CN101020915A - 一种制备酵母β-葡聚糖的方法 - Google Patents

一种制备酵母β-葡聚糖的方法 Download PDF

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刘晓永
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Abstract

本发明公开了一种制备酵母β-葡聚糖的方法。该方法,包括以下步骤:1)在酵母菌体悬浮液中,加入质壁分离剂,自溶酵母细胞;2)将自溶后的酵母细胞重悬于0.02M,pH值为7.5的磷酸缓冲液中,于115-125℃,搅拌抽提5-8小时,去除可溶酵母提取物,得到酵母细胞不溶物;3)将酵母细胞不溶物用蒸馏水重悬,在50-80MPa下均质处理2-5次,以进行酵母细胞破壁处理,离心洗涤,得到酵母细胞壁;4)将酵母细胞壁在丙酮中加热回流,得到脱脂的粗β-葡聚糖;5)将粗β-葡聚糖用蛋白酶酶解,除去蛋白后,得到酵母β-D-葡聚糖。本发明的方法不会造成β-葡聚糖的降解,保持了β-D-葡聚糖天然构象,最终产品得率≥11%,纯度≥93%。

Description

一种制备酵母β-葡聚糖的方法
技术领域
本发明涉及一种制备酵母β-葡聚糖的方法。
背景技术
β-葡聚糖存在于许多细菌、真菌和高等植物中,它的一个主要来源是酿酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae)。酵母β-葡聚糖是构成酵母细胞壁的主要成分,占细胞壁干重的30-60%。酵母β-葡聚糖属于结构多糖,位于细胞壁的最内层,和原生质体膜相连接,其主要生理功能是维持细胞壁的机械结构,保持细胞正常的生理形态。一般认为酵母β-葡聚糖由β-(1→3)-葡聚糖和β-(1→6)-葡聚糖组成,两者比例为85∶15。85%的碱不溶性葡聚糖是β-1,3键连接,同时在链间穿插3%β-1,6键,有着1500聚合度线性分子,分子量相当于240KDa。其余的15%是β-1,6键连接的,有着C-3,C-6位双取代形式,呈高度分支,聚合度为140,相当于22KDa的分子量。此外,根据从酵母细胞壁中提取葡聚糖的方法不同,又可分为碱溶、酸溶和酸碱不溶三类组成,其比例为10∶3∶17。
酵母β-葡聚糖具有显著的生理功效,人们研究发现酵母β-葡聚糖可以与特异的巨噬细胞受体结合以增强机体免疫活力,还可以通过激活巨噬细胞以起到抗肿瘤、抗菌和愈合伤口的功效。此外,酵母β-D-葡聚糖还具有良好的低胆固醇和血脂的功效。
酵母β-葡聚糖因其突出的功能活性而引起人们的关注,目前国外报道的酵母β-葡聚糖的提取方法主要是采用酸碱方法,其常规的工艺为:新鲜的酵母3000rpm离心15min,去上清液。加1N NaOH溶液在100℃下,剧烈搅拌反应1h,冷却至室温,4000rpm离心15min,弃去暗红色上清液;不溶物用去离子水洗涤2遍后,加入0.75N NaOH溶液在100℃下,剧烈搅拌反应0.5h,离心洗涤,再加入0.5N磷酸溶液室温下搅拌处理3h,4000rpm离心,不溶物用去离子水洗涤至中性,然后用无水乙醇洗涤2遍,喷雾干燥得酵母β-葡聚糖。酵母β-葡聚糖制备过程中酸碱的应用具有明显的不足之处:①酸碱用量大,工艺繁琐,劳动强度大;②在酸碱的极端提取介质中,会引起酵母β-葡聚糖的降解,使其提取率降低;③酵母β-葡聚糖在酸碱的极端介质中天然构象发生变化,使其生理活性显著降低;④酸、碱等物质的使用对环境造成了严重污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备酵母β-葡聚糖的方法。
本发明所提供的制备酵母β-葡聚糖的方法,包括以下步骤:
1)在酵母菌体悬浮液中,加入质壁分离剂,自溶酵母细胞;
2)将自溶后的酵母细胞重悬于0.02M,pH值为7.5的磷酸缓冲液中,于115-125℃,搅拌抽提,去除可溶酵母提取物,得到酵母细胞不溶物;
3)将步骤2)得到的酵母细胞不溶物用蒸馏水重悬,进行均质破壁处理,离心洗涤,得到酵母细胞壁;
4)将步骤3)得到的酵母细胞壁在有机溶剂中加热回流1.5-2.5小时,得到脱脂的粗β-葡聚糖;
5)将步骤4)得到的粗β-葡聚糖用蛋白酶酶解,除去蛋白后,得到酵母β-D-葡聚糖。
所述步骤1)中,所述质壁分离剂可为乙酸乙酯或NaCl;所述质壁分离剂优选为NaCl;所述NaCl加入菌体悬浮液中的终浓度为2-4%,优选为3%;所述百分比浓度为质量百分比浓度。
