CN101412972A - 用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途 - Google Patents

用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途。从中国东海近海海域的海水中筛选出海洋酵母菌株Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman。该海洋酵母的菌落为粉红色，表面光滑，在添加有1～2％NaCl的培养基中生长。利用一定浓度的该酵母细胞悬浮液可以有效抑制链格孢、灰葡萄孢、扩展青霉、指状青霉、多毛孢等多种果蔬采后主要真菌病害的发生。海洋酵母菌株Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman在国内外均是首次用于微生物防治果蔬采后病害。该菌株具有防止腐烂、控制氧化变色和软化变味的多种功能，配制和使用方便，不产生抗生素，不污染环境，安全无毒，市场前景广阔。同时，也有利于我国优质果蔬产品的出口创汇，经济效益和社会效益十分显著。

Description

用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物防治领域，尤其涉及一种用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途。
背景技术
近20年来，中国果蔬行业得到飞速发展，取得巨大成就，已成为世界上最大的果蔬原料生产国。2004年，我国果品总产量(含果用瓜类)达15000万吨，蔬菜总产量突破54900万吨，果蔬总产值超过4000亿元，已经成为广大农民的主要经济来源之一[1]。我国果蔬品种繁多，而且许多果蔬品质优良，风味独特，极具市场竞争力。但是很多优质果蔬受到产地的限制，无法进入高级市场，出口售价也很低。主要原因是贮藏技术不够发达，致使果蔬产品的采后品质下降、腐烂严重，平均年损失率达35％，个别地区和品种更是高达50％。
果蔬采后腐烂大多由真菌引起[2]，目前常规的方法是冷链技术结合化学杀菌剂，但是冷链技术不仅成本高，而且低温只能抑制病原菌，不能根除，还会导致热带和亚热带果蔬的冷害；冷害以上的温度则不能有效地控制微生物的活动，腐烂相当严重。化学杀菌剂虽然可以有效的抑制病原菌的生长，但是长期高浓度的频繁使用化学杀菌剂会使病原菌产生抗性，并且造成果蔬上农药残留的增加。随着人们对居住环境和生活健康等要求的日益提高，利用微生物代替化学杀菌剂防治果蔬腐烂，安全性高、污染少，近年来迅速得到发展。
细菌、霉菌、酵母菌均可作为拮抗微生物来防治果蔬采后病害。国内外的研究者已经利用微生物在对柑橘、苹果、梨、桃子、草莓和樱桃等多种水果的采后病害生物防治中取得了多方面的进展[3-7]。其中，酵母菌株由于具有拮抗效果好、不产生毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点而成为果蔬采后生物防治研究的热点。但是由于水果表面菌种资源有限，目前90％以上关于酵母菌株的研究集中在罗伦隐球酵母和季也蒙毕赤酵母等极少数从果实表面分离的酵母菌株上，这类酵母菌株与化学杀菌剂相比效果不稳定，生产成本高，这使得微生物杀菌剂的发展遭遇到了瓶颈。
海洋酵母是生活在海水中酵母的通称，是酵母家族的一个生态类群，广泛分布于各种自然海域中。海洋酵母除耐盐性外，其生物学性质和细胞的组成成分与陆生酵母基本相同。海洋酵母非常适合于工业化大规模生产，技术成熟，生产稳定.产量高，周期短。尤其是海洋酵母的活细胞可以低温下长期贮存，非常适合向市场推广。
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发明内容
本发明的目的是提供一种用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途。
