CN102336816A

CN102336816A - 日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR功能抑制肽及其应用

Info

Publication number: CN102336816A
Application number: CN2011103014854A
Authority: CN
Inventors: 余传信; 宋丽君; 殷旭仁; 王玠; 钱春艳; 梁幼生
Original assignee: Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Current assignee: Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Priority date: 2011-10-09
Filing date: 2011-10-09
Publication date: 2012-02-01

Abstract

日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR功能抑制肽及其应用，属于生物技术的分子生物学与生物化学等技术领域。本发明提供了抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）活性的抑制肽，所述的抑制肽氨基酸序列分别为：JIPDys1：WPHNWWPHFKVK；JIPDys2：LHAETRSAMHRT；JIPDys3：YTMPSLTLYAMG；及所述的SjTGR活性抑制肽在制备治疗血吸虫病新药或治疗用药物靶向载体制备方面的应用。本发明筛选到的三条噬菌体展示肽对日本血吸虫生存必须蛋白分子-硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）的硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶及谷氧还蛋白活性均具有抑制作用；为开发新的血吸虫病治疗药物奠定了良好的基础，对控制血吸虫病流行有重要的意义。

Description

日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR功能抑制肽及其应用

技术领域

本发明涉及采用噬菌体展示技术从噬菌体展示肽库中筛选能抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）酶活性的抑制肽，可破坏血吸虫生化代谢过程中的氧化还原平衡，导致血吸虫死亡，适用于新的血吸虫病治疗药物的研究。属于生物技术的分子生物学与生物化学等技术领域。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人类健康的人畜共患病，全球有76个国家有血吸虫病流行，有约6亿人口受到血吸虫感染的威胁，血吸虫病人有2000多万。经过60年不懈努力，我国仍有约2.4亿人口受血吸虫感染威胁，有血吸虫病人36万余人，血吸虫病流行的自然条件依然存在。由于仍没有可用的血吸虫病疫苗，血吸虫病的防治目前主要依靠药物治疗。吡喹酮是当前唯一的血吸虫病治疗药物，由于长期大规模的反复使用，曼氏血吸虫已出现了抗吡喹酮的耐药株，而在我国流行的日本血吸虫亦出现了对吡喹酮敏感性下降的现象，给未来血吸虫病的防治工作带来了严重的挑战。因此，开发新血吸虫病治疗药物，应对吡喹酮抗药性的出现是当前血吸虫病防治科研的紧迫任务。

生命过程是由一系列的生化代谢过程所组成，在这个过程中，生物体产生维持生命过程所必须的物质，并排除生物体内的毒性物质，从而保持体内平衡，一旦这种平衡被破坏就会导致生物死亡。因此，干扰血吸虫生命过程中一些重要蛋白分子的功能，使其失去活性，则可能破坏血吸虫的某一重要生化代谢过程，导致血吸虫死亡，达到治疗血吸虫病的目的，是新药开发的有效策略。生命过程中的这些重要蛋白分子（亦称为生命过程必须的蛋白分子，essential molecule）是新药开发重要的潜在靶标分子。

已有的研究成果显示血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）是血吸虫氧化还原平衡代谢过程中的一个必须蛋白分子，抑制血吸虫SjTGR的表达或功能，虫体因不能抵抗氧化损伤而死亡，是一个非常有潜力的抗血吸虫感染新药开发靶标，开发抗血吸虫SjTGR分子酶活性的抑制剂已成为血吸虫治疗新药研究的热点。

蛋白酶抑制剂包括了化学抑制剂，多肽抑制剂和抗体抑制剂。Sayed等筛选到能有效抑制曼氏血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SmTGR）蛋白活性的化学抑制剂，如噁二唑、磷酰胺、金诺芬。宋丽君等筛选到能抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）的化学抑制剂金诺芬、化合物4N等。这些化学抑制剂都具有一定的治疗血吸虫病疗效，但其副作用大，目前还没有进入临床研究阶段。除了化学抑制剂外，肽类和抗体是蛋白酶的另一类重要的功能抑制剂，已成为许多重要疾病的有效治疗药物，肽类与抗体类药物是近十年全球成长最快的医药产品。抗体由于其分子量大，不能进入细胞与目标靶分子直接作用，且易引起免疫中和与排异反应，限制了其应用价值。肽类药物因其分子量小，能直接进入靶细胞中直接抑制目标靶分子的功能，使用剂量小，疗效明确，具有广泛的应用前景。

噬菌体展示肽库是将一组人工设计合成的编码由7-12个氨基酸组成的短肽的基因序列与噬菌体M13的外壳蛋白pⅢ基因的N未端融合，使人工设计的短肽表达、展示在噬菌体外壳蛋白表面，并保持其空间构象。这种肽展示库包涵了10⁹种以上的短肽，可以模拟自然界可能存在各种蛋白结构，包括各种蛋白酶的底物结构。利用酶与底物亲和结合的特性，可以从噬菌体展示肽库中筛选到与蛋白酶特异性结合的短肽，为新药的开发奠定基础。噬菌体展示技术将基因型与表型，分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合起来，实现了基因型到表型的转换，是肽类药物开发的一项革命性新技术。

发明内容

本发明目的是利用噬菌体展示技术筛选能与日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）特异性结合，抑制其酶活性，破坏血吸虫氧化还原代谢平衡的抑制肽，可用于血吸虫病治疗新药的研究。

本发明的技术方案：抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）活性的抑制肽，所述的抑制肽其名称与氨基酸序列分别为：

JIPDys1：WPHNWWPHFKVK；即SEQ NO.1: Trp Pro His Asn Trp Trp Pro His Phe Lys Val Lys；

JIPDys2：LHAETRSAMHRT；即SEQ NO.2: Leu His Ala Glu Thr Arg Ser Ala Met His Arg Thr；

JIPDys3：YTMPSLTLYAMG；即SEQ NO.3: Tyr Thr Met Pro Ser Leu Thr Leu Tyr Ala Met Gly；

所述SjTGR活性抑制肽的氨基酸序列演变而产生的其它具有抑制SjTGR活性的肽段。

所述的SjTGR活性抑制肽在制备治疗血吸虫病新药或治疗用药物靶向载体制备方面的应用。

本发明用于筛选上述三种抑制肽的结合蛋白为重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）硒蛋白。

所述的SjTGR蛋白分子的氨基酸序列SEQ ID NO：4，保持有至少90%的同源性。

所述的SjTGR蛋白分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID NO：5。

所述的重组SjTGR硒蛋白分子（SjTGRsec）的表达，在于首先将编码SjTGR蛋白分子核苷酸片段SEQ ID NO：5的3’未端与与大肠杆菌中的硒代半胱氨酸插入序列SEQ ID NO：6 的5’未端通过PCR的方法连接在一起形成一个嵌合基因序列SEQ ID NO：7。然后通过插入到一种表达载体pET-41a中形成重组表达质粒SjTGRsec/pET-41a，然后将重组表达载体SjTGRsec/pET-41a转化入一种宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组SjTGR硒蛋白。

所述的重组SjTGR硒蛋白的制备方法，包括转录、翻译、蛋白分离和纯化，以及鉴定步骤。

本发明为了获得纯化的重组SjTGR硒蛋白，根据SjTGR硒蛋白中含有ADP结合域的结构特征，采用ADP-sepharose 4B胶亲和层析的方法进行纯化制备。

所述重组SjTGR硒蛋白应用包括但不限于：1)通过蛋白酶活性抑制的方法筛选、鉴定该蛋白酶抑制剂，用于血吸虫病的治疗。包括但不局限于化学抑制剂，多肽抑制剂和抗体抑制剂。2)制备血吸虫感染疫苗。

本发明优选的表达质粒是pET-41a (美国Novagen公司产品)，适合在大肠杆菌工程菌中表达。但是，本发明中的SjTGR硒蛋白也可选择利用其它质粒来表达，这些表达质粒包括但是不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。

具体地，该表达质粒含有适当的启动子，用以控制融合蛋白的表达。这些启动子包括但是不局限于以下所述的tac启动子, 优选的启动子为T7。

本发明在表达SjTGR硒蛋白时使用质粒pSU ABC为硒蛋白表达的辅助质粒，为SjTGR硒蛋白中硒代半胱氨酸的掺入提供Sel A、Sel B和Sel C等辅助因子。

