CN107460146B - 粪产碱菌粪亚种菌株、酶制剂及其降解农药残留的应用 - Google Patents

粪产碱菌粪亚种菌株、酶制剂及其降解农药残留的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了粪产碱菌粪亚种菌株、酶制剂及其降解农药残留的应用。本发明提供了粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)FY‑2菌株，其保藏编号为CGMCC No.13518。本发明还提供了菌株的筛选、诱导、驯化和农药农残降解活性酶制备方法，即以毒死蜱为碳源进行目的菌筛选，将目的菌于单一农药和混合农药进行诱导驯化。将菌株进行发酵，收集菌体，破胞、离心，上清液可制备农残降解酶制剂，可用于蔬果农药残留的降解，在降解蔬果农残方面具有应用潜力。

Description

粪产碱菌粪亚种菌株、酶制剂及其降解农药残留的应用
技术领域
本发明涉及生物技术降解农药残留领域，尤其涉及粪产碱菌粪亚种(Alcaligenesfaecalis subsp.faecalis)菌株筛选、诱导驯化及在去除蔬果中农药残留的应用。
背景技术
随着近年来农药的品种、产量及使用量剧增，在农业生产过程中混合施用多种农药的现象时有发生且较为严重，造成多种农药出现在同一产品中。食用农残超标的蔬菜水果会危害神经中枢、使神经传导功能紊乱；可诱发突变，导致畸形，影响后代健康；能诱发肝脏酶的改变，令肝脏肿大以致坏死；能侵犯肾脏而引起病变。残留农药在人体内蓄积，超过一定限度后会导致一些慢性疾病，如肌肉麻木、咳嗽等，甚至会诱发血管疾病、糖尿病和癌症等。
生物修复技术是80年代以来出现和发展的清除和治理环境污染的生物工程技术，其主要利用生物特有的分解有毒有害物质的能力，去除污染环境如土壤中的污染物，达到清除环境污染的目的。微生物具有较强的适应和被驯化的能力，通过一定的适应过程，微生物产生相应的酶系，或通过基因突变等建立新的酶系来降解新的农药。
提高食品安全具有重大的意义，但目前，尚未见到利用菌株或由其制成的酶制剂降解蔬果中的混合农药残留的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供经筛选、农药诱导、驯化得到的一株粪产碱菌粪亚种菌株。
本发明提供的粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)菌株(记为FY-2)，其保藏编号为CGMCC No.13518。
所述粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)菌株经筛选目的菌株、以及对目的菌株经单种农药及混合农药诱导、驯化获得，包括以下步骤：
1)将筛选的目的菌株复壮；
2)利用农药毒死蜱配制含不同有效成分浓度农药的培养基，将步骤1)复壮的目的菌株划线接种、培养并通过不断的诱导培育(通过不断提高农药含量)，培育出能耐受较高的毒死蜱浓度的目标菌株；
3)将农药毒死蜱、多菌灵、腐霉利和烯酰吗啉等浓度混合，并经稀释至一定浓度后添加进培养基内，配制成含不同有效成份浓度农药的培养基。再将步骤2)得到的目标菌株划线接种、培养并通过不断的诱导培育(通过不断提高农药含量)，培育得到耐受较高的农药浓度的菌株，最终分离得到一株粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalissubsp.faecalis)菌株(记为FY-2)。
本发明的第二个目的是提供一种生产生物降解酶的方法。
本发明提供的生产生物降解酶的方法，包括以下步骤：将上述粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)菌株FY-2发酵后，收集菌体、破胞、离心，提取上清液，得到生物降解酶溶液。
上述生产生物降解酶的方法中，所述发酵的条件为在25-37℃、180rpm-200rpm，培养16-24小时。
上述生产生物降解酶的方法中，所述发酵采用的发酵培养基的组分如下：每升所述发酵培养基包括胰蛋白胨15-19g、植物蛋白胨1-4g、氯化钠2-5g、磷酸氢二钾2-5g及葡萄糖2-5g，用水补足体积；发酵培养基的pH值为6.5-7.6，优选为6.8-7.2。
