TW202417611A - 一種重組微生物及生產衣康酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一種生產衣康酸及其衍生單體的重組微生物，其包括至少兩個基因，且該至少兩個基因係位於同一表現載體上，該至少兩個基因包括編碼順-烏頭酸脫羧酶的基因以及編碼烏頭酸酶的基因，且該重組微生物的基因組上包括編碼分子伴侶蛋白GroELS的基因。本揭露另提供使用該微生物生產衣康酸的方法。
Description
本揭露係關於一種生產衣康酸的方法，尤係關於以經重組的微生物作為生物催化劑生產衣康酸的方法。
傳統藉由化學方法生產及製備衣康酸的製程中，常使用到有機溶劑，製程上會有甲醛廢水產生，不利於永續生產目標。
近年來於工業發酵法中，主要利用土麴黴(Aspergillus terreus)發酵體內生產衣康酸，儘管最終能產生高濃度衣康酸，然而過多的生物代謝副產物不利工業純化，且耗時過久徒增生產成本。
於先前技術中，US 20190330665 A1已揭露藉由酶作為生物催化劑以製備衣康酸的方法，其揭露使用經基因修飾的假單胞菌屬(Pseudomonas)的細菌生產衣康酸或反式-烏頭酸的方法；另外，KR 102033217 B1則揭露利用含有烏頭酸酶(Aconitase)和順-烏頭酸脫羧酶(cis-aconitate decarboxylase)的重組載體作為生物催化劑於含有檸檬酸的培養基中生產衣康酸的方法，該方法為目前體外催化生產技術中較佳者，可在43小時內取得41.6g/L衣康酸，產率0.96g/L/h。
然而，上述方法的產率仍未臻理想，尚無法投入工業化製程實現大規模的生產，本揭露所屬技術領域對於藉由生物催化劑生產衣康酸並提升
製程產能的方法仍有需求，本揭露係提供一種新穎的重組微生物並使用該新穎的重組微生物生產衣康酸的方法，藉以解決習知技術所存在的問題。
為解決上述的問題，本揭露提供一種生產衣康酸及其衍生單體的重組微生物，其包括至少兩個基因，且該至少兩個基因係位於同一表現載體上，該至少兩個基因包括編碼順-烏頭酸脫羧酶的基因以及編碼烏頭酸酶的基因，且該重組微生物的基因組包括編碼分子伴侶蛋白GroELS的基因。
於本揭露的至少一個具體實施例中，該表現載體上還具有控制該至少兩個基因表現的誘導型啟動子基因。
於本揭露的至少一個具體實施例中，該誘導型啟動子為T7啟動子。
於本揭露的至少一個具體實施例中，在該重組微生物所包含的表現載體上，該編碼順-烏頭酸脫羧酶之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：1至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：1具有相同活性之序列；該編碼烏頭酸酶之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：2至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：2具有相同活性之序列。
於本揭露的至少一個具體實施例中，在該重組微生物所包含的表現載體上，該編碼順-烏頭酸脫羧酶之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：1至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：1具有相同活性之序列；該編碼烏頭酸酶之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：3至少有60%序列一致性且與SEQ ID NO：3具有相同活性之序列。
於本揭露的至少一個具體實施例中，在該重組微生物的基因組中，該編碼分子伴侶蛋白GroELS基因之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：5至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：5具有相同活性之序列。
於本揭露的至少一個具體實施例中，該重組微生物屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)。於本揭露的一些具體實施例中，該重組微生物為經重組的大腸桿菌BL21(DE3)菌株。
