CN103859016A - 酶类降解棒曲霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶类降解棒曲霉素的方法：将经过棒曲霉素诱导的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌体制备成粗酶制剂；将所述粗酶制剂放入被棒曲霉素污染的液态物中，降解温度为38～42℃，降解时间0.5～1h，从而进行棒曲霉素的降解；每100μL的粗酶液至多用于降解含有16μg棒曲霉素的被棒曲霉素污染的液态物。采用本发明的方法降解棒曲霉素，具有成本低、降解效果好、安全性好、无二次污染的优势。

Description

酶类降解棒曲霉素的方法

技术领域

本发明属于酶制剂领域，具体地，涉及一种利用来自海洋酵母的粗酶制剂降解真菌毒素棒曲霉素的方法。

背景技术

棒曲霉素（patulin，4-hydroxy-4H-furo[3,2-c]pyran-2(6H)-one）是一种水溶性的大环内酯，存在于一些腐烂的水果（如苹果、柑橘、石榴、梨等）及其制品中。棒曲霉素可由不少真菌产生，主要的包括曲霉属真菌（Aspergillus），青霉属真菌（Penicillium）以及拟青霉属真菌（Paecilomyces），其中青霉属真菌是自然界中棒曲霉素的主要生产者。

棒曲霉素是一种对人畜有毒性的真菌毒素。目前报道中已知的急性毒性包括恶心、溃疡；慢性毒性包括神经毒性、免疫毒性、基因毒性、抑制免疫系统、致癌致畸致突变等。另外，在分子生物学层面，棒曲霉素可抑制DNA合成、蛋白质的交联、与谷胱甘肽发生反应等。各国科学家对本国所产的苹果制品、石榴汁等产品中的棒曲霉素进行检测，发现在欧洲的大部分国家、韩国和日本，对食品中棒曲霉素的控制较好，而一些地方如西班牙、意大利、南非、印度和中国等，食品中棒曲霉素的检出率较高，而且部分样品超标很严重。

棒曲霉素是扩展青霉产生的二次代谢产物。虽然现在人们已拥有很多果蔬保鲜剂、杀菌剂以及保鲜手段（如低温储运、气调等），但抑制真菌生长和降低真菌毒素的分泌两者之间并不一定相关。现行的不少用于果蔬保鲜的物质或者手段（如低温、气调等）虽然能有效降低果蔬病害的发生，但它们对相应的真菌毒素的控制并无效果，相反，有一些保鲜产品或者保鲜手段反而促使真菌产生更多的毒素。这是因为不少真菌在不利于生长的逆境中，会分泌更多的真菌毒素等二次代谢产物，来增强自身的竞争能力。实例来说，据报道，体外实验中，在培养扩展青霉的培养基中加入克菌丹（Captan）、多菌灵（Carbendazim）、乙嘧酚磺酸酯（Bupirimate）等杀菌剂时，可以诱导扩展青霉产生更多的棒曲霉素。另有研究表明，经过生物制剂处理的有机苹果中的棒曲霉素含量高于经过传统农业（采用杀菌剂）栽培的苹果，对这个现象的解释还未形成定论。课题组对气调储藏的苹果进行研究，发现经过不同的气调处理的苹果虽然在发病率上有显著差异，但在棒曲霉素的含量上却无差异，说明在此处理下，病斑的大小和棒曲霉素的含量并不相关。总而言之，保鲜剂和保鲜手段虽然能控制真菌的生长，但并不能减少真菌分泌棒曲霉素的量。

由于棒曲霉素在酸性环境下稳定，因此一旦存在（被棒曲霉素污染的水果及其制品均为酸性环境）便很难通过常规方法去除。目前有报道利用臭氧、放射性元素、热处理、大孔树脂吸附等物理化学方法，对棒曲霉素进行去除。但这些方法有的成本较高，有的对环境或人体有负面影响，有的降解效果欠佳，因此并不很理想。相比较而言，生物方法更加安全、低成本。不少文献报道表明，利用微生物对棒曲霉素进行降解，不仅非常的有效，而且成本低廉，安全性高，其降解产物的毒性也比棒曲霉素本身要小。目前已报道的可降解棒曲霉素的微生物包括氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，需要在无氧环境下）、瘤胃中的微生物群、红酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）以及毕赤酵母（Pichia membranifaciens及Pichia caribbica）等。尽管生物降解棒曲霉素具有诸多优势，但微生物在降解过程中会消耗溶液中的营养物质，并且分泌二次代谢产物，若应用到果汁中，则可能对果汁本身的品质带来负面影响。而相应的酶制剂可弥补这些缺陷，而且更加高效。但目前没有任何文献涉及有关降解棒曲霉素的酶类报道。

