CN103421819A - 湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其应用，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白如SEQ ID NO.2所示。本发明的蛋白可应用于制备抗寄生虫感染的药物，以及制备抗氧化、抗衰老的药物中。

Description

湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其应用，特别是涉及一种湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其编码的蛋白的应用。

背景技术

湖北钉螺（Oncomelania hupensis），属无脊椎动物中的软体动物门（Phylum Mollusca）、腹足纲（Class Gastropoda）、中腹足目(Order Mesogastropoda)、圆口螺科(FamilyPomatiopsidae)。湖北钉螺是日本血吸虫唯一的中间宿主，在日本血吸虫病传播过程中起着重要作用，其分布区域直接决定着日本血吸虫病的流行范围。湖北钉螺主要分布于东南亚地区，北起北纬36°（日本利根川），南达南纬3°（印尼苏拉威西），西至东经99°（中国云龙县），东抵东经140°（日本利根川），涉及中国（包括台湾）、日本、菲律宾和印度尼西亚等国家和地区，特别是广泛分布于我国的长江中下游地区。到目前为止，对湖北钉螺的生活史以及相关的生理、生态等生物学知识掌握较为全面，其也是无脊椎动物中生物学研究最为深入的动物之一，因此湖北钉螺也是研究螺—寄生虫相互作用的较为理想的模型。

氧还蛋白过氧化物酶（peroxiredoxin，Prx）是生物体的一类抗氧化蛋白酶，是广泛存在酵母、真菌、寄生虫、哺乳动物和人类等多种生物的过氧化酶超家族之一，在生物体抗氧化作用中起着重要作用。在生物进化过程中，生物体逐渐形成各种抗氧化系统来抵抗活性氧族分子与活性氮族分子的损伤作用。氧还蛋白过氧化物酶主要通过还原过氧化氢和一些过氧化氢化合物来实现抗氧化作用。自1998年Kim教授在酿酒酵母中发现氧还蛋白过氧化物酶以来，氧还蛋白过氧化物酶也越来越受到人们的广泛关注。氧还蛋白过氧化物酶与其他过氧化物酶比较最明显的特征就是绝大部分的氧还蛋白过氧化物酶在体内是以硫氧还蛋白作为唯一的氢供体，因此,氧还蛋白过氧化物酶也被称为硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxinperoxidase,TPx)，但是并不是所有的氧还蛋白过氧化物酶都是以硫氧还蛋白作为唯一的氢供体。

硫氧还蛋白过氧化物酶的相对分子量（Mr）为20000～30000道尔顿，序列上具备着高度的相似性，是一类具有功能差异的巯基依赖性过氧化物酶家族。硫氧还蛋白过氧化物酶家族成员在N末端都有一个或两个保守的半胱氨酸（Cys）还原位点，依据其在催化过程中所起作用的半胱氨酸数量及基本催化位置Cys附近氨基酸序列的差异性，可以将硫氧还蛋白过氧化物还原酶分为3类：典型2-Cys类、非典型2-Cys类、和1-Cys类。硫氧还蛋白过氧化物酶主要分布于细胞质中，在线粒体、叶绿体和细胞核中也有分布。许多生物体都含有不止一种硫氧还蛋白过氧化物酶的同型异构体，例如，在哺乳动物细胞里已有六种硫氧还蛋白过氧化物酶被发现，在软体动物细胞中发现至少有四种硫氧还蛋白过氧化物酶。

随着对硫氧还蛋白过氧化物酶研究的不断深入，人们越来越认识到它在生物体内的重要性。硫氧还蛋白过氧化物酶在生物体内的主要功能是细胞脱毒能力，抵抗氧化压力和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。研究显示,硫氧还蛋白过氧化物酶在宿主与寄生虫之间的相互作用中起主要作用,宿主在抵抗病原体感染的过程中,可以由免疫效应细胞产生活性氧和活性氮,由两者组成氧应激微环境对病原体有毒性杀伤作用。多种无脊椎动物在寄生虫感染后，硫氧还蛋白过氧化物酶在mRNA水平显著上调，表明其硫氧还蛋白过氧化物酶基因在氧应激条件下诱导表达，这可能与宿主的早期免疫应答相关。并且，研究表明，无脊椎动物的硫氧还蛋白过氧化物酶与脊椎动物的硫氧还蛋白过氧化物酶高度同源。因此，在寄生虫防治和抗氧化、抗衰老药物的研究中，硫氧还蛋白过氧化物酶有着良好的前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其编码的蛋白的应用。通过该基因，可为抗寄生虫感染和抗氧化、抗衰老药物的研究提供基础。