用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母(Rhodosporidium paludigenum Fell& Tallman)，在英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心保藏，保藏号为SD 225，菌落为粉红色，表面光滑，在添加有1～2％NaCl的NYDB培养基中生长，当NaCl浓度达到16％时，酵母停止生长。
用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母的制备方法步骤如下：
1)从中国舟山，青岛海区的近海海域采取海水样品，稀释，吸取0.1～0.2mL稀释的海水样品均匀涂布在含有1～2％NaCl的NYDA培养基的平板上，倒置于培养箱内，恒温26～28℃培养3～4天，用接种环挑出培养特征相异的单菌落进行平皿划线纯化，镜检确认为酵母后，接入NYDA培养基斜面中进行培养保存；
2)把斜面保存的酵母菌接种到装有已经灭菌的35～70mLNYDB培养基的250mL的三角瓶中，恒温26～28℃下150～200转/分钟培养18～30小时，发酵液2000～3000转/分钟下离心5～10分钟收集菌体，并用无菌水洗涤酵母菌体两次，用血球计数板计数并调整成浓度为106～109CFU/mL的酵母菌细胞悬浮液；将链格孢、扩展青霉、指状青霉、灰葡萄孢、多毛孢在26～28℃下培养7～14天，刮取适量孢子，转移到含有0.05％Tween80的无菌水中，用血球计数板计数并调整浓度至5×104个/mL，待用；
3)挑选成熟果实浸入含有0.05％的次氯酸钠溶液的自来水中消毒15秒～45秒，再冲洗，晾干；用灭菌的打孔器在每个果实的腰部制造5mm×2mm的伤口，先接种20～40μl拮抗菌菌悬液，2～4小时后，再接种10～20μl病原菌孢子悬浮液；将果实至于塑料盒中，外套塑料袋以保持湿度；处理果实贮于20～25℃下4～6天后观察酵母菌对果实采后病原菌的抑制率；
4)根据分离的酵母菌对各种病原菌的抑制率，筛选出一株对链格孢，扩展青霉、指状青霉、灰葡萄孢、多毛孢均有显著抑制效果的海洋酵母，经英国国际微生物研究所(CABI Bioscience Identification Services)鉴定为Rhodosporidiumpaludigenum Fell & Tallman。
所述的菌株发酵培养基NYDB组成如下：牛肉膏6～8g/L、酵母粉4～5g/L、葡萄糖8～10g/L、氯化钠10～20g/L；
菌株保存培养基NYDA组成如下：牛肉膏6～8g/L、酵母粉4～5g/L、葡萄糖8～10g/L、氯化钠10～20g/L，琼脂10～20g/L。
用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母用于防治果蔬采后由链格孢，扩展青霉、指状青霉、灰葡萄孢、多毛孢等真菌造成的腐烂。
海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman在国内外均是首次用于微生物防治。该菌株从海水中分离，通过观察果实腐烂抑制效果筛选得到。Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman在含有1～2％NaCl的NYDB培养基中生长良好，单独使用一定浓度的该酵母细胞悬浮液能有效降低多种果蔬采后真菌病害的发生率。此法成本低，不污染环境，市场前景广阔。同时，也有利于我国优质果蔬产品的出口创汇，经济效益和社会效益十分显著。
附图说明
图1室温下本发明的海洋酵母菌株R.paludigenum Fell & Tallman对樱桃番茄果实采后链格孢和灰葡萄孢病害的防治效果柱状图；
图2是室温下本发明的海洋酵母菌株R.paludigenum Fell & Tallman对碰柑果实采后青霉病害的防治效果柱状图；
图3是室温下本发明的海洋酵母菌株R.paludigenum Fell & Tallman对柿子果实采后多毛孢病害的防治效果柱状图；
图4是室温下本发明的海洋酵母菌株R.paludigenum Fell & Tallman对樱桃番茄果实腐烂的防治效果柱状图；
图5是室温下本发明的海洋酵母菌株R.paludigenum Fell & Tallman对樱桃番茄贮藏外观的效果折线图；
图6是室温下本发明的海洋酵母菌株R.paludigenum Fell & Tallman对樱桃番茄贮藏口感的效果折线图。