红冬孢酵母（Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman）是一株从海洋中分离出来的安全的生防酵母。据研究，该酵母能适应高渗透压的环境，并且对小番茄、冬枣以及柑橘的采后病害控制非常有效。

该红冬孢酵母（Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman）亦名该海洋酵母

（Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman）被保藏于英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心（International Mycological Institute，CABI Genetic Resource Collection），保藏地址：英国TW209TY萨里郡艾格镇贝克汉姆路国际农业与生物中心英国中心，保藏日期：2006.4.19，保藏编号：IMI394084。

上述海洋酵母细胞悬浮液已被用于生产生物保鲜剂，该专利的申请号为200610155209.0。

上文中涉及的参考文献如下：

Burghardt RC,Barhoumi R,Lewis EH,Bailey RH,Pyle KA,Clement BA,Phillips T(1992).Toxicology and Applied Pharmacology,112(2),235-244（Burghardt RC,Barhoumi R,Lewis EH,Bailey RH,Pyle KA,Clement BA,Phillips T(1992).棒曲霉素诱发的细胞毒性：一种重要的荧光研究。112(2),235-244）；

Cao,J.,H.Zhang,et al.(2013)."5Efficacy of Pichia caribbica in controlling blue mold rotand patulin degradation in apples."International Journal of Food Microbiology162(2):167-173（Cao,J.,H.Zhang,et al.(2013).Pichia caribbica酵母控制苹果青霉害和降解棒曲霉素的效果。国际食品微生物。162(2):167-173）；

Castoria,R.,Mannina,L.,Durán-Patrón,R.,Maffei,F.,Sobolev,A.P.,De Felice,D.V.,Pinedo-Rivilla,C.,Wright,S.A.I.(2011).Conversion of the mycotoxin patulin to the less toxicdesoxypatulinic acid by the biocontrol yeast Rhodosporidium kratochvilovae strain LS11.Journalof Agricultural and Food Chemistry59(21),11571-11578（Castoria,R.,Mannina,L.,Durán-Patrón,R.,Maffei,F.,Sobolev,A.P.,De Felice,D.V.,Pinedo-Rivilla,C.,Wright,S.A.I.(2011).酵母Rhodosporidium kratochvilovae LS11降解棒曲霉素为低毒的desoxypatulinic acid。农业与食品科学。59(21),11571-11578）；

Coelho,A.R.,Celli,M.G.,Ono,E.Y.S.,Wosiacki,G.,Hoffmann,F.L.,Pagnocca,F.C.,Hirooka,E.Y.(2007).Penicillium expansum versus antagonist yeasts and patulin degradation in vitro.Brazilian Archives of Biology and Technology50(4),725-733（Coelho,A.R.,Celli,M.G.,Ono,E.Y.S.,Wosiacki,G.,Hoffmann,F.L.,Pagnocca,F.C.,Hirooka,E.Y.(2007).扩展青霉在体外对拮抗酵母及棒曲霉素的拮抗作用。巴西生物技术档案。50(4),725-733）

Cooray R,Kiessling KH,Lindahl-Kiessling K(1982).Food and Chemical Toxicology:anInternational Journal Published for the British Industrial Biological Research Association,20(6),893-898（Cooray R,Kiessling KH,Lindahl-Kiessling K(1982).棒曲霉素及棒曲霉素-半胱氨酸复合物对人类淋巴球细胞的DNA合成及姊妹单染色体互换的影响。食品及化学物质毒理学。20(6),893-898）；

G.Wichmann,O.Herbarth,I.Lehmann(2002).The mycotoxins citrinin,gliotoxin,and patulinaffect interferon-γrather than interleukin-4production in human blood cells.EnvironmentalToxicology,17(3),211-218（G.Wichmann,O.Herbarth,I.Lehmann(2002).真菌毒素橘霉素，木霉素及棒曲霉素对人类血细胞内干扰素-γ合成的影响大于白介素-4的合成。环境毒理学。17(3),211-218）；

