CN116904411A - 一种烯烃还原酶突变体及高效合成（r）-香茅醛的方法 - Google Patents

一种烯烃还原酶突变体及高效合成（r）-香茅醛的方法 Download PDF

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熊涛
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Abstract

本发明公开了一种烯烃还原酶突变体及高效合成(R)‑香茅醛的方法，属于生物技术领域。本发明的烯烃还原酶突变体N31‑CgOYE，该突变酶的催化活性相较于原始酶提高了4.86倍，接着通过半理性设计获得突变体N31‑CgOYEI81L/W128A/H190A，其催化底物(E/Z)‑柠檬醛合成香茅醛的比酶活为7.6U·mg‑1是CgOYE的4.27倍，其ee(R)以及转化率分别为99.0％和99.4％。将本发明构建的烯烃还原酶突变体偶联Bacillus subtilis来源葡萄糖脱氢酶用于生产(R)‑香茅醛，显著提高了(R)‑香茅醛的生产可持续性，可使反应24h(R)‑香茅醛达到24.528g/L。

Description

一种烯烃还原酶突变体及高效合成(R)-香茅醛的方法
技术领域
本发明涉及一种烯烃还原酶突变体及高效合成(R)-香茅醛的方法，属于生物技术领域。
背景技术
(R)-香茅醛的合成主要分为化学法，其化学合成的方法分为两个路线：其中一种是以肉豆蔻烯为起点(Takasago工艺)，另一种是以柠檬醛为起点(BASF工艺)。在Takasago工艺中，第一步是将肉豆蔻烯转化为中间化合物(N，N-二乙基-3，7-二甲基(E)-2，6-辛二烯-1-胺)。然后N，N-二乙基-3，7-二甲基(E)-2，6-辛二烯-1-胺在异构化、水解和过渡金属催化的作用下形成(R)-香茅醛，其ee>98％。BASF工艺则更直接，通过高温蒸馏柠檬醛混合物，从而获得高纯度的香叶醇，将香叶醇氢化得到(R)-香茅醛，其ee>87％。但在Takasago工艺和BASF工艺中由于基质缺乏手性必须使用昂贵的铑基催化剂，而铑基催化剂涉及到回收和使用寿命等问题。因此，用廉价的(E/Z)-柠檬醛还原成(R)-香茅醛的生物催化路线是具有广阔的应用前景。
(R)-香茅醛的生物合成已经成为研究的热点，主要分为单酶一步合成法。单酶法的主要是通过混合底物(E/Z)-柠檬醛通过OYE一步法合成(R)-香茅醛。近年来，尽管人们努力挖掘新来源的OYE，然而只有OYE2p可以达到ee(R)>88.8％，部分研究尝试通过酶工程改变老黄酶的立体选择性，如OYE2y的突变体P76M/R330H和XenA的突变体C25G对(R)-香茅醛的转化率为15.8-33.5％，其ee>99％，然而，XenA的突变体C25G实现了非对映选择性生产(R)-香茅醛，但转化率低下，不适用于大规模生物合成(R)-香茅醛。
发明内容
本发明要提供一种通过半理性设计获得烯烃还原酶突变体高效生产(R)-香茅醛的方法。
本发明提供一种来自于Corynebacterium glutamicum烯烃还原酶CgOYE的突变体，通过截短烯烃还原酶CgOYE序列N端的31个氨基酸(N31-CgOYE)，将第81位异亮氨酸突变为亮氨酸，第128位色氨酸突变为丙氨酸，第190位组氨酸突变为丙氨酸(N31-CgOYEI81L/W128A/H190A)。
本发明提供了一种烯烃还原酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，和/或，将第81位、第128位、第190位中的一个或多个氨基酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短得到的；命名为：N31-CgOYE。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为：N31-CgOYEH190A。
在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本酶烯烃还原酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码烯烃还原酶突变体酶N31-CgOYEH190A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为：N31-CgOYEW128A/H190A。
在本发明的一种实施方式中，编码烯烃还原酶突变体酶N31-CgOYEW128A/H190A的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第81位异亮氨酸突变为亮氨酸，第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为N31-CgOYEI81L/W128A/H190A。
在本发明的一种实施方式中，编码烯烃还原酶突变体酶N31-CgOYEI81L/W128A/H190A的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了编码上述烯烃还原酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pXMJ-19、pET-28a、pMA-5或pET-32a为表达载体。
