CN106085890A

CN106085890A - 通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法及所用制剂

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Publication number: CN106085890A
Application number: CN201610522546.2A
Authority: CN
Inventors: 余挺; 傅达
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2016-11-09
Anticipated expiration: 2036-06-29
Also published as: CN106085890B

Abstract

本发明公开了一种通过诱导抗性来抑制果实采后病害的制剂，该制剂是由海洋红冬孢酵母细胞壁和水组成，每1L制剂中含有0.1～10g海洋红冬孢酵母细胞壁。本发明还同时提供了利用上述制剂进行的通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法，在果实装箱贮藏前，先进行如下任意一种方式的预处理：预处理方式一、先将果实放入制剂中浸泡，沥干后放入容器内于密封状态下保持23～25小时；预处理方式二、果实采摘前，将制剂喷在果实表面，然后放入容器内于密封状态下保持23～25小时；将上述预处理后的果实从容器中取出后再装箱。采用本发明可在不使用化学杀菌剂的前提下能有效控制果实采后病害。

Description

通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法及所用制剂

技术领域

本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种通过诱导果实抗性来抑制果实采后病害的生物保鲜技术。

背景技术

水果在采后由于腐烂而导致的损失非常巨大，据资料显示，我国每年果蔬腐烂超过8000万吨，造成的经济损失达千亿元。病原真菌侵染是造成水果果实采后腐烂的主要原因，常见的病原真菌主要有青霉属(Penicillum spp.)、葡萄孢属(Botrytis spp.)和链格孢属(Alternaria spp.)等。

目前，化学杀菌剂仍然是控制水果采后病害的主要措施。以柑橘为例，中国发明专利(申请号200910028802.2，柑橘保鲜剂)提供了可控制柑橘病害的多种化学杀菌剂，包括甲基托布津，多菌灵。中国发明专利(申请号200910028804.1，柑橘长效保鲜剂)提供了可控制柑橘病害的化学杀菌剂，包括2,4-D钠盐，托布津。中国发明专利(申请号201110209305.X，一种柑橘保鲜剂及其制备方法、应用)提供了可控制柑橘病害的多种化学杀菌剂，包括醚菌酯、唑菌胺脂、肟菌酯、烯肟菌酯等。然而，化学杀菌剂的残留容易对人体健康及环境安全造成严重危害，同时会导致病原微生物产生耐药性，影响病害防治效果。因此，寻找新型的、安全有效的病害控制方法来代替杀菌剂日益成为人们关注的焦点。

植物自身存在着一套复杂的防御机制来抵御病原菌的入侵。外源因子可以通过刺激植物组织，使这种防御机制表现出来，从而使植物产生抗病性，这种现象称为诱导抗性。大量研究表明，热处理、紫外线、钙处理、植物激素及天然抑菌物质、生物防腐剂等都能诱导果实产生抗性。诱导抗性作为一种利用植物自身抗病机制的防治方法，和化学杀菌剂相比具有安全、稳定、环境友好等优点，能够有效降低果实采后贮藏过程中的腐烂，被认为是有效的新型病害控制方法之一。中国授权发明专利《在植物中诱导抗性的混合物和方法》(公开号1925748)公开了一种使用两种或者多种化合物，包括水杨酸或其功能类似产品、促进性化合物、调节性化合物，通过刺激植物天然防御系统和在植物中诱导抗性来抑制病原菌侵染的方法。中国发明专利(申请号201510015741.1，一种甜瓜病害控制方法)提供了一种安全的甜瓜病害控制方法，即在甜瓜幼果期、果实迅速膨大期、网纹形成期和采前48小时四个时期喷洒乙酰水杨酸，以诱导果实的抗性。中国发明专利(申请号201410314131.7，诱导果实抗性控制病害的方法及所用制剂)提供了一种利用胶体几丁质溶液诱导果实抗性以控制病害的方法。

海洋酵母是生活在海水中的酵母的通称，广泛分布于各种自然海域中，除耐盐性外，其生物学性质和细胞的组成成分与陆生酵母基本相同。海洋酵母可以在低温下长期贮存，适合于工业化大规模生产，开发海洋酵母作为生物保鲜剂的菌种资源非常具有市场潜力。海洋红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman)是一株从海洋中分离得到的新型果实病害生防酵母。中国授权发明专利《用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途》(公开号CN101412972A)公开了海洋红冬孢酵母抑制链格孢、灰葡萄孢、扩展青霉、指状青霉、多毛孢等多种果蔬采后主要真菌病害的生物防治方法。中国授权发明专利《基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂》(公开号102160572A)公开了一种由红冬孢酵母悬浮液、赤霉素/激动素、水杨酸、生长素和水组成的一种柑橘生物保鲜剂。