於本揭露的一些具體實施例中，本揭露提供的新型整合菌株AtCg/BD：：7G係於2022年6月13日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940694。以及本揭露提供的另一新型整合菌株AtEcN/BD：：7G係於2022年6月13日寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940695。
本揭露亦提供一種生產衣康酸及其衍生單體的方法，包括：將上述重組微生物於含有檸檬酸之溶液中進行反應，將該檸檬酸轉化以生產衣康酸及其衍生單體；以及自該溶液中分離獲得該衣康酸及其衍生單體。
於本揭露的一些具體實施例中，該方法之溶液為含有檸檬酸及檸檬酸鹽之混合溶液。
於本揭露的至少一個具體實施例中，進行該反應時的pH值介於5.0至7.0之間，例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。於本揭露的至少一個具體實施例中，進行該反應時的pH值介於5.0至6.0之間。
於本揭露的至少一個具體實施例中，進行該反應時的溫度介於22至37℃之間，例如22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、
30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。於本揭露的至少一個具體實施例中，進行該反應時的溫度介於22至30℃之間。
本揭露提供之含有質體pHCC-AtCg的BL21(DE3)菌株，可達到催化活性優於現有體外催化生產技術中最佳者，本揭露設計之含有質體pHCC-AtCg與pHCC-AtEcN的新型整合菌株AtCg/BD：：7G及AtEcN/BD：：7G，可進一步再提升全細胞反應催化衣康酸生產的整體效率，其中，該新型整合菌株AtEcN/BD：：7G能獲得最高產量，使藉由生物催化劑的大規模生產衣康酸得以實現。
圖1顯示不同來源的烏頭酸酶其蛋白表達的情形。圖中分別以箭頭指出源自大腸桿菌的烏頭酸酶(EcAcnA)和源自谷氨酸棒狀桿菌的烏頭酸酶(CgAcnA)於蛋白質電泳分析中的位置。Ec：大腸桿菌MG1655；Cg：谷氨酸棒狀桿菌；EcN：大腸桿菌Nissle；WC：全細胞；SP：上清液；M：標記。
圖2顯示不同來源的順-烏頭酸脫羧酶其蛋白表達的情形。圖中分別以箭頭指出源自芽孢桿菌的順-烏頭酸脫羧酶(BsCadA)和源自土麴黴的順-烏頭酸脫羧酶(AtCadA)於蛋白質電泳分析中的位置。Bs：芽孢桿菌；At：土麴黴；WC：全細胞；SP：上清液；M：標記。
圖3A至圖3D顯示不同的單一質體雙基因表達系統之質體圖譜(plasmid map)以及其於不同溫度條件下的蛋白質表達情形。圖3A、3B分別顯示單一質體雙基因表達系統之質體(pHCC-AtCg、pHCC-AtEcN)圖譜；圖3C顯示單一質體pHCC-AtCg在不同溫度(22℃、30℃、37℃)下的表達情形，圖中分別以箭頭指出谷氨酸棒狀桿菌烏頭酸酶(CgAcnA)和土麴黴順-烏
頭酸脫羧酶(AtCadA)於蛋白質電泳中的位置；圖3D顯示單一質體pHCC-AtEcN在30℃下的表達情形，圖中分別以箭頭指出大腸桿菌Nissle烏頭酸酶(EcNAcnA)和土麴黴順-烏頭酸脫羧酶(AtCadA)於蛋白質電泳中的位置。WC：全細胞；SP：上清液；M：標記。
圖4顯示含有單一質體(pHCC-AtCg)的菌株BL21(DE3)於不同培養基中培養對關鍵酶催化效果之影響。LB、G3Y1、G3Y2和G6Y1為不同的培養基，其成分詳見表3。圖中的圓點代表不同菌株之生產速率IA：衣康酸。
圖5顯示用於製作勝任細胞pAH69/BL21(DE3)之pAH69質體圖譜。
圖6顯示pHK-Km-T7-GroELS質體圖譜。
圖7顯示雙關鍵蛋白在BL21(DE3)菌株、新型整合菌株AtCg/BD：：7G和AtEcN/BD：：7G之催化活性差異。IA：衣康酸。圖中的圓點代表不同菌株之生產速率。