所述步骤1)中,所述酵母细胞自溶的温度为50-58℃,优选为55℃;自溶时间为12-48小时,优选为24小时。
所述步骤1)中,所述酵母菌体悬浮液中酵母的重量百分比浓度可为10-20%,优选为15%;所述酵母菌体悬浮液的pH值为4.0-6.0,优选为5.0。
所述步骤2)中,所述自溶后的酵母细胞在所述磷酸缓冲液中的重量百分比浓度可为8-14%,优选为10%。
所述步骤2)中,所述搅拌抽提的温度为121℃,所述搅拌抽提的时间为5-8小时,优选为6小时。
所述步骤3)中,所述均质破壁处理的压力可为50-80MPa,优选为70MPa;所述均质破壁处理的次数可为2-5次,优选为3次。
所述步骤4)中,所述有机溶剂为丙酮、正己烷或石油醚;优选为丙酮,所述酵母细胞壁在丙酮中回流的浓度可为100-300g/L,优选为250g/L。
所述步骤5)中,为避免酸碱等极端条件,所用蛋白酶为中性蛋白酶,所述中性蛋白酶与所述粗β-葡聚糖作用的重量份数比为0.2%-0.7%;优选为0.5%;所述酶解的条件为50-58℃,pH为5.5-8.0;优选为55℃,pH为7.0。
本发明的方法,以酿酒酵母为原料,通过诱导自溶、高温抽提、均质破壁、回流脱脂和生物酶解等技术,制备酵母β-葡聚糖,相比传统酸碱分离方法,此方法不会造成β-葡聚糖的降解,保持了其天然构象,最终产品得率≥11%,纯度≥93%。本发明的方法制备的酵母β-葡聚糖可以广泛应用于食品、医药、日化和发酵等行业。
附图说明
图1为制备酵母β-葡聚糖的方法的工艺流程图
具体实施方式
下述实施例中的方法,如无特别说明,均为常规方法。
实施例1、制备酵母β-葡聚糖及其效果验证
本发明制备酵母β-葡聚糖的方法的工艺流程图如图1所示,具体步骤如下所述:
①酵母预处理
将啤酒发酵生产中的废弃物-新鲜酿酒酵母(由郑州奥克啤酒有限公司提供)1000g(细胞干重)离心收集后,重悬于去离子水中,配成质量百分含量为15%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液,用直径为125μm的筛网过滤,以除去啤酒发酵后残余啤酒花等杂质;然后用蒸馏水离心洗涤3-4遍,至上清液清澈。
②诱导自溶
将步骤①洗净的酵母用去离子水稀释成质量百分含量为15%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬浮液,用1mol/L NaOH溶液调节pH值为5.0,加入NaCl,使NaCl最终质量百分浓度为3%;然后,在55℃,120rpm搅拌下自溶24h。自溶完成后,将自溶液加热到80℃保持15min后冷却至室温,离心,用去离子水洗涤得到自溶细胞,保存于4℃。
③高温抽提
将步骤②自溶后的酵母细胞用0.02M,pH7.5的磷酸缓冲液重悬,配成质量百分含量为10%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液,于121℃,100rpm下搅拌处理6h,离心得到沉淀,将沉淀用去离子水洗涤得到酵母细胞不溶物沉淀,保存于4℃备用。
④均质破壁
将上述酵母细胞不溶物沉淀,用蒸馏水配成质量百分含量为15%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液,于均质压力70MPa条件下进行均质破壁处理3次。将破壁后的酵母细胞用0.02M,pH7.5的磷酸缓冲液离心洗涤一次,再用蒸馏水离心洗涤三次至到上清液透亮,沉淀即为酵母细胞壁,保存于4℃备用。
⑤回流脱脂
将步骤④得到的酵母细胞壁,按250(g/L)的比例与丙酮溶剂配成菌悬液,加热回流2h,离心收集沉淀,再用丙酮按1∶1(g/L)的比例洗涤一次,离心得到脱脂的粗β-葡聚糖。
⑥生物酶解去除蛋白
将步骤⑤得到的脱脂β-D-葡聚糖用0.02M,pH7.0的磷酸缓冲液配成质量百分含量为15%的悬浮液,在pH7.0,55℃条件下,加入是脱脂β-D-葡聚糖重量的0.5%中性蛋白酶(蛋白酶的名称:Protamex,为丹麦NOVO公司产品)酶解处理5小时,酶解结束后,用去离子水离心洗涤直到上清液不含可溶蛋白,沉淀即为得到湿酵母β-D-葡聚糖。
⑦喷雾干燥
湿酵母β-D-葡聚糖用蒸馏水配成质量百分含量为8%的悬浮液,用喷雾干燥机(型号:Buchi190,德国Buchi公司),在进口温度180℃,出口温度85℃的条件下,进行喷雾干燥,得到白色粉末状β-葡聚糖。
结果表明,上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖为白色粉末状,共110g,最终产品得率为11%;
