CN103843880A - 基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液，由酵母细胞悬浮液和γ-氨基丁酸溶液这2部分组成；每0.5毫升酵母细胞悬浮液中含有拮抗酵母细胞10⁶～10⁹个，其余为无菌水；每0.5毫升γ-氨基丁酸溶液中含有90～110μg的γ-氨基丁酸，其余为无菌水；所述酵母细胞悬浮液与γ-氨基丁酸溶液的体积比为1:1。所述拮抗酵母为罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii或红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallmani。该生物保鲜液能用于防治/控制梨果实青霉病害。

Description

基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液及其用途

技术领域

本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种通过γ-氨基丁酸提高酵母对果实病害防治效力的生物保鲜技术。

背景技术

水果是人类饮食结构中的重要组成部分，提供人体所需的维生素、有机酸、矿物质和抗氧化成分等多种营养物质。然而，采后阶段新鲜水果的腐烂是一个全球性问题，由采后病害造成的损失非常巨大。据统计，发达国家新鲜果蔬采后腐烂损失率为15%～25%，而在发展中国家，果蔬腐烂损失率高达20%～50%。我国果蔬腐烂每年超过8000万吨，造成经济损失750亿元，占整个行业产值的30%以上。大多数的水果采后腐烂都是由病原菌引起，在采收、包装、储藏和运输过程中如果出现机械损伤，病原真菌很容易通过伤口途径侵染果实，在体内大量生长繁殖，导致腐烂变质现象的发生。

梨是我国传统的优势水果，营养丰富，具有极高的经济、营养保健价值和鲜食、加工等多种用途，据报道，我国栽种面积100多万公顷，年产量达800多万吨。各种病害的侵染在梨果实的贮藏和运输过程中普遍发生，尤其是一些真菌的侵染，如扩展青霉（Penicilliumexpansum）引发的青霉病造成大量的梨果实腐烂。

长期以来，国内外对于化学杀菌剂的应用具有较大的依赖性，如在柑橘、柚子、苹果、梨等水果保鲜中，广泛应用多种杀菌剂。化学杀菌剂控制果实采后病害非常稳定。因为杀菌剂针对病原菌的生理特点，所以十分有效，而在食品上不安全。这种不安全性主要包括：1、残留在果实表面甚至可能渗透到果肉组织中；2、其难于降解，而残留在环境中；3、病原菌进化形成抗药性，导致杀菌剂使用剂量的不断加大和毒性更高的农药使用。美国国家科学院（NAS）的报告指出，用于食品的杀菌剂构成60%的致癌风险。因此杀菌剂的减少使用，乃至最终停止使用是目前国际上的研究重点、热点，但也是难点问题。寻找毒性低、防效高、低残留和环保的杀菌剂的替代品非常迫切。

在众多被研究的可能替代化学杀菌剂的方法中，利用拮抗微生物，特别是拮抗酵母抑制采后果实病害的生物防治技术是当前国内外最为关注的新型采后病害控制方法之一。这主要是由于酵母具有遗传稳定、抑菌谱广、效价高、一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物、安全性高等特点；且其对营养要求低，生长快；并有对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，并能与多种其它化学和物理处理相容等优良特性。已有大量研究报道罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）和海洋酵母（Rhodosporidium paludigenum）能显著抑制多种果蔬的采后病害，而且非常适合于工业化大规模生产，技术成熟，生产稳定.产量高，周期短。因此，开发这两种酵母作为生物保鲜剂的菌种资源，非常具有市场潜力。

罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3590；红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman：保藏于英国国际真菌研究所（International Mycological Institute）国际农业与生物中心基因资源保藏中心（CABI Genetic Resource Collection），保藏号为IMI394084。