具体实施方式
实施例1
1)从中国舟山，青岛海区的近海海域采取几十种海水样品，稀释不同倍数，从各稀释浓度的海水样品中分别吸取0.1mL均匀涂布在NaCL浓度为2％的NYDA培养基平板上，倒置于培养箱内，恒温28℃培养3天，用接种环挑出培养特征相异的单菌落进行平皿划线纯化，镜检确认为酵母后，接入NYDA培养基斜面中进行培养保存。
2)把斜面保存的酵母菌接种到装有已经灭菌的70mLNYDB培养基的250mL的三角瓶中，恒温28℃下150转/分钟培养18小时，2000转/分钟下离心10分钟收集菌体，并用无菌水洗涤酵母菌体两次，用血球计数板计数并调制成浓度为106CFU/mL的酵母菌悬液。将扩展青霉(Pencillium expansum)、指状青霉(Penicillium digitatum)在28℃下培养7天，刮取适量孢子，转移到含有0.05％Tween80的无菌水中，用血球计数板计数并调整浓度至5×104个/mL，待用。
3)本实施例以碰柑为试验材料。果实来源于浙江黄岩果园。挑选出成熟果实浸入含有0.05％的次氯酸钠溶液的自来水中消毒30秒，再冲洗，晾干。用灭菌的打孔器在每个果实的腰部制造5mm×2mm的伤口，先接种40μl酵母细胞悬浮液，2小时后，再接种20μl病原菌孢子悬浮液。将果实至于塑料盒中，外套塑料袋以保持湿度。处理果实贮于20℃下4天后观察酵母对果实腐烂的抑制率。
4)筛选出一株对碰柑指状青霉，扩展青霉均有显著抑制效果的酵母，经英国国际微生物研究所(CABI Microbial Identification Service)鉴定为Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman。
实施例2
1)从中国舟山，青岛海区的近海海域采取海水样品，稀释，吸取0.2mL稀释的海水样品均匀涂布在含有2％NaCl的NYDA培养基的平板上，倒置于培养箱内，恒温26℃培养4天，用接种环挑出培养特征相异的单菌落进行平皿划线纯化，镜检确认为酵母后，接入NYDA培养基斜面中进行培养保存；
2)把斜面保存的酵母菌接种到装有已经灭菌的35mLNYDB培养基的250mL的三角瓶中，恒温26℃下200转/分钟培养30小时，发酵液3000转/分钟下离心5分钟收集菌体，并用无菌水洗涤酵母菌体两次，用血球计数板计数并调制成浓度为109CFU/mL的酵母细胞悬浮液；将链格孢(Alternaria alternata)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)在26℃下培养14天，刮取适量孢子，转移到含有0.05％Tween80的无菌水中，用血球计数板计数并调整浓度至5×104个/mL，待用；
3)本实施例以樱桃番茄为试验材料。果实来源于杭州郊区果园。挑选成熟果实浸入含有0.05％次氯酸钠溶液的自来水中消毒15秒，再冲洗，晾干；用灭菌的打孔器在每个果实的腰部制造5mm×2mm的伤口，先接种20μl拮抗菌菌悬液，4小时后，再接种10μl病原菌孢子悬浮液；将果实至于塑料盒中，外套塑料袋以保持湿度；处理果实贮于25℃下4天后观察酵母对果实采后病原菌的抑制率，；
4)根据分离的酵母对不同果实采后病原菌的抑制率，筛选出一株对链格孢、灰葡萄孢均有显著抑制效果的海洋酵母，经英国国际微生物研究所(CABIBioscience Identification Services)鉴定为Rhodosporidium paludigenum Fell &Tallman。
本发明制备的海洋酵母有如下特征：
1)形态特征：
红冬孢酵母菌株，分类命名为Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman，已于2006年4月19日保藏在英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心，地址：英国TW20 9TY萨里郡艾格镇贝克汉姆路国际农业与生物中心英国中心。保藏编号为SD 225。
2)培养特性