本发明还提供了表达上述烯烃还原酶突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或钝齿棒杆菌为表达宿主。
本发明还提供了一种提高烯烃还原酶转化底物(Z)-柠檬醛/(E)-柠檬醛/(E/Z)-柠檬醛非对映选择性合成(R)-香茅醛活性的方法，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，和/或，将第81位、第128位、第190位中的一个或多个氨基酸进行突变，所述(E/Z)-柠檬醛为(Z)-柠檬醛和(E)-柠檬醛的混合物。
在本发明的一种实施方式中，所述(E/Z)-柠檬醛混合物中，(Z)-柠檬醛：(E)-柠檬醛比值按照浓度计为10：9。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的一种实施方式中，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的一种实施方式中，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第81位异亮氨酸突变为亮氨酸，第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸。
本发明还提供了一种制备(R)-香茅醛的方法，所述方法为，将所述烯烃还原酶突变体，或所述重组细胞表达的重组酶添加至含有底物柠檬醛的反应体系中，进行反应制备得到(R)-香茅醛；所述底物柠檬醛为(Z)-柠檬醛或(E)-柠檬醛或(E/Z)-柠檬醛；其中(E/Z)-柠檬醛为将(Z)-柠檬醛和(E)-柠檬醛的混合物。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，底物的添加量为：10-220mM/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，反应条件为：pH 6-10，20-60℃。
在本发明的一种实施方式中，(E/Z)-柠檬醛非对映选择性还原成(R)-香茅醛。
在本发明的一种实施方式中，所述(E/Z)-柠檬醛混合物中，(Z)-柠檬醛：(E)-柠檬醛比值按照浓度计为10：9。
在本发明的一种实施方式中，所述应用中将烯烃还原酶突变体加入至反应体系中；所述反应体系包含磷酸盐缓冲液、(E/Z)-柠檬醛、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、Bacillussubtilis来源的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)、葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述应用在pH 6-10的条件下进行，酶的最适反应pH值为8。
在本发明的一种实施方式中，所述应用在20-60℃的温度下进行，酶的最适反应温度为40℃。
在本发明的一种实施方式中，所述应用在20-60℃的温度下至少反应6h。
本发明还提供了上述烯烃还原酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在制备(R)-香茅醛或含有(R)-香茅醛的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
有益效果
本发明通过半理性设计截短烯烃还原酶CgOYE序列N端的31个氨基酸(N31-CgOYE)，将第81位氨基酸突变为亮氨酸，第128位色氨酸突变为丙氨酸，第190位组氨酸突变为丙氨酸。并通过相关性质的测定，烯烃还原酶突变体N31-CgOYEI81L/W128A/H190A催化底物(E/Z)-柠檬醛合成香茅醛的比酶活为7.6U·mg-1是CgOYE的4.27倍，其ee(R)值从47.1％提高到99.0％，其转化率从78.0％提高至99.4％。
附图说明
图1为本发明实施例1中烯烃还原酶CgOYE核苷酸序列的核酸电泳图。
图2为本发明实施例1中pXMJ-19双酶切的核酸电泳图。
图3为本发明实施例1中E.coli BL21/pXMJ-19-CgOYE菌落PCR的核酸电泳图。
图4为本发明实施例2中烯烃还原酶CgOYE粗酶和纯酶的SDS-PAGE图。
图5为本发明实施例3中烯烃还原酶CgOYE四聚体蛋白结构。
图6为本发明实施例3中烯烃还原酶CgOYE的RMSF值。
图7为本发明实施例3中烯烃还原酶CgOYE以及截短突变体的SDS-PAGE图。
图8为本发明实施例4中野生型CgOYE及其截短突变体催化柠檬醛的比酶活。
图9为本发明实施例4中突变体N31-CgOYE和野生型CgOYE的最适温度和pH。
图10为本发明实施例6中突变体N31-CgOYEI81L/W128A/H190A和BsGDH偶联反应的最适温度和pH。