为解决上述技术问题，本发明的湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因（Oh-TPx基因），是通过RACE（rapid amplification of cDNA ends）的方法，从湖北钉螺总RNA中分离得到了硫氧还蛋白过氧化物酶基因TPx，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。该cDNA全长1016bp，最大读码框（ORF）为750bp，编码249个氨基酸残基的蛋白。其中，为实现RACE方法的PCR引物序列如SEQ ID NO.3-4所示，RACE引物序列如SEQ ID NO.5-6所示。

本发明的基因编码的蛋白（重组湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶Oh-TPx蛋白），即Oh-TPx蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；该蛋白的等电点（pI）为5.5，分子量为27.7kD，蛋白质信号肽区位于N端1～21氨基酸，高度保守的N端和C端半胱氨酸残基（C）分别定位于97、218位，蛋白活性区域位于52～210位。其中，蛋白活性区域的PCR引物序列如SEQ IDNO.7-8所示。

另外，本发明还提供了一种表达载体，包含有SEQ ID NO.1所示的基因序列，或包含有编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸的基因序列，或包含有编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸蛋白活性区域的基因序列。其中，优选的表达载体为，在质粒pET-28a的多克隆位点中间插入His的亲和标记位点和编码包含有如SEQ ID NO.2所示氨基酸蛋白活性区域的基因序列所形成的表达载体pET-28a-TPx（高表达载体）。

再者，本发明还提供一种宿主细胞，含有如上所述的表达载体，或其基因组中整合有：SEQ ID NO.1所示的基因序列、或含有编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸的基因序列、或包含有编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸蛋白活性区域的基因序列。其中，优选含有表达载体pET-28a-TPx的大肠杆菌BL21（DE3）【即大肠杆菌BL21DE3】。

上述Oh-TPx蛋白的制备方法，包括步骤：

1）培养如上所述的宿主细胞；

2）从培养物中分离出Oh-TPx蛋白。

其中，Oh-TPx蛋白可通过表达载体pET-28a-TPx在宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)原核表达的，该蛋白在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达，表达量可达620mg/L，且该可溶的表达蛋白（Oh-TPx蛋白）能经Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化。

所述Oh-TPx蛋白，可应用于制备抗寄生虫感染的药物，以及制备抗氧化、抗衰老的药物中。

本发明通过湖北钉螺安徽亚种的实验室繁育的F2代成螺进行实验考查。根据湖北钉螺转录组测序数据库中湖北钉螺TPx基因的部分序列，设计5’端和3’端RACE锚定引物，通过RACE的方法，获得了1个编码湖北钉螺TPx新基因（Oh-TPx）的cDNA全长序列。

另外，本发明通过设计引物，引入BamHⅠ酶切位点和Xho Ⅰ酶切位点，将包含编码湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶的新基因Oh-TPx的蛋白活性区PCR扩增后克隆到原核表达载体pET-28a上，构建原核表达载体pET-28a-TPx，并将其转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达。pET-28a表达载体以T7为启动子，其N端具有6×His标签，便于经Ni-NTA琼脂糖柱纯化。通过对培养时间，诱导IPTG剂量，温度等条件的优化，重组表达蛋白的表达量可达到620mg/L，且主要以可溶的方式存在。表达的重组蛋白经NiNTA琼脂糖柱纯化后可得到纯度在95%以上的重组蛋白。同时，本发明的含有湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶的表达质粒pET-28a-TPx经BamHⅠ和XhoⅠ酶切，可得到600bp的片段，即为含有Oh-TPx的活性区的片段序列。