Glaser,N.and H.Stopper(2012)."Patulin:Mechanism of genotoxicity."Food and ChemicalToxicology50(5):1796-1801（Glaser,N.and H.Stopper(2012).棒曲霉素：基因毒性的机理。食品和化学物质毒理学。50(5):1796-1801）；

K Walker,BP Wiesner(1944).Patulin and clavicin.Lancet,246:294（K Walker,BPWiesner(1944).棒曲霉素。柳叶刀。246:294）；

L Escoula,J More,C Baradat-Annales de Recherches Veterinaires(1977).The toxins ofByssochlamys nivea westling.-Acute toxicity of patulin in adult rats and mice.Annales deRecherches Veterinaires,8(1)41-49（L Escoula,J More,C Baradat-Annales de RecherchesVeterinaires(1977).Byssochlamys nivea westling的毒素：棒曲霉素对成人大鼠和小鼠的急性毒性。兽医研究年刊。8(1):41-49）；

Moake,M.M.,Padilla-Zakour,O.I.,Worobo,R.W.2005.Comprehensive review of patulincontrol methods in foods.Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety4,8-21（Moake,M.M.,Padilla-Zakour,O.I.,Worobo,R.W.(2005).控制食品中棒曲霉素的方法全面综述。食品科学和食品安全的全面综述。4:8-21）；

Morgavi,D.P.,Boudra,H.,Jouany,J.-P.,Graviou,D.(2003).Prevention of Patulin Toxicity onRumen Microbial Fermentation by SH-Containing Reducing Agents.Journal of Agricultural andFood Chemistry51(23),6906-6910（Morgavi,D.P.,Boudra,H.,Jouany,J.-P.,Graviou,D.(2003).包含SH键的还原性化学物质降低棒曲霉素对瘤胃微生物发酵的毒性影响。农业与食品科学。51(23):6906-6910）；

Moss,M.O.2008.Fungi,quality and safety issues in fresh fruits and vegetables.Journal ofApplied Microbiology104,1239-1243（Moss,M.O.(2008).新鲜果蔬的真菌，品质和安全议题。应用微生物学。104,1239-1243）；

Moss,M.O.,Long,M.T.(2002).Fate of patulin in the presence of the yeast Saccharomycescerevisiae Food Additives and Contaminants19(4),387-399（Moss,M.O.,Long,M.T.(2002).酵母Saccharomyces cerevisiae对棒曲霉素的影响。食品添加剂和污染物。19(4):387-399）；

Ralph Fliege,Manfred Metzler(1999).The mycotoxin patulin induces intra-and intermolecularprotein crosslinks in vitro involving cysteine,lysine,and histidine side chains,andα-amino groups.Chemico-Biological Interactions,123(2),85–103（Ralph Fliege,Manfred Metzler(1999).真菌毒素棒曲霉素体外诱导分子内及分子键蛋白质交联作用包括半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸侧链以及α-氨基的基团。化学-生物相互作用。123(2):85–103）；

Ricelli,A.,Baruzzi,F.,Solfrizzo,M.,Morea,M.,Fanizzi,F.P.(2007).Biotransformation ofpatulin by Gluconobacter oxydans.Applied and Environmental Microbiology73(3),785-792（Ricelli,A.,Baruzzi,F.,Solfrizzo,M.,Morea,M.,Fanizzi,F.P.(2007).Gluconobacter oxydans对棒曲霉素的生物转化。应用环境微生物学。73(3):785-792）；

Roll R,Matthiaschk G,Korte A(1990).Embryotoxicity and mutagenicity of mycotoxins.JEnviron Pathol Toxicol Oncol,10(1-2),1-7（Roll R,Matthiaschk G,Korte A(1990).真菌毒素的胚胎毒性和诱导突变性。环境病理学、毒理学及肿瘤学。10(1-2):1-7）；

Wang,Y.F.,T.Yu,et al.(2010)."Biocontrol of postharvest gray mold of cherry tomatoes withthe marine yeast Rhodosporidium paludigenum."Biological Control53(2):178-182（Wang,Y.F.,T.Yu,et al.(2010).海洋酵母Rhodosporidium paludigenum对樱桃番茄采后灰霉病的控制。生物防治53(2):178-182）；