本发明提供构建SjTGR硒蛋白的表达质粒的构建方法及工程菌构建方法。

首先克隆获得编码SjTGR的核苷酸序列。编码SjTGR蛋白氨基酸序列的核苷酸序列与序列SEQ ID NO：2保持有至少90%的同源性。

具体地，通过RT-PCR技术，从血吸虫mRNA中反转录合成编码SjTGR蛋白核苷酸片段。将SjTGR基因片段克隆到TA克隆载体pGEM-T中构建重组质粒SjTGR/pGEM-T进行DNA序列分析，确定其基因序列的正确性。

然后SjTGR基因片段为模板，使用SjTGR基因的5’端引物与另一个带有大肠杆菌硒代半胱氨酸插入序列（SEQ ID NO：6）的3’引物进行PCR扩增，获得表达SjTGR硒蛋白的嵌合基因（SEQ ID NO：7），并使该基因的5′端带有NdeⅠ的酶切位点，3′端带有SalⅠ的酶切位点。通过NdeⅠ，SalⅠ酶切位点插入到表达质粒pET-41a中构建重组表达质粒SjTGRsec/pET-41a。将该重组表达质粒转化到大肠杆菌DH5α，再转种到含有氨苄青霉素（AMP）的LB平板（1%的蛋白胨，0.5%的酵母抽提物，1%氯化钠，琼脂粉1.2%，氨苄青霉素100 mg/mL）上进行繁殖和保种。

本发明表达SjTGR硒蛋白的重组质粒SjTGRsec/pET-41a可在多种大肠杆菌中表达，其优选的菌株是大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供一种工程菌大规模表达SjTGR硒蛋白的方法。具体地，将含有重组表达质粒SjTGRsec/pET-41a的单个菌落再转化质粒pSU ABC，形成含有SjTGRsec/pET-41a和pSU ABC两种质粒的转化子细菌。再接种到选择性培养基LB（1%的蛋白胨，0.5%的酵母抽提物，1%氯化钠，卡那霉素50 mg/mL和氯霉素34 mg/mL)中，37°C振摇过夜。第二天按1︰10稀释接种到新鲜的LB培养基中，37°C振摇培养4 h (OD₆₀₀≈0.4), 加入亚硒酸盐与半胱氨酸，继续培养至静止生长期，加入0.1 mM异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达SjTGR硒蛋白。

重组SjTGR硒蛋白的表达，可以通过一般的蛋白生化手段检测，包括但不局限于：酶学分析，SDS-PAGE，Western Blotting等。

本发明也提供一种SjTGR硒蛋白的分离纯化方法。具体地，通过阿糖胞苷-2’, 5’-二磷酸琼脂糖凝胶亲和层析从表达产物中制备出纯化的重组SjTGR蛋白。

本发明提供一种筛选与SjTGR蛋白特异性结合噬菌体展示肽的方法。具体地，以纯化的重组SjTGR蛋白包被酶标板，再用噬菌体展示肽库（P.h.D-12）噬菌体进行反应，洗出未结合噬菌体后再用NADPH洗脱与重组SjTGR特异性结合的噬菌体。将洗脱噬菌体感染大肠杆菌ER2538中进行扩增，再以上述方法重新进行筛选，如此重复筛选三次，最后获得能表达与重组SjTGR蛋白特异性结合肽的噬菌体。

本发明还提供一种鉴定能与重组SjTGR蛋白特异性结合的噬菌体表达外源模拟肽的基因序列与氨基酸序列的鉴定方法。

具体地，制备能与重组SjTGR蛋白特异性结合噬菌体DNA，以DNA序列分析，确定噬菌体中外源性插入肽段的基因序列，再演绎成肽氨基酸序列。通过与Genbank中已经存在的蛋白质或多肽的氨基酸序列进行比对，确定该噬菌体模拟展示肽的性质。

本研究提供一种鉴定噬菌体展示肽与重组SjTGR蛋白结合特异性的方法。

具体地，通过SDS-PAGE及电转移方法将SjTGR蛋白条带转移到硝酸纤维素（NC）膜上，再将含有SjTGR蛋白条带的NC膜与筛选到的噬菌体反应，去除未结合的噬菌体后再与酶标记抗M13噬菌体二抗反应，用底物3′，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色，观察选到的噬菌体与重组SjTGR的反应情况，以判断此噬菌体与SjTGR蛋白结合的特异性。

本研究提供一种测定重组SjTGR蛋白的硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶及谷氧还蛋白活性的测定方法及筛选到的噬菌体对SjTGR活性抑制效果的分析方法。

具体地，硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性的测定方法是将5-联硫代-双-2-硝基苯甲酸（DTNB）与还原型辅酶I（NADPH）混合，在有SjTGR存在的情况下，DTNB可被还原为5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB），通过测定反应体系中TNB在波长为412nm处吸收值的增加值来确定SjTGR的TrxR的活性。在上述体系中加入一定数量的噬菌体，观察对其酶活性的抑制作用。

谷胱甘肽还原酶（GR）的活性测定的方法是将氧化型的谷胱甘肽（GSSG）与NADPH混合，在有TGR存在的情况下，氧化型谷胱甘肽被还原成还原型谷胱甘肽（GSH），随着NADPH被消耗，反应体系在340nm处的吸收峰值逐渐下降，通过测定反应体系在340nm处吸光度的变化来确定SjTGR的GR活性。在上述体系中加入一定数量的噬菌体，观察其对酶活性的抑制作用。

谷氧还蛋白（Grx）的活性测定方法是在NADPH提供还原物的情况下，Grx依赖于GSH还原β-羟乙基二硫化物（HED），生成HED还原形式的同时，形成了Grx-GSSG反应中间体。这个中间体被第2个分子的GSH 还原，产物为Grx-GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSSG在酵母谷光甘肽还原酶（Yeast GR）的作用下生成GSH，继续参与Grx的巯基-二硫化物转换的反应。Grx酶活性同样是测定NADPH消耗量来计算。在上述体系中加入一定数量的噬菌体，观察其对酶活性的抑制作用。

本发明的有益效果：本发明筛选到的三条噬菌体展示肽对日本血吸虫生存必须蛋白分子-硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）的硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶及谷氧还蛋白活性均具有抑制作用。为开发新的血吸虫病治疗药物奠定了良好的基础，对控制血吸虫病流行有重要的意义。

附图说明

图1 日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）的基因扩增

M：核酸标准分子量大小；1、PCR扩增得到的SjTGR基因片段。

图2 SjTGR-SECIS嵌合基因的制备；M：DNA标准分子量标准；1：SjTGRsec嵌合基因片段。

图3 重组质粒SjTGRsec/pET-41a酶切分析；1、DNA分子量标志物；2、日本血吸虫TGR基因纯化产物；3、重组的SjTGRsec/pET-41a质粒经Nde I/Sal I双酶切产物；4、质粒pET-41a经Nde I/Sal I 双酶切产物；5、质粒pET-41a；6、重组质粒SjTGRsec/pET-41a。

图4 重组日本血吸虫TGR蛋白的表达产物电泳图；M 蛋白分子量标准；1、含质粒SjTGRsec/pE-T41a的大肠杆菌BL21表达产物的沉淀；2、含质粒SjTGRsec/pET-41a的大肠杆菌BL21表达产物的上清；3、含质粒pET-41a的大肠杆菌BL21表达产物；4、大肠杆菌BL21的表达产物。

图5 SjTGR硒蛋白表达量分析；A、SjTGR蛋白表达产物SDS-PAGE图；B、SjTGR蛋白表达产物SDS-PAGE凝胶的放射性自显影；M、蛋白分子量标准；1、含质粒SjTGRsec/pET-41a的大肠杆菌BL21表达产物；2含质粒SjTGRsec/pET-41a和pSU ABC的大肠杆菌BL21表达产物；* 电泳后在SDS-PAGE凝胶上点上的表达产物的样品。

图6 纯化的重组SjTGR蛋白；1、蛋白质分子量标志物；2、纯化的重组SjTGR蛋白。

图7 不同的噬菌体克隆与SjTGR结合强度的比较。a、1×10¹²，b、2.5×10¹¹，c、6×10¹⁰，d、1.5×10¹⁰，e、3.75×10⁹；a’为a的对照，b’为b的对照，c’为c的对照，d’为d的对照，e’为e的对照。

