicos, cuyas secuencias específicas del gen diana se prolongaron en al menos 15 nucleótidos, que se solapaban con las secuencias en el extremo del ADN de vector. Como molde sirvió el gen sintético.
Para la amplificación por medio de PCR se seleccionaron las siguientes mezclas básicas:
- 20 ng del molde (Geneart), 0,5 pmol del respectivo cebador Ml-trxBA-directo (SEQ ID n ° 25) y Ml-trxBA-inverso (SEQ ID n.o 26), tampón de reacción Q5® (NEB), 1 unidad de ADN polimerasa Q5® (NEB) en un volumen final de 50 pl.
- Programa de PCR: 1 min 98°C, entonces 30 ciclos con 30 s 98°C, 30 s 60°C (hibridación) y 60 s 72°C (síntesis).
Tras la finalización de la reacción se añadió a la mezcla de reacción la enzima de restricción DpnI (10 unidades, NEB) y se incubó la mezcla básica durante 1 hora a 37°C. A continuación tuvo lugar la purificación cromatográfica del ADN (Macherey & Nagel: gel NucleoSpin® y kit de purificación de PCR).
LIC-PCR:
La secuencia de ADN que codifica proteína se introdujo a través de LIC-PCR (clonación independiente de ligación de productos de PCR) tal como se describe en Aslanidis C. y de Jong P. J., Nucleic Acids Res. 18, págs. 6069-6074) de manera exacta en cuanto a las bases en el vector de expresión básico pGJ3477.
Con este fin se utilizaron 50 ng del ADN codificante purificado junto con 60 ng del ADN de vector preparado en la reacción de LIC-PCR.
La mezcla básica de LIC-PCR se transformó entonces con métodos estándar en células XL1-blue deE. coliy se sembró en placa sobre medio LB selectivo (LB 100 mg/l de ampicilina) y se incubó durante 18 h a 37°C. Para la identificación de clones correctos se aisló ADN de plásmido de las colonias obtenidas y se secuenció completamente el casete de expresión.
El plásmido resultante, que se componía del vector de expresión pGJ3477 y de la secuencia de ADN codificante MltrxBA, se designó en lo sucesivo vector de expresión de Ml-trxBA.
Ejemplo 3: Clonación de la cistina reductasa TrxB5A (con secuencia ligadora)
Clonación de trxB5A:
La clonación de la trxB5A de ADN que codifica la proteína de fusión correspondiente TrxB5A tuvo lugar de manera análoga a la clonación de trxBA tal como se describió anteriormente mediante la inserción de una secuencia TrxB prolongada de manera C-terminal en 5 aminoácidos (denominada en lo sucesivo TrxB5, o la cds trxB5) en el vector de expresión de trxA por medio de LIC-PCR entre la etiqueta his y la secuencia trxA que codifica la proteína TrxA: Para la amplificación por medio de PCR se seleccionaron las siguientes mezclas básicas:
- El ADN de vector (vector de expresión de trxA) se amplificó por medio de PCR inversa con los cebadores vtrxA5-directo (SEQ ID n ° 29) y 3477-inverso (SEQ ID n.° 13), seleccionándose el siguiente programa de PCR: 2 min 98°C, entonces 30 ciclos con 45 s 98°C/30 s 60°C/2,5 min 72°C.
- trxB5 se amplificó por medio de PCR con los cebadores ftrxB-directo (SEQ ID mo 19) y ftrxB5-inverso (SEQ ID mo 30), seleccionándose el siguiente programa de PCR: 2 min 98°C -> entonces 30 ciclos con 45 s 98°C/30 s 60°C/15 s 72°C. Como molde se usó AdN genómico de BL21.
Tras la finalización de las reacciones de PCR se añadió a la respectiva mezcla de reacción la enzima de restricción DpnI (10 unidades, NEB) y se incubó la mezcla básica durante 1 hora a 37°C. A continuación tuvo lugar la purificación cromatográfica del ADN de inserto (Macherey & Nagel; gel NucleoSpin® and kit de purificación de PCR).
Para la reacción de LIC-PCR se usaron 50 ng del ADN de vector amplificado del vector de expresión de trxA y 75 ng del ADN de inserto (trxB5).