中国发明授权专利《一株水果蔬菜的生物保鲜剂及其制备方法》，专利号200610155209.0，公开了一种基于红冬孢酵母和尼泊金乙酯钠或尼泊金丁酯钠制备水果蔬菜的生物杀菌剂的方法。中国发明授权专利《用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途》，专利号ZL200610155062.5，公开了一种用海洋酵母菌株Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman抑制链格孢、灰葡萄孢、扩展青霉、指状青霉、多毛孢等多种果蔬采后主要真菌病害的生物防治方法。中国发明授权专利《一种海洋酵母的用途和相应微生物燃料电池及制备方法》，授权公告号CN101552340B，公开了一种利用红冬孢酵母制备微生物燃料电池的方法。中国发明申请专利《一种防治果蔬病害的生物保鲜剂及其制备方法》，申请号200910095643.8，公开了一种基于红冬孢酵母和羧甲基纤维素钠等物质防治果蔬病害的生物保鲜方法。中国发明申请专利《海洋酵母Rhodosporidum paludigenum Fell&Tallman的专用甘蔗糖蜜培养基》，申请号2010101485270，公开了一种海洋酵母Rhodosporidum paludigenum Fell&Tallman液体培养的方法。中国发明申请专利《海洋酵母Rhodosporidum paludigenum Fell&Tallman的真空冷冻干燥制》，申请号2010101400817，公开了一种红冬孢酵母活性干粉制备的方法。中国发明申请专利《一种诱导提高海洋红冬孢酵母对果实病害防治效力的方法》，申请号201010551754.8，公开了一种利用几丁质物质诱导提高红冬孢酵母生防效力的方法。中国申请发明专利《基于海洋生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鲜剂》（申请号201110111211.9）提供了一种红冬孢酵母悬浮液和氯化钙防治柑橘病害的技术。中国申请发明专利《基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂》（申请号201110112540.5）提供了一种红冬孢酵母悬浮液和水杨酸（SA）、生长素（IBA）防治柑橘病害的技术。

中国发明授权专利《桃果实病害生物防腐保鲜剂及用途和所用罗伦隐球酵母》，专利号201010152108.4，公开了一种桃果实病害生物防腐保鲜剂，其由罗伦隐球酵母悬浮液、壳聚糖、氯化钙和水组成以及所进行的桃果实保鲜法，能有效延长桃果实的保鲜时间。中国发明授权专利《罗伦隐球酵母专用培养基及其用途》，专利号201110112491.5，公开了一种罗伦隐球酵母专用培养基及其用途。中国发明申请专利《诱导提高生防酵母对果实病害防治效力方法及所用培养基》，申请号201010153561.7，公开了一种诱导提高罗伦隐球酵母CGMCCNo.3590对果实病害防治效力的培养基。中国发明申请专利《臭氧与罗伦隐球酵母结合处理对草莓采后病害防治的方法》，申请号201110360762.9，公开了0.574mg/ml臭氧与罗伦隐球酵母结合处理可以有效抑制草莓采后病害发生。中国发明申请专利《提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法》，申请号201210190959.7，公开了使用海藻糖可提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素的效力。中国发明申请专利《苯并噻二唑结合罗伦隐球酵母防治水果采后病害的方法》，申请号201210291499.7，提供了一种结合使用替代化学杀菌剂防治水果采后病害的方法，避免使用化学杀菌剂对人的危害。中国发明申请专利《提高生防酵母对果实病害防治效力的方法》，申请号201310127327.0，提供了一种提高罗伦隐球酵母CGMCC No.3590对果实病害防治效力的方法，包括将生防酵母菌进行活化，然后将活化后的生防酵母菌进行液体培养等步骤。

此外，中国发明申请专利《基于三种生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鲜剂》（申请号201110111499.X）提供了一种罗伦隐球酵母悬浮液、粘红酵母悬浮液和红冬孢酵母悬浮液防治柑橘果实病害的技术；中国发明申请专利《柑橘生物防腐保鲜剂》（申请号201110111499.X）提供了一种由罗伦隐球酵母悬浮液、粘红酵母悬浮液、红冬孢酵母悬浮液、水杨酸（SA）、生长素（IBA）、和氯化钙防治柑橘果实病害的技术；中国发明申请专利《基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂》（申请号201110114068.9）提供了一种由罗伦隐球酵母悬浮液、粘红酵母悬浮液、红冬孢酵母悬浮液、碳酸氢钠、吲哚丁酸和水杨酸防治柑橘果实病害的技术。

但目前国内外已报道，甚至已商业化开发的拮抗酵母对果实病害的控制效力与化学杀菌剂相比还存在差距。而且由于国内外研究的果实病害生防酵母均为非模式酵母，其遗传背景信息大多不明确，对其生防生理代谢的研究也尚少，严重限制了定向提高果实生防酵母活性技术的发展。

无论植物是抗病或感病品种，都具有潜在的抗性机制，外源因子可以诱导其表现出来，使植物产生抗病性，这种现象称为诱导抗性。植物诱导抗病理论和技术成为果蔬采后病害防治中一种安全高效的保鲜方法，是当前采后病理学、生理学的研究热点，并具有良好的应用前景。