按照下述方法测定各物质含量:总氮的测定采用凯氏定氮法;可溶蛋白的测定采用Lowry法;脂肪和灰分的测定采用AOAC法;总糖的测定采用苯酚-硫酸法;葡聚糖和甘露聚糖测定采用Dallies方法,测定结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖中粗蛋白的质量百分含量为2.99%,总糖质量百分含量为95.84%(其中酵母β-葡聚糖质量百分含量为93.12%),脂肪质量百分含量为0.04%,灰分质量百分含量为3.87%。在80℃进行干燥恒重测定,结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖的干燥失重为7%。
常温下,分别将1g的酵母β-葡聚糖搅拌溶于水(100mL)和二甲基亚枫(100mL)中,溶解性试验表明,上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖不溶于水,溶于二甲基亚枫(DMSO);
分别在20、30、40、50以及60℃下,将1g酵母β-葡聚糖搅拌溶于二甲基亚枫(50mL)中,离心得没有溶解的酵母β-葡聚糖干燥称重,计算溶解度。实验表明,上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖在DMSO中,溶解度随温度的升高而略有上升,20℃下溶解度为14%(w/w)。
实施例2、制备酵母β-葡聚糖及其效果验证
本发明制备酵母β-葡聚糖的方法的工艺流程图如图1所示,具体步骤如下所述:
①酵母预处理
将啤酒发酵生产中的废弃物-新鲜酿酒酵母(由郑州奥克啤酒有限公司提供)1000g(细胞干重)离心收集后,重悬于去离子水中,配成质量百分含量为15%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液,用直径为125μm的筛网过滤,以除去啤酒发酵后残余啤酒花等杂质;然后用蒸馏水离心洗涤3-4遍,至上清液清澈。
②诱导自溶
将步骤①洗净的酵母(细胞干重为1000g)用去离子水稀释成质量百分含量为20%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬浮液,用1mol/L NaOH溶液调节pH值为6.0,加入NaCl,使NaCl最终质量百分浓度为4%;然后,在58℃,120rpm搅拌下自溶48h。自溶完成后,将自溶液加热到80℃保持15min后冷却至室温,离心,用去离子水洗涤得到自溶细胞,保存于4℃。
③高温抽提
将步骤②自溶后的酵母细胞用0.02M,pH7.5的磷酸缓冲液重悬,配成质量百分含量为14%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液,于125℃,100rpm下搅拌处理8h,离心得到沉淀,将沉淀用去离子水洗涤得到酵母细胞不溶物沉淀,保存于4℃备用。
④均质破壁
将上述酵母细胞不溶物沉淀,用蒸馏水配成质量百分含量为15%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液,于均质压力80MPa条件下进行均质破壁处理5次。将破壁后的酵母细胞用0.02M,pH7.5的磷酸缓冲液离心洗涤一次,再用蒸馏水离心洗涤三次至到上清液透亮,沉淀即为酵母细胞壁,保存于4℃备用。
⑤回流脱脂
将步骤④得到的酵母细胞壁,按300g/L的比例与丙酮溶剂配成菌悬液,加热回流2.5h,离心收集沉淀,再用丙酮按1∶1(g/L)的比例洗涤一次,离心得到脱脂的粗β-葡聚糖。
⑥生物酶解去除蛋白
将步骤⑤得到的脱脂β-D-葡聚糖用0.02M,pH8.0的磷酸缓冲液配成质量百分含量为15%的悬浮液,在pH7.0,58℃条件下,加入是脱脂β-D-葡聚糖重量的0.7%的中性蛋白酶(该蛋白酶的名称:Protamex,为丹麦NOVO公司产品)酶解处理5小时,酶解结束后,用去离子水离心洗涤直到上清液不含可溶蛋白,沉淀即为得到湿酵母β-D-葡聚糖。
⑦喷雾干燥
湿酵母β-D-葡聚糖用蒸馏水配成质量百分含量为8%的悬浮液,用喷雾干燥机(型号:Buchi190,德国Buchi公司),在进口温度180℃,出口温度85℃的条件下,进行喷雾干燥,得到白色粉末状β-葡聚糖。
结果表明,上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖为白色粉末状,共93g,即最终产品得率为93%;
