CN109735511B

CN109735511B - 一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法

Info

Publication number: CN109735511B
Application number: CN201811036760.2A
Authority: CN
Inventors: 尹春丽; 杜国荣; 张九东
Original assignee: Xian University
Current assignee: Shaanxi Yonglei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2038-09-06
Also published as: CN109735511A

Abstract

本发明公开了提供一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法，该方法包括如下步骤：步骤一、将xdhA、xdhB和xdhC三个基因导入大肠杆菌中，三个基因在大肠杆菌中共表达，得到黄嘌呤脱氢酶；步骤二、将所述黄嘌呤脱氢酶使用巯基特异性修饰剂处理，得到临床检测用黄嘌呤氧化酶。该方法通过重组大肠杆菌发酵制备黄嘌呤氧化酶。具有表达量高、纯化工艺简单、纯化得率高以及生产成本低的优势。

Description

一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法。

背景技术

黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)是广泛存在于生物体内的嘌呤代谢途径关键酶，主要催化次黄嘌呤氧化生成黄嘌呤，进一步氧化黄嘌呤生成尿酸。XOD属于黄素蛋白氧化酶类中较为复杂的多亚基蛋白，其底物催化机理复杂，除需辅因子FAD，还需钼蝶呤及铁硫簇辅因子，XOD催化的最终电子受体为O₂。目前，XOD在医疗诊断酶、食品检测、工业催化及环境保护中都有广泛的应用价值。在医疗诊断领域XOD可用于测定次黄嘌呤和黄嘌呤水平、血清无机磷含量、5'-核苷酸酶及血清超氧化物歧化酶酶活力等。因此，对黄嘌呤氧化酶XOD制备方法的研究，具有重要理论意义和应用价值。

目前，国内外使用的XOD主要从牛奶中进行提取，来源单一，生产成本较高，同时由于黄嘌呤氧化酶的含量和质量受不同地域和不同品种奶牛的影响，在应用上对其限制很大。因此，XOD大规模低成本生产方法的研究可以为我国创造巨大的经济和社会效益。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法，该方法通过重组大肠杆菌发酵制备黄嘌呤氧化酶，具有表达量高、纯化工艺简单、纯化得率高以及生产成本低的优势。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤一、将xdhA、xdhB和xdhC三个基因导入大肠杆菌中，三个基因在大肠杆菌中共表达，得到黄嘌呤脱氢酶；

步骤二、将所述黄嘌呤脱氢酶使用巯基特异性修饰剂处理，得到临床检测用黄嘌呤氧化酶。

进一步地，上述步骤一的具体过程如下：将xdhA和xdhC基因连接到大肠杆菌共表达载体pETDuet-1，构建重组质粒pETDuet-1-xdhA-xdhC，同时将xdhB基因连接到大肠杆菌表达载体pACYCDuet-1，构建重组质粒 pACYCDuet-1-xdhB；然后将上述两个重组质粒共同转化大肠杆菌 BL21(DE3)，得到表达黄嘌呤脱氢酶的重组大肠杆菌。

进一步地，仅在所述xdhA亚基中加入组氨酸标签，用于后续重组蛋白纯化，而亚基xdhB和xdhC均不添加组氨酸标签。

进一步地，上述的巯基特异性修饰剂为5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)、N- 乙基马来酰亚胺和碘乙酰胺。

进一步地，上述的巯基特异性修饰剂为5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)。

本发明还公开了巯基特异性修饰剂用于将上述黄嘌呤脱氢酶转化为临床检测用黄嘌呤氧化酶的用途。

本发明一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法具有如下优点：(1)通过xdhA、xdhB和xdhC三个基因在大肠杆菌中的共表达，实现了重组酶高效表达，在摇瓶中的表达量超过50mg/L培养基。(2)与目前从牛奶中提取XOD 的方法相比，重组菌发酵制备XOD具有规模容易放大、纯化工艺简单、得率高和生产成本低等优势。(3)通过该法制备的重组黄嘌呤氧化酶具有高的比活力，为>60U/mg蛋白，而从牛奶中提取的XOD比活力较低，为≥0.8U/mg蛋白。

附图说明

图1为以大肠杆菌K12(E.coli K-12)基因组为模板，PCR扩增得到黄嘌呤脱氢酶的xdhA、xdhB和xdhC三个亚基。Lane M：DNAmarker；Lane 1：xdhA 基因；Lane 2：xdhB基因；Lane 3：xdhC基因；