经实验证明，本发明获得的Oh-TPx蛋白具有生物活性，如该Oh-TPx蛋白具有抗氧化作用，能还原H₂O₂，并能保护超螺旋DNA遭受外界氧化作用的破坏。另外，本发明获得的Oh-TPx基因具有抗日本血吸虫毛蚴感染的作用，该基因在湖北钉螺被日本血吸虫毛蚴侵袭后10小时内在转录水平显著上调。

因此，本发明获得的Oh-TPx基因，能用于抗寄生虫感染的研究，而且本发明的Oh-TPx蛋白可用于制备抗氧化、抗衰老的药物。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是本发明的湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶全长cDNA序列及预测氨基酸序列，其中，阴影表示TPx信号肽和特征性结构域；星号（*）表示保守的半胱氨酸残基（Cys）；下划线表示PolyA的信号序列；

图2是实施例2中的本发明的Oh-TPx蛋白活性区和其他物种的该蛋白的比较结果，其中，Consensus和黑色阴影表示相同的氨基酸，

Cp-TPx表示褶纹冠蚌TPx蛋白，GenBank号：ADM88874.1；

Bg-TPx表示光滑双脐螺TPx蛋白，GenBank号：AAK26236.1；

Aa-TPx表示埃及伊蚊TPx蛋白，GenBank号：AAL37254.1；

Rn-Prx4表示褐家鼠Prx4蛋白，GenBank号：AAH59122.1；

Hs-Prx4表示人Prx4蛋白，GenBank号：NP_006397.1；

图3是实施例3中的pET-28a-TPx重组表达载体的酶切和PCR鉴定图，其中，M：DNA分子量标准；1：pET-28a-TPx重组载体BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切；2：含有Oh-TPx蛋白活性区域序列的PCR产物电泳结果；

图4是实施例4中的Oh-TPx蛋白诱导表达、蛋白纯化电泳图，其中，M：蛋白标记物；1：pET-28a-TPx未诱导；2：pET-28a-TPx诱导全细胞；3：pET-28a-TPx诱导后上清；4-5：pET-28a-TPx诱导上清经Ni-NTA纯化；

图5是实施例5中的Oh-TPx蛋白体外H₂O₂活性的测定结果图；

图6是实施例6中的Oh-TPx蛋白体外保护超螺旋DNA损伤实验的电泳结果图；其中，1：pUC18质粒DNA；2：pUC18质粒DNA加入3.3mM二硫苏糖醇（DTT）；3：pUC18质粒DNA加入16.5uM氯化铁（Fecl3）；4：pUC18质粒DNA加入MCO体系（含有3.3mM DTT和16.5uM FeCl₃）；5-7：在MCO体系下，pUC18质粒DNA加入不同浓度梯度的重组TPx蛋白（2.5，5.0，10.0ug/ml）；NF：环状结构；SF：超螺旋结构；

图7是实施例7中的相对定量real-time Q-RT-PCR测定Oh-TPx基因被日本血吸虫毛蚴侵袭前后转录水平的结果图。湖北钉螺未感染组（0hr），感染日本血吸虫毛蚴5hr、10hr、24hr、48hr组；通过倍差计算公式，未感染组作为正常转录水平计作1，比较不同组钉螺表达的Ct值，计算TPx基因在不同时间转录相对倍差值。实验数据为2^-ΔΔCt±SD，且重复三次实验结果。

具体实施方式

以下实施例中使用的PCR试剂、质粒等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。其他未注明的实验操作，可按照常规分子生物学操作方法进行。

实施例1湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆

总RNA的提取：商业化的TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）提取湖北钉螺（湖北钉螺安徽亚种是经中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所实验室繁育的F2代成螺）总RNA，酚/氯仿抽提除去蛋白质污染，获得10μg的湖北钉螺总RNA。