按照下述方法测定各物质含量:总氮的测定采用凯氏定氮法;可溶蛋白的测定采用Lowry法;脂肪和灰分的测定采用AOAC法;总糖的测定采用苯酚-硫酸法;葡聚糖和甘露聚糖测定采用Dallies方法,结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖中粗蛋白质量百分含量为4.01%,总糖质量百分含量为92.23%(其中酵母β-葡聚糖质量百分含量为90.44%),脂肪质量百分含量为0.37%(w/w),灰分质量百分含量为4.50%。在80℃进行干燥恒重测定,结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖的干燥失重为7%。
常温下,分别将1g的酵母β-葡聚糖搅拌溶于水(100mL)和二甲基亚枫(100mL)中,溶解性试验表明,上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖不溶于水,溶于二甲基亚枫(DMSO);
分别在20、30、40、50以及60℃下,将1g酵母β-葡聚糖搅拌溶于二甲基亚枫(50mL)中,离心得没有溶解的酵母β-葡聚糖干燥称重,计算溶解度。实验表明,上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖在DMSO中,溶解度随温度的升高而略有上升,20℃下溶解度为13%(w/w)。
实施例3、制备酵母β-葡聚糖及其效果验证
本发明制备酵母β-葡聚糖的方法的工艺流程图如图1所示,具体步骤如下所述:
①酵母预处理
将啤酒发酵生产中的废弃物-新鲜酿酒酵母(由郑州奥克啤酒有限公司提供)1000g(细胞干重)离心收集后,重悬于去离子水中,配成质量百分含量为15%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液,用直径为125μm的筛网过滤,以除去啤酒发酵后残余啤酒花等杂质;然后用蒸馏水离心洗涤3-4遍,至上清液清澈。
②诱导自溶
将步骤①洗净的酵母(细胞干重为1000g)用去离子水稀释成质量百分含量为10%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬浮液,用1mol/L NaOH溶液调节pH值为4.0,加入NaCl,使NaCl最终浓度为2%;然后,在50℃,120rpm搅拌下自溶12h。自溶完成后,将自溶液加热到80℃保持15min后冷却至室温,离心,用去离子水洗涤得到自溶细胞,保存于4℃。
③高温抽提
将步骤②自溶后的酵母细胞用0.02M,pH7.5的磷酸缓冲液重悬,配成质量百分含量为8%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液,,于115℃,100rpm下搅拌处理5h,离心得到沉淀,将沉淀用去离子水洗涤得到酵母细胞不溶物沉淀,保存于4℃备用。
④均质破壁
将上述酵母细胞不溶物沉淀用蒸馏水配成质量百分含量为15%(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液,于均质压力50MPa条件下进行均质破壁处理2次。将破壁后的酵母细胞用0.02M,pH7.5的磷酸缓冲液离心洗涤一次,再用蒸馏水离心洗涤三次至到上清液透亮,沉淀即为酵母细胞壁,保存于4℃备用。
⑤回流脱脂
将步骤④得到的酵母细胞壁,按100g/L(w/w)的比例与丙酮溶剂配成菌悬液,加热回流1.5h,离心收集沉淀,再用丙酮按1∶1(g/L)的比例洗涤一次,离心得到脱脂的粗β-葡聚糖。
⑥生物酶解去除蛋白
将步骤⑤得到的脱脂β-D-葡聚糖用0.02M,pH8.0的磷酸缓冲液配成质量百分含量为15%的悬浮液,在pH5.5,50℃条件下,加入是脱脂β-D-葡聚糖重量的0.2%的中性蛋白酶(蛋白酶的名称:Protamex,为丹麦NOVO公司产品)酶解处理5小时,酶解结束后,用去离子水离心洗涤直到上清液不含可溶蛋白,沉淀即为得到湿酵母β-D-葡聚糖。
⑦喷雾干燥
湿酵母β-D-葡聚糖用蒸馏水配成质量百分含量为8%的悬浮液,用喷雾干燥机(型号:Buchi190,德国Buchi公司),在进口温度180℃,出口温度85℃的条件下,进行喷雾干燥,得到白色粉末状β-葡聚糖。
结果表明,上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖为白色粉末状,共132g,即最终产品得率为13.2%;
