CN109456917B - 降解棒曲霉素的tt-09细菌及其应用 - Google Patents

降解棒曲霉素的tt-09细菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了降解棒曲霉素的TT‑09细菌及其应用。本发明提供了肠杆菌(Enterobacter sp.)TT‑09，其保藏号为CGMCC NO.16574。本发明还提供了肠杆菌(Enterobacter sp.)TT‑09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在降解棒曲霉素中的应用。本发明的实验证明，本发明发现一株细菌TT‑09，其具有棒曲霉素降解的作用，且降解效率高、特异性强，该细菌菌株培养容易，繁殖速度快，易于制备，为研究棒曲霉素降解技术奠定基础。

Description

降解棒曲霉素的TT-09细菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种降解棒曲霉素的TT-09细菌及其应用。
背景技术
棒曲霉素(patulin)，也叫展青霉素，是一种有毒的真菌次生代谢产物。苹果等果品被扩展青霉等病原真菌侵染后会产生严重的棒曲霉素污染，它会随着水果及其加工产品进入食品流通，威胁人体健康。因此，亟需研发有效的毒素污染控制技术。目前，已有的棒曲霉素脱除技术大都依托物理(如树脂吸附、超声波破碎、射线辐照等)或化学(如氧化剂、巯基类化学剂等)原理。物理处理虽然操作简单，但会影响食品的营养价值；化学试剂脱除效果较好，但极易产生二次污染。
发明内容
本发明的一个目的是提供肠杆菌(Enterobacter sp.)TT-09。
本发明提供的肠杆菌(Enterobacter sp.)TT-09，其保藏号为CGMCC NO.16574。
上述的肠杆菌(Enterobacter sp.)TT-09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在降解棒曲霉素中的应用。
本发明另一个目的是提供一种降解棒曲霉素的方法。
本发明提供的方法，为用上述的肠杆菌(Enterobacter sp.)TT-09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物作用棒曲霉素，实现降解棒曲霉素。
上述方法中，所述用上述的肠杆菌(Enterobacter sp.)TT-09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物作用棒曲霉素为将上述的肠杆菌(Enterobacter sp.)TT-09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物与棒曲霉素共培养。
上述方法中，所述共培养的体系为pH值为4的缓冲液或pH值为7的缓冲液或苹果汁。
上述方法中，所述棒曲霉素在共培养体系中的浓度为大于0。
上述方法中，所述棒曲霉素在共培养体系中的浓度为具体为0-500ppm，且不为0。
上述方法中，所述肠杆菌(Enterobacter sp.)TT-09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物均为活菌或活菌培养液或活菌悬液或活菌发酵产物。
本发明的实验证明，本发明发现一株细菌TT-09，其具有棒曲霉素降解的作用，且降解效率高、特异性强，该细菌菌株培养容易，繁殖速度快，易于制备，为研究棒曲霉素降解技术奠定基础。
保藏说明
菌种名称：TT-09
拉丁名：Enterobacter sp.
分类命名:肠杆菌
菌株编号：16574
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年10月12日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.16574
附图说明
图1为TT-09细菌在100倍镜下的显微检测结果。
图2为不同反应体系中TT-09细菌降解棒曲霉素检测结果。
图3为不同棒曲霉素含量下TT-09细菌的生长情况检测结果。
图4为活性TT-09细菌的降解棒曲霉的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
棒曲霉素(Macklin，P816488)。
实施例1、降解棒曲霉素的细菌TT-09的分离鉴定
1、降解棒曲霉素的细菌TT-09的分离
在一个多年种植苹果的果园中有意识地选择地表烂苹果较多的土壤进行取样，取回的土样用无菌水洗涤，沉淀完全后取土壤浸出液进行梯度稀释，并涂布到含有200ppm棒曲霉素的平板培养基上进行筛选，对筛选到的菌株进行棒曲霉素降解能力检测，发现其中一株细菌(TT-09)对棒曲霉素具有较好的降解能力。
对TT-09细菌进行连续的平板划线，直至培养出单个细菌菌落。
2、降解棒曲霉素的细菌TT-09的鉴定
1)形态
将上述1分离得到的TT-09细菌在100倍镜下的显微检测。
结果如图1所示，左图为TT-09细菌在固体LB平板上的菌落形态，菌落呈淡黄色，表面光滑，略带黏稠；右图为TT-09细菌在100倍普通光学显微镜下的显微形态，可以看出，该菌在100倍显微镜下呈粗短杆状。
2)分子鉴定
将TT-09细菌进行16s rDNA鉴定，该株细菌的16s rDNA序列为序列表中序列1。将其与Genbank序列进行比对，发现，其与肠杆菌属的大多数细菌相似度极高，因此判定该株细菌为肠杆菌属细菌(Enterobacter sp.)。
将TT-09细菌于2018年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16574，分类命名为肠杆菌。
实施例2、TT-09细菌在降解棒曲霉素中的应用
一、不同反应体系中TT-09细菌降解棒曲霉素
TT-09菌体获得：将TT-09细菌过夜活化后按照体积比1:100的比例转接至20ml的LB(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L)培养基中，于25℃、200rpm的摇床中继续培养至细菌OD600达到0.6(3×108cfu/ml)，离心并去除上清，收集沉淀即为TT-09菌体。