上述生产生物降解酶的方法中，所述发酵具体包括以下步骤：将粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)菌株FY-2菌种经过扩大培养获得种子，将种子接种至所述发酵培养基中于所述发酵的条件下进行培养。
所述扩大培养的条件为在30-35℃、180-200rpm培养16-24h。
所述菌种为将上述粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)菌株FY-2的菌体悬浮在磷酸盐缓冲液中得到的溶液。
上述生产生物降解酶的方法中，在所述发酵后，将发酵产物于12000-14000rpm、温度4-6℃，离心15-25min，收集菌体，将菌体重悬后高压破胞，然后于8000-10000rpm、温度4-6℃，离心50-65min，收集上清液，将上清液过滤，得到生物降解酶溶液。
本发明的第三个目的是提供一种生物降解酶制剂。
本发明提供的生物降解酶制剂，其活性成分为上述粪产碱菌粪亚种(Alcaligenesfaecalis subsp.faecalis)菌株FY-2或上述生物降解酶。
本发明的第四个目的是提供上述粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalissubsp.faecalis)菌株FY-2、生物降解酶及生物降解酶制剂在农残降解，特别是蔬果农药残留的降解中的应用。
所述生物降解酶或生物降解酶制剂在蔬果农药残留降解中的使用浓度为2.5-15ppm，最优为2.5-7.5ppm，因具体蔬果而异。
本发明的有益效果体现在：
本发明的实验证明，本发明诱导、驯化得到粪产碱菌粪亚种(Alcaligenesfaecalis subsp.faecalis)菌株FY-2，对其进行发酵培养后提取胞内酶可作为生物降解酶，该生物降解酶可作用于蔬果中的农药残留，使多种农药残留降解，达到去除农药残留的效果，在农药残留降解领域具有应用潜力。
附图说明
图1为诱导驯化原始菌和诱导驯化菌株的降解农药的对比。
图2为基于粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)菌株FY-2的液态生物降解酶制剂处理茼蒿的农药残留的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的转速，均为在半径为5.5cm的离心半径下的转速。
实施例中采用比色法测定细菌数量，即浑浊度计数法；培养物的吸光值OD600表示细菌的生长量。
实例1、粪产碱菌粪亚种菌株分离鉴定
一、土壤样品的采集
采集于农药厂排放口污泥。
二、目的菌株的分离筛选
称取污泥10g于100mL无机盐液体培养基中，无机盐液体培养基成分如下：
MgSO4·7H2O 0.2g；K2HPO4 0.1g；(NH4)2SO4 0.1g；CaSO4 0.04g；FeSO4·7H2O0.001g；去离子水1L；pH 7.0。121℃灭菌30min。
在无机盐液体培养基中添加浓度为100mg/L的毒死蜱，得培养液，于35℃、180r/min摇床培养，培养一周后，以10％的接种量接入新鲜培养液中，以后每周转接一次，如此反复多次驯化。最后，用平板稀释法进行分离纯化，接种到含有100ppm毒死蜱的LB培养基中，挑选生长最好的接种斜面，编号保存用于驯化。
三、鉴定
具体鉴定步骤如下：提取编号保存菌株的总DNA并作为模板，应用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG-3′)，PCR扩增得到其ITS，经测序获得一条315bp的核苷酸序列(参见SEQ.ID.NO.1)，同源性比对分析表明：编号保存菌株与粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)的同源性最高。
实例2、粪产碱菌粪亚种菌株诱导、驯化
一、毒死蜱诱导、驯化
1.毒死蜱配制的有效成分含量区间：300mg/L-800mg/L。制备含不同浓度毒死蜱的胰蛋白胨琼脂。将不同量的毒死蜱分别添加进胰蛋白胨琼脂内制成含有毒死蜱的培养基。具体步骤：1)毒死蜱配制成4500mg/L的农药标准液。分别取4500mg/L浓度的农药标准液13.3mL、17.8mL、22.2mL、26.6mL、31.1mL、35.6mL加至200mL胰蛋白胨琼脂内，配制成含毒死蜱300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L和800mg/L的胰蛋白胨琼脂培养基。平板制作：将配制好的含300mg/L-800mg/L毒死蜱的胰蛋白胨琼脂倾注平皿，15mL/皿，待冷却凝固后使用。
