CN104286160B - 寡雄腐霉发酵液作为柑橘生物防腐保鲜剂的用途 - Google Patents

Abstract

寡雄腐霉发酵液作为柑橘生物防腐保鲜剂的用途，首先制备寡雄腐霉发酵液，然后用4000转/分离心5分钟，在上清液中加入2.5%（W/V）的食用级固体聚乙二醇，按发酵液：水体积比为1：0~2加水搅拌均匀，将柑橘果实浸泡0.5~1分钟；捞出，在遮阳通风处晾干，装框（袋）；在自然通风库、地窖库或冷库中保存柑橘果实。本发明可方便、经济、大规模生产次生代谢产物，克服活体菌剂受人为和环境因素干扰等缺点。安全、无毒、环境友好；操作方便，保鲜效果好，与自然保鲜相比，柑橘腐烂率降低80%以上。

Description

寡雄腐霉发酵液作为柑橘生物防腐保鲜剂的用途

技术领域

本发明涉及果品贮藏保鲜技术领域，特别是涉及一种寡雄腐霉发酵液作为柑橘生物防腐保鲜剂的用途。

背景技术

在柑橘采后贮藏过程中，病原微生物侵染导致烂果，发病率一般在20%左右，重则高达70%以上。目前，使用化学农药（如咪鲜胺、托布津等）抑制病原微生物繁殖生长是预防柑橘果实腐烂的主要手段。但是，残留于柑橘表皮或浸入果肉中的化学农药会引起急性或慢性中毒，导致疾病发生，危害人体健康，甚至发生致癌和遗传变异。此外，利用抗生素，如纳他霉素、克霉唑等也可抑制病原微生物生长，但长期大量使用容易导致病原菌产生抗药性，同时也存在环境和人畜安全等问题。

在欧美等发达国家，使用化学农药和抗生素对柑橘进行防腐保鲜正逐年减少，应用物理保鲜和生物制剂保鲜等日益普及，但对柑橘进行有效防腐保鲜的生物制剂不多。目前，除化学农药和抗菌素之外，制备柑橘或水果保鲜剂的方法和专利还有以下几类：①非病原微生物（如酵母菌、廉刀菌、乳酸杆菌、地衣芽孢菌、蜡样芽孢杆菌和光合菌等，主要是利用它们与病原微生物产生竞争作用，拮抗病原微生物感染）；②无机盐和乙醇等（氯化钠、氯化钙、碳酸氢钠、乙醇和有机酸等，通过改变柑橘表面的pH值和提高渗透压，抑制病原微生物生长繁殖）；③生物提取物和营养物质（如李果实提取物、藻类提取物壳聚糖、氨基酸、维生素、单（双）糖等，通过营养柑橘果皮和保持果皮健康而增强抗病性）。以上这些物质制备的柑橘保鲜剂能在一定程度上抑制病原微生物的生长繁殖，达到柑橘防腐保鲜之目的，对环境和人畜安全无害。但是，非病原微生物、无机盐和乙醇，以及生物提取物和营养物质不能有效地杀灭病原微生物，抑制病原微生物生长繁殖的能力也有限，防腐保鲜效果有待进一步提高。