许多研究报道外源因子如一些生物、物理和化学激发子都能诱导果实采后的抗性。经大量的研究证明果实抗性的化学激发子诱导已成为一种非常成熟和简易的操作，其对果实抗性诱导及防御各种逆境因子对果实的危害方面是有效的。化学激发子具有容易生产、运输的特点，而且储藏成本低，防效稳定，使用简单，受环境因素影响较小，其使用更为广泛。中国发明专利（申请号200580006760.2，在植物中诱导抗性的混合物和方法）提供了一种使用了两种或者多种化合物，包括水杨酸、促进性化合物、调节性化合物，通过刺激植物天然防御系统，增强植物诱导抗性抑制病原菌的侵染的方法；中国发明专利（申请号201010118266.8，利用提高植物免疫力防治植物病毒害的方法及其用途）提供了一种使用了多种化合物诱导植物免疫系统使植物产生对植物病毒抗性用于植物保护的方法。中国发明专利（申请号200810140359.3，一种果蔬保鲜剂及其制备与应用）提供了一种通过以牛蒡低聚糖为主要成分的混合物诱导果蔬系统获得抗性的方法。研究报道也指出，一些化学激发子还可以提高拮抗酵母对果实病害的防治效力，因此结合处理对于商业化应用具有更广阔的发展前景。

γ-氨基丁酸(GABA)又称4-氨基丁酸，是一个四碳非蛋白氨基酸，它广泛存在于动物、植物和微生物中。长久以来，GABA被认为是植物或微生物的代谢产物。在安全方面，美国环境保护署（EPA）已经确认这种物质在植物或果实上使用时对环境和人健康无任何毒害作用。GABA成本低廉，容易生产、运输，而且防效稳定，使用简单，受环境因素影响较小，并具有镇静神经、抗焦虑、降低血压、增进脑活力、抗衰老等生理功能，已逐渐发展成为一种新型功能性物质，被广泛应用于食品工业。中国发明授权专利《一种通过γ-氨基丁酸诱导提高植物抗盐性的方法》，专利号200710098727.8，公开了一种提高植物抗盐性的方法。该方法是对植物用浓度为0.1-10mmol/L的γ-氨基丁酸进行处理，植物的抗盐性获得提高；所述处理方式选自叶面喷施、浸种、浸根和根际注射中的一种或几种配合使用。中国发明授权专利《γ-氨基丁酸提高植物耐温度胁迫能力的新用途》，专利号200810239320.7，公开了γ-氨基丁酸在提高植物耐温度胁迫能力中的应用和γ-氨基丁酸在促进植物生长，提高植物产量，提高植物品质中的应用。试验证明，用一定浓度的γ-氨基丁酸通过种子处理、叶面喷施等方式，可提高农作物忍耐能力，减少高温、低温等温度胁迫带来的危害，减少产量损失。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种不使用化学杀菌剂的条件下，采用生物学和化学的方法抑制梨果实采后病害的保鲜技术。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液，由酵母细胞悬浮液和γ-氨基丁酸溶液这2部分组成；

每0.5毫升酵母细胞悬浮液中含有拮抗酵母细胞10⁶～10⁹个（优选10⁶～10⁸个，更优选10⁷个），其余为无菌水；

每0.5毫升γ-氨基丁酸溶液中含有90～110μg（最佳为100μg）的γ-氨基丁酸，其余为无菌水；

所述酵母细胞悬浮液与γ-氨基丁酸溶液的体积比为1:1。

作为本发明的基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液的改进：所述拮抗酵母为罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii或红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallmani。

作为本发明的基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液的进一步改进：

所述罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC3590；

所述红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman，保藏于英国国际真菌研究所（International Mycological Institute）国际农业与生物中心基因资源保藏中心（CABI GeneticResource Collection），保藏号为IMI394084。