对R.paludigenum Fell & Tallman进行耐盐性试验发现，该菌株在NYDB培养基NaCl浓度达到2％时生长最好，与从果实表面分离的拮抗酵母罗伦隐球酵母和粘红酵母相比，该菌株具有更高的耐盐性。当NaCl浓度达到16％时，该菌株菌体生长才完全受到抑制。这也证实了R.paludigenum Fell & Tallman是一株来自于海洋的酵母。
实施例3
室温下本发明的海洋酵母菌株R.paludigenum Fell & Tallman对樱桃番茄果实采后链格孢和灰葡萄孢病害的防治效果
1)酵母细胞悬浮液的配置
将保藏培养基菌种活化后接种到装有已经灭菌的35ml培养基的250ml的三角瓶中，在26℃下150转/分钟培养30小时左右，2000转/分钟下离心10分钟收集菌体，并用无菌水洗涤酵母菌体，用血球计数板计数，调节细胞悬浮液浓度为108CFU/mL的酵母细胞悬浮液。
2)本实施例以樱桃番茄为试验材料。果实来源于杭州郊区果园。
病原菌：链格孢(Alternaria alternata)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)
樱桃番茄果实刺伤后接种酵母细胞悬浮液。接种量20μl为。2小时后，接种10μl浓度为5×104个/mL的病原菌孢子悬浮液。果实处理后20℃下入库贮藏6天，观察其发病率。
R.paludigenum Fell & Tallman菌株对樱桃番茄果实采后链格孢病害和灰葡萄孢病害的防治效果如图1所示，酵母细胞悬浮液浓度为108CFU/mL时可以显著抑制樱桃番茄采后链格孢病害和灰葡萄孢病害的发生。
实施例4
室温下本发明的海洋酵母菌株R.paludigenum Fell & Tallman对碰柑果实采后青霉病害的防治效果
1)酵母细胞悬浮液的配置
将保藏培养基菌种活化后接种到装有已经灭菌的70ml的NYDB培养基的250ml的三角瓶中，在28℃下200转/分钟培养18小时，3000转/分钟下离心5分钟收集菌体，并用无菌水洗涤酵母菌体，用血球计数板计数，调节细胞悬浮液浓度为106-109CFU/mL的酵母细胞悬浮液。
2)本实施例以碰柑为试验材料。果实来源于浙江黄岩果园。
病原菌：指状青霉(Penicillium digitatum)
樱桃番茄果实刺伤后分别接种不同浓度的酵母细胞悬浮液。接种量40μl为。4小时后，接种20μl浓度为5×104个/mL的指状青霉孢子悬浮液。果实处理后25℃下入库贮藏4天，观察其发病率。
R.paludigenum Fell & Tallman菌株对碰柑果实采后青霉病害的防治效果如图2所示，各个浓度的酵母细胞悬浮液对樱桃番茄采后链格孢病害均有显著的防治效果，浓度越高效果越好。
实施例5
室温下本发明的海洋酵母菌株R.paludigenum Fell & Tallman对柿子果实采后多毛孢病害的防治效果
1)海洋酵母细胞悬浮液的配置
将保藏培养基菌种活化后接种到装有已经灭菌的50ml培养基的250ml的三角瓶中，在27℃下180转/分钟培养24小时左右，2500转/分钟下离心7分钟收集菌体，并用无菌水洗涤酵母菌体，用血球计数板计数，调节细胞悬浮液浓度为10HCFU/mL的酵母细胞悬浮液。
2)本实施例以柿子为试验材料。果实来源于浙江淳安果园。
病原菌：多毛孢(Pestalotia diospyr)
柿子果实刺伤后接种酵母细胞悬浮液。接种量30μl为。3小时后，接种15μl浓度为的链格孢孢子悬浮液。果实处理后22℃下入库贮藏5天，观察其发病率。
R.paludigenum Fell & Tallman菌株对柿子果实采后多毛孢病害的防治效果如图3所示，酵母细胞悬浮液浓度为108CFU/mL时可以显著抑制柿子多毛孢病害的发生。
实施例6
室温下本发明的海洋酵母菌株R.paludigenum Fell & Tallman对樱桃番茄果实腐烂的防治效果
1)酵母细胞悬浮液的配置
将保藏培养基菌种活化后接种到装有已经灭菌的50mlNYDB培养基的250ml的三角瓶中，在28℃下200转/分钟培养20小时，2800转/分钟下离心6分钟收集菌体，并用无菌水洗涤酵母菌体，用血球计数板计数，调节细胞悬浮液浓度为108CFU/mL的酵母细胞悬浮液。
2)本实施例以樱桃番茄为试验材料。果实来源于杭州郊区果园。
