CN103044572B - 酵母β-D-葡聚糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了酵母β-D-葡聚糖的制备方法。该方法包括如下步骤：（1）将酿酒酵母加入至水中得到悬浮液a；向悬浮液a中加入NaCl，然后进行诱导自溶，再经灭酶活后进行离心，得到沉淀a；（2）向沉淀a中加入磷酸盐缓冲液a得到悬浮液b，经抽提后进行离心处理，得到沉淀b；（3）向沉淀b中加入水得到悬浮液c；将悬浮液c进行微射流均质处理，然后经离心得到沉淀c；（4）向所述沉淀c中加入磷酸盐缓冲液b得到悬浮液d；向悬浮液d中加入酶进行酶解，然后进行灭酶活处理；（5）对经步骤（4）处理后的酶解液进行微射流均质处理，然后经离心得到沉淀d；（6）沉淀d依次经脱水和干燥后即得。本发明可实现工业副产物废啤酒酵母的综合利用，增加工业副产物的利用率和附加价值，具有重大的经济效益和环保意义。

Description

酵母β-D-葡聚糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种酵母β-D-葡聚糖的制备方法。

背景技术

β-D-葡聚糖是一类广泛存在于细菌、真菌、藻类和植物体内的多糖，它的主要来源之一即为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisisae）。酵母β-D-葡聚糖占酵母细胞壁的50%左右，其分子内多羟基相互作用形成致密的三股螺旋结构，直径一般在20~80μm。酵母β-D-葡聚糖具有增强免疫力、抗消炎、抗菌、抗感染、抗病毒、抗癌、降低胆固醇、防辐射、治愈伤口等诸多生理功能，是一种良好的生物效应调节剂[BRMs]。我国有着丰富的酿酒酵母资源，如废啤酒酵母。近年来，我国啤酒工业发展迅猛，年产量已经超过4000万吨，而啤酒废酵母作为啤酒工业主要的副产物之一，年产量也已达40~70万吨，但是目前酿酒酵母的开发利用率极低，不仅浪费资源，还容易污染环境，所以亟需利用现代的科学技术加强对酿酒酵母资源的综合利用，这将具有极大的经济效益和社会效益。

现有酿酒酵母β-D-葡聚糖的制备方法主要有酸法、碱法、酸碱法、酶法、超声波法和结合法等方法。虽然制备酿酒酵母β-D-葡聚糖的方法众多，但是大多产业化规模生产受限。目前，我国广泛用于工业化生产酿酒酵母β-葡聚糖的方法主要为碱法，虽然碱法制备出的产品纯度高，但是碱法会破坏β-D-葡聚糖的结构而使得率低，且大量使用碱会污染环境和损害人体健康。采用非强酸、强碱等温和条件制备适合产业化生产高纯度酵母β-D-葡聚糖且的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种酵母β-D-葡聚糖的制备方法，该方法采用自溶、高温抽提、高压微射流均质和酶解结合由酿酒酵母制备β-D-葡聚糖，制备条件温和，不采用强酸、强碱和有机溶剂等对环境有害的试剂，且可实现产业化规模生产。