图2为黄嘌呤脱氢酶xdhA、xdhB和xdhC三个亚基共表达载体 pETDuet-1-xdhA-xdhC和pACYCDuet-1-xdhB的构建；A：表达载体 pETDuet-1-xdhA-xdhC构建；B：表达载体pACYCDuet-1-xdhB构建；

图3为重组大肠杆菌表达黄嘌呤脱氢酶的电泳图。Lane M:蛋白分子量标准；Lane1：未加诱导剂IPTG(对照)；Lane 2:添加0.1mM IPTG；Lane 3：添加0.3mM IPTG；Lane 4：添加0.5mM IPTG。重组表达的黄嘌呤脱氢酶包含xdhA、xdhB和xdhC三个亚基；

图4为纯化的重组酶。Lane M：蛋白分子量标准；Lane 1-3：纯化的重组酶(包含xdhA、xdhB和xdhC三个亚基)；

图5为重组黄嘌呤氧化酶活性测定的紫外吸收光谱图；

其中：A：未被巯基特异性修饰剂5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)处理的重组黄嘌呤脱氢酶；

B：5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(1mM)处理重组黄嘌呤脱氢酶1h。

具体实施方式

本发明一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤一、将xdhA、xdhB和xdhC三个基因导入大肠杆菌中，三个基因在大肠杆菌中共表达，得到黄嘌呤脱氢酶；其中：xdhA(取自Gene ID:947116)、 xdhB(取自Gene ID:947205)和xdhC(取自Gene ID:945148)为大肠杆菌基因。

具体过程如下：将xdhA和xdhC基因连接到大肠杆菌共表达载体 pETDuet-1，构建重组质粒pETDuet-1-xdhA-xdhC，同时将xdhB基因连接到大肠杆菌表达载体pACYCDuet-1，构建重组质粒pACYCDuet-1-xdhB；然后将上述两个重组质粒共同转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达黄嘌呤脱氢酶的重组大肠杆菌。

仅在所述xdhA亚基中加入组氨酸标签，用于后续亲和纯化；而亚基xdhB 和xdhC均不添加组氨酸标签。

步骤二、将黄嘌呤脱氢酶使用巯基特异性修饰剂处理，得到临床检测用黄嘌呤氧化酶。超滤除去巯基特异性修饰剂。

上述巯基特异性修饰剂为5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)、N-乙基马来酰亚胺和碘乙酰胺。

上述巯基特异性修饰剂优选为5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)。

1.细胞和试剂：

大肠杆菌K12(E.coli K-12)、大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)、大肠杆菌表达质粒pETDuet-1和pACYCDuet-1均为本实验室保存，也可以购买得到；质粒DNA抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Omega公司。T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和各种限制性内切酶购自Takara公司。亲和层析柱 HisTrap Fast Flow预装柱购自GE公司，其余试剂均为国产或进口分析纯。

2.培养基：

LB培养基(0.5％酵母粉，1％蛋白胨，1％氯化钠；以上均为质量分数)，氨苄青霉素(ampicillin)和氯霉素(chloramphenicol)终浓度均为50μg/mL。

固体LB培养基：在液体LB培养基中加入1.5％琼脂，即制成固体琼脂平板培养基。

本发明可以通过下述实施例进一步阐明：

实施例1黄嘌呤脱氢酶基因的克隆：

将大肠杆菌K12在LB培养基中37℃培养过夜，离心收集大肠杆菌菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板PCR扩增分别获得黄嘌呤脱氢酶三个亚基xdhA、xdhB和xdhC 的基因序列。根据NCBI GenBank数据库中大肠杆菌黄嘌呤脱氢酶三个亚基 xdhA(取自Gene ID:947116)、xdhB(取自Gene ID:947205)和xdhC(取自Gene ID:945148)的基因序列设计引物。