引物设计：基于对湖北钉螺转录组中的TPx基因片段研究，利用Oligo 6.0设计TPx基因的PCR引物：TP-F1：5’-TGTTCTTCATCAGCCCTATATTTGC-3’（SEQ ID NO.3所示），TP-R1：5’-CGTATTAAAGCTCTTCCGGGGCT-3’（SEQ ID NO.4所示）。根据SMARTer^TM RACE cDNAAmplification Kit（美国Clontech公司）说明书，设计3’端与5’端RACE引物：5’GSP1：5’-CTCTTCCGGGGCTTTCTGTTTGTTG-3’（SEQ  ID NO.5所示），3’GSP2：5’-CCACAGTCTGAGAGGTCTGTTCATCATC-3’（SEQ ID NO.6所示）。

cDNA合成：利用TRIzol试剂提取的湖北钉螺总RNA，反转录成第一链cDNA为模板，以TP-F1、TP-R1为引物进行PCR扩增，扩增出湖北钉螺TPx基因的部分序列；根据获得的湖北钉螺TPx基因的部分序列设计5’GSP1以及3’GSP2RACE引物，用SMARTer^TMRACE cDNAAmplification Kit反转录成第一链cDNA，并分别以其为模板，用试剂盒内带引物UPM与5’GSP1和3’GSP2引物分别进行PCR扩增5’末端与3’末端cDNA。PCR反应参数为：94℃1min；94℃30s；65℃30s；72℃3min；共35个循环；72℃10min。PCR产物通过克隆测序后比对拼接出1个编码湖北钉螺TPx新基因的cDNA全长序列，该新基因命名为Oh-TPx基因。该基因编码的蛋白命名为Oh-TPx蛋白。

实施例2湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因序列的测定和分析

测序实施例1获得的湖北钉螺新TPx基因（Oh-TPx基因）的全长cDNA序列。对其进行生物信息学分析，结果显示其cDNA全长1016bp（如图1和SEQ ID NO.1所示），最大读码框（ORF）为750bp，编码249个氨基酸残基的蛋白（如图1和SEQ ID NO.2所示），蛋白质分子量27.7kDa，蛋白质等电点（pI）为5.5；SignalP4.0分析其蛋白质信号肽区N端1～21氨基酸，含有高度保守区motif1（FYPLDFTVCPTEI）和motif2（HGEVCP)，高度保守的N端和C端半胱氨酸残基（C）分别定位于97、218位；使用motif scan软件分析蛋白活性区域Thioredoxin2（52～210），即蛋白活性区域位于52～210位。

另外，Oh-TPx基因还包含有假定PloyA信号（AATAAA）位于距离polyA末端上游102个核苷酸序列处。

通过Blastx检索发现，Oh-TPx蛋白与具有两个活性半胱氨酸功能域的过氧化物酶同源性较高，与NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank光滑双脐螺的TPx（GenBank号：AAK26236.1）具有显著的相似性【Identities=183/225(81%)，Positives=202/225(90%)】。

Clustal x 1.8程序对Oh-TPx基因预测的蛋白质序列与已报道TPx蛋白序列进行多重序列比对结果如图2所示，结果揭示出：Oh-TPx蛋白保守区motif1和motif2，保守的存在于Oh-TPx蛋白与其他所选物种TPx蛋白中，而且Oh-TPx蛋白的N端和C端半胱氨酸残基（C97和C218），高度保守的存在于所选物种的TPx蛋白中。

实施例3湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因重组表达质粒的构建

根据Oh-TPx基因的开放性读码框序列设计引物（包含蛋白活性区域），PF：5'-CGGGATCCATGGTCTATCCGCAAGAAACAC-3’，SEQ ID NO.7所示，(引入BamH Ⅰ酶切位点)；PR：5'-CCGCTCGAGTTAGTCTGGAATAATCGTGTC-3’，SEQ ID NO.8所示，(引入Xho Ⅰ酶切位点)。

用实施例1获得的湖北钉螺总RNA反转录成第一链cDNA为模板，PF、PR为引物，进行PCR扩增，PCR反应参数为：96℃3min；94℃30s；56℃30s；72℃2min；共33个循环；72℃10min。