图11为本发明实施例6中N31-CgOYEI81L/W128A/H190A与BsGDH偶联放大反应生物合成(R)-香茅醛。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW，MolecularCloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
下述实施例中所涉及的培养基以及培养条件如下：
LB培养基：10g·L-1蛋白胨、5g·L-1酵母粉、10g·L-1氯化钠，其固体培养基额外添加1.5％-2.0％的琼脂粉；
大肠杆菌以及重组大肠杆菌在温度为37℃，转速为180r·min-1的往复式摇床中培养8-12h。
下述实施例中所涉及的基因组DNA和相关质粒的提取：
Corynebacterium glutamicum菌株提取基因组DNA时根据上海捷瑞细菌基因组DNA快速提取试剂盒说明书操作。质粒提取时将培养适当浓度的菌液离心后去除上清液，谷氨酸棒杆菌为革兰氏阳性菌，其重组菌株提取质粒时，需要添加适量的溶菌酶于37℃水浴0.5h，大肠杆菌的重组菌株提取质粒时无需加入溶菌酶，采用捷瑞小型质粒提取试剂盒提取，详细操作参照说明书。
下述实施例中所涉及的CgOYE基因序列的获取：
在NCBI数据库中检索来源于C.glutamicum的CgOYE基因序列(GenBank登入号：WP_011015590.1)，使用限制性核酸内切酶处理表达载体pXMJ-19上的EcoR I和HindⅢ位点，通过PCR扩增将C.glutamicum基因组上的OYE基因克隆。PCR程序设置为：(1)95℃，10min，预变性；(2)95℃，30s，变性；55℃，30s，复性；72℃，30s，延伸；该步骤设置28次循环。(3)72℃，10min，后延伸。
待PCR结束后，产物用琼脂糖凝胶电泳进行检验，通过DNA Maker进行比较片段大小，确定正确的PCR产物，具体操作步骤为：1×TAE缓冲液中加入1％(g·mL-1)的琼脂糖，放置微波炉加热至琼脂糖完全溶解，加入0.1％的核酸染料溴化乙锭(EB)，搅拌均匀后倒入制胶板中自然凝固；琼脂糖核酸凝胶电泳：将制备好的琼脂糖核酸胶浸润1×TAE缓冲液，向胶孔加入6-8μL的DNA Marker和PCR产物，随后放置于核酸电泳仪中使用120V进行15-25min的核酸电泳，电泳结束后，用Tanon凝胶成像仪观察核酸条带并与DNA Marker进行比较。将含有正确PCR产物条带的琼脂糖凝胶放置2mL的EP管中，按照核酸回收试剂盒说明书步骤进行核酸纯化，并检测核酸浓度，-20℃保存。
下述实施例中所涉及重组质粒的构建：
按照核酸片段连接试剂盒说明书步骤进行酶切质粒与目的基因的重组连接，反应在37℃金属浴中反应1h，放置-20℃保存。酶连反应体系如下：基因片段2μL，酶切质粒10μL，Ligation Buffer 4μL，Ligation Enzyme 2μL，去离子水2μL。
下述实施例中所涉及大肠杆菌感受态的制备、转化以及阳性重组子的验证：
E.coli BL21感受态细胞的制备：将E.coli BL21菌株接种至10mL LB培养基中培养12h，接着按照1％接种量将E.coli BL21菌液转接至50mL LB培养基中，检测LB培养基中大肠杆菌的菌体浓度，当大肠杆菌的菌体浓度OD600为0.4-0.6时，将LB培养基放置冰上孵育30min，从而抑制菌体的生长，接着严格按照大肠杆菌感受态细胞制备试剂盒的说明书进行操作。
重组质粒化转至E.coli BL21感受态细胞：将感受态细胞冰浴30min，将10μL重组质粒加入到感受态细胞中混匀，接着将感受态细胞冰浴处理45min，接着将感受态细胞放入42℃水浴锅中热激处理90s，接着将感受态细胞冰浴处理10min，在超净工作台中加入800μLLB培养基，随后放置37℃、180r·min-1的恒温摇床中培养2h。将1.5mL EP管放置小型离心机中6000r·min-1离心5min，倒去上清培养基，涂布于抗性平板，放置恒温培养箱中37℃、180r·min-1培养12h，设计引物将化转板上的单菌落，使用无菌牙签挑出后进行PCR验证。
下述实施例中所涉及重组蛋白的表达、纯化以及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：
将重组菌株接种至10mL LB培养基中，接着放置摇床中在37℃、180r·min-1条件下培养12h，接着按照1％的接种量将菌液转接至50mL LB培养基中，当培养基菌体浓度OD600为0.6-0.8时，加入重组蛋白诱导剂IPTG，使得终浓度为0.2mM。将培养基放置16℃、180r·min-1培养16-18h。诱导结束后，通过冷冻离心机在4℃、8000r·min-1将菌体收集，倒去上清液后，加入5mL PBS缓冲液洗涤细胞后，接着冷冻离心机在4℃、8000r·min-1将菌体重新收集，倒去上清液后再5mL PBS缓冲液洗涤细胞，重复两次。获得的菌体通过超声细胞破碎仪进行破碎，随后冷冻离心机在4℃、10000r·min-1的条件下获取重组蛋白所在的上清液。上清粗酶液接着用于蛋白的纯化。重组蛋白纯化具体操作步骤按照AKTA蛋白纯化仪的说明书进行操作，获得纯酶加入10％(v·v-1)的甘油，放置-40℃保存。