本发明所提供的一种酵母β-D-葡聚糖的制备方法，包括如下步骤：

（1）将酿酒酵母加入至水中得到悬浮液，记为悬浮液a；向所述悬浮液a中加入NaCl，然后进行诱导自溶，再经灭酶活后进行离心，得到沉淀，记为沉淀a；

（2）向所述沉淀a中加入磷酸盐缓冲液a得到悬浮液，记为悬浮液b，经抽提后进行离心处理，得到沉淀，记为沉淀b；

（3）向所述沉淀b中加入水得到悬浮液，记为悬浮液c；将所述悬浮液c进行微射流均质处理，然后经离心得到沉淀，记为沉淀c；

（4）向所述沉淀c中加入磷酸盐缓冲液b得到悬浮液，记为悬浮液d；向所述悬浮液d中加入酶进行酶解，然后进行灭酶活处理；

（5）对经步骤（4）处理后的酶解液进行微射流均质处理，然后经离心得到沉淀，记为沉淀d；

（6）所述沉淀d依次经脱水和干燥后即得到所述酵母β-D-葡聚糖。

上述的制备方法中，步骤（1）中，所述悬浮液a中所述酿酒酵母与所述水的体积份数比可为1：2~20，具体可为1：5~20、1：5或1：20；

所述悬浮液a中所述NaCl的质量百分含量可为2%~5%，具体可为3%；

所述诱导自溶的温度可为45℃~60℃，时间可为10~30小时，pH值可为4.5~5.5，具体可在pH值为5.0、温度为55℃下诱导自溶24小时；

所述灭酶活的温度可为85℃~100℃，具体可为85℃或100℃，时间可为10~20min，具体可为10~15min、10min或15min；

所述方法还包括用水洗涤所述沉淀a的步骤。

上述的制备方法中，步骤（2）中，所述悬浮液b中所述沉淀a与所述磷酸盐缓冲液a的质量份数比可为1：3~20，具体可为1：5~20、1：5或1：20；

所述抽提的温度可为80℃~120℃，时间可为2~7小时，如在95℃的条件下抽提4小时；

所述方法还包括用水洗涤所述沉淀b的步骤；

所述磷酸盐缓冲液a的浓度可为0.02mol/L，pH值可为7.5。

上述的制备方法中，步骤（3）中，所述悬浮液c中所述沉淀b与所述水的质量份数比可为1：3~20，具体可为1：4~20、1：4或1：20；

所述微射流均质处理的压力可为70~250MPa，具体可为200MPa，处理流量可为25~200mL/min，具体可为200mL/min；

所述微射流均质处理的处理次数可为1~8次；

所述方法还包括用水洗涤所述沉淀c的步骤。

上述的制备方法中，步骤（4）中，所述悬浮液d中所述沉淀c与所述磷酸盐缓冲液b的质量份数比可为1：3~20，具体可为1：3或1：20；

所述磷酸盐缓冲液b的浓度可为0.02mol/L，pH值可为6.0~8.0，如7.0。

上述的制备方法中，步骤（4）中，所述酶的添加量可为所述悬浮液d的质量的0.1%~2.5%，具体可为0.5%~1.5%、0.5%或1.5%；

所述酶解的温度可为45~65℃，具体可为50~55℃、50℃或55℃，时间可为0.1~24小时，具体可为0.4~0.5小时、0.4小时或0.5小时；

所述灭酶活处理的温度可为80℃~100℃，时间可为10~20min，具体可为80℃的条件下处理15min。

上述的制备方法中，步骤（4）中，所述酶可为木瓜蛋白酶、酵母抽提酶、中性蛋白酶和甘露聚糖酶中至少一种；

所述酶具体可选择酵母抽提酶和甘露聚糖酶，所述酵母抽提酶和甘露聚糖酶的用量均可为所述悬浮液的质量的0.5%或1.5%。

上述的制备方法中，步骤（5）中，所述微射流均质处理的压力可为70~250MPa，具体可为200MPa，处理流量可为15~200mL/min，具体可为200mL/min；

所述微射流均质处理的处理次数可为1~15次；

所述方法还包括用水洗涤所述沉淀d的步骤。

上述的制备方法中，步骤（6）中，采用质量百分含量可为50%~95%的乙醇水溶液进行脱水，如采用70%的乙醇水溶液；

所述干燥的温度可为40℃~65℃，时间可为60~180min，具体可在60℃的条件下进行干燥120min。

本发明提供的方法制备的酵母β-D-葡聚糖为乳白色粉末，其纯度可达80%，得率可达13%。

本发明提供的酵母β-D-葡聚糖的制备方法具有如下优点：

1、制备条件温和，不采用强酸、强碱、有机溶剂等对环境有害的试剂，清洁高效，环保安全；

2、采用仪器均有对应适合产业化生产的设备，可完全实现产业化规模生产；

3、本发明可实现工业副产物废啤酒酵母的综合利用，增加工业副产物的利用率和附加价值，具有重大的经济效益和环保意义。

附图说明

图1为实施例1中所用原料和各步骤所得产品的扫描电镜照片，其中工业废啤酒酵母、自溶后的酵母细胞、高温抽提后的酵母细胞、步骤（3）高压微射流处理后的物质、复合酶解后的物质和所制备的酵母β-D-葡聚糖的电镜照片分别为图1（a）、图1（b）、图1（c）、图1（d）、图1（e）和图1（f）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例每步骤的数据处理都是采用DPS软件完成。