作为本发明的基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液的进一步改进：

每0.5毫升酵母细胞悬浮液中含有拮抗酵母细胞10⁷个，其余为无菌水；

每0.5毫升γ-氨基丁酸溶液中含有100μg的γ-氨基丁酸，其余为无菌水。

本发明还同时提供了上述生物保鲜液的用途：用于防治/控制梨果实青霉病害。

作为本发明的生物保鲜液的用途的改进：所述生物保鲜液的使用方法为：

先将γ-氨基丁酸溶液喷洒在梨果实表面，直至果实表面润湿；然后于20～25℃的恒温、90%的相对湿度下诱导22～26小时；得诱导处理后梨果实；

最后将酵母细胞悬浮液喷洒在诱导处理后梨果实的表面；

所述酵母细胞悬浮液与γ-氨基丁酸溶液的体积比为1:1。

备注说明：本发明所述的梨果实是指采摘24h内的新鲜梨果实。

本发明所用的生防酵母（拮抗酵母）：罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3590；红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman，保藏于英国国际真菌研究所（International Mycological Institute）国际农业与生物中心基因资源保藏中心（CABI GeneticResource Collection），保藏号为IMI394084。

本发明的生物保鲜液在制备过程中涉及以下技术内容（均属于常规技术）：

1）拮抗酵母菌体活化：

把斜面保存的酵母菌接种到灭菌NYDA斜面培养基中，25～28℃下培养48～72小时，相同条件下重复传代培养两次。固体活化好的酵母菌接种到灭菌NYDB液体培养基中，25～28℃、150～200rpm条件下培养18～36小时。NYDA斜面培养基组成为：牛肉膏6～8g/L，酵母粉4～5g/L，葡萄糖8～10g/L，琼脂15～20g/L，余量为水，NYDB液体培养基组成为不添加琼脂的NYDA培养基。

2）拮抗酵母菌体制备：

液体培养后的酵母发酵液2000～4000rpm下离心5～15分钟收集菌体，并用无菌水洗涤酵母菌体两次从而除去培养基后，用无菌水重新悬浮酵母细胞，并用血球计数板计数后调整成相应浓度的酵母细胞悬浮液。

本发明属于基于罗伦隐球酵母或红冬孢酵母抑制果实病害的保鲜技术，通过利用γ-氨基丁酸作为拮抗酵母活性和果实抗性的激发子，从而提高两种生防酵母对梨果实青霉病害的控制效力。

本发明的优点是：（1）本发明中的罗伦隐球酵母C.laurentii和红冬孢酵母R.paludigenum均遗传稳定，抑菌谱广，不产生抗生素，无化学污染，安全性高；（2）拮抗微生物除具备可诱导果实抗性的功能外，还可以通过营养与空间竞争、分泌抑菌物质、寄生等途径来达到抑菌的效果；（3）诱导抗性是植物受病虫害侵染后产生的一种自然反应，可以对病虫害产生持久和系统的广谱抗性。γ-氨基丁酸为化学制剂，产品成本低廉，容易生产、运输，而且防效稳定，使用简单，受环境因素影响较小，其可以广泛用于柑橘、梨、苹果、水蜜桃等多种水果，且对环境和人健康无任何毒害作用；（4）生防酵母与γ-氨基丁酸结合处理显著降低梨果实的采后病害，具有经济实用、安全高效、环境友好等特点。

综上所述，本发明提供了一种利用γ-氨基丁酸结合生防酵母控制梨果实青霉病害的防治方法，该方法能显著提高生防酵母的拮抗活性，具有重要的理论意义和实用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为γ-氨基丁酸（GABA）和C.laurentii直接结合处理对梨果实青霉病的控制的对比图；

其中，图（a）为伤口处理发病率，图（b）为伤口处理病斑直径。

图2为γ-氨基丁酸（GABA）诱导结合C.laurentii处理对梨果实青霉病的控制的对比图；

其中，图（a）为伤口处理发病率，图（b）为伤口处理病斑直径。

图3为γ-氨基丁酸（GABA）和R.paludigenum直接结合处理对梨果实青霉病的控制的对比图；

其中，图（a）为伤口处理发病率，图（b）为伤口处理病斑直径。

具体实施方式

实验1γ-氨基丁酸（GABA）和C.laurentii直接结合处理对梨果实青霉病的控制效果

1、实验材料：

果实为梨，品种为水晶梨。

病原菌：扩展青霉（Penicillium expansum），25℃活化7天备用。

2、处理：

（1）水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1%（质量%）的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

（2）用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小（5mm）和尽可能相同的深度（2mm）的伤口4个。每个伤口处分别加入等量（50μl）100μg/ml的GABA溶液、10⁶cells/ml C.laurentii、10⁶cells/ml C.laurentii+100μg/ml GABA，以加入等量的无菌水作为对照。