按照下述方法测定各物质含量:总氮的测定采用凯氏定氮法;可溶蛋白的测定采用Lowry法;脂肪和灰分的测定采用AOAC法;总糖的测定采用苯酚-硫酸法;葡聚糖和甘露聚糖测定采用Dallies方法,结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖中粗蛋白质量百分含量为7.74%,总糖质量百分含量为85.51%(其中酵母β-葡聚糖质量百分含量为78.32%),脂肪质量百分含量为1.48%(w/w),灰分质量百分含量为6.03%。在80℃进行干燥恒重测定,结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖的干燥失重为8%。
常温下,分别将1g的酵母β-葡聚糖搅拌溶于水(100mL)和二甲基亚枫(100mL)中,溶解性试验表明,上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖不溶于水,溶于二甲基亚枫(DMSO);
分别在20、30、40、50以及60℃下,将1g酵母β-葡聚糖搅拌溶于二甲基亚枫(50mL)中,离心得没有溶解的酵母β-葡聚糖干燥称重,计算溶解度。实验表明,上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖在DMSO中,溶解度随温度的升高而略有上升,20℃下溶解度为16%(w/w)。

Claims (10)

1、一种制备酵母β-葡聚糖的方法,包括以下步骤:
1)在酵母菌体悬浮液中,加入质壁分离剂,自溶酵母细胞;
2)将自溶后的酵母细胞重悬于0.02M,pH值为7.5的磷酸缓冲液中,于115-125℃,搅拌抽提,去除可溶酵母提取物,得到酵母细胞不溶物;
3)将步骤2)得到的酵母细胞不溶物用蒸馏水重悬,进行均质破壁处理,离心洗涤,得到酵母细胞壁;
4)将步骤3)得到的酵母细胞壁在有机溶剂中加热回流1.5-2.5小时,得到脱脂的粗β-葡聚糖;
5)将步骤4)得到的粗β-葡聚糖用蛋白酶酶解,除去蛋白后,得到酵母β-葡聚糖。
2、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,所述质壁分离剂为乙酸乙酯或NaCl。
3、根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,所述质壁分离剂为NaCl;所述NaCl加入菌体悬浮液中的终浓度为2-4%,优选为3%;所述百分比浓度为质量百分比浓度。
4、根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,所述酵母细胞自溶的温度为50-58℃,优选为55℃;自溶时间为12-48小时,优选为24小时。
5、根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述步骤1)中,所述酵母菌体悬浮液中酵母的重量百分比浓度为10-20%,优选为15%;所述酵母菌体悬浮液的pH值为4.0-6.0。
6、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,所述自溶后的酵母细胞在所述磷酸缓冲液中的重量百分比浓度为8-14%,优选为10%。
7、根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,所述搅拌抽提的温度为121℃;所述搅拌抽提的时间5-8小时,优选为6小时。
8、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,所述均质破壁处理的压力为50-80MPa,优选为70MPa;所述均质破壁处理的次数为2-5次,优选为3次。
9、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤4)中,所述有机溶剂为丙酮、正己烷或石油醚,优选为丙酮;所述酵母细胞壁在丙酮中回流的浓度为100-300g/L,优选为250g/L。
10、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤5)中,所述蛋白酶为中性蛋白酶,所述中性蛋白酶与所述粗β-葡聚糖作用的重量份数比为0.2%-0.7%;优选为0.5%;所述酶解的温度为50-58℃,pH值为5.5-8.0;所述酶解的温度优选为55℃,pH值优选为7.0。
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