在1%的琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物后，用DNA凝胶回收试剂盒【天根生化科技(北京)有限公司】对PCR产物进行切胶纯化、回收。回收的DNA片段与pGEM-Teasy质粒连接，形成pGEM-Teasy/TPx质粒，并转化至大肠杆菌克隆菌DH5α（上海索莱宝生物科技有限公司），菌液加入40ul 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（x-gal）（20mg/ml）和4ul异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）（200mg/ml），经含有氨苄（50μg/mL，AMP）的LB平板筛选白色菌落，接种LB培养基摇菌后抽提质粒，经BamH I和Xho I酶切鉴定，阳性克隆送上海生工生物公司测序鉴定。

将测序正确的pGEM-Teasy/TPx质粒及pET-28a表达载体分别用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，回收目的片段，T₄DNA连接酶连接，并转化至大肠杆菌克隆菌DH5α（上海索莱宝生物科技有限公司），菌液加入40ul x-gal（20mg/ml）和4ul IPTG（200mg/ml），经含有氨苄（50μg/mL，AMP）的LB平板筛选白色菌落，接种LB培养基摇菌后抽提质粒，经BamH I和XhoI酶切鉴定，阳性克隆送上海生工生物公司测序鉴定。测序正确的阳性克隆提取质粒后将质粒转化表达菌BL21(DE3)（上海索莱宝生物科技有限公司）中，用含有卡那霉素（50μg/ml）（Kan+）的LB平板筛选阳性菌落，形成带有pET-28a-TPx表达载体的BL21(DE3)重组表达菌。结果表明：BamH I和XhoI双酶切重组质粒后获得与PCR产物(600bp)大小一致的片段，以及与线性载体pET-28a(3.0kb)大小一致的片段，见图3。测序结果表明，Oh-TPx基因序列无变异，开放阅读框（ORF）正确，并正向插入原核表达载体pET-28a中，可以表达重组蛋白（即Oh-TPx蛋白）。并将该表达载体，命名为pET-28a-TPx。

实施例4湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因重组蛋白的表达和纯化

将实施例3获得的重组表达菌接种于5mL含Kan+（50μg/ml）的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养16h。按1：100体积比接种于200ml LB培养基，37℃培养至菌液吸光度值（D600值）为0.5时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于20℃诱导表达4h。4℃4000×g，离心20min收菌。在强度为400W，超声3S、间隔3S的条件下超声裂解细菌100次，4℃10000×g离心30min，分别收集上清和沉淀后进行SDS-PAGE分析。将总菌液离心后取上清液，使用Ni-NTA琼脂糖柱对目的蛋白进行纯化，收集各个蛋白质洗脱峰进行SDS-PAGE分析检测重组蛋白质的纯化情况。结果表明：重组表达菌经IPTG诱导后，经SDS-PAGE分析显示，重组表达菌表达出明显的特异产物带，相对分子质量与预测的理论值27kDa相符；上清液进行SDS-PAGE分析，显示重组蛋白可溶。将上清液进行Ni-NTA琼脂糖柱层析，收集洗脱峰，经SDS-PAGE分析显示最后获得的Oh-TPx蛋白，结果见图4。

实施例5Oh-TPx蛋白还原H₂O₂活性实验

实验参照Pushpamali等（Pushpamali WA,et al.Comparative study of two thioredoxinperoxidases from disk abalone(Haliotis discus discus):Cloning,recombinant proteinpurification,characterization of antioxidant activities and expression analysis.Fish&Shellfish Immunology,2008,24(3):294-307）的方法。反应体系为100ul，包括5mmol/L二硫苏糖醇（DTT），50mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液和实施例4获得的Oh-TPx蛋白（10、20、30、40、50ug/ml）。37℃孵育30min后，加入1μl 0.5mol/L的H₂O₂至终浓度50umol/L。混匀后37℃孵育30min后，加入900μl质量体积分数为100%的水合氯醛（TCA），混匀后立即加入200ul 10mmol/L Fe(NH₄)₂(SO₄)₂和100μl 2.5mol/L KSCN，37℃孵育30min后测定OD₄₈₀。根据反应剩余的H₂O₂和KSCN、Fe(NH₄)₂(SO₄)₂形成的络合物的OD₄₈₀来判断Oh-TPx蛋白还原H₂O₂的能力。Oh-TPx蛋白显示结果如图5，结果表明，在含有DTT的组中，随着重组TPx蛋白浓度的不同，不同量的H₂O₂被还原了。随着重组TPx蛋白浓度的增加，还原的H₂O₂的量也增多。未加入DTT的组中，H₂O₂也被Oh-TPx蛋白还原，但其还原量比DTT存在情况下还原量要少。该实验证明了Oh-TPx蛋白具有还原H₂O₂的能力，且还原能力与重组蛋白的浓度成正比，并且，湖北钉螺Oh-TPx蛋白活性具有部分巯基依赖性。