将纯化的蛋白样品与SDS溶液按比例混合，并于100℃的水浴加热10min，使蛋白变性。将蛋白胶板放入蛋白电泳槽中并卡紧，加入Runing Buffer蛋白电泳缓冲液，在蛋白样孔中加入4μL Protein Marker和蛋白样品。蛋白条带在浓缩胶时电泳仪80V恒压，当蛋白条带分离胶时改为120V恒压电泳。蛋白条带电泳至蛋白胶板底部时，停止电泳。将蛋白胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，染色后将染色液回收，将蛋白胶放置适量的稀乙酸中，微波炉加热7min。重复脱色一次，然后放置于Tanon凝胶成像仪上拍照和观察。
所用试剂及配方:
1×Runing Buffer蛋白电泳缓冲液：3g Tris、14.4g甘氨酸、1g SDS加入约800mL的用去离子水后搅拌均匀，定容至1L，放置室温保存。
考马斯亮蓝染色液：使用精密称量仪称取200mg考马斯亮蓝R-250溶于90mL甲醇中，加入20mL冰醋酸，加入100mL去离子水，搅拌均匀后定容至200mL，室温下保存。
下述实施例中所涉及烯烃还原酶CgOYE及其突变体酶活定义：
通过在酶标仪上监测NADPH在340nm处吸光度的降低用于测定酶活力，NADPH摩尔吸光系数为6.22mM-1cm-1用于计算。反应条件：在适宜的pH、温度条件下，添加10mM柠檬醛、0.6mM NADPH、50U葡萄糖脱氢酶BsGDH、200mM葡萄糖，反应2min检测NADPH吸光值的变化。具体比酶活定义以及计算公式如下：
活力单位(U)定义为：在上述测定条件下，每分钟消耗1mmol NADPH所需的酶量。酶活计算公式如下：
酶活力(U)＝EW×V·ε-1；
比活力(U·mg-1)＝EW×V·(ε×m)-1；
EW：每分钟吸光值的变化量；
V：反应液体积(mL)；
ε：NADPH的吸光系数(mM-1cm-1)；
m：加入反应液中蛋白的质量(mg)。
下述实施例中所涉及催化样品的萃取、底物和产物的检测方法：
催化样品的萃取：向反应液中加入等体积的乙酸乙酯，反复摇晃混匀后，放置于离心机12000rpm/min条件下离心10min，取出上清溶液，再次加入等体积的乙酸乙酯，重复萃取。将两次收集的上清溶液混合，加入无水硫酸钠干燥30min，将干燥后的样品于12000rpm/min条件下离心5min以积固形物再将适量上清萃取液装入液相小瓶中，并确保无杂质。
样品的检测：萃取后的样品使用气相色谱检测。GC(Agilent 6890N)使用HP-5柱检测烯烃还原酶CgOYE及其突变体催化反应的转化率。气相色谱检测条件设定为分流比为10:1，进样口和氢火焰检测器温度分别为220℃和250℃，升温程序为100℃、2min，然后升温10℃·min-1至150℃，4min。香茅醛、橙花醛和香叶醛的保留时间分别为3.68、4.60和4.92min。
产物香茅醛的立体选择性检测：在β-DEX 225柱上进行，GC检测条件为100:1分流比、进样口温度和氢火焰检测器温度分别为220℃和250℃，升温程序为95℃，35min，随后5℃·min-1至160℃，2min，然后10℃·min-1至200℃，5min，(S)-香茅醛和(R)-香茅醛峰值时间分别为25.058和25.154min。
实施例1：构建烯烃还原酶基因CgOYE的表达质粒
具体步骤如下：
(1)引物的设计
通过Snapgene软件将CgOYE(GenBank登入号：WP_011015590.1)的核苷酸序列插入质粒pXMJ-19的多克隆位点上(酶切位点为EcoR I和HimdⅢ)，得到pXMJ-19-CgOYE质粒图谱。根据质粒图谱设计相应的引物，并加入了相应的酶切位点EcoR I和HimdⅢ，将所设计的基因PCR扩增所用引物通过苏州金唯智生物有限公司来合成，引物如下所示。
P1：5’-ggaaacagaattaattaagcttaaaggaggacaaccatgcaccaccaccaccaccacgcaaacgtcgtactag-3’；
P2：5’-ccaaaacagccaagctgaattcttaaagtacgtagtcgtat-3’。
注：加粗字体为酶切位点。
(2)谷氨酸棒杆菌基因组的获取
C.glutamicum菌株提取基因组DNA时根据上海捷瑞细菌基因组DNA快速提取试剂盒说明书操作。质粒提取时将培养适当浓度的菌液离心后去除上清液，谷氨酸棒杆菌为革兰氏阳性菌，其重组菌株提取质粒时，需要添加适量的溶菌酶于37℃水浴0.5h，大肠杆菌的重组菌株提取质粒时无需加入溶菌酶，采用捷瑞小型质粒提取试剂盒提取，详细操作参照说明书。
(3)目的基因CgOYE的克隆
目的基因通过采用高保真酶PhantaR Max(p515)DNA polymerases进行PCR扩增，PCR体系为50μL的标准反应体系：25μL PhantaR Max(p515)DNA polymerases、23μL去离子水、1μL谷氨酸棒杆菌基因组、引物P1和P2各0.5μL，PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；退火温度一般设置为58～60℃，30～60s；72℃延伸按照每分钟扩增1500bp基因设置时间；变性至延伸程序30个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，PCR产物条带的位置与CgOYE核酸序列大小基本一致，并且PCR产物条带单一，较亮，即表明成功从谷氨酸棒杆菌的基因组中扩增出目的基因CgOYE。PCR结束后将PCR产物进行核酸电泳进行验证及胶回收纯化。