图8 Western Blotting鉴定噬菌体；M、蛋白标准分子量标准；1、JIPDys1；2、JIPDys2；3、JIPDys3；4、JIPDys4。

图9 不同的噬菌体对SjTGR酶活性的抑制作用。a、硫氧还蛋白还原酶（TrxR），b、谷胱甘肽还原酶（GR），c、谷氧还蛋白（Grx）。

图10 噬菌体对重组SjTGR酶活性的抑制作用。

具体实施方式

下面提供的实施例可以详细地解释本发明的主要内容，但不局限于以下这些内容。

实施例1：日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）基因克隆

日本血吸虫SjTGR基因通过RT-PCR技术，从血吸虫成虫组织的mRNA中反转录合成而来，具体制备方法如下：

1、血吸虫成虫mRNA的制备

取新鲜分离的血吸虫成虫0.5 g，在液氮中冷冻后，在陶瓷研钵中粉碎，再用GE Healthcare公司的mRNA纯化试剂盒（Illustra QuickPrep^TM mRNA purification kit）制备纯化mRNA，操作方法严格按试剂盒的操作说明书。用紫外分光光度计测mRNA的纯度与含量。

2、SjTGR基因扩增

2.1引物设计：

SjTGR1: 5’-AACATATGCCTCCGATTGATGGAACA-3’

单划线为NdeⅠ位点；

SjTGR2: 5’-TCAGCAACCGGTTACCGCTGCAGAGCCCCCA-3’

2.2 第一链cDNA合成

采用Phusion^TM RT-PCR Kit(购自NEB北京分公司)在一0.2 mL的PCR管中，加入mRNA 2 μL(约10ng)，10 mM dNTP 混合物1 μL，Oligo(dT) primer 1 μL，加无离子水至10 μL。混匀，离心收集于管底。65°C，水浴预变性5 min，置冰上冷却。加入10×反转录缓冲液2 μL，反转录酶混合物2 μL，无核糖核酸酶水（无Rnase水）6 μL，混匀，离心收集于管底。25°C保温10 min，再在40°C保温30 min以合成cDNA。80°C保温5 min以中止反应。

2.3 目的基因扩增

在一个0.2 mL的PCR管中，加入2×Phusion^a Master Mix 25 μL，第一链cDNA 3 μL，引物SjTGR1 0.5 μL (25 μM)、SjTGR2 0.5 μL (25 μM)，加无核糖核酸酶水到终体积50 μL。PCR条件：98 °C 30 Sec；然后98°C变性10 Sec；56°C、30 Sec，72°C、90 Sec，一共30个循环；最后，72°C、保温5 min。采用低融点琼脂糖凝胶电泳方法回收纯的SjTGR基因片段。具体是用1%的低融点agarose胶电泳PCR扩增产物，切下分子量约1800bp左右的目的DNA条带，再用Promega公司的PCR产物回收试剂盒纯化SjTGR基因DNA片段。如图1所示。

TA克隆与序列分析

SjTGR的3′端加腺嘌呤（A）尾巴：将纯化的SjTGR片段置于PCR 反应管中，加入10×Taq DNA 聚合酶链反应缓冲液10 μL，MgCl₂ 10 μL（25 mmol/L），dATP1 μL(10 mmol/L)，Taq DNA 聚合酶1 μL (5 U/μL)，加灭菌无离子水至100 μL，在PCR仪上72°C保温30 min，使SjTGR基因片段的3′端加上“A”尾巴。用Promega 公司的酶切产物纯化试剂盒纯化加A 尾后的SjTGR基因DNA片段。再用Promega公司的PCR产物回收试剂盒纯化SjTGR基因DNA片段。将SjTGR DNA片段与TA clone 载体pGEM-T(美国PROMEGA公司产品) 按照3︰1 的比例混合，在T4 DNA连接酶的作用下连接，反应体系如下：2×ligase buffer 5 mL，pGEM-T vector 1 μL (50 ng)，SjTGR DNA片段 3 μL，T4 DNA ligase 1 μL，总体积10 μL。混匀后，短暂离心，16°C水浴连接过夜，形成重组质粒SjTGR/pGEM-T。

电转化：1）取5 μL连接产物加入到50 μL感受态细胞E.coli DH5a中，小心混匀，勿使有气泡产生，放置冰浴上30 min。2）将连接产物与E.coli DH5a的混合物转移到冰上预冷的狭缝为0.1cm 的电击杯中，勿使有气泡产生，小心拭去电击杯外的冷凝水。3）设置电脉冲仪（BIO-RAD）脉冲参数：电压2.5 kV，电容25 μF，电阻200Ω。将电击杯插入电脉冲仪电击槽内，同时按住两个脉冲电极保持至放电为止。4）取出电击杯，加入0.5 mL 37°C预热的SOC培养基，混匀后将电击后的菌液转移到一无菌玻璃试管中，37°C、200 rpm 振荡培养40 min。5）取200 μL菌液均匀涂布于表面预先涂有40 μL X-gal（40 mg/mL）的LB 平板上（含Amp 100 μg/mL）。室温下放置待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37°C培养箱过夜。在LB 平板上出现白色菌落可初步判定为阳性克隆，蓝色菌落为阴性克隆。将白色菌落细菌送到上海英俊公司进行DNA序列分析。

实施例2：表达SjTGR硒蛋白嵌合基因的构建

1、引物设计：根据大肠杆菌硒代半胱氨酸插入序列，设计一个下游引物TGR3，使这包括SjTGR的3’端序列与大肠杆菌硒代半胱氨酸插入序列。

SjTGR3: 5’-GTCGACGGGCGCATAGGTTAACGATTGGTGCAGACCTGCAACCGA

TTATTAACCTCAGCAACCGGTTACCGC-3’，单划线为 SalⅠ位点。

引物的合成由上海英俊公司完成。

2、日本血吸虫SjTGR硒蛋白表达基因的制备

在一个0.2 mL的PCR管中，加入5×Phusion^TM HF buffer 10 μL，10mM dNTP 1 μL，引物SjTGR1 1 μL (25 μM)、SjTGR3 1 μL (25 μM)，SjTGR/pGEM-T 1 μL (50 ng), Phusion^TM Hot Start DNA Polymerase 0.5 μL，加无核糖核酸酶水到终体积50 μL。PCR条件：98 °C、30 Sec；然后98°C变性10 Sec；70.6°C、30 Sec，72°C、90 Sec，一共35个循环。采用低融点琼脂糖凝胶电泳方法回收纯的SjTGR基因片段。具体是用1%的低融点agarose胶电泳PCR扩增产物，切下分子量约1800bp左右的目的DNA条带，再用Promega公司的PCR产物回收试剂盒纯化SjTGRsec基因DNA片段。如图2所示。

TA克隆与序列分析

SjTGRsec的3′端加腺嘌呤（A）尾巴将纯化的SjTGRsec片段置于PCR 反应管中，加入10×Taq DNA 聚合酶链反应缓冲液10 μL，MgCl₂ 10 μL（25 mmol/L），dATP1 μL(10 mmol/L)，Taq DNA 聚合酶1 μL (5 U/μL)，加灭菌无离子水至100 μL，在PCR 仪上72°C保温30 min，使SjTGR基因片段的3′端加上“A”尾巴。用Promega 公司的酶切产物纯化试剂盒纯化加A 尾后的SjTGRsec基因DNA片段。再用Promega公司的PCR产物回收试剂盒纯化SjTGRsec基因DNA片段。将SjTGRsec DNA片段与TA clone 载体pGEM-T(美国PROMEGA公司产品) 按照3︰1 的比例混合，在T4 DNA 连接酶的作用下连接，反应体系如下：2×ligase buffer 5 mL，pGEM-T vector 1 μL (50 ng)，SjTGR DNA片段 3 μL，T4 DNA ligase 1 μL，总体积 10 μL。混匀后，短暂离心，16°C水浴连接过夜，形成重组质粒SjTGRsec/pGEM-T。