胰蛋白胨琼脂成分为：每L含16g胰蛋白胨、3.5g植物蛋白胨、2.5g氯化钠以及15g琼脂(pH为6.9±0.3)。
2.将所有目的菌株分别划线接种于中300mg/L的平板。
3.将接种好的平板置于35℃恒温培养箱内，培养24h。
4.然后将培养好的菌株重新接种至400mg/L的平板。将接种好的平板置于35℃恒温培养箱内，培养24小时。
5.逐步在500mg/L、600mg/L、700mg/L和800mg/L平板中继续培养，最后得到可耐800mg/L有机磷农药(毒死蜱)的目标菌株。
二、混合农药诱导、驯化
1.混合农药稀释方法
将毒死蜱、多菌灵、腐霉利和烯酰吗啉分别用磷酸盐缓冲液(pH 7.2)配制成6.2％浓度的溶液。
2.将有效成分含量均为6.2％的四种农药溶液，各取3.60mL混合均匀，得混合农药。
3.取混合农药0.97mL、1.30mL、1.61mL、1.94mL、2.26mL、2.58mL分别加入200mL胰蛋白胨琼脂内，混合均匀，配制成300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L和800mg/L的混合农药胰蛋白胨琼脂培养基，并制成平板。
4.将可耐800mg/L有机磷农药(毒死蜱)的目标菌株转接到300mg/L混合农药的平板中。将接种好的平板置于35℃恒温培养箱内，培养24小时。
5.逐步提高平板中混合农药浓度，继续诱导、驯化突变，得到一株可降解高浓度混合农药的菌株，记为FY-2，诱导驯化前后降解毒死蜱和多菌灵对比效果如图1所示。
上述菌株FY-2已于2016年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.13518，分类命名为粪产碱菌粪亚种(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)。
6.用无菌的磷酸盐缓冲液将驯化得到的FY-2菌体从培养皿中冲洗下来，用反复离心重悬的方法洗涤菌体3次，称重，按菌体与磷酸盐缓冲液(pH7.2)为0.1g:500μL的比例重新悬浮菌体。将灭菌的50％甘油水溶液与菌液按体积比1:1混合后分装，每管500μL，4℃冰箱中冷藏。
实例3、利用粪产碱菌粪亚种FY-2菌株制备生物降解酶制剂
1.菌种扩增培养：取冷藏的菌种接种到100mL无菌的TSB培养基中，35℃、180rpm培养24h，即为一级种子；将一级种子按10％接种量转接至1L的TSB培养基中，35℃、180rpm培养24小时，即为二级种子。将二级种子按10％接种量转接至10L的工业培养基中，35℃、180rpm培养24h，即为三级种子。
2.将三级种子接种到发酵罐中，接种量为发酵培养基的5％。控制通气量为2.5m3/h、温度为35℃、pH为6.9±0.4，转速为180rpm，隔时取样，测定OD600及pH，中间根据泡沫情况适量补加无菌消泡剂。发酵18小时后下罐。
3.将发酵罐中的发酵液高速离心(14000rpm，温度4℃)15-20min，弃液体，收集菌体。用磷酸盐缓冲液将菌体按1:10(g/mL)重新悬浮，获得菌悬液。
4.用高压细胞破碎仪，于2.5-5.0MPa、温度4-6℃，破碎菌悬液中的重悬菌体，破碎两次，得破碎液。
5.破碎液于8000rpm，温度4℃离心50min，上清液即为生物降解酶粗酶液。
6.过滤：先用6-8层滤纸过滤粗酶液，再用孔径为0.45μm的滤膜过滤，即可得澄清的生物降解酶溶液。
7.稳定化处理：将生物降解酶溶液用磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释100倍，添加0.01-0.02％聚六亚甲基胍，再与灭菌后的甘油等体积充分混合在一起，4℃保存。
所述工业培养基(即发酵培养基)的组分如下：每升所述发酵培养基由胰蛋白胨16g、植物蛋白胨2.5g、氯化钠3.5g、磷酸氢二钾4.5g、葡萄糖3.5g及水组成，用水补足体积。
实例4、生物降解酶制剂在降解蔬菜(水果)农药残留中的应用