(4)质粒pXMJ-19的双酶切
使用限制性核酸内切酶EcoR I和HindⅢ对表达质粒pXMJ-19进行双酶切(图2)，在37℃条件下水浴40min后，接着进行琼脂糖凝胶电泳，得到含有EcoR I和HindⅢ的黏性末端质粒pXMJ-19。PCR结束后将PCR产物进行核酸电泳进行验证及胶回收纯化。
(5)重组质粒pXMJ-19-CgOYE的构建
将CgOYE核酸序列与pXMJ-19双酶切线性化载体使用ClonExpress II One StepCloning Kit连接后化转E.coli BL21感受态细胞，挑取阳性转化子提取质粒进行PCR验证及测序验证。
(6)大肠杆菌感受态制备与化学转化法
制备大肠杆菌化转感受态细胞，采用TakaRa公司的感受态细胞制备试剂盒Competent Cell Preparation Kit。采用42℃热击化转至E.coli BL21，经过抗生素(氯霉素)抗性平板筛选获得阳性转化子，进行菌落PCR验证(图3)及送至金唯智生物科技公司测序验证。
制备得到重组质粒pXMJ-19-CgOYE和重组菌E.coli BL21/pXMJ-19-CgOYE。
实施例2：烯烃还原酶CgOYE蛋白的表达和纯化
1、蛋白的诱导表达
将E.coli BL21/pXMJ-19-CgOYE及含有空载pXMJ-19质粒的对照菌株E.coliBL21/pXMJ-19分别划线至LB氯霉素抗性平板上活化后，挑取单菌落接入10mL LB液体小瓶，30℃、180rpm培养12h后按1％接种量转接至50mL LB液体培养基，37℃、180rpm培养4～5h后，添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mmol·L-1，继续于37℃、180rpm诱导表达16～18h后，4℃下离心收集菌体细胞。
收集的细胞采用10mmol·L-1的PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤两次后，重新悬浮于PBS缓冲液中，控制菌体浓度一致的情况下，采用超声破碎仪破碎，破碎液4℃下离心20min，收集上清，SDS-PAGE分析蛋白表达情况，剩余粗酶液用于后续的酶活测定，结果如图4中的(a)所示。
2、CgOYE蛋白的纯化
将上清液粗酶液采用0.45μm滤膜过滤后，采用Ni-NTA蛋白纯化柱进行纯化去除杂蛋白，重组酶CgOYE末端带有his标签能够与纯化柱上的Ni+进行鳌合，梯度洗脱，采用不同浓度的咪唑缓冲液梯度洗脱，结合于纯化柱上的纯化蛋白被洗脱下来，进而达到纯化酶。纯化后蛋白使用SDS-PAGE分析图4中的(b)，利用Bradford试剂盒测定蛋白浓度，获得纯酶加入10％(v·v-1)的甘油，放置-40℃保存。
制备得到野生型CgOYE的纯酶。
实施例3：烯烃还原酶CgOYE的截短突变和表达纯化
1、烯烃还原酶CgOYE蛋白模型分析
通过AlphaFold2.0对CgOYE四聚体建模，结果如图5所示，烯烃还原酶以二聚体与二聚体之间相互疏水作用，形成了四聚体蛋白结构，FMN以非共价方式结合在单体蛋白的序列C端区域，而不是在二聚体的N端区域。根据AlphaFold2.0建模数据表明，CgOYE的N端肽链区域pLDDT的评分较低，因此推测N端区域可能是不规则的柔性肽段(Met1-Arg31)，该结构可能会影响CgOYE的结构稳定性。接着使用Gromacs 2019.6和GROMOS96力场进行MolecularSimulation对接的方法对CgOYE进行RMSD分析，研究CgOYE的结构稳定性。结果如图6所示，CgOYE的N端区域肽链(Met1-Arg31)RMSF数据显著偏高，表明该肽段是一个不稳定的结构。
Molecular Simulation对接具体操作为：将每个反应系统被浸泡在spc216主导水的十二面体中，然后，加入Na+或Cl+来中和系统的电荷，接着进行能量最小化、系统平衡和产物动力学等步骤。在能量最小化之后，在300k下进行了100ns的NVT和NPT模拟。最后，在300K下进行100ns的MD模拟。
2、烯烃还原酶CgOYE的截短突变
以实施例1制备得到的pXMJ-19-CgOYE质粒为模板，设计引物对CgOYE进行不同长度肽段的截短(N8：烯烃还原酶的N段的第1位至第8位的肽段进行截短、N20：烯烃还原酶的N段的第1位至第20位的肽段进行截短、N31：烯烃还原酶的N段的第1位至第31位的肽段进行截短)突变体，引物如下所示。
P3：5’-ttaattaagcttaaaggaggacaaccatgcaccaccaccaccaccacgagcctttggtgtcc-3’；
P4：5’-ccaaaacagccaagctgaattcttaaagtacgtagtcgtat-3’；
P5：5’-cagaattaattaagcttaaaggaggacaaccatgcaccaccaccaccaccacatccgcgacatcaccatccccaa-3’；