电转化：1）取5 μL 连接产物加入到50 μL 感受态细胞E.coli DH5a中，小心混匀，勿使有气泡产生，放置冰浴上30 min。2）将连接产物与E.coli DH5a的混合物转移到冰上预冷的狭缝为0.1cm 的电击杯中，勿使有气泡产生，小心拭去电击杯外的冷凝水。3）设置电脉冲仪（BIO-RAD）脉冲参数：电压2.5 kV，电容25 μF，电阻200Ω。将电击杯插入电脉冲仪电击槽内，同时按住两个脉冲电极保持至放电为止。4）取出电击杯，加入0.5 mL 37°C预热的SOC培养基，混匀后将电击后的菌液转移到一无菌玻璃试管中，37°C、200 rpm 振荡培养40 min。5）取200 μL菌液均匀涂布于表面预先涂有40 μL X-gal（40 mg/mL）的LB 平板上（含Amp 100 μg/mL）。室温下放置待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37°C培养箱过夜。在LB平板上出现白色菌落可初步判定为阳性克隆，蓝色菌落为阴性克隆。将白色菌落细菌送到上海英俊公司进行DNA序列分析,以确定构建的SjTGR硒蛋白表达基因序列的正确性。

实施例3：SjTGR硒蛋白表达质粒的构建

本发明采用pET-41a为表达载体质粒，其制备方法为常用分子生物学方法。即通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备质粒后-20°C保存待用。

具体如下，对表达载体质粒pET-41a及重组质粒SjTGRsec/pGEM-T分别进行NdeⅠ、SalⅠ双酶切。具体条件如下。质粒DNA 30 μL，NdeⅠ2μL，SalⅠ2μL，10×酶切缓冲液5 μL；加ddH₂O 至总体积为50 μL。37°C温浴3小时，通过低琼脂糖凝胶电泳回收线性化的pET-41a质粒DNA和SjTGRsec DNA片段。将回收的SjTGRsec DNA片段与表达质粒pET-41a DNA片段连接，构建SjTGR硒蛋白表达质粒SjTGRsec/pET-41a。连接体系为10 mL，双酶切的pET-41a质粒与双酶切SjTGRsec DNA的摩尔比为1︰2-10，10×T4 DNA ligase 缓冲液1 μL，T4 DNA ligase 1 μL，加无菌水至总体积为10 μL。连接反应16°C恒温水浴内温浴16小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。阳性克隆的鉴定是通过含卡那霉素的LB平板挑选阳性克隆，抽提质粒，并通过NdeⅠ和SalⅠ双酶切分析确定目的基因是否被插入到表达载体中（图3所示）。

实施例4：SjTGR硒蛋白表达工程菌的构建

具体方法如下。

首先挑选含有SjTGRsec/pET-41a组质粒的细菌克隆，提取质粒DNA。然后，用电转化的方法把质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中。

质粒DNA提取方法按Promega公司质粒DNA纯化试剂盒操作说明进行。

电转化方法转化大肠杆菌具体如下。

先进行感受态细胞的准备。挑取新鲜的BL21（DE3）单菌落，接种至含有3 mL LB液体培养基的试管中，37°C、200 r/min培养过夜。然后取1 mL的培养物接种至含有500 mL新鲜LB培养基的2 L三角摇瓶中，37°C、250-300 r/min培养过夜，至OD₆₀₀小于0.4，将细菌培养物置于冰上冷却，2500 g离心20 min，去上清，用500 mL的冰预冷的ddH₂O将菌体沉淀重悬。离心后，再用250 mL的冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用10 mL的冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬，调节菌液OD_600nm=10.0。以每管100 mL的体积分装感受态细胞，-70°C保存备用。

电击转化，具体如下。

将SjTGRsec/pET-41a重组质粒DNA溶解在5~10 μL TE溶液中，与80 μL的上述感受态菌体混匀，转至0.1cm狭缝的预冷电转化杯中，冰浴10 min。然用1.8 kv电压、25 μF电容； 200Ω电阻的条件进行电击。电击完毕后，加入1 mL 37°C预温的LB液体培养基悬浮，并转至无菌的玻璃试管中，37°C、250-300 r/min培养40 min。将菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，置于37°C培养过夜。

挑取过夜生长平板上的单个菌落，接种3 mL LB 液体培养基中（含卡那霉素50 μg/mL），37°C振荡培养过夜。次日以1︰100 比例将过夜培养菌液转接入 3 mL LB 培养液中，37°C、200 rpm振荡培养2-3小时。

取1 mL的LB培养液到1.5 mL的离心管中，离心沉淀细菌，将上清倒掉。

将1 μL的pSU ABC质粒加在细菌沉淀表面。加入100 mL预冷的TSS缓冲液（TSS缓冲液：在50 mL的TSS缓冲液中含有5 g 的PEG 6000/8000，2.5 mL的DMSO，2.5 mL 1 M 的MgCl₂和32.5 mL的LB培养基，小心混匀）。 4°C冰箱静置30 min。

加入1 mL的LB培养基，37°C温育1小时。离心5 min，去掉上清，用100 mL的LB培养基重悬沉淀，悬浮液均匀涂布于LB平板上（含卡那霉素50 mg/mL 和氯霉素34 mg/mL），37°C 培养过夜。通过卡那霉素和氯霉素筛选含重组表达质粒SjTGRsec/pET-41a和pSU ABC的菌株。

实施例5：SjTGR硒蛋白的表达

挑取单个菌落接种3 mL LB 液体培养基中（含卡那霉素50 μg/mL和氯霉素34 mg/mL），37°C振荡培养过夜。次日以1︰100 比例将过夜培养菌液转接入1 L LB 培养液中（含卡那霉素50 μg/mL和氯霉素 34 mg/mL），37°C，200 rpm继续振荡培养。当菌液OD_600nm达到1.8左右时，加入L-半胱氨酸（100 mg/mL）和硒酸盐（5 mM）。当菌液OD_600nm达到2.4时（即静止生长期），将培养物冷却到室温，加入IPTG至终浓度为0.5 mM，在24°C振荡培养过夜。离心收集细菌（菌液的OD_600nm大概在4-5），去上清，用25 mL的PBS重悬浮细菌沉淀。

加入溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，在冰上放置1小时。反复冻融2-3次，直到菌液变为粘稠。在细菌裂解物中加MgCl₂溶液至终浓度8 mM，DNase I至终浓度10 U/mL，低温下孵育消化细菌DNA至菌液变为液体。以16 000 rpm离心30 min，收集上清，用PBS重悬沉淀。取上述表达产物200 mL 加等体积2×蛋白电泳上样缓冲液，混匀，室温作用 30 min，煮沸10 min，取20 mL 表达产物进行12 % SDS-PAG 电泳。120 V 电压使样品进入分离胶后，180 V电压继续电泳70 min。电泳结束后，取出凝胶，室温下考马斯亮蓝染色30 min，再用脱色液脱色至背景清晰为止，表达产物中有一条分子量约65kDa的蛋白条带（图4所示）。

实施例6：SjTGR硒蛋白表达量分析

分别将含有重组质粒SjTGRsec/pET-41a和质粒pSU ABC的转化子细菌、含有重组质粒SjTGRsec/pET-41a的转化子细菌的BL21单个菌落接种于3 mL LB 液体培养基中，37°C振荡培养过夜。次日，培养过夜的菌液按1︰100分别接种于1 mL 的LB培养基中，各加入1 mL的⁷⁵Se半胱氨酸。37°C，200 rpm 振摇3小时，加入5 mM的硒酸盐，100 mg/mL的L-半胱氨酸，继续振摇培养。约1小时后，加入IPTG 至终浓度为 0.1 mM，继续振摇培养4小时。取20 μL的菌液加入等体积的2×上样缓冲液，混匀，室温作用 30 min，煮沸10 min，取20 μL表达产物进行12 % SDS-PAG 电泳。电泳结束后，取出凝胶，室温下考马斯亮蓝染色 30 min，再用脱色液脱色至背景清晰为止。将凝胶放入感光屏上，用图像扫描仪器扫描观察是否有⁷⁵Se放射性的显影条带。从显影照片上可以发现含有重组质粒SjTGRsec/pET-41a和质粒pSU ABC的转化子细菌表达的SjTGR蛋白中⁷⁵Se标记的硒代半胱氨酸的含量明显高于只含有质粒SjTGRsec/pET-41a质粒细菌表达的SjTGR蛋白中⁷⁵Se标记的硒代半胱氨酸的含量。图5所示。