La mezcla básica de LIC-PCR se transformó entonces con métodos estándar en células XL1-blue deE. coliy se sembró en placa sobre medio LB selectivo (LB 100 mg/l de ampicilina) y se incubó durante 18 h a 37°C. Para la identificación de clones correctos se aisló ADN de plásmido de las colonias obtenidas y se secuenció completamente el casete de expresión.
SEQ ID n ° 28 indica la secuencia de aminoácidos, que resulta de la expresión de la secuencia SEQ ID n ° 27, de la proteína de fusión TrxB5A.
Ejemplo 4: Actividad enzimática de las cistina reductasas
Para la expresión recombinante de las proteínas TrxA, TrxB, TrxBA, TrxB5A, TrxAB y Ml-TrxBA se introdujeron los plásmidos de expresión comprobados, que codifican la proteína correspondiente, en la cepa deE. coliTOP10 (Thermo_Fisher Scientific, MA/EE. UU.). Las células bacterianas se sembraron en placa sobre medio LB con 100 mg/l de ampicilina. A continuación se inyectaron 25 ml de medio LB, que contenía 100 mg/l de ampicilina y un 0,2% de arabinosa (p/v), con una colonia individual y se incubó 18 h a 28°C en el armario agitador de cultivo.
Para aislar las proteínas expresadas se hicieron sedimentar las células mediante centrifugación (10 min 4000 g), se retiró el sobrenadante de medio y se resuspendió la biomasa en tampón de lisis (PBS BugBuster al 10% (Sigma)). Las células se lisaron completamente de manera correspondiente a las indicaciones del fabricante en el manual del kit BugBuster (Sigma) en 15 min a TA y a continuación se separaron los componente insolubles por centrifugación (20 min 9500 rpm correspondientemente a las indicaciones del fabricante). Para la purificación del sobrenadante (= lisado celular) por medio de cromatografía de afinidad se aplicó el lisado celular obtenido a columnas Protino IDA2000 equilibradas con PBS (Macherey & Nagel). Tras una etapa de lavado (7 ml de PBS) se eluyeron las muestras con 5 ml de tampón de elución (PBS imidazol 200 mM). Las concentraciones de proteína obtenidas se determinaron por medio del ensayo de Bradford (Thermo_Fiseher).
Para la determinación de la actividad cistina-reductasa de las diferentes enzimas TrxA, TrxB, TrxBA, TrxB5A, TrxAB o Ml-TrxBA se usaron los dos métodos de análisis descritos en detalle a continuación.
1. El primer método consistía en el método de detección fotométrico, que se basa en el consumo de NADPH o la caída condicionada por el mismo de los valores de extinción a 340 nm en la reacción de reducción. Como se representa esquemáticamente en la Fig. 2, la conversión enzimática de cistina durante la reducción a cisteína va acompañada del consumo del cofactor NADPH.
Para la determinación fotométrica se usó la siguiente mezcla básica de ensayo, ascendiendo el volumen final de las muestras a 1 ml:
• tampón fosfato 100 mM pH 7,4
• EDTA 2 mM
• NADPH 0,2 mM (Sigma)
• cistina 1 mM (Wacker Chemie AG)
• Tras mezclar todos los componentes de ensayo excepto la enzima tuvo lugar el inicio de la reacción mediante la adición de enzima: 10 ug de enzima TrxA, TrxB, una mezcla de TrxA y TrxB, TrxBA, TrxB5A, TrxAB o Ml-TrxBA. Las mezclas básicas de ensayo se incubaron hasta la medición descrita más adelante a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C).
La concentración de NADPH de las diferentes mezclas básicas de ensayo de 1 ml se midió en diferentes puntos de tiempo con ayuda de un espectrofotómetro (espectrofotómetro UV-Vis Evolution 201, Thermo Fiseher Scientific) en forma de los valores de extinción a 340 nm. A partir de los valores de extinción a 340 nm se calculó por medio del software Thermo INSIGHT del fabricante Thermo Fiseher Scientific la actividad enzimática de las diferentes muestras. Como controles negativos se analizaron en cada caso en paralelo muestras, que contenían o bien enzima inactivada por calor, ninguna enzima, nada de cistina como sustrato o bien nada de NADPH como cofactor.