P6：5’-ccaaaacagccaagctgaattcttaaagtacgtagtcgtat-3’；
P7：5’-ttaagcttaaaggaggacaaccatgcaccaccaccaccaccactcaccgatgtgcacctactc-3’；
P8：5’-ccaaaacagccaagctgaattcttaaagtacgtagtcgtat-3’。
注：加粗字体为酶切位点。
不同截短烯烃还原酶突变体基因序列通过采用高保真酶PhantaR Max(p515)DNApolymerases进行PCR扩增，PCR体系为50μL的标准反应体系，PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；退火温度一般设置为58～60℃，30～60s；72℃延伸按照每分钟扩增1500bp基因设置时间；变性至延伸程序30个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。PCR结束后将PCR产物进行核酸电泳进行验证及胶回收纯化，回收后与pXMJ-19双酶切线性化载体使用ClonExpress II One Step Cloning Kit连接后化转E.coli BL21感受态细胞，挑取阳性转化子提取质粒进行PCR验证及测序验证。
分别制备得到重组质粒：pXMJ-19-N8-CgOYE、pXMJ-19-N20-CgOYE、pXMJ-19-N31-CgOYE和重组菌株：E.coli BL21/pXMJ-19-N8-CgOYE、E.coli BL21/pXMJ-19-N20-CgOYE、E.coli BL21/pXMJ-19-N31-CgOYE。
3、烯烃还原酶截短突变体的蛋白表达和纯化
分别将重组菌株E.coli BL21/pXMJ-19-N8-CgOYE、E.coli BL21/pXMJ-19-N20-CgOYE、E.coli BL21/pXMJ-19-N31-CgOYE接种至10mL LB培养基中，接着放置摇床中在37℃、180r·min-1条件下培养12h，制备得到种子液；
将制备得到的种子液按照1％(v/v)的接种量转接至50mL LB培养基中，当培养基菌体浓度OD600为0.6-0.8时，加入重组蛋白诱导剂IPTG，使得终浓度为0.2mM。将培养基放置16℃、180r·min-1培养16-18h。诱导结束后，通过冷冻离心机在4℃、8000r·min-1将菌体收集，倒去上清液后，加入5mL PBS缓冲液洗涤细胞后，接着冷冻离心机在4℃、8000r·min-1将菌体重新收集，倒去上清液后再5mL PBS缓冲液洗涤细胞，重复两次。
获得的菌体通过超声细胞破碎仪进行破碎，随后冷冻离心机在4℃、10000r·min-1的条件下获取重组蛋白所在的上清液。
上清粗酶液接着用于蛋白的纯化。重组蛋白纯化具体操作步骤按照AKTA蛋白纯化仪的说明书进行操作，纯化后蛋白使用SDS-PAGE分析(图7)，获得纯酶加入10％(v·v-1)的甘油，放置-40℃保存。分别制备得到N8-CgOYE纯酶、N20-CgOYE纯酶、N31-CgOYE纯酶。
实施例4：烯烃还原酶CgOYE及其截短突变体的酶学性质的测定
1、烯烃还原酶CgOYE及其截短突变体对底物柠檬醛活性，即：比酶活的检测：
将烯烃还原酶CgOYE及其截短突变体放置反应体系中检测对底物(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛的比酶活；
其100mL反应体系为：200mM PBS、10mM(E)-柠檬醛或(Z)-柠檬醛、0.6mM NADPH、50U葡萄糖脱氢酶(BsGDH)、200mM葡萄糖、50U CgOYE或其突变体纯酶，反应条件：40℃，pH8.0，反应时间24h。其中葡萄糖脱氢酶BsGDH购买于上海源叶生物科技有限公司，比酶活为200U/mg。
CgOYE或其突变体纯酶的活力单位(U)定义为:在上述测定条件下，每分钟消耗1mmol NADPH所需的酶量。酶活计算公式如下：
酶活力(U)＝EW×V·ε-1；
比活力(U·mg-1)＝EW×V·(ε×m)-1；
EW：每分钟吸光值的变化量；
V：反应液体积(mL)；
ε：NADPH的吸光系数(mM-1cm-1)；
m：加入反应液中蛋白的质量(mg)。
2、底物浓度对烯烃还原酶CgOYE及其截短突变体活性的影响
结果显示：
(1)底物为(E)-柠檬醛条件下的比酶活：
蛋白CgOYE野生型(WT)、N8-CgOYE、N20-CgOYE和N31-CgOYE催化底物(E)-柠檬醛的比酶活分别为1.7±0.1、3.3±0.3、5.5±0.1和8.1±0.2μmol·min-1·mg-1(图8中的(a))。
相比于野生型，突变体N31-CgOYE对对(E)-柠檬醛的比酶活提高了4.8倍。
(2)底物为(Z)-柠檬醛条件下的比酶活：
蛋白CgOYE野生型(WT)、N8-CgOYE、N20-CgOYE和N31-CgOYE催化底物(Z)-柠檬醛的比酶活分别为1.8±0.2、3.3±0.1，5.9±0.2和8.7±0.3μmol·min-1·mg-1(图8中的(b))。
相比于野生型，突变体N31-CgOYE对(Z)-柠檬醛的比酶活提高了4.7倍。