以下藉由特定的具體實施例說明本揭露的實施方式，熟習此技藝的人士可由本說明書所揭示的內容輕易地瞭解本揭露的優點及功效。本揭露亦可藉由其它不同的實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同的觀點與應用，在不悖離本揭露所揭示的範圍下賦予不同的修飾與變更。此外，本文所有範圍和數值皆為包含及可合併的。落在本文中所述範圍內的任何數值或點，例如任何整數，都可以作為最小值或最大值以導出下位的範圍。
除非文中另有說明，否則本揭露說明書及所附申請專利範圍中所使用的單數形式「一」及「該」包括複數個體。
除非文中另有說明，否則本揭露說明書及所附申請專利範圍中所使用的術語「或」包括「及/或」的含義。
本揭露提供一種表現載體，其包括編碼生成順-烏頭酸脫羧酶(CadA)與烏頭酸酶(AcnA)的基因，以及控制該順-烏頭酸脫羧酶與烏頭酸酶的核酸分子表現的T7啟動子序列。本揭露亦提供一種包含該表現載體的重組微生物，該重組微生物的基因組上包括編碼分子伴侶蛋白GroELS的基因，以及利用該重組微生物生產衣康酸的方法。
如本文中所使用，術語「順-烏頭酸脫羧酶(cis-aconitate decarboxylase,CadA)」是指催化順-烏頭酸化學反應而生成兩種產物衣康酸和二氧化碳的酶。其EC編號為EC 4.1.1.6。順-烏頭酸脫羧酶屬於裂解酶(lyase)家族，是一種可以切割碳-碳鍵的脫羧酶(carboxylase)。其他常用的名稱包括順-烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase)、CAD和順-烏頭酸羧基裂解酶(cis-aconitate carboxy-lyase)。
根據本揭露的至少一個具體實施例，該編碼順-烏頭酸脫羧酶的核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：1至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：1具有相同活性的序列，例如可表現出具有順-烏頭酸脫羧酶活性的蛋白質。於一些具體實施例中，該編碼順-烏頭酸脫羧酶的核苷酸序列為SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
如本文中所使用，術語「烏頭酸酶(Aconitase,AcnA)」是一種鐵硫蛋白，其參與檸檬酸循環的一部分，將檸檬酸鹽轉化為異檸檬酸鹽。在細胞的粒線體中存在特定形式的烏頭酸酶，執行檸檬酸循環大部分的轉化，而在
細胞質中也有一種類似的形式，執行其他反應產生異檸檬酸。其EC編號為EC 4.2.1.3。其他常用的名稱為烏頭酸酶(aconitate hydratase)。
如本文中所使用，術語「伴侶蛋白(molecular chaperone)GroELS」是分子伴侶體系中研究最為深入的一種，所述伴侶蛋白GroELS與輔助伴侶GroES一起在ATP作用下形成大分子空腔(Anfinsen cage)，為蛋白質折疊提供合適的微環境1,2。
根據本揭露的至少一個具體實施例，該編碼烏頭酸酶的核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：2至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：2具有相同活性的序列，例如可表現出具有烏頭酸酶活性的蛋白質。於一些具體實施例中，該編碼烏頭酸酶的核苷酸序列為SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
根據本揭露的至少一個具體實施例，該編碼烏頭酸酶的核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：3至少有60%(例如：至少62%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：3具有相同活性的序列，例如可表現出具有烏頭酸酶活性的蛋白質。於一些具體實施例中，該編碼烏頭酸酶的核苷酸序列為SEQ ID NO：3的胺基酸序列。
根據本揭露的至少一個具體實施例，編碼分子伴侶蛋白GroELS基因的核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：5至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：5具有相同活性的序列，例如可表現出具有分子伴侶蛋白GroELS活性的蛋白質。於本揭露的一些具體實施例中，該編碼分子伴侶蛋白GroELS的核苷酸序列為SEQ ID NO：5的胺基酸序列。
