CN106243205B - 一种降解棒曲霉素的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降解棒曲霉素的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质。在氧化型辅酶存在的情况下，采用本发明所提供的蛋白质可体外降解棒曲霉素，且效果非常好。本发明所提供的蛋白质在清除棒曲霉素方面具有重要应用价值。

Description

一种降解棒曲霉素的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种降解棒曲霉素的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

棒曲霉素(Patulin)是部分青霉属和曲霉属真菌的次生代谢产物。它对人及动物具有广泛而强烈的毒性作用。急性毒性表现为抽搐、痉挛、皮下组织水肿、肺肠充血、肠炎、无尿直至死亡；慢性毒性可导致胃溃疡，并具有抑制免疫、致畸性以及潜在的致癌性等，还有可能影响男性的生育能力。棒曲霉素能溶于水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿，微溶于乙醚、苯，不溶于石油醚，在酸性条件下化学性质稳定。

在具有棒曲霉素产生能力的真菌中，部分真菌是植物致病菌，其中最主要的一种是扩展青霉病菌(Penicillium expansum)。这种病原菌是世界范围内引起果实采后腐烂的最重要的病原菌之一，常见的寄主包括苹果、梨、葡萄、樱桃、桃、草莓等等。它在引起果实腐烂的同时，会向果实组织中分泌大量的棒曲霉素。在果汁加工产业中，如果腐烂的果实混入原材料中，那么生产出的果汁就会有不同程度的棒曲霉素残留，给消费者(特别是儿童)的身体健康带来危害。基于棒曲霉素对人体健康的潜在危害，世界上很多国家都对果汁产品中棒曲霉素的最大限量做了规定，EU、USFDA规定果汁产品中棒曲霉素的最大限量为50μg/kg，WHO建议人每天棒曲霉素的摄入量不超过0.4μg/kg体重。

目前，主要通过吸附、微波处理等物理手段进行去除棒曲霉素，但效果不是十分理想，亟需研发新型的降解棒曲霉素的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种降解棒曲霉素的蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，命名为Cgscd，来源于季也蒙假丝酵母菌(Candidaguilliermondii)，具体是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质。

为了便于上述(a)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

在本发明中，所述蛋白质具体为将pET-30a(+)载体的多克隆位点BamHI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段后得到的重组载体所表达的蛋白质。该蛋白质的N端有6×His标签。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因(命名为Cgscd)，所述基因为如下1)-3)中任一的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同一性，且编码具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明中，所述重组载体具体为将pET-30a(+)载体的多克隆位点BamHI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段后得到的重组载体(命名为pET30a(+)-Cgscd)。

在本发明中，所述重组微生物具体为导入了所述重组载体pET30a(+)-Cgscd的大肠杆菌BL21(DE3)。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)降解棒曲霉素；

(b)制备具有降解棒曲霉素功能的产品。

本发明还提供了一种降解棒曲霉素的方法。

本发明所提供的降解棒曲霉素的方法，具体可包括如下步骤：在氧化型辅酶存在的情况下，采用所述蛋白质体外催化棒曲霉素的降解反应。

在所述方法中，所述降解反应的温度可为25-30℃(如25℃)，pH可为4-6(如6)，时间可为12-24h(如12h)。

所述降解反应的反应体系中所述氧化型辅酶的浓度具体可为2-5mM(如2.1mM)。所述降解反应的反应体系中所述蛋白质与待降解的棒曲霉素的质量比具体可为12:5。进一步，所述降解反应的反应体系中所述蛋白质的浓度具体可为60μg/mL；所述降解反应的反应体系中所述待降解的棒曲霉素的浓度具体可为25μg/mL。

在所述方法中，进行所述降解反应时，最好将所述反应体系置于摇床上振荡，具体转速可为120-200rpm(如120rpm)。

本发明还提供了一种具有降解棒曲霉素功能的产品。

本发明所提供的具有降解棒曲霉素功能的产品，其活性成分为所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物。

根据需要，所述产品中还可含有氧化型辅酶。

在本发明中，所述氧化型辅酶具体可为氧化型辅酶I(NAD⁺)或氧化型辅酶II(NADP⁺)。

实验证明，在氧化型辅酶存在的情况下，采用本发明所提供的Cgscd蛋白(序列1)可体外降解棒曲霉素，且效果非常好。本发明所提供的Cgscd蛋白(序列1)在清除棒曲霉素方面具有重要应用价值。