3、温度对烯烃还原酶CgOYE及其截短突变体N31-CgOYE活性的影响
将烯烃还原酶CgOYE及其截短突变体N31-CgOYE分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60℃反应2min，并取样检测酶活。
结果如图9中的(a)所示，分别设置WT和N31-CgOYE(N31)的最高比酶活为100％。野生型的最适温度为40℃，突变体N31的最适温度为40℃，且在30-50℃区间有较好的相对酶活。
4、pH对烯烃还原酶CgOYE及其截短突变体N31-CgOYE活性的影响
烯烃还原酶CgOYE及其截短突变体N31-CgOYE在不同pH值(6、7、8、9、10)条件下反应2min，并取样检测酶活。
设置WT和N31-CgOYE(N31)的最高比酶活为100％。
如图9中的(b)所示，野生型CgOYE的最适pH为8.0，突变体N31-CgOYE的最适pH为8.0；
pH在7.0到9.0范围内突变体N31的相对酶活在80％以上，而野生型在pH在7.0和9.0的相对酶活分别为64％和53％，表明突变体N31的pH耐受性明显提高。
实施例5：烯烃还原酶N31-CgOYE的半理性改造以及表达纯化
1、烯烃还原酶N31-CgOYE的半理性改造
以pXMJ-19-N31-CgOYE为模板，设计引物，通过反向PCR将第81位异亮氨酸突变为亮氨酸，第128位色氨酸突变为丙氨酸，第190位组氨酸突变为丙氨酸。引物设计如下。
P9：5’-tccaaggtcgactggggaaaggggagctacggg-3’；
P10：5’-ctttccccagtcgaccttggactttggagc-3’；
P11：5’-ccgccaccattggccggagcatc-3’；
P12：5’-gccaatggtggcggatatgttggacca-3’；
P13：5’-ggtagccgtgtgctgcgtgaatttcc-3’；
P14：5’-gcagcacacggctaccttttgcataacttcc-3’。
将烯烃还原酶CgOYE突变质粒化转E.coli BL21感受态细胞，挑取阳性转化子提取质粒进行PCR验证及测序验证。分别制备得到含有单突变体的重组菌株：E.coli BL21/pXMJ-19-N31-CgOYEH190A、含有双突变体的重组菌株：E.coli BL21/pXMJ-19-N31-CgOYEW128A/H190A、含有三突变体的重组菌株：E.coli BL21/pXMJ-19-N31-CgOYEI81L/W128A/H190A。
2、烯烃还原酶N31-CgOYE及其突变体的蛋白表达和纯化
分别将步骤1至制备得到的重组菌株接种至10mL LB培养基中，接着放置摇床中在37℃、180r·min-1条件下培养12h，制备得到种子液；
接着按照1％(v/v)的接种量将种子液转接至50mL LB培养基中，当培养基菌体浓度OD600为0.6-0.8时，加入重组蛋白诱导剂IPTG，使得终浓度为0.2mM。将培养基放置16℃、180r·min-1培养16-18h。
诱导结束后，通过冷冻离心机在4℃、8000r·min-1将菌体收集，倒去上清液后，加入5mL PBS缓冲液洗涤细胞后，接着冷冻离心机在4℃、8000r·min-1将菌体重新收集，倒去上清液后再5mL PBS缓冲液洗涤细胞，重复两次。获得的菌体通过超声细胞破碎仪进行破碎，随后冷冻离心机在4℃、10000r·min-1的条件下获取重组蛋白所在的上清液。
上清粗酶液接着用于蛋白的纯化。重组蛋白纯化具体操作步骤按照AKTA蛋白纯化仪的说明书进行操作，获得纯酶加入10％(v·v-1)的甘油，放置-40℃保存。
分别制备得到N31-CgOYEH190A纯酶、N31-CgOYEW128A/H190A纯酶、N31-CgOYEI81L/W128A/H190A纯酶。
3、烯烃还原酶及其突变体催化(E)-柠檬醛、(Z)-柠檬醛、(E/Z)-柠檬醛的活性
其100mL反应体系为：200mM PBS、10mM(E)-柠檬醛/(Z)-柠檬醛/(E/Z)-柠檬醛、0.6mM NADPH、50U葡萄糖脱氢酶BsGDH、200mM葡萄糖、50U CgOYE或其突变体纯酶，反应条件：40℃，pH 8.0，反应时间24h；其中葡萄糖脱氢酶BsGDH购买于上海源叶生物科技有限公司，比酶活为200U/mg。
其中所述(E/Z)-柠檬醛为：将(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛混合，比例为按照浓度计为10：9。
烯烃还原酶N31-CgOYE及其突变体的催化活性结果如表1～3所示。
表1：野生型CgOYE及其突变体催化底物(E)-柠檬醛的活性
表2：野生型CgOYE及其突变体催化底物(Z)-柠檬醛的活性
表3：野生型CgOYE及其突变体催化底物(E/Z)-柠檬醛的活性
从表1～3可得知，突变体N31-CgOYEI81L/W128A/H190A具有将底物(E)-柠檬醛、(Z)-柠檬醛和(E/Z)-柠檬醛非对映选择性合成(R)-香茅醛活性，其ee(R)和转化率均大于或等于99.0％。
实施例6：偶联突变酶N31-CgOYEI81L/W128A/H190A合成(R)-香茅醛