Zhu,R.,L.Lu,et al.(2013)."Postharvest Control of Green Mold Decay of Citrus Fruit UsingCombined Treatment with Sodium Bicarbonate and Rhodosporidium paludigenum."Food andBioprocess Technology6(10):2925-2930（Zhu,R.,L.Lu,et al.(2013).碳酸氢钠及Rhodosporidium paludigenum对采后柑橘的绿霉病害控制。食品和生物工艺技术。6(10):2925-2930）。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、降解效果好、安全性好、无二次污染的酶类降解棒曲霉素的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种酶类降解棒曲霉素的方法：将经过棒曲霉素诱导的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌体制备成粗酶制剂；

将所述粗酶制剂放入被棒曲霉素污染的液态物中，降解温度为38～42℃，降解时间0.5～1h，从而进行棒曲霉素的降解；

每100μL的粗酶液至多用于降解含有16μg棒曲霉素的被棒曲霉素污染的液态物。

备注说明：一般而言，被棒曲霉素污染的液态物中棒曲霉素的浓度≤40ppm。

作为本发明的利用红冬孢酵母生物降解棒曲霉素的方法的改进：

所述被棒曲霉素污染的液态物的pH≤7。

作为本发明的酶类降解棒曲霉素的方法的进一步改进，粗酶制剂的制备方法为：

在NYDB培养液中添加棒曲霉素，直至棒曲霉素的浓度为1ppm；得含有棒曲霉素的NYDB培养液；

将Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌落接种到上述含有棒曲霉素的NYDB培养液中，于24～26℃（较佳为25℃）、180～220rpm（较佳为200rpm）的摇床中培养35～37小时（较佳为36小时）；培养结束后，经离心、弃去上清后用无菌水洗涤，得菌体；

按照每1g菌体配用9～11ml的pH7.0的Britton-Robinson缓冲溶液的用量比，将菌体研磨破碎后加入pH为7.0的Britton-Robinson缓冲溶液，于3～5℃、10000～14000g的条件下离心8～12min（较佳为于4℃、12000g的条件下离心10min），吸取上清液（为澄清的上清液）作为粗酶制剂（于4℃条件下放置，待用）。

备注说明：上述菌体研磨时，需要加入石英砂并在液氮条件下快速研磨破碎菌体，此属于常规技术。

作为本发明的酶类降解棒曲霉素的方法进一步改进，粗酶制剂的制备方法为：

在NYDB培养液中添加棒曲霉素，直至棒曲霉素的浓度为1ppm；得含有棒曲霉素的NYDB培养液；

将Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌落接种到上述含有棒曲霉素的NYDB培养液中，于24～26℃（较佳为25℃）、180～220rpm（较佳为200rpm）的摇床中培养35～37小时（较佳为36小时）；培养结束后，经离心、弃去上清后用无菌水洗涤，得菌体；

将所得的菌体于-15～-25℃放置11～13小时（较佳为-20℃放置12小时），然后再放入冷冻干燥机中，于-35～-45℃干燥46～50小时（较佳为-40℃干燥48小时），得菌体冻干粉；

按照每1g菌体冻干粉配用14～16ml的pH7.0的Britton-Robinson缓冲溶液的用量比，将菌体冻干粉研磨破碎后加入pH7.0的Britton-Robinson缓冲溶液中，于3～5℃、10000～14000g的条件下离心8～12min（较佳为于4℃、12000g的条件下离心10min），吸取上清液（为澄清的上清液）作为粗酶制剂（于4℃条件下放置，待用）。

作为本发明的酶类降解棒曲霉素的方法的进一步改进：降解温度为40℃。

在本发明中，NYDB为常规技术：10g葡萄糖+8g牛肉浸膏+5g酵母浸出粉+1L蒸馏水。

pH7.0的Britton-Robinson缓冲溶液也属于常规技术：磷酸、乙酸、硼酸三酸混合液，浓度均为0.04mol/L，通过加入0.2mol/LNaOH溶液来调整pH值。

在本发明中，

将棒曲霉素加入到用于培养红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的NYDB培养液中，是因为棒曲霉素能诱导红冬孢酵母产生更大量的分解棒曲霉素的相关酶类。将菌体制成冻干粉，是因为冻干粉有利于保持酶的活性，易于保存，且方便研磨。

本发明是获取菌株Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的胞内粗酶组分，将其放入到被棒曲霉素污染的液态物（pH≤7）中，从而达到利用酶制剂降解棒曲霉素的效果。