从蔬菜批发市场(寿光)购买比较代表性的蔬菜茼蒿进行试验，首先将实例3得到生物降解酶溶液(酶制剂)用纯水配制成酶制剂浓度为2.5-5ppm的试验液，在33-37℃恒温水浴下将茼蒿浸泡于试验液中2-3min，送第三方检测机构(诺安实力可商品检测(青岛)有限公司)进行检测。茼蒿农药残留降解种类(嘧菌酯、甲基硫菌灵、多菌灵、乙霉威、苯醚甲环唑、烯酰吗啉、噁霜灵、多效唑、嘧霉胺等)和效果如图2所示。
序列表
<110> 西安罗格斯生物科技有限公司
<120> 粪产碱菌粪亚种菌株、酶制剂及其降解农药残留的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 315
<212> DNA
<213> Alcaligenes faecalis subsp. faecalis
<400> 1
ccatcacgtg gtagcgccct ccttacggtt aggctaccta cttctggtga aacccactcc 60
catggtgtga cgggcggtgt gtacaagacc cgggaacgta ttcaccgcga cattctgatc 120
cgcgattact agcgattccg acttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccggactacg 180
atcgggtttc tgagattggc tccccctcgc gggttggcga ccctctgtcc cgaccattgt 240
atgacgtgtg aagccctacc cataagggcc atgaggactt gacgtcatcc ccaccttcct 300
ccggtttgtc gtggg 315
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
tcctccgctt attgatatg 19

Claims (10)

1.一种粪产碱菌粪亚种（Alcaligenes faecalis subsp. faecalis）菌株，其特征在于：该菌株的保藏编号为CGMCC No.13518。
2.一种生物降解酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将粪产碱菌粪亚种（Alcaligenes faecalis subsp. faecalis）菌株进行发酵后，收集菌体、破胞、离心，提取上清液，得到生物降解酶溶液，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.13518。
3.根据权利要求2所述一种生物降解酶的制备方法，其特征在于：所述发酵采用的培养基包括胰蛋白胨15-19g/L、植物蛋白胨1-4g/L、氯化钠2-5g/L、磷酸氢二钾2-5g/L及葡萄糖2-5g/L，培养基pH值为6.5-7.6。
4.根据权利要求2所述一种生物降解酶的制备方法，其特征在于：所述发酵的条件为于25-37℃、180-200rpm培养16-24小时。
5.根据权利要求2所述一种生物降解酶的制备方法，其特征在于：在所述发酵后，将发酵产物于12000-14000 rpm离心15-25 min，收集菌体，将菌体重悬后高压破胞，然后于8000-10000rpm离心50-65 min，收集上清液，将上清液过滤，得到生物降解酶溶液。
6.根据权利要求5所述一种生物降解酶的制备方法，其特征在于：所述过滤的具体步骤为将上清液依次经滤纸以及0.45 μm滤膜过滤，得到澄清液体即为生物降解酶溶液。
7.一种如权利要求1所述的粪产碱菌粪亚种（Alcaligenes faecalis subsp. faecalis）菌株在体外降解农药残留中的应用。
8.一种生物降解酶制剂在体外降解农药残留中的应用，其特征在于：该酶制剂的活性成分为权利要求2制备的生物降解酶。
9.一种生物降解酶制剂，其特征在于：该酶制剂的活性成分为权利要求2制备的生物降解酶。
10.一种降解农药残留的试剂，其特征在于：该试剂的活性成分为粪产碱菌粪亚种（Alcaligenes faecalis subsp. faecalis）菌株或为权利要求2制备的生物降解酶，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.13518。
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