备注说明：10⁶cells/ml C.laurentii+100μg/ml GABA即为：

所用的生物保鲜液由酵母细胞悬浮液和γ-氨基丁酸溶液这2部分组成；

每0.5毫升酵母细胞悬浮液中含有罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii细胞10⁶个，其余为无菌水；

每0.5毫升γ-氨基丁酸溶液中含有100μg的γ-氨基丁酸，其余为无菌水；

酵母细胞悬浮液与γ-氨基丁酸溶液的体积比为1:1。

常温（25℃）处理2小时后，在伤口处接入1×10⁴spores/ml扩展青霉Penicillium expansum菌悬液30μl，处理完毕后在常温下（25℃）贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同处理的效力进行比较，结果以平均发病率（%）和平均病斑直径（mm）表示。选取6个果为一组/重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。

γ-氨基丁酸（GABA）和C.laurentii直接结合处理对梨果实青霉病的控制效果如图1所示。

3、结果：

如图1所示，γ-氨基丁酸在梨果实体内不能直接抑制青霉病害，而10⁶cells/ml C.laurentii处理果实伤口后，可以有效降低病害的发生率，在贮藏后的第4天和第5天与对照相比降低了55.6%、38.9%，当10⁶cells/ml C.laurentii和GABA直接结合处理（即，酵母细胞悬浮液和γ-氨基丁酸溶液直接混合成生物保鲜液进行使用）后，病害抑制效果更为突出，发病率低于与C.laurentii单独处理，仅为16.7%和27.8%。第5至第6天，C.laurentii+GABA直接结合处理组发病率虽略有升高，但仍显著低于C.laurentii单独处理。在病斑直径上也有一致的结果。因此，本发明提供的γ-氨基丁酸与C.laurentii直接结合处理控制梨果实青霉病害具有显著效果。

实验2、γ-氨基丁酸（GABA）诱导结合C.laurentii处理对梨果实青霉病的控制效果

1、实验材料：

果实为梨，品种为水晶梨。

病原菌：扩展青霉（Penicillium expansum），25℃活化7天备用。

2、处理：

（1）水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1%的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

（2）用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小（5mm）和尽可能相同的深度（2mm）的伤口。每个伤口处分别加入等量（50μl）的以下液体：

100μg/ml GABA溶液，

10⁶cells/ml C.laurentii，

10⁷cells/ml C.laurentii，

10⁸cells/ml C.laurentii，

100μg/ml GABA+10⁶cells/ml C.laurentii，

100μg/ml GABA+10⁷cells/ml C.laurentii；

无菌水作为对照。

备注说明：

100μg/ml GABA+10⁶cells/ml C.laurentii的制备同实验1。

100μg/ml GABA+10⁷cells/ml C.laurentii即为：

所用的生物保鲜液由酵母细胞悬浮液和γ-氨基丁酸溶液这2部分组成；

每0.5毫升酵母细胞悬浮液中含有罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii细胞10⁷个，其余为无菌水；

每0.5毫升γ-氨基丁酸溶液中含有100μg的γ-氨基丁酸，其余为无菌水；

酵母细胞悬浮液与γ-氨基丁酸溶液的体积比为1:1。

具体加入方法如下：

100μg/ml GABA+10⁶cells/ml C.laurentii，100μg/ml GABA+10⁷cells/ml C.laurentii这2个组别为：

先加入25μl的γ-氨基丁酸溶液，于25℃的恒温、90%的相对湿度下诱导24小时；然后再加入25μl的酵母细胞悬浮液；于25℃的常温下放置2小时。

在上述2个组别加入酵母细胞悬浮液的同时，100μg/ml GABA溶液、10⁶cells/ml C.laurentii、10⁷cells/ml C.laurentii、10⁸cells/ml C.laurentii，无菌水均直接加入伤口内（50μl）；于25℃的常温下放置2小时；

上述接入酵母2小时后，在每个伤口处接入1×10⁴spores/ml扩展青霉Penicillium expansum菌悬液30μl，处理完毕后在常温下（25℃）贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同处理的效力进行比较，结果以平均发病率（%）和平均病斑直径（mm）表示。选取7个果为一组/重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。