La actividad enzimática se determinó a partir de la pendiente lineal al principio de la curva dibujada, indicando la variación de la extinción (disminución) a lo largo del tiempo, la velocidad del consumo de NADPH. Dado que siempre se utiliza la misma cantidad de enzima, pueden compararse las velocidades.
2. El segundo método detectó la cisteína generada por la actividad cistina-reductasa a partir de cistina directamente mediante el grupo SH libre mediante la reacción con el compuesto DTNB (ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico; reactivo de Ellman), tal como se representa esquemáticamente en la Fig. 3, denominado en el marco de esta invención también ensayo<d>T<n>B.
Para la fotometría se usó la siguiente mezcla básica de ensayo, ascendiendo el volumen final de las muestras a 1 ml:
• tampón fosfato 100 mM pH 7,4
• EDTA 2 mM
• 0,2 mM NADPH (Sigma)
• cistina 1 mM (Wacker Chemie AG)
• Tras mezclar todos los componentes de ensayo excepto la enzima tuvo lugar el inicio de la reacción mediante la adición de enzima: 10 |jg de enzima TrxA, TrxB, una mezcla de TrxA y TrxB, TrxBA, TrxB5A, TrxAB o Ml-TrxBA. Las mezclas básicas de ensayo se incubaron hasta la medición descrita más adelante a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C).
La cuantificación de L-cisteína tuvo lugar mediante la prueba descrita por Lee S.-H.et al.1995 (Biochemical and Biophysical Research Communications 213, págs. 837-844) por medio de ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB). La cuantificación de Cys-TNB tuvo lugar mediante la medición de la extinción mediada por DTNB a 412 nm. También es posible un análisis a través de HPLC.
Como controles negativos se analizaron en cada caso en paralelo muestras, que contenían o bien enzima inactivadas por calor, ninguna enzima, nada de cistina como sustrato o nada de NADPH como cofactor.
La Fig. 4 muestra la actividad cistina-reductasa relativa de las enzimas TrxBA, TrxB5A, TrxAB y Ml-Trx así como de una mezcla (9:1) de TrxA y TrxB tras determinación fotométrica tal como se describió anteriormente en el punto 1, normalizándose la actividad de la mezcla (9:1) de TrxA y TrxB a 1 y poniéndose en relación de la misma todas las demás actividades. En el caso de la mezcla (9:1) de TrxA y TrxB se trata de una relación de mezcla estimada de las enzimas individuales, que ensayos comparativos ha resultado ser la relación de mezcla más activa.
La Fig. 5 muestra la detección de la formación de cisteína mediante TrxBA y TrxAB según el ensayo DTNB y HPLC tal como se describió anteriormente en el punto 2.
La utilización de clones, que contenían una secuencia ligadora más larga que TrxB5A en el intervalo de >60 nucleótidos entre las cds para TrxA y TrxB, condujo sorprendentemente a una actividad significativamente menor de la proteína de fusión.
Ejemplo 5: Actividad de la combinación de enzimas cistina reductasa y ADH
Si se compara la especificidad enzimática con respecto a los cofactores NADPH y NADP+, entonces las cistina reductasas TrxBA y TrxAB son altamente específicas para el cofactor NADPH. En las pruebas, con NADP+ no pudo detectarse ninguna actividad enzimática con respecto a cistina.
En experimentos de combinación se estudió en qué medida la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) puede transformar NADP+ para la reacción de nuevo a NADPH.
Para ello se usaron las siguientes condiciones:
tampón fosfato 100 mM pH 7,4
5 gl de isopropanol
EDTA 2 mM
NADPH o NADP+ 15-50 gM
cistina 1 mM
5 gg de enzima T rxBA
50 gl de extracto bruto de lisado celular o como control negativo 50 gl de tampón fosfato (digestión Fast Prep de 0,5 ml de células en 1,5 ml de 4x tampón fosfato pH 7,4. Producción de las células tal como se describe en el documento EP 1832658 B1)
La reacción se incubó durante 60 min a 30°C. A intervalos de 5 min se tomaron muestras y se derivatizó la cisteína liberada con DTNB tal como se describe en el documento WO 2013/000864 A1. La cuantificación tuvo lugar mediante la medición de la extinción mediada por DTNB a 412 nm.
La Fig. 6 muestra el resultado de la medición de la formación de cisteína mediante TrxBA por medio del ensayo DTNB en presencia (con) o en ausencia (sin) de ADH como sistema regenerativo.