1、为了有效合成(R)-香茅醛，进行反应条件的优化，具体同实施例5，区别在于调整温度、pH，具体如下：
(1)如图10中的(a)所示，突变体N31-CgOYEI81L/W128A/H190A和葡萄糖脱氢酶BsGDH偶联合成(R)-香茅醛的最适反应温度为40℃，当温度低于40℃或者高于40℃时，产物香茅醛浓度和ee值也随着降低。
(2)如图10中的(b)所示，在最适温度40℃条件下，pH对香茅醛的ee值有显著的影响，当pH值高于8.0时，随着pH的增加，ee值逐渐降低，pH为10时ee值降低至69.3％，而pH在6.5到8.0范围时，随着pH增加突变体N31-CgOYEI81L/W128A/H190A的ee值和香茅醛浓度逐渐升高。pH为8.0时ee值最大，但其产物香茅醛浓度略低于pH为7.0和7.5条件下的香茅醛浓度，考虑到ee值对产品价值的影响最大，最终确定N31-CgOYEI81L/W128A/H190A和BsGDH偶联的最适反应pH为8.0。
2、为了证明突变体的实际应用，我们用突变体与BsGDH偶联，对(E/Z)-柠檬醛进行不对称还原，生物合成(R)-香茅醛。
将反应体系放大为100mL将底物(E/Z)-柠檬醛浓度提高至220mM，反应条件为：200mM PBS、220mM(E/Z)-柠檬醛、0.6mM NADPH、50U BsGDH、200mM葡萄糖、50UCgOYEI81L/W128A/H190A；温度为40℃，pH为8.0；反应时间为：24h。
其中所述(E/Z)-柠檬醛为：将(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛混合，比例为按照浓度计为10：9。
结果如图11所示，在反应12h内(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛的浓度迅速下降，而(R)-香茅醛的浓度以稳定的速度增加，该反应优先消耗底物(E)-柠檬醛，反应结束后(S)-香茅醛的浓度低于2mM，表明N31-CgOYEI81L/W128A/H190A在优化的反应条件下能够保持良好的(R)-立体选择性，反应结束时，反应体系中的(R)-香茅醛的量为2452.8mg，产物浓度为24.528g/L；转化率和ee值分别为99.4％和99.0％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种烯烃还原酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短得到的；
或所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的；
或所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的；
或所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第81位异亮氨酸突变为亮氨酸，第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸得到的。
2.编码权利要求1所述烯烃还原酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.表达权利要求1所述烯烃还原酶突变体，或携带权利要求2所述基因，或携带权利要求3所述重组载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
6.一种提高烯烃还原酶转化底物柠檬醛非对映选择性合成(R)-香茅醛活性的方法，其特征在于，所述底物为(Z)-柠檬醛和/或(E)-柠檬醛；所述方法为，将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示烯烃还原酶的N段的第1位甲硫氨酸至第31位的精氨酸截短，并将第81位异亮氨酸突变为亮氨酸，第128位色氨酸突变为丙氨酸，同时将第190位的组氨酸突变为丙氨酸。
7.一种制备(R)-香茅醛的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的烯烃还原酶突变体，或权利要求4或5所述重组细胞表达的重组酶添加至含有底物柠檬醛的反应体系中，进行反应制备得到(R)-香茅醛；所述底物柠檬醛为(Z)-柠檬醛或(E)-柠檬醛或(E/Z)-柠檬醛；其中(E/Z)-柠檬醛为将(Z)-柠檬醛和(E)-柠檬醛的混合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，底物的添加量为：10-220mM/L。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，反应条件为：pH 6-10，20-60℃。
10.权利要求1所述的烯烃还原酶突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4或5所述的重组细胞在制备(R)-香茅醛或含有(R)-香茅醛的产品中的应用。
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