本发明所得的Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体冻干粉，可放置于-20℃～-80℃中干燥保存，保存期为一年以上。本发明所得的来自Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的粗酶制剂可于4℃下保存一个星期，于-20℃下保存一个月。

研究表明来自Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体的粗酶制剂能有效降解棒曲霉素。随着人们对食品安全的高度重视，安全、高效的降解棒曲霉素的粗酶制剂有着广阔的实际应用前景和研究价值。

本发明具有如下优点：

1.降解效率高：

本发明通过获取Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体的胞内粗酶组分制成粗酶制剂，该粗酶制剂能在极短时间高效降解棒曲霉素，降解效率高；同时，棒曲霉素被降解后的产物毒性远远低于棒曲霉素本身的毒性，不造成二次污染。

2.成本低：

Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman是从海洋分离得到的天然、安全酵母菌株，存在于大自然中，来源广泛，易于获取。Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman对生长环境要求不苛刻，且耐高渗透压，易于培养，能大量繁殖，因此成本低廉。

3.操作简单，实际应用方便：

本发明获得的粗酶制剂使用方便，只需将其加入被棒曲霉素污染的液态物中，便可以通过酶解作用降解棒曲霉素。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的来自Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的粗酶制剂在Britton-Robinson缓冲溶液（pH=7.0）中的降解棒曲霉素的效果图。

图2为本发明的来自Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman粗酶制剂在石榴汁中的降解棒曲霉素的效果图。

图3为本发明的来自Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman粗酶制剂降解棒曲霉素后降解产物对人体肝脏细胞的毒性图。

图4为棒曲霉素对人体肝脏细胞的毒性图，作为和图3的对比。

具体实施方式

下面通过实施例对本实验作进一步详细说明。

实施例1、粗酶制剂降解Britton-Robinson缓冲溶液（pH=7.0）中的棒曲霉素，依次进行如下步骤：

1）、粗酶制剂的制备：

先配制含有棒曲霉素的无菌NYDB：

在1L的无菌NYDB培养液中加入棒曲霉素使其最终浓度为1ppm；得含有棒曲霉素的NYDB培养液；

挑取Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的单菌落接种到50mL上述含有棒曲霉素的NYDB培养液中，于25℃、200rpm的摇床中培养36小时。培养结束后，先3000rpm离心10min、弃去上清、用无菌水（约30ml）洗涤沉淀，此过程重复两次（即，再重复一次上述的离心、弃去上清、用无菌水洗涤沉淀），最后再次离心（3000rpm离心10min）后弃去上清，收获菌体。将所得的菌体放于-20℃冰箱中过夜（约12小时），再马上放入冷冻干燥机（-40℃）中冷冻干燥48小时，获得菌体冻干粉。

往研钵中加入1g菌体冻干粉，快速研磨破碎菌体后，再溶于15mL pH7.0的Britton-Robinson缓冲溶液（配方为磷酸、乙酸、硼酸三酸混合液，浓度均为0.04mol/L，再逐滴加入0.2mol/LNaOH溶液，调整pH值至7.0）。在4℃、12000g的条件下离心10min，吸取澄清的上清液制成粗酶制剂，于4℃条件下放置，待用。

2）、棒曲霉素的降解：

将5mg的棒曲霉素标品溶解于20mL乙酸乙酯中，吸取0.6mL于氮吹仪中吹干，再溶解于0.6m的Britton-Robinson缓冲溶液（pH=7.0）中，制成棒曲霉素溶液。向2mL的离心管中加入380μL Britton-Robinson缓冲溶液（pH=7.0）、20μL棒曲霉素溶液以及100μL粗酶制剂，混合均匀，即，共含有5μg的棒曲霉素（棒曲霉素的最终浓度为10ppm）。以不加粗酶制剂的处理为空白对照。每个处理及空白对照各设三个平行。放置于40℃恒温箱反应；检测的时间点分别为5分钟、10分钟、30分钟、1小时。

对反应所得物中棒曲霉素的含量按照如下方法进行检测：

1）样品处理：向每管中加入1mL乙酸乙酯，于250rpm小摇床中振荡10分钟，再于3000rpm的离心机中离心3分钟。吸取850μL上清液，氮气吹干，溶于200μL去离子水中（用乙酸调节pH值至4.0），用2.5μm的滤膜过滤，进行HPLC检测。