实施例7：SjTGR硒蛋白的纯化

按实施例5的方法大量制备表达SjTGR硒蛋白的细菌，细菌裂解后将裂解物上清液过0.45 μm的过滤器过滤，用平衡缓冲液（50 mM磷酸钾，3 mM EDTA，pH 7.5）稀释10倍。将ADP-agrose 凝胶装入到层析柱中，用5个柱体积平衡缓冲液平衡柱。再将稀释后的表达产物以0.5 mL/min 的速度上样。用洗涤缓冲液（0.4 M 磷酸钾，3mM EDTA，pH 7.5）洗柱，直到A_280nm的紫外吸收值不再降低为止。用50 mM磷酸钾缓冲液（含0.5 M KCl，pH 7.5）将重组蛋白从柱上洗脱下来。用超滤管浓缩洗脱下来的重组蛋白溶液，再用平衡缓冲液稀释一定的倍数后重新上一新的ADP-Agarose凝胶柱。用洗涤缓冲液（0.4 M磷酸钾缓冲液含3 mM EDTA，pH 7.5）洗涤柱子直到A_280nm紫外吸收值不再降低为止。再用洗脱缓冲液（50 mM磷酸钾，0～0.5 mM NADPH，3 mM EDTA，pH 7.5）进行特异性的洗脱，分管收集洗脱蛋白。每管洗脱液取20 μL进行12 % SDS-PAG 电泳，电泳结束后，考马斯亮蓝染色 30 min，再用脱色液脱色至背景清晰为止，观察获得重组SjTGR硒蛋白纯度。电泳结果显示获得的SjTGR硒蛋白为单一的蛋白条带，纯度高于95%。如图6所示。

实施例8：重组SjTGR的硫氧还蛋白还原酶活性分析方法

硫氧还蛋白还原酶（TrxR）的活性：硫氧还蛋白还原酶的活性是通过DTNB的还原反应和胰岛素的还原反应来测定的。

DTNB的还原

1）反应原理：5-联硫代-双-2-硝基苯甲酸（DTNB）在还原物NADPH存在情况下，可被TrxR还原为5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB），TNB在波长为412nm处有最大的吸收峰，发生酶促还原反应后，反应体系在412nm的吸收值会增加。

NADPH+H⁺+DTNB NADP⁺+2TNB

2）反应体系如下：

EDTA	5 mM
		磷酸钾缓冲液(pH 7.4)	100 mM
NADPH	50 mM
		DTNB	1.5 mM

3）样品测定：将上述试剂混匀以后，取190 mL加入到体积为200 mL的比色皿中，加入10 mL的重组SjTGR启动反应，以混合液为参比，25°C，连续观察反应起始后前2分钟内在412nm处吸收峰的增加值。

4）酶活性计算：一个单位的酶活性定义为25°C条件下1分钟由NADPH产生2 mM的2-硝基-5-硫代苯甲酸。根据不同时间的吸光度值，在OriginPro 7.0上进行直线拟合，斜率即为初速度υ（△A412/min）。计算公式如下：

样品中硫氧还蛋白还原酶活性（μmol·min^-1mg^-1）=

Figure 2011103014854100002DEST_PATH_IMAGE002

计算时使用TNB的吸光系数（ε）为13.6 mM^-1cm^-1 。

胰岛素的还原

1）反应原理：在还原物NADPH存在的情况下，SjTGR将硫氧还蛋白二硫化物（Trx-S₂）转化为硫氧还蛋白巯基化合物（Trx-SH），巯基化合物作用于胰岛素的二硫键，将胰岛素分解为A链和B链。NADPH在340nm处有最大吸收峰。在酶促反应过程中，NADPH被分解为NADP，反应体系在340nm处的吸收值逐渐下降。

Figure 2011103014854100002DEST_PATH_IMAGE003

2）反应体系如下：

EDTA	10 mM
		磷酸钾缓冲液(pH 7.4)	100 mM
NADPH	100 μM
		Sj Trx	10 μM
Insulin	172 μM

3）样品测定：将上述试剂混匀以后，取190 μL加入到体积为200 μL的比色皿中，加入10 μL的SjTGR启动反应，以混合液为参比，25°C，连续观察反应起始后前2分钟内在340nm处吸收峰的减少值。

4）酶活性计算：1单位的酶活性为：25°C，每分钟氧化1 μM的NADPH。根据不同时间的吸光度值，在OriginPro 7.0上进行直线拟合，斜率即为初速度υ（△A340/min）。

样品中硫氧还蛋白还原酶活性（μmol·min^-1mg^-1）=

Figure 2011103014854100002DEST_PATH_IMAGE004

计算时使用NADPH的吸光系数6.22 mM^-1cm^-1。

谷胱甘肽还原酶（GR）的活性

1）反应原理：氧化型的谷胱甘肽在NADPH提供还原物的情况下由SjTGR还原为还原型的谷胱甘肽。随着NADPH被消耗，反应体系在340nm处的吸收峰逐渐下降。

NADPH+H⁺+GSSG

NADP⁺+2GSH

2）反应体系如下：

EDTA	10 mM
		磷酸钾缓冲液(pH 7.4)	100 mM
NADPH	100 μM
		GSSG	100 μM

4）酶活性计算：1单位的酶活性为：25°C，每分钟氧化1 μM的NADPH。根据不同的时间的吸光度值，在OriginPro 7.0上进行直线拟合，斜率即为初速度υ（△A340/min）。

样品中硫氧还蛋白还原酶活性（μmol·min^-1mg^-1）=

计算时使用NADPH的吸光系数6.22 mM^-1cm^-1。

谷氧还蛋白（Grx）的活性

1）反应原理：Grx 的抗氧化机制主要依赖于GSH的巯基-二硫化物转换的反应，即在NADPH提供还原物的情况下，Grx依赖于GSH还原β-羟乙基二硫化物（HED），生成HED还原形式的同时，形成了Grx-GSSG反应中间体。这个中间体被第2个分子的GSH 还原，产物为Grx-GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSSG在酵母谷光甘肽还原酶（Yeast GR）的作用下生成GSH，继续参与Grx的巯基-二硫化物转换的反应。酶活性同样是测定NADPH消耗量来计算。

Figure 2011103014854100002DEST_PATH_IMAGE006

2）反应体系如下：

GSH	1 mM
		NADPH	100 μM
EDTA	10 mM
		HED	8 mM
Yeast GR	0.6 U
		磷酸钾缓冲液(pH 7.4)	100 mM

样品中硫氧还蛋白还原酶活力（μmol·min^-1mg^-1）=

计算时使用NADPH的吸光系数6.22 mM^-1cm^-1。

酶动力学分析：酶促反应动力学是研究酶促反应速率及其影响因素的科学。这些因素包括酶浓度、底物浓度、pH 值、温度、激活剂和抑制剂等。其中底物浓度和抑制剂是反应酶学特征两个重要因素。

底物浓度对反应速度的影响

1）反应原理：在温度，pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加，但当底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，此为最大反应速度V_max，反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：，其中K_m为米氏常数，V_max为最大反应速度，K_m是酶的特征常数，反映酶与底物亲和力的大小。K_cat 指反应常数 (catalytic constant )，K_cat表示每单位时间内（秒）每摩尔的酶（或者说每摩尔的活性中心）能够把转化成产物的底物摩尔数。K_cat / K_m 的大小可以用来比较不同酶或者同一种酶催化不同底物的催化效率。

2）反应体系：日本血吸虫TGR酶活性的底物包括NADPH，DTNB，Trx，GSSG，HED，GSH。所有的反应均是在下列的反应体系中进行的：

EDTA	10 mM
		磷酸钾缓冲液(pH 7.4)	100 mM
SjTGR	48 nM

在硫氧还蛋白还原酶活性分析体系中，DTNB的浓度为100～1000 mM，NADPH 的浓度为5～100 mM，Trx 的浓度为9～34 mM。在谷胱甘肽还原酶分析体系中，GSSG的浓度为10～100 mM，NADPH 的浓度为5～100 mM。谷氧还蛋白的分析中，HED 的浓度为2～10 mM，GSH 的浓度为100～1500 mM，NADPH的浓度为10～100 mM。在反应中，保持其他底物浓度不变的情况下，改变其中一种底物的浓度。

3）酶动力学参数的计算 K_m和V_max采用双倒数法在OriginPro 7.0软件上进行直线拟合得到的；K_cat = V_max/ [E]，[E]指酶浓度。所有试验均重复3次。

酶学分析的结果显示纯化的重组SjTGR蛋白具有TrxR，GR 和 Grx的活性，可以分别以DTNB、Trx、GSSG、HED为底物。以DTNB为底物的活性为8.11 ± 0.34 mmol·min^-1mg^-1；以Trx为底物的活性为3.33 ± 0.08 mmol·min^-1mg^-1；以GSSG为底物的活性为2.19 ± 0.01 mmol·min^-1mg^-1，以HED为底物的活性为 12.10 ± 0.39 mmol·min^-1mg^-1（表4-1）。