γ-氨基丁酸（GABA）诱导结合C.laurentii处理对梨果实青霉病的控制效果如图2所示。

3、结果：

在接入病原菌后的第5天，扩展青霉在对照组的梨果实上快速侵染，发病率已达到94.4%；GABA单独诱导处理24小时后，可以提高梨果实的抗性，第5天相比对照组青霉病发生率减低了22.2%，而C.laurentii处理组的发病率均较低；从第6天开始，C.laurentii处理组发病率逐渐升高；第7天时，低浓度（10⁶～10⁷cells/ml）C.laurentii病害发生率分别为55.6%和21.2%，而通过γ-氨基丁酸诱导结合10⁶～10⁷cells/ml C.laurentii处理后，能显著增强C.laurentii对病害的控制效力，发病率相比C.laurentii单独处理降低了16.7%和11.1%，其中γ-氨基丁酸诱导结合10⁷cells/ml C.laurentii处理组抑制病害的效果与高浓度10⁸cells/ml C.laurentii单独处理相当，有效地降低了C.laurentii的使用浓度。因此，本发明提供的γ-氨基丁酸诱导结合C.laurentii处理对梨果实青霉病的抑制具有明显效果。

备注说明：在图2中，10⁸cells/ml C.laurentii与100μg/ml GABA+10⁷cells/ml C.laurentii的数据曲线基本相重叠。

对比例1、选用与实验2同一批次的水晶梨；将实验2中所用的“100μg/ml GABA+10⁷cells/ml C.laurentii”分别改成以下内容：10⁷cells/ml C.laurentii+80μg/ml GABA、10⁷cells/mlC.laurentii+120μg/ml GABA、10⁷cells/ml C.laurentii+100μg/ml的2-氨基丁酸、10⁷cells/mlC.laurentii+100μg/ml的3-氨基丁酸；

其使用方法类同于实验2中“100μg/ml GABA+107cells/ml C.laurentii”的使用方法（即，诱导结合）；所得结果具体如下（以下为接种病原菌后的第7天所得）：

10⁷cells/ml C.laurentii+80μg/ml GABA处理后发病率为25%，

10⁷cells/ml C.laurentii+120μg/ml GABA处理后发病率为23%，

10⁷cells/ml C.laurentii+100μg/ml2-氨基丁酸处理后发病率为38%、

10⁷cells/ml C.laurentii+100μg/ml3-氨基丁酸处理后的发病率为33%。

对比例2、选用与实验2同一批次的水晶梨；将100μg/ml GABA+106cells/ml C.laurentii、100μg/ml GABA+10⁷cells/ml C.laurentii这2个组别的使用方法改成：

将50μl的100μg/ml GABA+10⁶cells/ml C.laurentii、50μl的100μg/ml GABA+10⁷cells/ml C.laurentii分别一次性加入伤口内；处理2小时后接入扩展青霉Penicillium expansum菌悬液。

其余内容等同于实验2。

所得结果具体如下（以下为接种病原菌后的第7天所得）：

100μg/ml GABA+10⁶cells/ml C.laurentii处理后发病率为49%，

100μg/ml GABA+10⁷cells/ml C.laurentii处理后发病率为21%。

实验3、γ-氨基丁酸（GABA）诱导结合C.laurentii处理对梨果实青霉病的控制效果

1、实验材料：

果实为梨，品种为水晶梨。

病原菌：扩展青霉（Penicillium expansum），25℃活化7天备用。

2、处理：

（1）水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1%的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

（2）均选用100μg/ml GABA+10⁷cells/ml C.laurentii（其制备方法同实验2）；

组别A为：先将γ-氨基丁酸溶液喷洒在梨果实表面，直至果实表面润湿；然后于25℃的恒温、90%的相对湿度下诱导24小时；得诱导处理后梨果实；最后将酵母细胞悬浮液喷洒在诱导处理后梨果实的表面，所述酵母细胞悬浮液与γ-氨基丁酸溶液的体积比为1:1。

组别B为：将同组别A用量的酵母细胞悬浮液和γ-氨基丁酸溶液直接混合成生物保鲜液，在组别A喷洒酵母细胞悬浮液的同时，将生物保鲜液喷洒在梨果实表面。

设置无菌水作为对照，即，在组别A喷洒酵母细胞悬浮液的同时，将无菌水喷洒在梨果实表面。

（2）用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小（5mm）和尽可能相同的深度（2mm）的伤口。