酵母细胞壁富含葡聚糖和甘露聚糖，在食品领域应用广泛，多用作动物饲料和葡萄酒生产辅料。中国授权发明专利《生物毒素吸附剂及其生产方法》(公开号101361524)公开了一种由酵母细胞壁提取物(甘露寡糖)和矿性黏土组成的生物毒素吸附剂，可以吸附动物饲料中的霉菌毒素并使之失活，从而降低饲料中毒素的含量，提高动物生产力和健康状况。中国授权发明专利《毒素吸附剂在葡萄酒发酵中的应用》(公开号104004615A)公开了一种由酵母细胞壁制备的毒素吸附剂，在发酵过程中可以吸附葡萄酒中的多链脂肪酸与农药残留，有效预防或解决了葡萄酒代谢毒素引起的酵母中毒、发酵缓慢甚至中止的问题，同时为葡萄酒提供了丰富的生存因子，改善了葡萄酒的外观品质和结构感，提升了葡萄酒的稳定性。中国发明专利(申请号201510791302.X，动物饲料添加剂)提供了一种包含酵母细胞壁和抗菌肽的饲料用抗菌肽脱霉剂作为动物饲料添加剂，具有杀霉、脱霉、修复免疫抑制等多重功效。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法及所用制剂，采用本发明可在不使用化学杀菌剂的前提下能有效控制果实采后病害。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种通过诱导抗性来抑制果实采后病害的制剂：该制剂是由海洋红冬孢酵母细胞壁和水(无菌蒸馏水)组成，每1L制剂中含有0.1～10g海洋红冬孢酵母细胞壁。

作为本发明的制剂的改进：每1L制剂中含有5g海洋红冬孢酵母细胞壁。

作为本发明的制剂的进一步改进，海洋红冬孢酵母细胞壁的制备方法为：

将海洋红冬孢酵母细胞灭活处理(121℃灭菌20min)，得灭活酵母细胞；

取100mg灭活酵母细胞悬浮于0.4～0.6mL(较佳为0.5mL)的0.2mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH 8.0)中，加入酸洗玻璃珠，于研磨机上进行研磨(研磨时间为10～15分钟)从而破碎细胞，然后离心，无菌水洗涤沉淀后离心，得海洋红冬孢酵母细胞壁。

本发明的制剂为悬浮液。

本发明还同时提供了利用上述制剂进行的通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法，在果实装箱贮藏前，先进行如下任意一种方式的预处理：

预处理方式一、

先将果实放入制剂中浸泡，沥干后放入容器内于密封状态下保持23～25小时；

预处理方式二、

果实采摘前，将制剂喷在果实表面(湿润即可)，然后放入容器内于密封状态下保持23～25小时；

将上述预处理后的果实从容器中取出后再装箱。

作为本发明的通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法的改进：所述预处理方式一中，浸泡时间为8～12分钟(较佳为10分钟)。

作为本发明的通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法的进一步改进：所述预处理方式一和预处理方式二中的容器均为保鲜薄膜袋。

在本发明中，病害例如为青霉病、黑斑病。

在本发明中，所述海洋红冬孢酵母是保藏编号为IMI 394084的海洋红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman。该菌株已经在申请号为200610155209.0的专利中被公开。

在本发明中，

预处理方式一：选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，用自来水冲洗并在室温(25℃左右)下放干。然后将清洗后的果实在本发明的制剂中浸泡8～12分钟(较佳为10分钟)后，取出放干(即，沥干水)，再放入保鲜薄膜袋中(扎紧袋口，使其密封)在室温(25℃左右)下保持23～25小时(即，24小时左右)，再将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。

预处理方式二：采用采前喷壶喷洒的方法处理，在果实采摘前，将本发明的制剂喷在果实表面(湿润即可)，待干后(果实表面不再滴液后)取下果实放入保鲜薄膜袋中(扎紧袋口)在室温(25℃左右)下保持23～25小时(即，24小时左右)，再将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。