含有TT-09细菌的pH＝4的MES缓冲液体系制备：将上述TT-09菌体重悬于6ml pH＝4的50mM的MES缓冲液(9.76g MES溶于1L蒸馏水中，用NaOH调节pH至4)中，得到含有TT-09细菌的pH＝4的MES缓冲液体系，其中，TT-09细菌的浓度为1×109cfu/ml。
含有TT-09细菌的pH＝7MES缓冲液体系制备：将上述TT-09菌体重悬于pH＝7的50mM MES缓冲液(9.76g MES溶于1L蒸馏水中，用NaOH调节pH至7)中，得到含有TT-09细菌的pH＝7的MES缓冲液体系，其中，TT-09细菌的浓度为1×109cfu/ml。
含有TT-09细菌的汇源苹果汁体系制备：将上述TT-09菌体重悬于市售汇源苹果汁(软盒包装200ml/盒)中，得到含有TT-09细菌的汇源苹果汁体系，其中，TT-09细菌的浓度为1×109cfu/ml。
pH＝4MES缓冲液组：将上述0.5ml含有TT-09细菌的pH＝4 50mM MES缓冲液体系与25μg棒曲霉素混匀,形成500μl的反应体系(TT-09细菌与棒曲霉素的配比为2×107cfu:1μg)，25度共培养72h；
pH＝7MES缓冲液组：将上述0.5ml含有TT-09细菌的pH＝7 50mM MES缓冲液体系与25μg棒曲霉素混匀，形成500μl的反应体系(TT-09细菌与棒曲霉素的配比为2×107cfu:1μg)，25度共培养72h；
汇源苹果汁组：将上述0.5ml含有TT-09细菌的汇源苹果汁体系与25μg棒曲霉素混匀,形成500μl的反应体系(TT-09细菌与棒曲霉素的配比为2×107cfu:1μg)，25度共培养72h；
各自实验组对应的CK组：分别在0.5ml pH＝4 50mM MES缓冲液、0.5ml pH＝750mM MES缓冲液以及0.5ml汇源苹果汁中添加25μg棒曲霉素，形成500μl的反应体系，混匀后作为对照组与实验组一起培养。
收集上述各组的培养产物，通过高效液相色谱法(HPLC)检测各组中棒曲霉素含量。采用的色谱仪为美国Waters公司高效液相色谱仪，配备有自动进样器(Waters2498)，双向HPLC泵(Waters 1525)，紫外检测器(Waters 2487)；所用色谱柱为岛津ODS反相柱(C18柱，5μm，250×4.6mm)；检测时，流动相为乙腈∶水＝10∶90(v/v)，流速1.0mL/min，所用柱温、检测波长、进样量分别为25℃、276nm、10μL。
样品反应结束后，用0.22μm的滤膜过滤，取200μl反应液于液相小瓶中，进行HPLC检测。
降解效率＝[(C0-C1)/C0]*100％,其中C0为对照组棒曲霉素的含量，C1为实验组棒曲霉素的含量。
结果如图2所示，可以看出，无论是在不同pH条件下的MES缓冲液中还是市售的果汁中，该株细菌均具有较好的棒曲霉素降解能力；pH＝4MES缓冲液和pH＝7MES缓冲液中该株细菌处理后体系中棒曲霉素残留量已低于检测限，在市售的汇源果汁中该株细菌对棒曲霉素的降解效率为87％。
二、不同棒曲霉素含量下TT-09细菌的生长情况
将TT-09细菌过夜活化后按照体积比1:100的比例转接至20ml的LB培养基中，得到TT-09细菌转接培养液，然后按照如下操作：
0ppm组：20ml的TT-09细菌转接培养液中不添加棒曲霉素；
25ppm组：20ml的TT-09细菌转接培养液中添加终浓度为25ppm的棒曲霉素；
50ppm组：20ml的TT-09细菌转接培养液中添加终浓度为50ppm的棒曲霉素；
100ppm组：20ml的TT-09细菌转接培养液中添加终浓度为100ppm的棒曲霉素；
将以上各组培养液置于25℃、200rpm的摇床中培养，分别检测不同培养时间(0h、24h、48h、72h、96h)下该株细菌的OD600(756型紫外可见分光光度计)；
结果如图3所示，可以看出，该细菌菌株能够在100ppm的棒曲霉素浓度下生长，最终接近0ppm棒曲霉素条件下细菌的生长浓度。
三、细菌的降解机制研究
将TT-09细菌过夜活化后按照1:100的比例转接至20ml的LB培养基中，于25℃、200rpm的摇床中继续培养至细菌OD600 0.6(3×108cfu/ml)左右，得到含有TT-09活菌的培养液。
含有灭活TT-09细菌的培养液为将上述含有TT-09活菌的培养液在121℃条件下灭活20min得到。
含有活性TT-09细菌的pH＝6的50mM MES缓冲液:将含有TT-09活菌的培养液5000g离心10min并去除上清，沉淀重悬于pH＝6的50mM MES缓冲液中，得到含有活性TT-09细菌的pH＝6的50mM MES缓冲液。
含有灭活TT-09细菌的pH＝6的50mM MES缓冲液:将含有灭活TT-09细菌的培养液离心并去除上清，沉淀重悬于pH＝6的50mM MES缓冲液中，得到含有灭活TT-09细菌的pH＝6的50mM MES缓冲液。
活细胞组(有活性-细胞组)：将500ul含有活性TT-09细菌的pH＝6的50mM MES缓冲液与25μg棒曲霉素混匀，形成500μl的反应体系(TT-09细菌与棒曲霉素的配比为2×107cfu:1μg)，共培养72h；
灭活细胞组(无活性-细胞组)：将500ul含有灭活TT-09细菌的pH＝6的50mM MES缓冲液与25μg棒曲霉素混匀，形成500μl的反应体系(TT-09细菌与棒曲霉素的配比为2×107cfu:1μg)，共培养72h；
细胞培养液组(有活性-培养液组)：将含有TT-09活菌的培养液5000g离心10min收集上清液，500ul上清液与25μg棒曲霉素混匀，形成500μl的反应体系，共培养72h；
灭活细胞培养液组(无活性-培养液组)：将含有灭活TT-09细菌的培养液5000g离心10min收集上清液，500ul上清液与25μg棒曲霉素混匀，形成500μl的反应体系(TT-09细菌与棒曲霉素的配比为2×107cfu:1μg)，共培养72h；
细胞组CK：pH＝6的50mM MES缓冲液与25μg棒曲霉素混合，形成500μl的反应体系；
培养液组CK：LB培养基与25μg棒曲霉素混合，形成500μl的反应体系。
检测不同组中棒曲霉素含量(同上)；
结果如图4所示，可以看出，TT-09细菌的活细胞以及有活性的细胞培养液均能起到降解棒曲霉素的效果，而将TT-09细菌细胞以及培养液进行高温灭活后，降解作用消失，说明该TT-09细菌对棒曲霉素的降解作用是由细胞或发酵液中的活性物质来完成的。
序列表
<110> 中国科学院植物研究所
<120>降解棒曲霉素的TT-09细菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1414