处理2小时后（即，喷洒酵母细胞悬浮液2小时后），在伤口处接入1×10⁴spores/ml扩展青霉Penicillium expansum菌悬液30μl，处理完毕后在常温下（25℃）贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同处理的效力进行比较，结果以平均发病率（%）和平均病斑直径（mm）表示。每个组选用6个果，实验重复3次，以相同结果为准。具体如下表所示。

表2、γ-氨基丁酸整果处理对梨果实抗性的影响（检测时间为第5天）

处理号	发病率（%）
		对照	100
组别A	72.2±4.2
		组别B	90.5±5.6

实验4γ-氨基丁酸（GABA）和R.paludigenum直接结合处理对梨果实青霉病的控制效果：

1、实验材料：

果实为梨，品种为水晶梨。

病原菌：扩展青霉（Penicillium expansum），25℃活化7天备用。

2、处理：

（1）水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1%的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

（2）用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小（5mm）和尽可能相同的深度（2mm）的伤口7个。每个伤口处分别加入等量（50μl）100μg/mlGABA溶液、10⁶cells/ml R.paludigenum、10⁷cells/ml R.paludigenum、10⁸cells/ml R.paludigenum、10⁶cells/ml R.paludigenum+100μg/ml GABA、10⁷cells/ml R.paludigenum+100μg/ml GABA，以加入等量的无菌水作为对照；

处理2小时后，在伤口处接入1×10⁴spores/ml扩展青霉Penicillium expansum菌悬液30μl，处理完毕后在常温下（25℃）贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同处理的效力进行比较，结果以平均发病率（%）和平均病斑直径（mm）表示。选取6个果为一组/重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。

γ-氨基丁酸（GABA）和R.paludigenum直接结合处理对梨果实青霉病的控制效果如图3所示。

3、结果：

在接入病原菌的第4天，对照组和GABA单独处理组的梨果实青霉病害发生率达到100%；10⁶～10⁸cells/ml R.paludigenum单独处理能有效抑制扩展青霉在梨伤口处的侵染，尤其是对早期（4天内）的青霉病害控制效果十分显著，病害发生率随R.paludigenum浓度的提高呈下降趋势，从第5开始，低浓度（10⁶～10⁷cells/ml）R.paludigenum发病速度较快，而γ-氨基丁酸与R.paludigenum直接结合处理可明显降低扩展青霉的侵染，病害发生率相比R.paludigenum单独处理降低了16.7%左右，随着贮藏期的延长，结合处理组虽然抑制病害效力弱于高浓度10⁸cells/ml R.paludigenum单独处理，但可以显著增强低浓度R.paludigenum的生防效力，降低R.paludigenum的使用浓度。因此，本发明提供的γ-氨基丁酸与R.paludigenum直接结合处理控制梨果实青霉病害具有明显效果。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液，其特征在于：由酵母细胞悬浮液和γ-氨基丁酸溶液这2部分组成；

每0.5毫升酵母细胞悬浮液中含有拮抗酵母细胞10⁶～10⁹个，其余为无菌水；

每0.5毫升γ-氨基丁酸溶液中含有90～110μg的γ-氨基丁酸，其余为无菌水；

所述酵母细胞悬浮液与γ-氨基丁酸溶液的体积比为1:1。

2.根据权利要求1所述的基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液，其特征在于：所述拮抗酵母为罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii或红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenumFell&Tallmani。

3.根据权利要求2所述的基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液，其特征在于：

所述罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC3590；

所述红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman，保藏于英国国际真菌研究所（International Mycological Institute）国际农业与生物中心基因资源保藏中心（CABI GeneticResource Collection），保藏号为IMI394084。

4.根据权利要求3所述的基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液，其特征在于：

每0.5毫升酵母细胞悬浮液中含有拮抗酵母细胞10⁷个，其余为无菌水；

每0.5毫升γ-氨基丁酸溶液中含有100μg的γ-氨基丁酸，其余为无菌水。

5.如权利要求1～4任一所述的生物保鲜液的用途，其特征在于：用于防治/控制梨果实青霉病害。

6.根据权利要求5所述的生物保鲜液的用途，其特征在于：所述生物保鲜液的使用方法为：

先将γ-氨基丁酸溶液喷洒在梨果实表面，直至果实表面润湿；然后于20～25℃的恒温、90%的相对湿度下诱导22～26小时；得诱导处理后梨果实；

最后将酵母细胞悬浮液喷洒在诱导处理后梨果实的表面；

所述酵母细胞悬浮液与γ-氨基丁酸溶液的体积比为1:1。

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