本发明中的海洋红冬孢酵母细胞壁的制备方法为：

保藏编号为IMI 394084的海洋红冬孢酵母在低温(4℃)下保存在NYDA培养基(牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20g，用水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min)中，活化时取出，在28℃下于NYDA培养基中培养48小时(培养条件为200rpm、28℃)，重复传代培养2次后，用接种环将活化好的酵母接到NYDB培养基(牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，用水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min)中，在200rpm、28℃条件下培养24小时，收集培养液，在4000rpm、4℃条件下离心15min，用无菌蒸馏水洗涤2次，以除去培养介质，然后在高压蒸汽灭菌锅中灭活(121℃灭菌20min)，离心(4000rpm、4℃条件下离心15min)收集灭活酵母细胞。取100mg灭活酵母细胞，悬浮于0.5mL 0.2mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH 8.0)中，加入0.5g酸洗玻璃珠(美国Sigma公司生产的G8772型号，粒径425-600μm)，于自动样品研磨机上研磨破碎细胞(频率为70Hz)，3min/循环，处理5个循环，破碎后在4000rpm、4℃条件下离心10min，用无菌水洗涤沉淀至上清液澄清，最后离心(4000rpm、4℃条件下离心10min)收集沉淀，即为海洋红冬孢酵母细胞壁(简称酵母细胞壁)。

本发明的优点是：(1)本发明中的海洋红冬孢酵母资源丰富、成本低廉、性价比高，具有生物可降解性；(2)诱导抗性是植物受病虫害侵染后产生的一种自然反应，可以对病虫害产生持久和系统的广谱抗性；(3)能显著降低果实的采后病害，对环境和人体健康无任何毒害作用，具有经济实用、安全高效、环境友好等特点；(4)该制剂在不使用化学杀菌剂的前提下能有效控制果实采后病害。(5)、灭活处理后的海洋红冬孢酵母细胞壁更便于保存。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为红冬孢酵母细胞壁对梨果实青霉病抗性的诱导作用对比图；

其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

海洋红冬孢酵母，即为保藏编号为IMI 394084的海洋红冬孢酵母Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman。

实施例1、用于控制果实采后病害的制剂

将海洋红冬孢酵母细胞在高压蒸汽灭菌锅中灭活处理(121℃灭菌20min)，得灭活酵母细胞。

取100mg灭活酵母细胞，悬浮于0.5mL 0.2mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH 8.0)中，加入0.5g酸洗玻璃珠(美国Sigma公司生产的G8772型号，粒径425-600μm)，于自动样品研磨机上研磨破碎细胞(频率为70Hz)，3min/循环，处理5个循环，破碎后在4000rpm、4℃条件下离心10min，用无菌水洗涤沉淀，最后离心(4000rpm、4℃条件下离心10min)收集沉淀，即为海洋红冬孢酵母细胞壁(简称酵母细胞壁)。

取50g海洋红冬孢酵母细胞壁，加水1L，配制成细胞壁悬浮液，再加水稀释至10L备用。最终所得的每1L制剂中含有5g海洋红冬孢酵母细胞壁，其余为水；即，该制剂是浓度为0.5％的海洋红冬孢酵母细胞壁悬浮液。

为了证明本发明制剂的实际使用效果，发明人进行了如下的实验：

实验1、红冬孢酵母细胞壁对梨果实青霉病抗性的诱导作用

1、实验材料：

果实为水晶梨。

病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)，25℃活化7天备用。

2、处理：

选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％(质量％)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小和深度的伤口。每个伤口加入30μL浓度分别为0.01％、0.1％、0.2％、0.5％、1％的红冬孢酵母细胞壁悬浮液，以加入等量的无菌水作为对照；并用PE塑料膜密封。24小时后掀开PE塑料膜在每个伤口处加入30μL病原菌孢子悬浮液(Penicillium expansum，浓度为1×10⁴spores/mL)，在常温(25℃左右)下贮藏，再次用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理重复3次，每个重复9个果实，实验重复两次，以相同结果为准。第4天观察结果。

备注说明：浓度为0.01％红冬孢酵母细胞壁悬浮液是指每1L制剂中含有0.1g海洋红冬孢酵母细胞壁，其余为水。其余类推。

3、结果：

如图1所示，在接种病原菌后第4天，对照组的发病率已经达到96.3％，而0.01-1％的海洋红冬孢酵母细胞壁悬浮液处理后，发病率显著下降。其中浓度为0.5％的细胞壁悬浮液效果最为明显，发病率仅为19.4％，比对照组下降了76.9％。在病斑直径上也有类似的结果，0.5％细胞壁处理组比对照组减少了14.8mm。说明红冬孢酵母细胞壁悬浮液能有效减缓梨果实青霉病的发生和发展。而浓度为1％的处理组的效果明显不如浓度为0.5％的处理组。