2）HPLC检测：检测方法如下：

流动相为10%乙腈+90%水（为体积%），流速为0.2mL/min，检测波长为276nm，柱温35℃，进样量10μL。所选取的柱子为Synergi2.5μ,Fusion-RP,100×2mm。实验中棒曲霉素的出峰时间为3.18min。

结果如图1所示，在1h的降解过程中，处理组中棒曲霉素的含量随着时间不断下降。在短短的5分钟内，有22.5%的棒曲霉素被降解（即，经检测棒曲霉素含量仅为3.875μg）；10分钟后，有48.3%的棒曲霉素被降解（即，经检测棒曲霉素含量仅为2.585μg）；到了30分钟，有90%的棒曲霉素被降解（即，经检测棒曲霉素含量仅为0.5μg）；1h时，已经检测不到棒曲霉素的存在。

通过上述实验，我们可以得到以下结论：本发明的来自Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体的胞内粗酶制剂能够高效的降解棒曲霉素。

实施例2、粗酶制剂降解石榴汁（pH为4.6）中的棒曲霉素，依次进行如下步骤：

1）、粗酶制剂的制备：

同实施例1中的粗酶制剂的制备。

2）、石榴汁中棒曲霉素的降解：

向50mL的离心管中加入20mL市购石榴汁，已事先测得石榴汁内含有95μg/L的棒曲霉素（即管内共有1.9μg棒曲霉素）。加入100μL粗酶制剂，混合均匀。放置于40℃恒温箱反应；检测的时间点分别为5分钟、10分钟、30分钟、1小时；从而实现对棒曲霉素进行降解。

其余内容等同于实施例1。

结果如图2所示。在1h的降解过程中，处理组中棒曲霉素的含量随着时间不断下降。在短短的5分钟内，有22.5%的棒曲霉素被降解（即，经检测棒曲霉素含量仅为1.4725μg）；10分钟后，有67.33%的棒曲霉素被降解（即，经检测棒曲霉素含量仅为0.62μg）；到了30分钟，已经检测不到棒曲霉素的存在。

通过上述实验，我们可以得到以下结论：本发明的来自Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman菌体的胞内粗酶制剂能够有效应用于被棒曲霉素污染的石榴汁中，从而可进行实际推广应用。

实施例3、相对于实施例1而言，作如下更改：

向2mL的离心管中加入336μL Britton-Robinson缓冲溶液（pH=7.0）、64μL棒曲霉素溶液以及100μL粗酶制剂，混合均匀，即，共含有16μg的棒曲霉素。以不加粗酶制剂的处理为空白对照。每个处理及空白对照各设三个平行。放置于40℃恒温箱反应；检测的时间点分别为5分钟、10分钟、30分钟、1小时。

结果为：在1h的降解过程中，处理组中棒曲霉素的含量随着时间不断下降。在短短的5分钟内，有25%的棒曲霉素被降解；10分钟后，有55%的棒曲霉素被降解；到了30分钟，有95%的棒曲霉素被降解；1h时，已经检测不到棒曲霉素的存在。