附图说明

图1为Cgscd基因克隆的PCR产物检测结果及菌液PCR检测结果。其中，A为PCR产物检测结果；B为菌液PCR检测结果(泳道1-6为阳性转化菌株)。

图2为Cgscd重组蛋白的原核表达结果。1，3：pET-30a(+)上清和包涵体；2，4：pET-30a(+)-Cgscd上清和包涵体。

图3为Cgscd重组蛋白的镍柱亲和纯化结果。1：载入蛋白；2：贯穿蛋白；3-4：洗涤液；5-8：洗脱液。

图4为不同辅酶对Cgscd蛋白降解棒曲霉素的影响。*p＜0.05。

图5为不同pH对Cgscd蛋白降解棒曲霉素的影响。*p＜0.05。

图6为不同温度对Cgscd蛋白降解棒曲霉素的影响。*p＜0.05。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、Cgscd基因的克隆及Cgscd蛋白的原核表达

一、Cgscd基因的克隆

根据Cgscd蛋白(gi|190348612，Short-chain dehydrogenase)的GI号在NCBI中查找对应的Cgscd基因序列，在该基因两端设计引物并在引物上增加BamHI和XhoI两个酶切位点，分别命名为pET-30a-F(BamHI)和pET-30a-R(XhoI)。

pET-30a-F(BamHI)：5’-GGATCCATGGAACAAACGTACTTTATTTCAGGCG-3’；

pET-30a-R(XhoI)：5’-CTCGAGTTACCATGGAAGTTCGGTTCCATCG-3’。

以季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)CGMCC 2.63(记载于“YuanyuanZong,Jia Liu,Boqiang Li,et al.Effects of yeast antagonists in combinationwith hot water treatment on postharvest diseases of tomato fruit.BiologicalControl 54(2010)316-321”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)的基因组DNA为模板，以pET-30a-F(BamHI)和pET-30a-R(XhoI)为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系如下：25μL Q5超保真2×Master Mix(纽英伦生物技术有限公司)，2.5μL正向引物(10μM)，2.5μL反向引物(10μM)，0.5μL模板DNA，19.5μL去离子水。

扩增条件为：98℃30s；98℃10s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃终延伸2min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，结果如图1中A所示，目的产物大小为750bp左右。

DNA凝胶回收试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)回收目的基因片段。取4μL该基因胶回收产物加入1μLSimple Cloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)，吸打混匀后离心使反应液至管底，25℃连接20min。

取50μL Trans1-T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)置于冰上缓慢融化，加入5μL连接产物，轻弹混匀，冰浴放置30min。42℃水浴热激90s后立即冰浴静置90s。超净台中加入800μL新鲜配制的LB液体培养基，37℃，200rpm培养1h。6000rpm离心1min，去掉750μL上清，用余下的100μL培养基悬浮细胞后，均匀涂布于LB平板上(含100μg/mL Kan)，37℃倒置培养12h左右至单菌落长出。

挑取单菌落，转接于含有Kan抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养6h后进行菌液PCR鉴定，PCR反应体系如下：10μL 2×Taq PCR Master Mix buffer，0.4μLpET-30a-F(BamHI)引物，0.4μL pET-30a-R(XhoI)引物，1μL菌液，8.2μL去离子水。

扩增条件为：95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环；72℃终延伸5min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1中B所示，阳性克隆得到大小约为750bp的目的条带。将鉴定的阳性克隆菌液提取质粒(命名为pEASY-Blunt-Cgscd)，共取了两个重复，将质粒送到北京美吉桑格生物医药科技有限公司测序。两个重复的测序结果用DNAMAN软件与NCBI中得到的该基因进行比对分析。结果显示：两个重复测序结果在DAMAN中进行比对，相似性为100％，Cgscd基因的序列如序列表中序列2所示，编码所得Cgscd蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。将基因序列与NCBI中已知序列进行blast比对分析，最高相似性为83.93％，氨基酸最高相似性为85.20％，表明本发明所得的Cgscd基因是一个新基因。

二、Cgscd蛋白的原核表达及纯化

1、重组原核表达载体pET30a(+)-Cgscd的构建

取步骤一构建的pEASY-Blunt-Cgscd质粒和pET-30a(+)，分别用BamHI和XhoI双酶切，酶切体系为：质粒30μL，5μL 10×K(Double Restriction Digestion Buffers，TakaRa)，1μL BamHI，1μL XhoI(TakaRa)，30μL去离子水。吸打混匀后稍离心，37℃，酶切反应2h，加入10μL 6×loading buffer，混匀后1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带大小无误后，DNA凝胶回收试剂盒回收片段。