<212> DNA
<213> 肠杆菌（Enterobacter sp. ）
<400> 1
tgcaagtcga gcggcagcgg aaagtagctt gctactttgc cggcgagcgg cggacgggtg 60
agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac 120
cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc tcttgccatc agatgtgccc 180
agatgggatt agctagtagg tggggtaacg gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc 240
tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc 300
agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtatgaagaa 360
ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaggc ggtgaggtta ataacctcat 420
cgattgacgt tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata 480
cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggtctgtca 540
agtcggatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca ttcgaaactg gcaggctaga 600
gtcttgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga 660
ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg 720
gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcga cttggaggtt 780
gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaagt cgaccgcctg gggagtacgg 840
ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900
ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tactcttgac atccagagaa ctttccagag 960
atggattggt gccttcggga actctgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020
tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatcctttgt tgccagcggt 1080
tgggccggga actcaaagga gactgccagt gataaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1140
aagtcatcat ggcccttacg agtagggcta cacacgtgct acaatggcgc atacaaagag 1200
aagcgacctc gcgagagcaa gcggacctca taaagtgcgt cgtagtccgg attggagtct 1260
gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgta gatcagaatg ctacggtgaa 1320
tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag 1380
taggtagctt aaccttcggg agggcgctta ccac 1414

Claims (8)

1.肠杆菌（Enterobacter sp.）TT-09，其保藏号为CGMCC NO.16574。
2.权利要求1所述的肠杆菌（Enterobacter sp. ）TT-09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物在降解棒曲霉素中的应用。
3.一种降解棒曲霉素的方法，为用权利要求1所述的肠杆菌（Enterobacter sp.）TT-09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物作用棒曲霉素，实现降解棒曲霉素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述用权利要求1所述的肠杆菌（Enterobacter sp. ）TT-09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物作用棒曲霉素为将权利要求1所述的肠杆菌（Enterobacter sp.）TT-09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物与棒曲霉素共培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述共培养的体系为pH值为4的缓冲液或pH值为7的缓冲液或苹果汁。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述棒曲霉素在共培养体系中的浓度为大于0。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述棒曲霉素在共培养体系中的浓度具体为0-500ppm，且不为0。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述肠杆菌（Enterobacter sp. ）TT-09或其培养液或其菌悬液或其发酵产物均为活菌或活菌培养液或活菌悬液或活菌发酵产物。
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