於本揭露至少一個具體實施例所提供的表現載體，其包括編碼生成順-烏頭酸脫羧酶(CadA)與烏頭酸酶(AcnA)的基因，以及控制該順-烏頭酸脫羧酶與烏頭酸酶的核酸分子表現的T7啟動子序列。於本揭露的一些具體實施例中，該表現載體具有SEQ ID NO：4的序列或與SEQ ID NO：4至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：4具有相同活性的序列，例如可表現出具有順-烏頭酸脫羧酶及烏頭酸酶活性的蛋白質。
於本揭露至少一個具體實施例所提供的表現載體，其包括編碼生成順-烏頭酸脫羧酶(CadA)與烏頭酸酶(AcnA)的基因，以及控制該順-烏頭酸脫羧酶與烏頭酸酶的核酸分子表現的T7啟動子序列。於本揭露的一些具體實施例中，該表現載體具有SEQ ID NO：6的序列或與SEQ ID NO：6至少有80%(例如：至少82%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)序列一致性且與SEQ ID NO：6具有相同活性的序列，例如可表現出具有順-烏頭酸脫羧酶及烏頭酸酶活性的蛋白質。
如本文中所使用，術語「序列一致性百分比」是指一候選核酸片段的核苷酸殘基與一參考核酸片段的核苷酸殘基完全相同的百分比。於進行上述比對時，可先將候選核酸片段與所述的參考核酸片段並排(align)，並於必要時引入間隙(gap)，以使二序列形成最高的序列一致性。在計算序列一致性時，簡併密碼子的核苷酸殘基也將視為不同的殘基，例如同樣編碼天門冬醯胺酸的密碼子AAU和AAC之間，將視為有一個不同的殘基U或C。
應當理解，相較於本揭露中作為參考核酸片段的核苷酸序列，序列中的至少一部分經修飾(如刪除、取代或添加)的候選核酸片段的核苷酸序列亦在本揭露的範圍內，只要所得的候選核酸片段實質上具有與參考核酸片段的核苷酸相同的生物活性，此因密碼子的簡併性(codon degeneracy)。舉例
而言，在本揭露所編碼順-烏頭酸脫羧酶的核苷酸序列中，可在編碼區中產生各種修飾，限制條件在於其不改變自該編碼區表現的多肽的活性。因此，本揭露所編碼順-烏頭酸脫羧酶基因的核苷酸序列可為具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列或與SEQ ID NO：1至少有80%序列一致性的任何核苷酸序列，只要該核苷酸序列所編碼的蛋白質能夠呈現順-烏頭酸脫羧酶的活性。
如本文中所使用，術語「誘導型啟動子」是指必須受到外界信號或誘導物而調控表現特定基因的啟動子。
根據本揭露的至少一個具體實施例，本揭露的表現載體進一步包括選自由下列所組成群組的至少一者：標記基因序列、報導基因序列、抗生素抗性基因序列、限制酶切割位置序列、聚腺苷酸化(polyadenylation)位置序列、加強子序列、終端子序列以及調節子序列。
根據本揭露的至少一個具體實施例，本揭露提供一種包括至少兩個基因以及控制該至少兩個基因表現的T7啟動子位於同一表現載體上的重組微生物，該至少兩個基因包括順-烏頭酸脫羧酶的基因以及烏頭酸酶的基因，且該重組微生物的基因組上包括編碼分子伴侶蛋白GroELS的基因，該分子伴侶蛋白GroELs具有穩定及優化該順-烏頭酸脫羧酶以及烏頭酸酶的功能。於一些具體實施例中，本揭露所提供的重組微生物為經重組的大腸桿菌BL21(DE3)菌株，該經重組的大腸桿菌BL21(DE3)菌株可同時表現順-烏頭酸脫羧酶及烏頭酸酶。於一些具體實施例中，本揭露提供一種可用於生產衣康酸的經重組的大腸桿菌BL21(DE3)菌株。
如本文中所使用，術語「重組」是指以人工方式組合兩個彼此分離的序列片段。一般而言，術語「重組」是指核酸、蛋白質或微生物含有源自於多個不同來源的遺傳物質，或由源自於多個不同來源的遺傳物質編碼，諸如源自於兩種或更多種不同品系或物種的生物。
如本文中所使用，術語「全細胞催化法(in vitro whole-cell biotransformation)」是指利用完整的生物有機體作為催化劑而進行化學轉化的一種方法，亦即，將微生物培養至一定細胞量後，再加入基質進行催化，進而轉化為產物。例如，使用經重組的微生物使其同時表現順-烏頭酸脫羧酶及烏頭酸酶，並透過高密度發酵提升菌量，藉以增加順-烏頭酸脫羧酶及烏頭酸酶的表現量，進而提升其催化生產衣康酸的轉化效率。