对比例1、相对于将实施例1作如下改变：

将粗酶制剂的制备方法中所用的含有棒曲霉素的NYDB培养液改成“常规的NYDB培养液”，即，棒曲霉素的添加量为0；

检测时间点为1小时。

其余内容等同于实施例1。

结果为：降解1小时后，仅有73%的棒曲霉素被降解。

对比例2、相对于将实施例1作如下改变：

将粗酶制剂的制备方法中所用的含有棒曲霉素的NYDB培养液中棒曲霉素的浓度由1ppm改成2ppm；

检测时间点为0.5小时、1小时。

结果为：

降解0.5小时后，仅有75%的棒曲霉素被降解。

降解1小时后，仅有92%的棒曲霉素被降解。

对比例3、将实施例1中的降解温度由40℃下降为30℃，检测时间为5分钟；其余等同于实施例1。

结果为：

降解5分钟后，仅有12.28%的棒曲霉素被降解。

对比例4、将实施例1中的降解温度由40℃上升为50℃，检测时间为5分钟；其余等同于实施例1。

结果为：

降解5分钟后，仅有18.1%的棒曲霉素被降解。

安全性实验：

将棒曲霉素被降解后所得的产物进行毒性评估，检测方法如下：

1）、棒曲霉素降解产物的获取

将700μL粗酶制剂加入装有4.2mL醋酸铵（0.1mM）水溶液的50mL离心管里，并加入100μL的棒曲霉素（也用0.1mM的醋酸铵水溶液溶解），使棒曲霉素的最终浓度为20ppm，共有10个重复。于40℃恒温箱中反应2h。每管加入15mL乙腈，低温下静置30分钟，3000rpm离心，收获上清，将蛋白质沉淀弃去。用氮吹仪将乙腈和醋酸铵水溶液的混合溶液吹干，再用DMEM高糖细胞培养液（10%胎牛血清）溶解，用无菌滤头过滤（用HPLC检测，确认棒曲霉素已被完全降解）。在无菌条件下，配制棒曲霉素降解产物的溶液，使浓度分别为50ppm，10ppm，1ppm，0.5ppm。同时，用相同的溶剂配制相同浓度梯度的棒曲霉素溶液。

2）、棒曲霉素降解产物的毒性检测

将正常人体肝脏细胞（LO2）接种到无菌96孔板上，接种密度为6000个细胞/孔，接种两块培养板。37℃恒温培养箱内培养24h。吸取掉培养液，加入150μL棒曲霉素溶液或棒曲霉素降解产物的溶液，每个处理做5个平行。于37℃，5%CO2培养条件下在恒温培养箱内培养24小时、48小时。吸弃上清液，加入120μL预先配制好的MTT溶液，继续培养3-4小时。取出96孔培养板，以3000rmp转速离心5分钟，弃去上清。每孔加入150μL DMSO，放置10min后用酶标仪检测在570nm下的吸光度值。

实验结果如图3和图4所示。由实验结果可知，棒曲霉素对人体肝脏下细胞有显著毒性，当棒曲霉素的浓度高于1ppm时，能显著抑制人体肝脏细胞的存活。相比较，棒曲霉素降解产物的毒性要比棒曲霉素低很多。

通过上述实验，我们可以得到以下结论：采用本发明来自Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的粗酶制剂降解棒曲霉素，其降解产物的毒性远远低于棒曲霉素。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.酶类降解棒曲霉素的方法，其特征是：将经过棒曲霉素诱导的Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman的菌体制备成粗酶制剂；

将所述粗酶制剂放入被棒曲霉素污染的液态物中，降解温度为38～42℃，降解时间0.5～1h，从而进行棒曲霉素的降解；

每100μL的粗酶液至多用于降解含有16μg棒曲霉素的被棒曲霉素污染的液态物。

2.根据权利要求1所述的酶类降解棒曲霉素的方法，其特征是：

所述被棒曲霉素污染的液态物的pH≤7。

3.根据权利要求2所述的酶类降解棒曲霉素的方法，其特征是所述粗酶制剂的制备方法为：

在NYDB培养液中添加棒曲霉素，直至棒曲霉素的浓度为1ppm；得含有棒曲霉素的NYDB培养液；

将Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌落接种到上述含有棒曲霉素的NYDB培养液中，于24～26℃、180～220rpm的摇床中培养35～37小时；培养结束后，经离心、弃去上清后用无菌水洗涤，得菌体；

按照每1g菌体配用9～11ml的pH7.0的Britton-Robinson缓冲溶液的用量比，将菌体研磨破碎后加入pH为7.0的Britton-Robinson缓冲溶液，于3～5℃、10000～14000g的条件下离心8～12min，吸取上清液作为粗酶制剂。

4.如权利要求2所述的酶类降解棒曲霉素的方法，其特征是所述粗酶制剂的制备方法为：

在NYDB培养液中添加棒曲霉素，直至棒曲霉素的浓度为1ppm；得含有棒曲霉素的NYDB培养液；

将Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman的菌落接种到上述含有棒曲霉素的NYDB培养液中，于24～26℃、180～220rpm的摇床中培养35～37小时；培养结束后，经离心、弃去上清后用无菌水洗涤，得菌体；

将所得的菌体于-15～-25℃放置11～13小时，然后再放入冷冻干燥机中，于-35～-45℃干燥46～50小时，得菌体冻干粉；

按照每1g菌体冻干粉配用14～16ml的pH7.0的Britton-Robinson缓冲溶液的用量比，将菌体冻干粉研磨破碎后加入pH7.0的Britton-Robinson缓冲溶液中，于3～5℃、10000～14000g的条件下离心8～12min，吸取上清液作为粗酶制剂。

5.根据权利要求3或4所述的酶类降解棒曲霉素的方法，其特征是：所述降解温度为40℃。

Images