将完整无损的果实置于酵母细胞悬浮液中，浸泡30秒，捞出晾干，在20℃下入库贮藏25天，观察其发病率并测定其品质指标。
R.paludigenum Fell & Tallman菌株对樱桃番茄果实腐烂率的防治效果如图4所示，好果率达到75％以上，没有采用酵母细胞悬浮液处理的樱桃番茄好果率仅为30％。如图5、6所示，经R.paludigenum Fell & Tallman处理的果实仍基本保持新鲜果实的艳丽色泽，果实的硬度和风味基本不变，
因此，本发明的酵母拮抗菌具有防止腐烂、控制氧化变色和软化变味的多种功能，配制和使用方便，安全无毒，对多种果蔬均有明显的保鲜效果，是一株及具潜力的新的生物防治菌株。

Claims (5)

1.一种用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母(Rhodosporidiumpaludigenum Fell & Tallman)，其特征在于：在英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心保藏，保藏号为SD 225，菌落为粉红色，表面光滑，在添加有1～2％NaCl的NYDB培养基中生长，当NaCl浓度达到16％时，酵母停止生长。
2.一种如权利要求1所述用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)从中国舟山，青岛海区的近海海域采取海水样品，稀释，吸取0.1～0.2mL稀释的海水样品均匀涂布在含有1～2％NaCl的NYDA培养基的平板上，倒置于培养箱内，恒温26～28℃培养3～4天，用接种环挑出培养特征相异的单菌落进行平皿划线纯化，镜检确认为酵母后，接入NYDA培养基斜面中进行培养保存；
2)把斜面保存的酵母菌接种到装有已经灭菌的35～70mLNYDB培养基的250mL的三角瓶中，恒温26～28℃下150～200转/分钟培养18～30小时，发酵液2000～3000转/分钟下离心5～10分钟收集菌体，并用无菌水洗涤酵母菌体两次，用血球计数板计数并调整成浓度为106～109CFU/mL的酵母菌细胞悬浮液；将链格孢、扩展青霉、指状青霉、灰葡萄孢、多毛孢在26～28℃下培养7～14天，刮取适量孢子，转移到含有0.05％Tween80的无菌水中，用血球计数板计数并调整浓度至5×104个/mL，待用；
3)挑选成熟果实浸入含有0.05％的次氯酸钠溶液的自来水中消毒15秒～45秒，再冲洗，晾干；用灭菌的打孔器在每个果实的腰部制造5mm×2mm的伤口，先接种20～40μl拮抗菌菌悬液，2～4小时后，再接种10～20μl病原菌孢子悬浮液；将果实至于塑料盒中，外套塑料袋以保持湿度；处理果实贮于20～25℃下4～6天后观察酵母菌对果实采后病原菌的抑制率；
4)根据分离的酵母菌对各种病原菌的抑制率，筛选出一株对链格孢，扩展青霉、指状青霉、灰葡萄孢、多毛孢均有显著抑制效果的海洋酵母，经英国国际微生物研究所(CABI Bioscience Identification Services)鉴定为Rhodosporidiumpaludigenum Fell & Tallman。
3.根据权利要求2所述一种用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母的制备方法，其特征在于：所述的菌株发酵培养基NYDB组成如下：牛肉膏6～8g/L、酵母粉4～5g/L、葡萄糖8～10g/L、氯化钠10～20g/L；
4.根据权利要求2所述一种用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母的制备方法，其特征在于：所述的菌株保存培养基NYDA组成如下：牛肉膏6～8g/L、酵母粉4～5g/L、葡萄糖8～10g/L、氯化钠10～20g/L，琼脂10～20g/L。
5.一种如权利要求1所述用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母的用途，其特征在于：它用于防治果蔬采后由链格孢，扩展青霉、指状青霉、灰葡萄孢、多毛孢等真菌造成的腐烂。
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