TGR不同底物的K_m值分别为1.42 ± 0.44 μM（NADPH），3.24 ± 0.40 μM （Trx），145.05 ± 6.31 μM（DTNB），49.55 ± 6.31 μM（GSSG）， 2 792 ± 231 μM （HED），3 831 ± 54 μM （GSH）。各种底物的K_cat/ K_m值如表4-2，TGR中TrxR、GR、Grx的酶催化能力是不同的，从大到小依次排列为TrxR、GR、Grx，K_cat/K_m的值分别在10⁵ -10⁶，10⁵，10³ M^-1·s^-1数量级。

实施例9：SjTGR活性抑制噬菌体展示肽的筛选

1、噬菌体滴度测定

1）从平板上挑取ER2738单克隆，接种到5 mL的LB培养基中，37°C培养1-8小时到细菌对数生长期（OD_600nm= 0.5）。

2）当细菌生长时，将顶琼脂（0.6%琼脂粉，1%蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1% NaCl）放在微波炉里融化后，分装3 mL到无菌管中，并置于45°C水浴中保温。

3）LB/IPTG/Xgal 平板置于37°C培养箱中预热至少一个小时。

4）用LB培养基将噬菌体作10倍或者10³倍连续稀释。

5）将对数生长期的ER2738菌分装到1.5 mL离心管中，每管200 μL。

6）分别从不同稀释度的噬菌体溶液取10 μL噬菌体与离心管中的细菌混合，快速涡旋震荡，室温下放置1-5 min。

7）将感染的细胞和噬菌体一同转移到45°C预温的顶琼脂中，颠倒混匀后快速铺在预热的LB/IPTG/Xgal 平板表面，旋转平板使顶琼脂均匀地分布。

8）室温下冷却平板5 min，倒置，37°C培养过夜。

9）计数平板上的噬菌斑数，通过乘以稀释倍数来计算原始噬菌体液中的噬菌体滴度（单位pfu/mL）。

、第一轮淘洗

1）挑取ER2738单克隆细菌分别接种于10 mL和20 mL的LB培养基中，37°C剧烈振摇至对数生长期，用于噬菌体滴度测定和扩增。

2）将纯化SjTGR蛋白用0.1M NaHCO₃（pH 8 .6）溶液配成10 μg/mL的溶液，取1.5 mL包被24孔细胞培养板，4°C过夜。

3）将包被液倒掉后，在干净的纸上拍干，去除剩余的液体。再在孔中加满封闭液，置4°C封闭至少1h。

4）倒掉封闭液后拍干，迅速用TBST (TBS+0.1%[v/v]Tween-20)洗板，洗板6次。

5）用 TBST将噬菌体肽库（1×10¹³ pfu/mL）稀释100倍。取噬菌体稀释液1 mL（10¹¹ pfu）加入到板上，室温下轻柔混匀结合60min。

6）倒掉未结合的噬菌体，然后再拍干，去除残余液体。

7）用TBST洗板10次，吸干时每次采用新的纸巾防止交叉污染。

8）在板中加入1 mL 0.5 M的NADPH溶液，在室温中轻轻摇动10-60 min，洗脱结合的噬菌体，将洗脱液转移到一无菌离心管中。

9）待ER2738生长到对数生长期（OD_600nm= 0.5）时，按照本部分2的方法测定洗脱液中噬菌体的滴度。

10）噬菌体扩增：将洗脱的噬菌体液加到20 mL的ER2738培养液中（OD_600nm=0.01 - 0.05），37°C剧烈震摇4.5 h。

11）将细菌培养液转移到离心管中，12 000 g，4°C离心10 min。将上清液转移到一个新的离心管中，重新离心。

12）转移80%的细菌上清液到一个新的离心管中，加入1/6体积的20% PEG/2.5 M NaCl，混匀，4°C放置2 h，沉淀噬菌体（放置过夜效果更好）。

13）12 000g，4°C，离心15 min。倒掉上清，再次快速离心后，吸净剩余的上清液（噬菌体的沉淀呈现白色，沾在管壁上）。

14）用1 mL的TBS重悬沉淀。将悬浮液转移到一个离心管中，14 000 rpm，4°C，5 min，沉淀剩余的细胞。

15）将上清液转移到一个新的1.5 mL离心管中，加1/6体积的20% PEG / 2.5 M NaCl重新沉淀，放在冰上15 - 60 min。然后在4°C，以14 000 rpm离心10 min，将上清倒掉，快速重新离心，将剩余的液体吸干净。

16）用200 μL的TBS重悬沉淀，离心1 min除去剩余的不溶性固体。将上清转移到一个新的离心管中，上清液即为扩增的噬菌体。

17）按照本部分2的方法在LB/IPTG/Xgal平板上测定噬菌体的滴度。扩增的噬菌体在4°C可以保存3周。为了更长时间的保存，可以加入等体积的无菌甘油。储存在-20°C。

第二轮淘洗

1）按照本部分2步骤2）用纯化SjTGR包被24孔细胞培养板。

2）计数本部分17）平板上蓝色噬菌斑的个数，确定噬菌体的稀释度。

3）按本部分步骤3）-17）进行第二轮淘洗、噬菌体扩增、浓缩。所用噬菌体为第一轮扩增的噬菌体液1.5 mL（10¹¹pfu），洗液中吐温的量增加到0.5%（v/v）。

4）按照本部分2的方法测定第二轮洗脱下来的噬菌体滴度。

第三轮淘洗

1）按照本部分2步骤2）包板。

2）按本部分步骤3）-17）进行第三轮淘洗、噬菌体扩增、浓缩。所用噬菌体为第二轮扩增的噬菌体液1.5 mL （10¹¹pfu），将洗液中吐温的量增加到0.5%（v/v）。

3）按照本部分2的方法测定第三轮洗脱液中噬菌体的滴度。

噬菌体DNA制备

1）将培养到对数生长期的ER2738细菌按照1：100稀释，接种于含LB培养基的玻璃试管中，每管1 mL。

2）利用无菌的木棒或者枪头尖从滴定板上挑选单个独立噬菌斑，接种到含有稀释ER2738的试管中，一管接种一个噬菌斑，共挑取60个噬菌斑。

3）37°C，震摇4.5-5 h。

4）转移培养液到离心管中，14 000 rpm，离心30 s，上清液转移到新的离心管中，重新沉淀一次，再转移上层80%的上清液到新的离心管中，此即为扩增的噬菌体储存液。

5）转移500 μL扩增的噬菌体储存液到1.5 mL的离心管中。

6）加入200 μL 20%的PEG/2.5M NaCl，颠倒混匀，在冰上静置10-20 min。4°C，14 000 rpm，离心10 min，倒掉上清，可以看到白色的噬菌体沉淀。重新离心，小心移走剩余的上清。

7）加100 μL碘化钠溶液将沉淀重悬，用移液器反复抽吸混匀沉淀，使噬菌体分散，加250 μL的无水乙醇，室温放置10-20 min，沉淀单链的噬菌体DNA。

8）4°C，以14 000 rpm离心10 min，去上清，用0.5 mL的70%乙醇洗涤DNA沉淀，重新离心，小心地去掉上清，真空抽干。

9）用30 μL的TE重悬沉淀，经紫外分光光度计测定噬菌体DNA的浓度。将噬菌体DNA送上海生工生物工程技术有限公司进行DNA序列分析。

DNA序列分析获得58个噬菌斑DNA序列，2个噬菌斑未获得测序结果。有4种展示肽有同源DNA序列，分别命名为JIPDys1，肽序列为SEQ ID NO.1: WPHNWWPHFKVK；JIPDys2，肽序列为SEQ ID NO. 2: LHAETRSAMHRT；JIPDys3，肽序列为SEQ ID NO.3: YTMPSLTLYAMG；JIPDys4，肽序列为SEQ ID NO. 4: KHMHWHPPALNT。其中肽JIPDys1的同源序列数最多，在58个序列中有26个同源噬菌斑；JIPDys2有2个同源噬菌斑；JIPDys3有3个同源噬菌斑；JIPDys4有4个同源噬菌斑。