Abreviaturas usadas en las figuras
AraC: gen AraC (gen represor)
pAraC: promotor del gen AraC (gen represor; orientación inversa al P<bad>)
pBAD (en el marco de esta invención también designado con P<bad>): promotor inducible por arabinosa para la expresión (en el sentido de 3’) de secuencias de proteína diana insertadas
6HIS: región codificante para etiqueta His
term: terminador para la transcripción
Amp: marcador de resistencia a ampicilina
CR: cistina reductasa
rel.: relativo
pb: pares de bases
t: tiempo
Claims (12)
- REIVINDICACIONES1 Enzima para la reducción de cistina a cisteína,caracterizada porqueen el caso de la enzima se trata de una proteína de fusión, que comprende las actividades proteicas dei) tiorredoxina (proteína i) con el número de la base de datos KEGG EC 1.8.4.8 o EC 1.8.4.10,tratándose en el caso de la tiorredoxina (proteína i) de la actividad proteica de tiorredoxina 1 deE. coli,y ii) tiorredoxina-reductasa (proteína ii) con el número de la base de datos KEGG EC 1.8.1.9,tratándose en el caso de la tiorredoxina-reductasa (proteína ii) de la actividad proteica de la tiorredoxina-reductasa deE. coli,ascendiendo la actividad de la proteína de fusión a al menos el 100% de la actividad de una mezcla de las mismas proteínas individuales, pero no fusionadas, i y ii,presentando la proteína de fusión la actividad enzimática de reducir cistina a cisteína yhabiéndose fusionado las secuencias codificantes (cds) responsables de la actividad de proteína i y ii.
- 2. - Enzima según la reivindicación 1,caracterizada porquela proteína de fusión comprende dos secuencias de aminoácidos,- teniendo una secuencia de aminoácidos una identidad de al menos el 50% con respecto a SEQ ID n.° 7 y - teniendo la otra secuencia de aminoácidos una identidad de al menos el 50% con respecto a SEQ ID n° 8 y presentando la proteína de fusión actividad CR (actividad cistina reductasa).
- 3. - Enzima según una o varias de las reivindicaciones 1 o 2,caracterizada porqueen la proteína de fusión la secuencia de aminoácidos de la proteína situada en el extremo N-terminal está acortada de manera C-terminal en de uno a como máximo cinco aminoácidos.
- 4. - Enzima según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3,caracterizada porqueen la proteína de fusión la secuencia de aminoácidos de la proteína situada en el extremo C-terminal está acortada de manera N-terminal en de uno a como máximo cinco aminoácidos.
- 5. - Enzima según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4,caracterizada porqueen la proteína de fusión la secuencia de aminoácidos de las actividades proteicas fusionadas de tiorredoxina (proteína i) y tiorredoxina-reductasa (proteína ii) está unida mediante una secuencia ligadora de desde uno hasta como máximo cinco aminoácidos.
- 6. - Enzima según una o varias de las reivindicaciones 1 a 5,caracterizada porqueen el caso de la proteína de fusión se trata de una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID n° 9, SEQ ID n° 10 y SEQ ID mo 28.
- 7. - Procedimiento para la reducción enzimática de cistina a cisteína,caracterizado porquese reduce cistina con una enzima según una de las reivindicaciones 1 a 6 en presencia de un cofactor, generándose a partir de una molécula del compuesto químico cistina dos moléculas de L-cisteína.
- 8. - Procedimiento según la reivindicación 7,caracterizado porquela reducción tiene lugar a un valor de pH de desde 6 hasta 9.
- 9. - Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 7 u 8,caracterizado porqueen el caso del cofactor se trata de una sustancia seleccionada del grupo que consiste en NADPH y NADH.
- 10. - Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 7 a 9,caracterizado porquecontiene una enzima regeneradora de cofactor.
- 11. - Procedimiento según la reivindicación 10,caracterizado porqueen el caso de la enzima regeneradora de cofactor se trata de una deshidrogenasa, teniendo lugar la reducción adicionalmente en presencia de un donador de electrones.
- 12. - Procedimiento según la reivindicación 11,caracterizado porqueen el caso de la deshidrogenasa se trata de la alcohol deshidrogenasa, usándose isopropanol como donador de electrones.
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