酵母抽提酶购自广西南宁生物技术有限公司，其商品目录号为YC-3，酶活为5.5万u/g，其中酶活的测定方法为福林-酚法。

甘露聚糖酶复合酶购自北京索莱宝科技有限公司，其商品目录号为110318，酶活为50.0万u/g，其中酶活的测定方法为福林-酚法。

实施例1、酵母β-D-葡聚糖的制备

（1）自溶：以高β-D-葡聚糖含量酿酒酵母（FFLM2.0016，其保藏号为CGMCCNo.3730）为原料，用水洗涤后离心去除杂质，按体积比1：5加水配制成悬浮液，加入NaCl并使其最终浓度为3%，置于pH5.0和55℃的条件下的恒温水浴振荡器中诱导自溶24h，升温至85℃，保温15min灭酶活，离心，水洗沉淀3次；

（2）高温抽提：对步骤（1）中所得沉淀按比质量比1：5加入0.02mol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲液配制成悬浮液，于95℃的条件下恒温水浴振荡器中高温抽提4h，离心，水洗沉淀2次；

（3）高压微射流处理：对步骤（2）中所得沉淀按质量比1：4加水配制成悬浮液，采用高压微射流均质机进行均质处理，工艺条件为：压力200MPa和处理流速200mL/min下循环处理4次，离心，水洗沉淀3次；

（4）酶解：对步骤（3）中所得沉淀按质量比1：3加入0.02mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液配制成悬浮液，加入酵母抽提酶和甘露聚糖酶复合酶，酶添加量均为悬浮液质量的0.5%，于55℃的恒温水浴振荡器中复合酶解0.5h，升温至85℃，保温15min进行灭酶活处理；

（5）高压微射流处理：将步骤（4）中的酶解液冷却至室温，再次进行高压微射流处理，工艺条件为：200MPa和处理流速200mL/min下循环处理12次，离心，水洗沉淀2次；

（6）干燥：将步骤（5）中所得沉淀用质量百分含量为70%的乙醇水溶液脱水后，置于鼓风干燥箱中烘干，条件为：65℃下干燥120min，粉碎即得到酵母β-D-葡聚糖。

本实施例制备的酵母β-D-葡聚糖为乳白色粉末。

本实施例中，所用原料和各步骤所得产品的成分分析如表1所示，酵母β-D-葡聚糖含量为81.07±0.82%，总糖含量为91.60±1.51%，得率为14.73%。

表1中，酵母β-D-葡聚糖含量的测定方法如下：取产物10mg左右放入具塞试管中，加入1.5ml72%的硫酸中，混匀，室温静置3小时；然后加入去离子水使硫酸终浓度为2mol／L，封管，于100℃条件下酸水解4h后用NaOH中和，GOPOD双酶法测定葡萄糖含量，乘以校正因子0.9即得β-D-葡聚糖含量。

表1中，总糖含量采用苯酚-硫酸法进行测定的，总氮含量采用GB5009.5-2010进行测定的。

本实施例中，所用原料和各步骤所得产品的扫描电镜照片分别如图1（a）、图1（b）、图1（c）、图1（d）、图1（e）和图1（f）所示，由该图可得知，新鲜酿酒酵母细胞图1（a）呈典型的椭圆形外形，表面光滑，诱导自溶后图1（b），由于细胞内容物溶出，细胞椭圆形外形部分被破坏，经高温抽提处理图1（c），部分酵母细胞壁已被破坏，呈透明的糊状物质附着于未破壁酵母表面，但仍有酵母细胞未破壁，与已破壁的透明糊状物质形成鲜明的对比。第一次微射流处理后图1（d），酵母细胞已基本完全破壁，且由于微射流的机械性破坏作用，酵母细胞壁部分被破坏成碎片，复合酶解后图1（e）的物质已无完整的细胞结构，细胞壁呈扁平的透明状物质，第二次微射流处理后图1（f）的β-D-葡聚糖表面粗糙、扁平，无立体结构，与新鲜酵母细胞形成了鲜明的对比。

表1实施例1制备过程中每步处理后产物的成分分析

实施例2、酵母β-D-葡聚糖的制备

（1）自溶：以高β-D-葡聚糖含量酿酒酵母（FFLM2.0016，其保藏号为CGMCCNo.3730）为原料，用水洗涤后离心去除杂质，按体积比1：20加水配制成悬浮液，加入NaCl并使其最终浓度为3%，置于pH5.0和55℃的条件下的恒温水浴振荡器中诱导自溶24h，升温至100℃，保温10min灭酶活，离心，水洗沉淀3次；