将回收的Cgscd片段分别与切开的pET30a(+)质粒骨架大片段连接，连接体系如下：4.5μL Cgscd片段，4μL pET30a(+)质粒骨架大片段，1μL 10×T4DNALigase buffer，1μLT4DNALigase(TakaRa)。吸打混匀后离心，16℃，过夜连接，转化，菌液PCR鉴定阳性克隆后，提取其质粒即为重组原核表达载体，命名为pET30a(+)-Cgscd。

经测序，pET30a(+)-Cgscd的结构描述为：将pET-30a(+)载体的多克隆位点BamHI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段后得到的重组载体

2、重组蛋白的原核表达

转化pET30a(+)-Cgscd质粒及对应的空载pET-30a(+)至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，涂布于Kan抗性的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。挑取生长较好的单菌落于Kan抗性的LB培养液中，37℃、200rpm，振荡培养过夜。按1:100的比例接种菌液于新鲜的Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、200rpm继续培养至OD600≈0.5，向菌液中加入终浓度为1mM的IPTG，37℃、200rpm诱导培养3h后，4℃，12000rpm离心10min收集菌体。向菌体沉淀(3mL培养液)中加入150μL 50mM Tris-Cl(pH7.4)重悬菌体；超声处理(功率200W，脉冲1s，间隔2s，共120次)破碎大肠杆菌细胞，4℃，12000rpm离心15min收集上清，将沉淀重悬于150μL 50mMTris-Cl(pH 7.4)中，100℃煮10min，SDS-PAGE检测重组蛋白的诱导表达效果。

Cgscd蛋白大小约为25kDa，pET30a(+)携带的His标签大小约为6-7kDa，因此，通过pET30a(+)-Cgscd载体，表达获得的目的蛋白条带的大小约为31-32kDa，如图2中方框所示。由图可见，以pET30a(+)-Cgscd为表达载体时，Cgscd蛋白主要存在于上清中，以可溶蛋白形式存在。

3、重组蛋白的大规模制备及纯化

(1)按上述步骤2的方法扩大培养体系，100mL LB培养导入pET30a(+)-Cgscd的大肠杆菌BL21(DE3)重组菌，IPTG诱导后，4℃10000g离心10min收集菌体沉淀，加入10mL的1×binding buffer(50mM磷酸二氢钠，0.3M NaCl，10mM咪唑，pH8.0)重悬菌体后冰上放置30min。超声处理(功率300W，脉冲20s，间隔50s，共30次)以破碎大肠杆菌细胞，4℃10000g离心20min收集上清液。

(2)将层析柱底端堵住，向层析柱中加入10mL的1×binding buffer，轻轻颠倒混匀His-bind Resin(Novagen)，吸取1.5mL树脂到层析柱中，并轻柔颠倒混匀，静置4min后，自然沉降排空贮存液，如此重复3次平衡柱子。

(3)将(1)中收集的上清吸出0.5mL后，余下上清液均加入平衡好的His-bind树脂柱中，4℃轻柔颠倒混合2h后，让其中液体自然流下，保存该贯穿液。

(4)用10mL的1×wash buffer(50mM磷酸二氢钠，0.3M NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)洗涤柱子，反复5次，依次收集，分别命名为洗涤液1-5。

(5)准备好4个1.5mL离心管，加入4mL的1×elute buffer(50mM磷酸二氢钠，0.3MNaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱与镍柱结合的蛋白，每管收集1mL左右的洗脱液。

(6)SDS-PAGE检测镍柱纯化过程中各步骤中所得的样品，以评估纯化效果。

如图3所示，泳道1为纯化前的蛋白，目的蛋白表达量相对较高；泳道2为穿过镍柱后的蛋白，绝大部分目的蛋白已经结合到镍柱；部分未结合到镍柱上的目的蛋白被洗脱下来(泳道3-4)；依次洗脱了4管蛋白(5-8泳道)，目的蛋白主要集中在前两管(对应泳道5和6)中，取这两管蛋白做后续实验。