实施例10：ELISA 鉴定筛选到的噬菌体结合的特异性

1）噬菌体扩增：按实施例9第2部分步骤10）-17）对测序鉴定到的有同源插入肽序列的噬菌体进行扩增。

2）包板：用100 mL SjTGR蛋白液（0.1 M NaHCO₃，pH 8.6，SjTGR10 mg/mL）包被酶标板，4°C过夜。

3）封闭：将包被液倒掉后，加满封闭液。一排未包被的孔也同样加入封闭液，用来稀释噬菌体，避免噬菌体与酶标板孔壁结合，造成假阳性。4°C，封闭1-2小时。

4）洗板：将包被液倒掉后，用TBST（吐温的浓度为0.5%）洗板6次，在干净的纸上拍干。

5）噬菌体结合：分别加入200 mL经TBST连续4倍稀释的噬菌体液（噬菌体浓度分别为1×10¹²、2.5×10¹¹、6×10¹⁰、1.5×10¹⁰、3.75×10⁹pfu/mL）。室温下孵育1-2小时。

6）洗板：用TBST洗板6次，在干净的吸水纸上拍干。

7）二抗反应：加入用HRP标记的抗M13的抗体（GE Healthcare，1︰5000稀释），每孔200 mL。室温下孵育1小时。

8）洗板：用TBST洗板6次，在干净的吸水纸上拍干。

9）显色：每孔加入底物50 mL TMB，室温显色10 min，加入50 mL 2 M的硫酸终止显色。

10）读数：用酶标仪450nm读板。

ELISA检测显示JIPDys1、2、3、4号噬菌体均能不同程度的与SjTGR结合，其中JIPDys1号噬菌体克隆的结合能力最强。图7所示。

实施例11 Western Blotting鉴定筛选到的噬菌体结合特异性

1）蛋白样品处理：每个噬菌体样本用10 μg 重组SjTGR蛋白加等体积的2×上样缓冲液，室温作用 20 min，沸水浴煮沸5 min，短暂离心后用于下一步实验。

2）电泳：将上述样本进行 12 % 的 SDS-PAG 电泳，按以下程序进行：先在80 V 电泳15 min，再在180 V 电泳75 min。

3）转印

（1）电泳结束，用转膜缓冲液平衡凝胶；

（2）膜处理预先裁好与胶条同样大小的滤纸和 NC 膜，浸入转膜缓冲液中10 min。

（3）转膜将转膜装置的各组件从下至上依次按阳极、滤纸、NC 膜、凝胶、滤纸、阴极的顺序放好，滤纸、凝胶、NC 膜精确对齐，每一步去除气泡。将转膜装置卡紧后按正负极方向插入转移电泳槽中。接通电源，恒流 30 mA，转移过夜。转移结束后，断开电源将膜取出，并进行适当的切割。

（4）用PBS 洗膜，10 min/次，共3 次，加入封闭液，平稳摇动，室温2 h。

（5）弃封闭液，用 TBST（吐温的浓度为0.5%）洗膜，10 min/次，共 3 次。加入用 TBST 1︰100 稀释的噬菌体，室温作用2 h。

（6）弃血清反应液，用TBST洗膜，10 min/次，共3次，加入1︰3000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体，平稳摇动，室温作用2 h。

（7）弃二抗，用TBST 洗膜，10 min/次，共3次，加入DAB 底物，室温显色5～10 min，显色完全后用去离子水漂洗终止反应。结果显示各株噬菌体均能与变性SjTGR蛋白结合。如图8所示。

实施例12：噬菌体对重组SjTGR硒蛋白活性抑制作用

以上述筛选到的噬菌体为抑制剂，按实施例8中酶活性分析方法，在反应体系中加入10 μL（10¹⁴pfu/mL）的噬菌体，测定各噬菌体对SjTGR酶活性（TrxR、GR、Grx活性）的抑制作用，并分别计算酶活性抑制百分比。

酶活性抑制试验结果显示JIPDys1、2、3号噬菌体（各株噬菌体的滴度均为10¹¹pfu）均能不同程度地抑制SjTGR的TrxR、GR、Grx酶活性，其中JIPDys1号噬菌体抑制抑制作用最强，对SjTGR的TrxR、GR、Grx酶活性抑制作用均在50%以上（表1、图9）。

表 1 不同的噬菌体对SjTGR酶活性的抑制作用比较

噬菌体	TrxR 活性抑制百分比	GR 活性抑制百分比	Grx 活性抑制百分比
				JIPDys1	59.04	80.80	53.56
JIPDys2	45.24	69.43	25.64
				JIPDys3	54.72	20.88	43.02
JIPDys4	0.73	1.50	1.23

SEQ NO.1：

Trp Pro His Asn Trp Trp Pro His Phe Lys Val Lys

10 12

SEQ NO.2：

Leu His Ala Glu Thr Arg Ser Ala Met His Arg Thr

10 12

SEQ NO.3：

Tyr Thr Met Pro Ser Leu Thr Leu Tyr Ala Met Gly

10 12

SEQ NO.4：

Met Pro Pro Ile Asp Gly Thr Ser Gln Trp Leu Gln Arg Thr Ile

5 10 15

Glu Ser Ala Ala Val Ile Val Phe Ser Lys Thr Thr Cys Pro Phe

20 25 30

Cys Lys Lys Leu Lys Asp Val Leu Ala Glu Ala Lys Ile Lys His

35 40 45

Ala Thr Ile Glu Leu Asp Gln Leu Ser Asn Gly Ser Val Ile Gln

50 55 60

Lys Ala Leu Ser Asn Phe Ser Lys Ile Glu Thr Val Pro Gln Met

65 70 75

Phe Val Arg Gly Lys Phe Ile Gly Asp Ser Lys Ala Val Leu Asn

80 85 90

Tyr His Asn Asn Asn Gln Leu Gln Ala Ile Val Asn Glu Asn Lys

95 100 105

Tyr Asp Tyr Asp Leu Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu

110 115 120

Ala Ala Gly Lys Glu Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Lys Thr Ala Val

125 130 135

Leu Asp Tyr Val Glu Pro Thr Pro Met Gly Thr Thr Trp Gly Leu

140 145 150

Gly Gly Thr Cys Val Asn Val Gly Cys Ile Pro Lys Lys Leu Met

155 160 165

His Gln Ala Gly Leu Leu Ser His Ser Leu Glu Asp Ala Gln His

170 175 180

Phe Gly Trp Ser Leu Asp Lys Ser Lys Ile Ser His Asp Trp Ser

185 190 195

Thr Met Val Glu Gly Val Gln Ser His Ile Gly Ser Leu Asn Trp

200 205 210

Gly Tyr Lys Val Ser Leu Arg Asp Asn Ala Val Thr Tyr Leu Asn

215 220 225

Ala Arg Gly Met Leu Leu Ser Pro His Glu Val Gln Ile Thr Glu

230 235 240

Lys Asn Lys Lys Val Ser Thr Ile Thr Gly Asn Lys Ile Ile Leu

245 250 255

Ala Thr Gly Glu Arg Pro Lys Tyr Pro Glu Ile Pro Gly Ala Ile

260 265 270

Glu Tyr Gly Ile Thr Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr Phe

275 280 285

Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu

290 295 300

Cys Ala Gly Phe Leu Ala Ser Leu Gly Gly Asp Val Thr Val Met

305 310 315

Val Arg Ser Ile Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gln Gln Met Ala Glu

320 325 330

Lys Val Gly Asp Tyr Met Glu Asn His Gly Val Lys Phe Ala Lys

335 340 345

Leu Cys Val Pro Asp Glu Ile Thr Gln Leu Lys Pro Val Asp Thr

350 355 360

Glu Asn Asn Lys Pro Gly Leu Leu Leu Val Lys Gly His Tyr Thr

365 370 375

Asp Gly Lys Lys Phe Glu Glu Glu Phe Glu Thr Val Ile Phe Ala

380 385 390

Val Gly Arg Glu Pro Gln Leu Ser Lys Leu Asn Cys Glu Ala Val

395 400 405

Gly Val Lys Leu Asp Lys Asn Gly Arg Val Val Cys Ser Asp Asp

410 415 420

Glu Gln Thr Thr Val Ser Asn Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Asn

425 430 435

Ala Gly Lys Pro Gln Leu Thr Pro Val Ala Ile His Ala Gly Arg

440 445 450

Tyr Leu Ala Arg Arg Leu Phe Ala Gly Ala Thr Glu Leu Thr Asp

455 460 465

Tyr Ser Asn Val Ala Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr Gly

470 475 480

Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Asp Ala Ile Glu Lys Tyr Gly Asp