（2）高温抽提：对步骤（1）中所得沉淀按比质量比1：20加入0.02mol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲液配制成悬浮液，于95℃的条件下恒温水浴振荡器中高温抽提4h，离心，水洗沉淀2次；

（3）高压微射流处理：对步骤（2）中所得沉淀按质量比1：20加水配制成悬浮液，采用高压微射流均质机进行均质处理，工艺条件为：压力200MPa和处理流速200mL/min下循环处理3次，离心，水洗沉淀3次；

（4）酶解：对步骤（3）中所得沉淀按质量比1：20加入0.02mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液配制成悬浮液，加入酵母抽提酶和甘露聚糖酶复合酶，酶添加量均为悬浮液质量的1.5%，于50℃的恒温水浴振荡器中复合酶解0.4h，升温至85℃，保温15min进行灭酶活处理，离心，水洗沉淀2次；；

（5）高压微射流处理：将步骤（4）中的酶解液冷却至室温，再次进行高压微射流处理，工艺条件为：200MPa和处理流速200mL/min下循环处理12次，离心，水洗沉淀2次；

（5）干燥：将步骤（5）中所得沉淀用质量百分含量为70%的乙醇水溶液脱水后，置于鼓风干燥箱中烘干，条件为：65℃下干燥120min，粉碎即得到酵母β-D-葡聚糖。

本实施例制备的酵母β-D-葡聚糖为乳白色粉末，酵母β-D-葡聚糖含量为65%，得率为18%。

Claims (1)

1.酵母β-D-葡聚糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将酿酒酵母加入至水中得到悬浮液，记为悬浮液a；向所述悬浮液a中加入NaCl，然后进行诱导自溶，再经灭酶活后进行离心，得到沉淀，记为沉淀a，用水洗涤所述沉淀a；

(2)向所述沉淀a中加入磷酸盐缓冲液a得到悬浮液，记为悬浮液b，经抽提后进行离心处理，得到沉淀，记为沉淀b，用水洗涤所述沉淀b；

(3)向所述沉淀b中加入水得到悬浮液，记为悬浮液c；将所述悬浮液c进行微射流均质处理，然后经离心得到沉淀，记为沉淀c，用水洗涤所述沉淀c；

(4)向所述沉淀c中加入磷酸盐缓冲液b得到悬浮液，记为悬浮液d；向所述悬浮液d中加入酶进行酶解，然后进行灭酶活处理；

(5)对经步骤(4)处理后的酶解液进行微射流均质处理，然后经离心得到沉淀，记为沉淀d，用水洗涤所述沉淀d；

(6)所述沉淀d依次经脱水和干燥后即得到所述酵母β-D-葡聚糖；

步骤(1)中，所述悬浮液a中所述酿酒酵母与所述水的体积比为1∶5；

所述悬浮液a中所述NaCl的质量百分含量为3％；

所述诱导自溶的温度为55℃，时间为24小时，pH值为5.0；

所述灭酶活的温度为85℃，时间为15min；

步骤(2)中，所述悬浮液b中所述沉淀a与所述磷酸盐缓冲液a的质量份数比为1∶5；

所述抽提的温度为95℃，时间为4小时；

所述磷酸盐缓冲液a的浓度为0.02mol/L，pH值为7.5；

步骤(3)中，所述悬浮液c中所述沉淀b与所述水的质量份数比为1∶4；

所述微射流均质处理的压力为200MPa，处理流量为200mL/min；

所述微射流均质处理的处理次数为4次；

步骤(4)中，所述酶为酵母抽提酶和甘露聚糖酶中至少一种；

所述酶的添加量为所述悬浮液d的质量的0.5％；

所述酶解的温度为55℃，时间为0.5小时；

所述灭酶活处理的温度为85℃，时间为15min；

所述悬浮液d中所述沉淀c与所述磷酸盐缓冲液b的质量份数比为1∶3；

所述磷酸盐缓冲液b的浓度为0.02mol/L，pH值为7.0；

步骤(5)中，所述微射流均质处理的压力为200MPa，处理流量为200mL/min；

所述微射流均质处理的处理次数为12次；

步骤(6)中，采用质量百分含量为70％的乙醇水溶液进行脱水；

所述干燥的温度为65℃，时间为120min。