实施例2、Cgscd蛋白对棒曲霉素降解作用研究

考马斯亮蓝法测得实施例1中纯化的Cgscd蛋白浓度后，取纯化后的蛋白，探索不同辅酶、pH及共培养温度对Cgscd蛋白体外催化降解棒曲霉素的影响。

棒曲霉素：加拿大Toronto Research Chemicals(TRC)公司产品，其产品目录号为P206500。

1、辅酶

共分为4组：(1)还原型辅酶Ⅰ(NADH)；(2)氧化型辅酶Ⅰ(NAD⁺)；(3)还原型辅酶Ⅱ(NADPH)；(4)氧化型辅酶Ⅱ(NADP⁺)。

反应体系总体积为300μL，其中含有245μL 50mM的MES缓冲液(pH6)(配制方法：MES溶于适量水后用2M NaOH调节pH为6，然后水定容使得溶液中MES的终浓度为50mM)，20μL浓度为0.9mg/mL的Cgscd蛋白溶液(1×elute buffer溶解)，5μL浓度为1.5mg/mL的棒曲霉素母液，四个实验组中分别加入30μL浓度为21mM不同类型的辅酶。对照组(CK)中无Cgscd蛋白，加入了与蛋白等体积(20μL)的1×elutebuffer(配方：50mM磷酸二氢钠，0.3M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)。

25℃，120rpm共培养12h后0.22μm滤膜过滤，HPLC检测棒曲霉素残余量。每个处理三个重复，结果取均值。

其中，HPLC检测棒曲霉素残余量的具体检测条件如下：

色谱仪：美国Waters公司高效液相色谱仪，配备有自动进样器(Waters 2498)，双向HPLC泵(Waters 1525)，紫外检测器(Waters 2487)；

色谱柱：ODS反相柱(C18柱，5μm，250×4.6mm，GL Sciences，Japan)；

流动相：乙腈∶水＝10∶90(v/v)，流速1.0mL/min；

柱温：25℃；

检测波长：276nm；

进样量：10μL。

结果如图4所示，由图可见，添加两种氧化型辅酶NAD⁺和NADP⁺对Cgscd蛋白体外降解棒曲霉素的效果最好，共培养12h后，棒曲霉素的含量均下降了一半左右；而还原型辅酶NADH和NADPH效果稍差，棒曲霉素含量只减少了3/10。

2、pH

反应体系总体积为300μL，其中含有245μL不同pH的50mM的MES缓冲液(分别为pH4，pH5和pH6)(配制方法：MES溶于适量水后用2M NaOH或HCl调节pH为4、5或6，然后水定容使得溶液中MES的终浓度为50mM)，20μL浓度为0.9mg/mL的Cgscd蛋白溶液(1×elute buffer溶解)，5μL浓度为1.5mg/mL的棒曲霉素母液，30μL浓度为21mM的NAD⁺。对照组(CK)中无Cgscd蛋白，加入了与蛋白等体积(20μL)的1×elute buffer(配方同上)。

25℃，120rpm共培养12h后0.22μm滤膜过滤，HPLC检测棒曲霉素残余量(检测方法同上)。每个处理三个重复，结果取均值。

结果如图5所示，由图可见，当pH为4-6，在氧化型辅酶NAD⁺存在条件下，Cgscd蛋白体外降解棒曲霉素的效果都不错，特别是pH为6时，共培养12h后，棒曲霉素的含量下降了近一半。

3、温度

反应体系总体积为300μL，其中含有245μL 50mM的MES缓冲液(pH6)(配制方法同上)，20μL浓度为0.9mg/mL的Cgscd蛋白溶液(1×elute buffer溶解)，5μL浓度为1.5mg/mL的棒曲霉素母液，30μL浓度为21mM的NAD⁺。对照组(CK)中无Cgscd蛋白，加入了与蛋白等体积(20μL)的1×elute buffer(配方同上)。

分别于25℃、30℃和37℃，120rpm共培养12h后0.22μm滤膜过滤，HPLC检测棒曲霉素残余量(检测方法同上)。每个处理三个重复，结果取均值。

结果如图6所示，由图可见，当温度为25-37℃时，氧化型辅酶NAD⁺对Cgscd蛋白体外降解棒曲霉素的效果都很好，共培养12h后，棒曲霉素的含量下降了一半左右。其中，37℃条件下棒曲霉素自降解程度较高，因此最佳反应温度为25-30℃。

Claims (11)

1.蛋白质，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组微生物。

5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒或重组微生物在制备具有降解棒曲霉素功能的产品中的应用。

6.一种降解棒曲霉素的方法，包括如下步骤：在氧化型辅酶存在的情况下，采用权利要求1所述蛋白质体外催化棒曲霉素的降解反应；所述方法为非疾病治疗方法。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述降解反应的温度为25-30℃，pH为4-6，时间为12-24h。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述氧化型辅酶为氧化型辅酶I或氧化型辅酶II。

9.具有降解棒曲霉素功能的产品，其活性成分为权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒或重组微生物。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于：所述产品中还含有氧化型辅酶。

11.根据权利要求10所述的产品，其特征在于：所述氧化型辅酶为氧化型辅酶I或氧化型辅酶II。