实验2、红冬孢酵母细胞壁对樱桃番茄果实黑斑病抗性的诱导作用

1、实验材料：

果实为樱桃番茄。

病原菌：链格孢(Alternaria alternata)，25℃活化14天备用。

2、处理：

选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

将樱桃番茄果实浸泡在0.5％的海洋红冬孢酵母细胞壁悬浮液中10min，以无菌水作为对照，取出放干(沥干)后用PE塑料薄膜密封。24小时后，用消过毒的打孔器在每个樱桃番茄果实表面形成统一大小和深度的伤口，加入20μL A.alternata孢子悬浮液，浓度为1×10⁴spores/mL。每天定时观察、记录果实伤口处病害发生情况，结果以平均发病率(％)表示。每个处理重复3次，每个重复20个果实，实验重复两次，以相同结果为准。第3天观察结果。

3、结果：

如表1所示，用0.5％的红冬孢酵母细胞壁悬浮液对樱桃番茄果实进行整果浸泡处理，24小时之后再接入病原菌，72小时后，细胞壁悬浮液处理组相比对照组发病率下降了37.7％，具有显著差异。

表1、诱导24小时后樱桃番茄果实的发病率(％)

	72小时的发病率(％)
		无菌水	90.2±2.2
海洋红冬孢酵母细胞壁悬浮液(0.5％)	50.5±6.0

对比实验1、将实验2中所述的“24小时后，用消过毒的打孔器在每个樱桃番茄果实表面形成统一大小和深度的伤口”改为“分别于0小时、6小时和48小时后，用消过毒的打孔器在每个樱桃番茄果实表面形成统一大小和深度的伤口”，所用的海洋红冬孢酵母细胞壁悬浮液的浓度仍然为0.5％；其余等同于实验2。

第3天(72小时)观察的结果如表2所述：

表2、不同诱导时间下樱桃番茄果实的发病率(％)

	0小时	6小时	48小时
				海洋红冬孢酵母细胞壁悬浮液(0.5％)	92.6±3.0	85.2±4.4	67.6±3.7

在没有诱导(0小时)、短时间诱导(6小时)、长时间诱导(48小时)的条件下，海洋红冬孢酵母细胞壁悬浮液对樱桃番茄果实黑斑病的抑制效果都不如本发明(诱导时间为24小时)。其中在没有诱导的条件下，细胞壁悬浮液不能体现抑制作用。

对比例、

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对柑橘青霉病(Penicillium italicum)和绿霉病(Penicillium digitatum)，以及对樱桃、黄桃、油桃等果实的褐腐病(Moniliniafructicola)、板栗采后黑斑病等都有良好的抑制效果。但是将枯草芽孢杆菌灭活后所得的细胞壁，其不再具备抑制效果，即使如同本发明所述对果实进行诱导(诱导时间设定为1～48小时，浓度设定为0.01％～2％)，均不具备抑制效果。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.通过诱导抗性来抑制果实采后病害的制剂，其特征是：

该制剂是由海洋红冬孢酵母细胞壁和水组成，每1L制剂中含有0.1～10g海洋红冬孢酵母细胞壁。

2.根据权利要求1所述的制剂，其特征是：每1L制剂中含有5g海洋红冬孢酵母细胞壁。

3.根据权利要求1或2所述的制剂，其特征是海洋红冬孢酵母细胞壁的制备方法为：

将海洋红冬孢酵母细胞灭活处理，得灭活酵母细胞；

取100mg灭活酵母细胞悬浮于0.4～0.6mL的0.2mol/L的磷酸缓冲液中，加入酸洗玻璃珠，于研磨机上进行研磨从而破碎细胞，然后离心，无菌水洗涤沉淀后离心，得海洋红冬孢酵母细胞壁。

4.利用如权利要求1～3任一所述的制剂进行的通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法，其特征是：在果实装箱贮藏前，先进行如下任意一种方式的预处理：

预处理方式一、

预处理方式二、

果实采摘前，将制剂喷在果实表面，然后放入容器内于密封状态下保持23～25小时；

将上述预处理后的果实从容器中取出后再装箱。

5.根据权利要求4所述的通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法，其特征是：

所述预处理方式一中，浸泡时间为8～12分钟。

6.根据权利要求4或5所述的通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法，其特征是：

所述预处理方式一和预处理方式二中的容器均为保鲜薄膜袋。