如本文中所使用，術語「微生物」屬於微觀生物體，包括細菌、古細菌、病毒或真菌等。如於本文中所使用，「微生物」的引述應理解為涵蓋「細菌」。
適用於作為本揭露的表現載體的微生物宿主包括，但不限於，屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物。於一些具體實施例中，本揭露所使用的微生物宿主能夠於體內表現順-烏頭酸脫羧酶及烏頭酸酶。
以下藉由特定的具體實施例進一步說明本揭露的特點及功效，但非用於限制本揭露的範圍。
實施例
菌株培養
菌株活化：將儲存在-80℃的菌株接種至含有卡那黴素(kanamycin,Km)的LB平板培養基進行活化，在37℃下培養12小時。
活化前培養：將前述菌株活化步驟的菌株接種至4mL LB液態培養基中繼續培養，加入50mg/L的Km，在溫度37℃條件下培養8小時。
前培養：以1%的接種量轉入20mL LB液態培養基中，加入50
mg/L的Km，在溫度37℃條件下培養12小時。
誘導培養：以2%的接種量加入總體積50mL的M9培養基並添加50mg/L的Km，在溫度37℃條件下培養至生物量到達OD600為0.6至0.8，即可加入0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導劑(IPTG)誘導，轉至溫度22~37℃培養12至16小時。
全細胞轉化活性分析
將生產的菌體以去離子水清洗二次，將所需的菌體生物量收集在離心管內，以轉速12000rpm將菌體離心，並去除離心管內上清液體。在每個離心管內加入1mL 1M pH 5.5的檸檬酸/檸檬酸鹽混合溶液以沖散菌體並送入2mL離心管，夾上防爆夾後放置37℃培養箱中進行反應，反應8小時後收取離心管，以轉速12000rpm離心，抽取上清液製備HPLC分析樣品進行定量分析。
1M pH 5.5檸檬酸/檸檬酸鹽混合溶液配置如下：
‧1M檸檬酸溶液：9.6g無水檸檬酸(昭和化學工業株式會社，日本)加水至50mL。
‧1M檸檬酸鈉溶液：14.7g二水合檸檬酸鈉(PANREAC，歐洲)加水至50mL。
‧將1M檸檬酸水溶液加入1M檸檬酸鈉水溶液中，調整酸鹼值至pH5.5。
HPLC定量分析衣康酸與烏頭酸生產
為了定量衣康酸(itaconic acid,IA)與烏頭酸(aconitic acid,CAA)的產量，將反應後的上清液稀釋50倍並過濾，利用高效液相層析(HPLC,Hitachi,Japan)，在Coregel 87H3管柱以流動相0.008 N H_2 SO_4(0.008 N H2SO4：440μL的純硫酸(景明化工，台灣)加入2L的去離子水
中)、流速0.4mL/min、柱溫為70℃分離，在紫外線(UV)波長210nm測烏頭酸(CAA)、檸檬酸(CA)、衣康酸(IA)出峰時間分別為10.8min、12.1min、18.8min，將結果帶入檢量線計算後可得產量和生產速率。
實施例1：順-烏頭酸脫羧酶CadA及烏頭酸酶AcnA基因之篩選。
為構建誘導型啟動子T7啟動子以表達大腸桿菌MG1655烏頭酸酶(EcAcnA)、谷氨酸棒狀桿菌烏頭酸酶(CgAcnA)、大腸桿菌Nissle烏頭酸酶(EcNAcnA)、芽孢桿菌順-烏頭酸脫羧酶(BsCadA)和土麴黴順-烏頭酸脫羧酶(AtCadA)等目標基因，先設計帶有HindIII及PstI之切位引子，以基因組為範本利用聚合酶連鎖反應(PCR)得到擴增相關基因片段，再利用酶切反應將目標基因片段選殖入pHCC-duet載體內，轉型(transformation)送入構建型菌株DH5a。其中，編碼土麴黴順-烏頭酸脫羧酶(AtCadA)的基因片段的序列為如SEQ ID NO：1所示之序列，編碼谷氨酸棒狀桿菌烏頭酸酶(CgAcnA)的基因片段的序列為如SEQ ID NO：2所示之序列，以及編碼大腸桿菌Nissle烏頭酸酶(EcNAcnA)的基因片段的序列為如SEQ ID NO：3所示之序列(參見表4)。