485 490 495

Asn Asp Ile Glu Val Tyr His Ser His Phe Lys Pro Leu Glu Trp

500 505 510

Thr Val Ala His Arg Glu Asp Asn Val Cys Tyr Met Lys Leu Val

515 520 525

Cys Arg Ile Ser Asp Asn Met Arg Val Leu Gly Leu His Val Leu

530 535 540

Gly Pro Asn Ala Gly Glu Ile Thr Gln Gly Tyr Ala Val Ala Ile

545 550 555

Lys Met Gly Ala Thr Lys Glu Asp Phe Asp Arg Thr Ile Gly Ile

560 565 570

His Pro Thr Cys Ser Glu Thr Phe Thr Thr Leu His Val Thr Lys

575 580 585

Arg Ser Gly Gly Ser Ala Ala Val Thr Gly Cys ***

590 595 596

SEQ NO.5

atgcctccga ttgatggaac atcccagtgg ttgcagagga ctatcgaatc agcggcggta 60

atcgtcttta gcaaaacaac ttgtccattt tgcaaaaagc taaaggatgt tttagctgaa 120

gcaaagatta aacacgctac aattgaactg gatcaattat ccaatggttc ggttattcaa 180

aaggcattat ctaacttctc taaaattgaa acagtcccgc aaatgtttgt tagaggcaag 240

ttcattggcg attctaaagc agtacttaat taccacaata ataatcaatt gcaggcgatc 300

gtcaacgaaa ataagtatga ctatgatctg ataatcatcg gtggaggatc tggtggactc 360

gctgctggaa aggaggcagc caaatacggc gcaaagacag ctgttctgga ttatgtagaa 420

ccgactccaa tgggtactac ttggggatta ggtggaacct gtgttaacgt tggatgtatc 480

cctaaaaaat taatgcacca agctggactc ttaagtcatt ctttggaaga tgcccaacat 540

ttcggttgga gcttggataa atcaaaaatt tcccatgatt ggtcaactat ggttgaagga 600

gttcagagtc acatcggttc tttaaattgg ggctataaag tttcactaag agataatgcg 660

gttacgtatc ttaatgctcg tgggatgcta ttaagtcctc atgaggttca gattacagaa 720

aagaataaaa aagtatccac aataactgga aataaaatca tcttagctac tggcgagcgt 780

ccaaaatacc cagaaatacc tggagcaatc gaatatggga ttacaagtga tgatttgttt 840

tccttaccat acttcccggg caaaacactg gtcgttggag cgagctatgt tgcattggaa 900

tgtgctggtt ttcttgccag tttgggcggt gatgttactg ttatggttcg ttccattttg 960

cttcgtggtt tcgatcaaca aatggctgag aaggttggcg attatatgga aaatcatgga 1020

gtcaagttcg caaagttgtg tgtaccagac gagattacac agttgaaacc ggtagatact 1080

gagaataaca aacctggact cctgcttgtt aagggtcatt atactgatgg taagaagttt 1140

gaagaagaat ttgaaacggt cattttcgct gttggtcgtg aaccacaatt atcgaagctt 1200

aattgtgaag ctgtcggtgt taaactagat aagaatggtc gggttgtatg ctcagatgat 1260

gaacaaacta cagtcagtaa catttatgcc attggagata taaacgctgg aaaaccacag 1320

ttaactccag tggctattca tgctggacgt tatttggcta gacggttatt cgctggtgca 1380

actgaactga ctgactattc caatgttgct acgactgttt tcactccatt agaatatggc 1440

gcttgtggac tgagtgaaga ggatgcaatt gaaaagtatg gtgataatga tattgaggta 1500

tatcattcac atttcaaacc tttagaatgg actgttgctc atcgtgaaga taatgtttgt 1560

tacatgaaac ttgtttgccg tatatctgat aacatgcgtg tactgggtct acatgtttta 1620

ggacctaatg caggtgaaat aacacagggg tatgcagttg caattaaaat gggtgcaact 1680

aaagaagatt ttgatcgtac cataggaatt cacccaactt gttctgagac atttacaacg 1740

ttgcatgtaa ccaagagatc tgggggctct gcagcggtaa ccggttgctg a 1791

SEQ ID NO.6：

ggttaataat cggttgcagg tctgcaccaa tcgttaacct atgcgccc 48

SEQ ID NO. 7：

atgcctccga ttgatggaac atcccagtgg ttgcagagga ctatcgaatc agcggcggta 60

atcgtcttta gcaaaacaac ttgtccattt tgcaaaaagc taaaggatgt tttagctgaa 120

gcaaagatta aacacgctac aattgaactg gatcaattat ccaatggttc ggttattcaa 180

aaggcattat ctaacttctc taaaattgaa acagtcccgc aaatgtttgt tagaggcaag 240

ttcattggcg attctaaagc agtacttaat taccacaata ataatcaatt gcaggcgatc 300

gtcaacgaaa ataagtatga ctatgatctg ataatcatcg gtggaggatc tggtggactc 360

gctgctggaa aggaggcagc caaatacggc gcaaagacag ctgttctgga ttatgtagaa 420

ccgactccaa tgggtactac ttggggatta ggtggaacct gtgttaacgt tggatgtatc 480

cctaaaaaat taatgcacca agctggactc ttaagtcatt ctttggaaga tgcccaacat 540

ttcggttgga gcttggataa atcaaaaatt tcccatgatt ggtcaactat ggttgaagga 600

gttcagagtc acatcggttc tttaaattgg ggctataaag tttcactaag agataatgcg 660

gttacgtatc ttaatgctcg tgggatgcta ttaagtcctc atgaggttca gattacagaa 720

aagaataaaa aagtatccac aataactgga aataaaatca tcttagctac tggcgagcgt 780

ccaaaatacc cagaaatacc tggagcaatc gaatatggga ttacaagtga tgatttgttt 840

tccttaccat acttcccggg caaaacactg gtcgttggag cgagctatgt tgcattggaa 900

tgtgctggtt ttcttgccag tttgggcggt gatgttactg ttatggttcg ttccattttg 960

cttcgtggtt tcgatcaaca aatggctgag aaggttggcg attatatgga aaatcatgga 1020

gtcaagttcg caaagttgtg tgtaccagac gagattacac agttgaaacc ggtagatact 1080

gagaataaca aacctggact cctgcttgtt aagggtcatt atactgatgg taagaagttt 1140

gaagaagaat ttgaaacggt cattttcgct gttggtcgtg aaccacaatt atcgaagctt 1200

aattgtgaag ctgtcggtgt taaactagat aagaatggtc gggttgtatg ctcagatgat 1260

gaacaaacta cagtcagtaa catttatgcc attggagata taaacgctgg aaaaccacag 1320

ttaactccag tggctattca tgctggacgt tatttggcta gacggttatt cgctggtgca 1380

actgaactga ctgactattc caatgttgct acgactgttt tcactccatt agaatatggc 1440

gcttgtggac tgagtgaaga ggatgcaatt gaaaagtatg gtgataatga tattgaggta 1500

tatcattcac atttcaaacc tttagaatgg actgttgctc atcgtgaaga taatgtttgt 1560

tacatgaaac ttgtttgccg tatatctgat aacatgcgtg tactgggtct acatgtttta 1620

ggacctaatg caggtgaaat aacacagggg tatgcagttg caattaaaat gggtgcaact 1680

aaagaagatt ttgatcgtac cataggaatt cacccaactt gttctgagac atttacaacg 1740

ttgcatgtaa ccaagagatc tgggggctct gcagcggtaa ccggttgctg aggttaataa 1800

tcggttgcag gtctgcacca atcgttaacc tatgcgccc 1839

Claims

1.抑制日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR活性的抑制肽，其特征在于所述的抑制肽氨基酸序列分别为：

SEQ NO.1；即JIPDys1：WPHNWWPHFKVK；

SEQ NO.2；即JIPDys2：LHAETRSAMHRT；

SEQ NO.3；即JIPDys3：YTMPSLTLYAMG。

2.根据权利要求1所述SjTGR活性抑制肽，其特征在于该抑制肽的氨基酸序列演变而产生的其它具有抑制SjTGR活性的肽段。

3.按权利要求1、或2所述的SjTGR活性抑制肽的应用，其特征在于在制备治疗血吸虫病新药或治疗用药物靶向载体制备方面的应用。