寡雄腐霉菌能分泌纤维素酶、胞外溶解酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶等多种酶类，破坏病原菌的细胞壁，杀抑20多种植物病原真菌；寡雄蛋白（Oligandrin）能刺激诱导果实抗性，拮抗病原菌，降低病害的发生率；寡雄腐霉还能分泌小分子抗菌物质和生长活性物，前者能抑制病原微生物的生长繁殖，后者可促进果实伤口快速愈合，防止后续感染。目前，人们只是利用寡雄腐霉的卵孢子固体制剂田间防治植物真菌病害，至今没有用于水果采后防腐保鲜的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种寡雄腐霉发酵液作为柑橘生物防腐保鲜剂的用途。如果直接利用寡雄腐霉活体菌剂对柑橘进行防腐保鲜，其生防效果依赖于卵孢子萌发和菌丝生长，常受温度、湿度等多种自然环境或人为因素的影响，容易出现防效迟缓，稳定性欠佳的现象。利用寡雄腐霉优良菌株进行液体发酵可方便、经济、大规模生产次生代谢产物，用于柑橘防腐保鲜可减少人为和环境因素的干扰，提高防治柑橘果实病害的效果，有效地防腐保鲜。因此，本发明首先采用寡雄腐霉菌株，制备出发酵液，再进一步加工处理，用于柑橘的生物防腐保鲜。寡雄腐霉发酵液通过下列步骤制备（申请人已授权的发明专利：寡雄腐霉发酵液制备方法，专利号: ZL201210332611.7）：

（1）寡雄腐霉菌种的获得

将“多利维生．寡雄腐霉”卵孢子制剂用无菌水稀释10³~10⁵倍，改进马丁氏（Martin）琼脂培养基100°C 溶化摇匀，取5 mL培养基于25 mL试管中，121°C 蒸汽灭菌30分钟，冷却至45°C，每支试管加入16.5 mL 1%孟加拉红无菌水溶液和15 mL 1%链霉素无菌水液，摇匀，倾斜放置制备斜面；接入稀释后的寡雄腐霉卵孢子，25°C暗培养10~12天，挑选出寡雄腐霉菌丝，并用下述培养基和培养方法扩繁菌丝；

改进马丁氏（Martin）琼脂培养基：1 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄·7H₂O、5 g 蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g 酒石酸铵、1 g 琥珀酸、20 g琼脂 、1000ml水、pH5.5-6.0；

（2）寡雄腐霉发酵液的制备

（2.1）培养基：

种子罐培养基：2%玉米粉，1%葡萄糖，0.25%酒石酸铵，0.1%琥珀酸，余量为水，初始pH5.5-6.0；

二级罐培养基：同种子罐培养基；

发酵罐培养基：2%玉米粉，1.5%葡萄糖，0.5%酒石酸铵，0.2%琥珀酸，余量为水，初始pH5.5-6.0；

所述培养基组分百分比均为质量百分比；

（2.2）液体发酵：种子罐盛有121℃灭菌30min并冷却至30~35℃的种子罐培养基，在无菌操作下，将寡雄腐霉菌丝接入种子罐，在通风量为1:0.1，罐压0.05Mpa，30℃±1℃的条件下培养48小时；二级罐盛有121℃灭菌30min并冷却至30~35℃的二级罐培养基，将种子罐中的培养液转入二级罐中，在通风量为1:0.25，罐压0.05Mpa，30℃±1℃的条件下培养24小时；发酵罐盛有121℃灭菌30min并冷却至30~35℃的发酵罐培养基，将二级罐中的培养液转入到发酵罐中，在通风量为1:0.5，罐压0.05Mpa，30℃±1℃的条件下培养120~140小时；

（2.3）过滤浓缩：发酵液放入缓存罐，用板框压滤机压滤；滤液打入另一个缓存罐，真空刮板浓缩5倍，蒸发温度40~42℃，即得发酵液。

寡雄腐霉发酵液可作为柑橘生物防腐保鲜剂。但是：

发酵液含大量剩余的营养物质，细菌容易繁殖，降解有效成分，导致迅速失效。目前，常规延长发酵液保质期的方法是高温灭菌或加入抗生素，前者灭活寡雄腐霉分泌的有效成分而使保鲜剂失效，后者对人、动物、环境产生副作用，微生物也容易产生抗药性。

本发明根据聚乙二醇与许多化学物质不发生反应，并能保活有效成分，且水溶性好，大幅度提高溶液渗透压等特性，在发酵液中加入2.5%（W/V）食用级固体聚乙二醇，既保护有效成分活性，又能抑制细菌微生物繁衍，从而达到延长生物保鲜剂有效期的目标。此外，聚乙二醇成本低廉，低于高温灭菌和使用抗生素的成本，且无毒、安全、无刺激，对热、酸、碱稳定。 具体方法为：