將構建完成之質體送入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，並在含有卡那黴素(kanamycin)的培養基中進行篩選，培養後利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白質分析相關蛋白表達並進行活性測試。
在此進一步說明SDS-PAGE蛋白質分析法的步驟。將上述待測試酶活性的蛋白質樣品取30μL後混合10μL的蛋白質染劑，於100℃加熱10分鐘，在上述膠片樣品槽中加入15μL的樣品溶液，即可進行電泳分析。
如圖1所示，由SDS-PAGE蛋白質電泳分析的結果可以發現，相較於源自大腸桿菌MG1655的烏頭酸酶(EcAcnA)的蛋白表達量，源自谷氨酸棒狀桿菌的烏頭酸酶(CgAcnA)的蛋白表達量增加許多，另外，源自大腸桿菌Nissle的烏頭酸酶(EcNAcnA)的表達量也與谷氨酸棒狀桿菌的烏頭酸酶(CgAcnA)的蛋白表達量接近，且不論源自大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌，烏頭酸酶的蛋白表現均集中於細胞內。
表1為大腸桿菌烏頭酸酶(EcAcnA)和谷氨酸棒狀桿菌烏頭酸酶(CgAcnA)在不同酸鹼值的條件下作用二小時，自檸檬酸(CA)生產順式-烏頭酸(CAA)的產量，可以發現CgAcnA在pH為5.5至7.0的條件下其產量顯著增加，表現出較EcAcnA優越的酶催化能力。
表1. EcAcnA和CgAcnA在不同pH下自CA生產CAA的產量
如圖2所示，由SDS-PAGE蛋白質電泳分析的結果可以發現，源自芽孢桿菌的順-烏頭酸脫羧酶(BsCadA)和源自土麴黴的順-烏頭酸脫羧酶(AtCadA)均有顯著的蛋白表達量，且不論源自芽孢桿菌或土麴酶，順-烏頭酸脫羧酶的蛋白表現於細胞內較上清夜中為多。
表2為芽孢桿菌順-烏頭酸脫羧酶(BsCadA)和土麴黴順-烏頭酸脫羧酶(AtCadA)在不同酸鹼值的條件下作用二小時，自順式-烏頭酸(CAA)生產衣康酸(IA)的產量，可以發現AtCadA在pH為5.6至6.0的範
圍內表現出優勢的酶催化能力。
表2. BsCadA和AtCadA在不同pH下自CAA生產IA的產量
實施例2：構建單質體雙基因表達系統。
根據實施例1的結果，選擇源自谷氨酸棒狀桿菌的烏頭酸酶(CgAcnA)或源自大腸桿菌Nissle的烏頭酸酶(EcNAcnA)與源自土麴黴的順-烏頭酸脫羧酶(AtCadA)構建單質體雙基因表達系統，以pHCC-duet作為載體，利用重疊延伸聚合酶連鎖反應(POE-PCR)將CgAcnA基因或EcNAcnA插入載體pHCC-AtCadA，最終得到含有上述雙基因的表達質體pHCC-AtCg或pHCC-AtEcN，其質體大小分別為8027及7916bp，且含有單一限制酶切位點：HindIII、SpeI、PstI、BglII、SalI、XhoI、SacI、NdeI及NotI等限制酶切位點，該質體pHCC-AtCg及pHCC-AtEcN的序列分別如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所示之序列(參見表4)，其質體圖譜詳見於圖3A、3B。
圖3C顯示含有AtCadA和CgAcnA雙基因的表達質體pHCC-AtCg在不同溫度(22℃、30℃、37℃)時的表達情形，可以發現pHCC-AtCg在22℃至30℃的範圍下可於BL21(DE3)菌株中表達土麴黴順-烏頭酸脫羧酶(AtCadA)和谷氨酸棒狀桿菌烏頭酸酶(CgAcnA)。
圖3D顯示含有AtCadA和EcNAcnA雙基因的表達質體pHCC-AtEcN在30℃時的表達情形，可以發現pHCC-AtEcN可於BL21(DE3)菌株中表
達土麴黴順-烏頭酸脫羧酶(AtCadA)和大腸桿菌Nissle烏頭酸酶(EcNAcnA)。
實施例3：不同培養基對單質體雙基因表達系統催化效果的影響。
測試不同成分的培養基(表3)對於單質體雙基因表達系統中之關鍵酶催化效果的影響，藉由將質體pHCC-AtCg轉型(transformation)進入大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經轉型後含有質體pHCC-AtCg的BL21(DE3)菌株分別於不同培養基中進行菌體培養，接著，進行全細胞反應催化1M,pH 5.5的檸檬酸，反應8小時後收集上清液以HPLC進行定量分析生產衣康酸的產量及生產速率。