PCR扩增xdhA基因的引物序列为：

上游引物xdhA-F：′-AAGTggatccAATGCGCGTCGTCGATGCCATTGC-3′；

下游引物xdhA-R：′-TACTgcggcccgcTTAAATCAATCCTGCCAGATG-3′；

PCR的扩增条件为：94℃4min；94℃1min，56℃30s，72℃150s， 30cycles；72℃8min。

PCR扩增xdhB基因的引物序列为：

上游引物xdhB-F：5′-ACGTccatggCAATGTTTGCTTCTTAC-3′；

下游引物xdhB-R：5′-ACATaagcttTTATTGCAATTTTCCCCCCGC-3′；

PCR的扩增条件为：94℃4min；94℃1min，56℃30s，72℃60s， 30cycles；72℃8min。

PCR扩增xdhC基因的引物序列为：

上游引物xdhC-F：′-ACGCagatctGATGAATCACAGCGAAACAATTAC-3′；

下游引物xdhC-R：5′-CCGTggtaccTTACTTCGTTTTCTCGCAATCC-3′；

PCR的扩增条件为：94℃4min；94℃1min，56℃30s，72℃40s， 30cycles；72℃8min。

如图1所示，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明，扩增的xdhA、 xdhB和xdhC基因产物长度分别约为2300bp，900bp和500bp，如图1所示。与NCBI GenBank数据库中大肠杆菌黄嘌呤脱氢酶三个亚基的基因长度基本一致，测序结果表明获得了正确的黄嘌呤脱氢酶三个亚基的基因。

实施例2

构建重组表达质粒pETDuet-1-xdhA-xdhC和pACYCDuet-1-xdhB；

为了将黄嘌呤脱氢酶的三个亚基xdhA、xdhB和xdhC在大肠杆菌中进行共表达，我们将xdhA和xdhC基因和共表达载体pETDuet-1连接，构建载体 pETDuet-1-xdhA-xdhC，如图2A所示。同时将xdhB基因和表达载体 pACYCDuet-1连接，构建载体pACYCDuet-1-xdhB，如图2B所示。具体实验过程如下：

如图2所示，以大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增获得xdhA基因，然后通过DNA胶回收试剂盒获得纯的xdhA基因。将质粒pETDuet-1 和xdhA基因分别使用Bam HⅠ和NotⅠ在37℃双酶切4h，然后通过DNA 胶回收试剂盒进行回收。将回收的质粒和xdhA基因在16℃连接过夜，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养12h，随机挑选转化子接种于3mL液体LB培养基中，37℃培养12h后提取质粒，进行酶切和测序鉴定。测序正确的重组质粒命名为 pETDuet-1-xdhA。随后将PCR扩增并回收的xdhC基因和重组质粒 pETDuet-1-xdhA使用BglⅡ和KpnⅠ在37℃双酶切4h，将回收的质粒和xdhC基因在16℃连接过夜，获得重组质粒pETDuet-1-xdhA-xdhC。

以大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增获得xdhB基因，将质粒 pACYCDuet-1和xdhB基因分别使用NcoⅠ和HindⅢ在37℃双酶切4h，然后通过DNA胶回收试剂盒进行回收。将回收的质粒和xdhB基因在16℃连接过夜，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有氯霉素的 LB固体平板，37℃培养12h，随机挑选转化子接种于3mL液体LB培养基中，37℃培养12h后提取质粒，进行酶切和测序鉴定。测序正确的重组质粒命名为pACYCDuet-1-xdhB。

实施例3重组黄嘌呤脱氢酶的表达和纯化：

将构建的重组质粒pETDuet-1-xdhA-xdhC和pACYCDuet-1-xdhB共同转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化液涂于氨苄青霉素(50μg/mL)和氯霉素(50μg/mL)的固体LB平板上，37℃培养12-16h后获得克隆，即得到黄嘌呤脱氢酶的表达菌株。

将带有双质粒的黄嘌呤脱氢酶表达菌株按照1％接种量接种于液体LB 培养基中，30℃培养至OD600＝0.6-0.8，分别加入终浓度为0.1mM、0.3mM 和0.5mM的诱导剂IPTG在30℃下诱导12h，然后进行SDS-PAGE电泳检测重组酶的表达情况，电泳结果如图3所示。结果表明黄嘌呤脱氢酶的三个亚基xdhA、xdhB和xdhC均在大肠杆菌中表达，xdhA亚基表观分子量约为 90kDa，xdhB亚基分子量约为30kDa，xdhC亚基分子量约为18kDa，分子量大小与预测的一致。同时，电泳结果表明当诱导剂IPTG浓度为0.1mM 时，黄嘌呤脱氢酶的三个亚基的表达量较高。