发酵液用4000转/分离心5分钟，在上清液中加入2.5%（W/V）的食用级固体聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG），在常温（<25°C）、避光、密封条件下，有效期180天。该发酵液作为柑橘生物防腐保鲜剂的使用方法如下：

按发酵液：水体积比为 1：0~2加水（见具体实施方式），搅拌均匀，将水果浸泡0.5~1分钟；捞出，在遮阳通风处晾干，装框（袋）；在自然通风库、地窖库或冷库中（冷库保存柑橘类水果一般为3~6°C，90%-95%相对湿度）保存水果。

本发明的优点是：

可方便、经济、大规模生产次生代谢产物，克服活体菌剂受人为和环境因素干扰等缺点。此外，抗菌谱广，可抑制青霉、绿霉、炭疽、黑根霉、终极腐霉等多种造成柑橘果实腐烂的真菌病害的生长繁殖。有“一剂多防”的特性，而一种化学农药一般只针对1至几种病原菌。

安全、无毒、环境友好；操作方便，保鲜效果好，与自然保鲜相比，柑橘腐烂率降低80%以上。

具体实施方式

按前述方法制备寡雄腐霉发酵液，用4000转/分离心5分钟，在上清液中加入2.5%（W/V）的食用级固体聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG），在常温（<25°C）、避光、密封条件下保存，用于下列实验。

实施例1：

取寡雄腐霉发酵液15L，加水15 L，采集柑橘果实（品种：纽荷尔脐橙）1吨，浸泡30秒钟，晾干，装框；以1吨不浸泡保鲜剂做对照，余同保鲜剂处理。置于3~5°C，相对湿度92%～94％的冷库中，保存120天。对照烂果率23.7%，保鲜剂处理的烂果率4.1%。

实施例2：

取寡雄腐霉发酵液15L，加水30 L，采集柑橘果实（品种：奉节脐橙）1吨，浸泡60秒钟，晾干，套袋、装框；分别以1吨（1）不浸泡保鲜剂和（2）250 mg/ L咪鲜胺溶液（化学保鲜剂）浸果做对照，余同保鲜剂处理。自然通风库室温保存（5~12°C）保存90天。不浸泡保鲜剂的对照处理烂果率26.9%，咪鲜胺溶液（化学保鲜剂）处理的烂果率4.7%，寡雄腐霉发酵液处理的烂果率5.1%。

实施例3：

取寡雄腐霉发酵液30L，不加水，采集柑橘果实（品种：哈姆林甜橙）1吨，浸泡45秒钟，晾干，套袋、装框；分别以1吨（1）不浸泡保鲜剂、（2）1%酵母菌水悬液、（3）质量浓度分别为0.4%氯化钠+0.3%氯化钙+0.4%碳酸氢钠水混合液浸果做对照，余同保鲜剂处理。自然通风库室温保存（5~12°C）保存90天。不浸泡保鲜剂的烂果率为22.3%，1%酵母菌水悬液的烂果率为24.1%，0.4%氯化钠+0.3%氯化钙+0.4%碳酸氢钠水混合液的烂果率为18.7%，寡雄腐霉发酵液保鲜剂处理的烂果率为3.4%。

Claims (1)

1.寡雄腐霉发酵液作为柑橘生物防腐保鲜剂的用途，其特征在于首先制备寡雄腐霉发酵液，然后用4000转/分离心5分钟，在上清液中加入2.5%（W/V）的食用级固体聚乙二醇，按发酵液：水体积比为 1：0~2加水搅拌均匀，将柑橘果实浸泡0.5~1分钟；捞出，在遮阳通风处晾干，装框或袋；在自然通风库、地窖库或冷库中保存柑橘果实。