如圖4的結果所示，於LB、G3Y1、G3Y2、G6Y1培養基分別培養含有質體pHCC-AtCg的BL21(DE3)菌株，進行8小時全細胞反應催化1M,pH 5.5的檸檬酸，可獲得的衣康酸產量分別為29.7、53.6、67.0、45.5g/L，其生產速率則分別為3.7125、6.7、8.375、5.6875g/L/h，顯示於G3Y2培養基培養的菌株具有最高的衣康酸產量(67.0g/L)與生產速率(8.375g/L/h)。
表3 不同主要培養基之成分組成
實施例4：構建用於生產衣康酸的新型整合菌株AtCg/BD：：7G和AtEcN/BD：：7G。
為了構建用於生產衣康酸的新型整合菌株AtCg/BD：：7G和AtEcN/BD：：7G，首先需構建基因組中含有分子伴侶蛋白GroELS的基因。將pAH69質體轉型(transformation)進入大腸桿菌BL21(DE)菌株中，以製作成此菌株pAH69/BL21(DE3)之勝任細胞，所述pAH69質體是HK022位點整合的輔助質體，pAH69質體對於pIT5_KH質體的基因組整合是必要的3，其質體圖譜詳見於圖5。
接著將pHK-Km-T7-GroELS質體(其質體圖譜詳見圖6)以熱機轉型法(heat shock transformation)而轉型進入pAH69/BL21(DE3)勝任細胞中，再將轉型完成之細胞塗布在含有抗生素的固體平板培養基，放置於37℃培養24小時，選取平板培養基上的菌落進行PCR驗證，即可獲得BD：：7G整合菌株。
將實施例2中構建的pHCC-AtCg及pHCC-AtEcN質體分別以熱機轉型法(heat shock transformation)轉型進入BD：：7G整合菌株中，再將轉型完成之細胞塗布在含有抗生素的固體平板培養基，放置於37℃培養24小時，即可獲得含有單質體雙基因表達系統的新型整合菌株AtCg/BD：：7G和AtEcN/BD：：7G。
實施例5：含有單質體雙基因表達系統的新型整合菌株AtCg/BD：：7G和AtEcN/BD：：7G之催化效果。
藉由實施例4的方法，構建了含有單質體雙基因表達系統的新型整合菌株AtCg/BD：：7G和AtEcN/BD：：7G，分別將新型整合菌株AtCg/BD：：7G、AtEcN/BD：：7G以及僅含有質體pHCC-AtCg的BL21(DE3)菌株(無分子伴侶蛋白GroELS基因)於G3Y2培養基中進行菌體培養，再分別進行全細胞反應催化1M,pH 5.5的檸檬酸，反應8小時後收集上清液以HPLC進行定量分析生產衣康酸的產量及生產速率。
如圖7的結果所示，將本揭露設計之新型整合菌株AtCg/BD：：7G和AtEcN/BD：：7G進行8小時全細胞反應催化1M,pH 5.5的檸檬酸，最終AtCg/BD：：7G和AtEcN/BD：：7G可達到衣康酸產量分別為84.0和86.0g/L，以及生產速率分別為10.5和10.75g/L/h的催化活性，較含有質體pHCC-AtCg的BL21(DE3)菌株的催化活性(衣康酸產量67.0g/L與生產速率8.375g/L/h)顯著提高更多。
本揭露於G3Y2培養基中培養的含有質體pHCC-AtCg的BL21(DE3)菌株，其催化活性已顯著優於現有體外催化生產技術中最佳者(如在KR 102033217 B1中揭示的43小時內衣康酸產量41.6g/L，產率0.96g/L/h，或是在Halomonas bluephagenesis當中的產量為63.3g/L)；申請人驚訝的發現，本揭露設計之含有單質體雙基因表達系統的新型整合菌株AtCg/BD：：7G和AtEcN/BD：：7G，可進一步再提升全細胞反應催化衣康酸生產的整體效率，最高衣康酸產量為86.0g/L與生產速率為10.75g/L/h的高效催化活性。
以下表4詳細列出本揭露中相關的AtCadA、CgAcnA、EcNAcnA、質體pHCC-AtCg、pHCC-AtEcN的核苷酸序列以及GroELS基因序列。
表4
上述實施例僅為例示性說明，而非用於限制本揭露。任何熟習此技藝的人士均可在不違背本揭露的範圍下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，本揭露的權利保護範圍將由所附的申請專利範圍所定義，只要不影響本揭露的效果及實施目的，皆應涵蓋於本揭露的內容中。