将诱导表达的重组大肠杆菌进行超声波破碎，破碎后的粗酶液加入30 mM的咪唑和0.5M的氯化钠，然后在4℃离心15min(12000rpm)获得上清液，上清液使用HisTrap FastFlow预装柱纯化蛋白，纯化的蛋白通过 SDS-PAGE进行电泳分析，结果如图4所示。黄嘌呤脱氢酶的三个亚基xdhA、 xdhB和xdhC均得到纯化，重组蛋白的纯化达到90％以上。在摇瓶中重组黄嘌呤脱氢酶表达量达到50mg/L。另外，在载体构建中，我们仅在最大的亚基xdhA上添加了His标签，而亚基xdhB和xdhC均没有添加His标签。因此，在镍柱亲和层析过程中仅能吸附亚基xdhA，而亚基xdhB和xdhC均是通过亚基间相互作用和xdhA结合，保证了三个亚基在纯化的全蛋白中数量一致性，保证黄嘌呤氧化酶具有较高的比活力。

实施例4巯基特异性修饰剂处理重组黄嘌呤脱氢酶：

在研究中发现，当以O₂为反应电子受体时纯化的重组黄嘌呤没有活性，当以辅酶NAD⁺为电子受体时，重组酶表现出较高的活性，这些结果表明表达的重组酶为黄嘌呤脱氢酶，而不具有黄嘌呤氧化酶的催化特性(以O₂为反应电子受体)。在该研究中，使用终浓度为1mM的巯基特异性修饰剂5,5'- 二硫双(2-硝基苯甲酸)室温处理重组黄嘌呤脱氢酶(1mg/mL)1h，然后通过超滤除去5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)。黄嘌呤氧化酶活性测定结果表明未用5,5'- 二硫双(2-硝基苯甲酸)处理的酶没有催化活性，结果如图5A所示。而使用 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)处理后的酶具有较高的活性(68U/mg蛋白)，结果如图5B所示。表明通过巯基特异性修饰剂处理，使黄嘌呤脱氢酶活性转化为黄嘌呤氧化酶活性(以O₂为反应电子受体)。

同时，使用1mM的N-乙基马来酰亚胺处理后的酶比活性为52U/mg，使用1mM碘乙酰胺处理后的酶比活性为47U/mg。实验结果表明使用1mM 的5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)处理的酶具有较高的比活性。

本实验中，采用紫外分光光度法检测XOD的活性。紫外分光光度法主要根据黄嘌呤氧化酶在催化黄嘌呤氧化的反应过程中，每氧化1mol黄嘌呤，将消耗1mol分子氧和水，产生1mol尿酸和1mol H₂O₂，而尿酸在293nm 处有特异吸收峰，可通过检测溶液在293nm处的吸光度来测定尿酸浓度，从而通过尿酸浓度变化计算XOD酶活性。1U酶活力定义为在37℃下1min催化产生1μmol尿酸所需的酶量为1U。在该检测条件下每毫摩尔尿酸的消光系数为12.5。

具体使用试剂及步骤如下：

试剂配制：

A液：50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)；

B液：0.025M氢氧化钠溶液(取0.01g溶于10ml去离子水中)；

C液：10mM黄嘌呤溶液(溶于溶液B中)；

D液：1mM氧嗪酸钾溶液(溶于50mL去离子水中)；

测定步骤：

1、取A液179.2μL、C液6.4μL、D液6.4μL，置于比色皿中，37℃下孵育5min，然后进行紫外扫描(220nm-450nm)；

2、加入8μL酶溶液轻柔翻转混合，在37℃下孵育3-5min，然后进行紫外扫描(220nm-450nm)；

3、根据反应液在293nm处吸光度的变化计算得到酶活性。

Claims

1.一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

步骤二、将所述黄嘌呤脱氢酶使用巯基特异性修饰剂处理，得到临床检测用黄嘌呤氧化酶；

所述的巯基特异性修饰剂为碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺或5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)；

其中：xdhA、xdhB和xdhC均为大肠杆菌基因，xdhA取自Gene ID:947116，xdhB取自GeneID:947205，xdhC取自Gene ID:945148；

所述步骤一的具体过程如下：将xdhA和xdhC基因连接到大肠杆菌共表达载体pETDuet-1，构建重组质粒pETDuet-1-xdhA-xdhC，同时将xdhB基因连接到大肠杆菌表达载体pACYCDuet-1，构建重组质粒pACYCDuet-1-xdhB；然后将上述两个重组质粒共同转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达黄嘌呤脱氢酶的重组大肠杆菌，共表达，得到黄嘌呤脱氢酶。

2.根据权利要求1所述的一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，仅在所述xdhA亚基中加入组氨酸标签。

3.根据权利要求2所述的一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，所述的巯基特异性修饰剂为5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)。