參考文獻
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3. Hao N, Chen Q, Dodd IB, Shearwin KE. ACS Synth Biol. 2021 Jun 30. doi: 10.1021/acssynbio.1c00215. 10.1021/acssynbio.1c00215
【生物材料寄存】
新型整合菌株AtCg/BD：：7G：財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2022年6月13日，寄存編號為BCRC 940694。
新型整合菌株AtEcN/BD：：7G：財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2022年6月13日，寄存編號為BCRC 940695。
Claims (17)
- 一種生產衣康酸及其衍生單體的重組微生物，其包括至少兩個基因，且該至少兩個基因係位於同一表現載體上，其中，該至少兩個基因包括編碼順-烏頭酸脫羧酶的基因以及編碼烏頭酸酶的基因，且該重組微生物的基因組包括編碼分子伴侶蛋白GroELS的基因。
- 如請求項1所述的重組微生物，其中，該表現載體上還具有控制該至少兩個基因表現的誘導型啟動子基因。
- 如請求項2所述的重組微生物，其中，該誘導型啟動子為T7啟動子。
- 如請求項1所述的重組微生物，其中，該編碼順-烏頭酸脫羧酶之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：1至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：1具有相同活性之序列。
- 如請求項1所述的重組微生物，其中，該編碼烏頭酸酶之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：2至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：2具有相同活性之序列。
- 如請求項1所述的重組微生物，其中，該編碼烏頭酸酶之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：3至少有60%序列一致性且與SEQ ID NO：3具有相同活性之序列。
- 如請求項1所述的重組微生物，其中，該編碼分子伴侶蛋白GroELS基因之核苷酸序列為具有與SEQ ID NO：5至少有80%序列一致性且與SEQ ID NO：5具有相同活性之序列。
- 如請求項1所述的重組微生物，其屬於大腸桿菌屬(Escherichia)、克雷白氏菌屬(Klebsiella)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸 桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)。
- 如請求項8所述的重組微生物，其為經重組的大腸桿菌BL21(DE3)菌株。
- 如請求項9所述的重組微生物，其寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940694。
- 如請求項9所述的重組微生物，其寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940695。
- 一種生產衣康酸及其衍生單體的方法，包括：將請求項1至11中任一項所述的重組微生物於含有檸檬酸之溶液中進行反應，將該檸檬酸轉化以生產衣康酸及其衍生單體；以及自該溶液中分離獲得該衣康酸及其衍生單體。
- 如請求項12所述的方法，其中，該溶液為含有該檸檬酸及檸檬酸鹽之混合溶液。
- 如請求項12所述的方法，其中，進行該反應時的pH值介於5.0至7.0之間。
- 如請求項14所述的方法，其中，進行該反應時的pH值介於5.0至6.0之間。
- 如請求項12所述的方法，其中，進行該反應時的溫度介於22至37℃之間。
- 如請求項16所述的方法，其中，進行該反應時的溫度介於22至30℃之間。
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