实施例6Oh-TPx蛋白保护超螺旋DNA实验

在金属催化氧化系统（metal-catalyzed oxdation system，MCO）下，检测超螺旋状质粒DNA受到羟自由基破坏形成环状质粒DNA情况来完成的。反应体系为50μl，包括3.3mmol/LDTT，16.5umol/L FeCl₃，实施例4获得的Oh-TPx蛋白(2.5、5.0、10.0μg/ml)，混匀后37℃孵育2h。再各组加入300ng pUC18超螺旋质粒DNA，混匀后37℃孵育2.5h。反应完后分别取10μl进行1%琼脂糖凝胶电泳，并通过紫外分光成像系统分析结果，见图6。

结果表明：在MCO系统中，未加入Oh-TPx蛋白，超螺旋状pUC18质粒DNA遭到破坏，以环状（nicked form NF）存在；在MCO系统中，加入Oh-TPx蛋白不同浓度的情况（2.5、5.0、10μg/ml）下，超螺旋状pUC18质粒DNA所遭到的破坏受到不同程度的保护，以超螺旋状（super-coiled form SF）存在为主。该实验证明了一些自由基对DNA造成伤害时，Oh-TPx蛋白对超螺旋的DNA具有一定的保护作用。

实施例7Real-time RT-PCR分析日本血吸虫（S.japonicum）毛蚴侵袭湖北钉螺前后Oh-TPx基因差异表达实验

Real-time PCR引物设计：Oh-TPx目的基因TPF2：5’-GGCATGCAATCCAGTGGAGC-3’（SEQID NO.9所示），TPR2：5’-TTCACTACAGCCGTGCCGTT-3’（SEQ ID NO.10所示），内参18SrRNA基因18SF5：5’-CATGAGAAACGGCTACCAC-3’（SEQ ID NO.11所示），18SR5：5’-TTGCCCTCCAATAGATCCTC-3’（SEQ ID NO.12所示）。

日本血吸虫毛蚴侵袭湖北钉螺：取新鲜活动度好的由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所实验室驯化培养株湖北钉螺安徽亚种F2代湖北钉螺200只，放入24孔培养板中，每孔放一只螺。新鲜孵化的毛蚴，每孔（每只螺）放入10只日本血吸虫毛蚴（中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所实验室孵化的日本血吸虫安徽株毛蚴），加满脱氯水（满而未溢），28～30℃灯光照射下，分别于0hr、5hr、10hr、24hr、48hr五个时间点各取40只钉螺，经液氮处理后，冻存于-80℃备用。

Real-time RT-PCR：用TRIzol试剂提取各处理组钉螺总RNA，逆转录合成第一链cDNA，并以其为模板，用Oh-TPx目的基因TPF2和TPR2引物、内参基因18SrRNA引物18SF5和18SR5；Real-time RT-PCR反应使用Applied Biosystens 7000Real-time PCR System，反应体系参照美国DBI公司提供的SYBR Green QRT-PCR Master mix说明书配制；Real-time RT-PCR三步扩增法反应条件：Stage1:95℃2min，Stage2：95℃10s，56℃31s，72℃30s，共40循环，Stage3：60℃20min。实验结束时，根据扩增曲线设置荧光强度阈值，导出Ct值，保存融解曲线，根据公式：倍差（Fold change）=2^-ΔΔCt=2^-[(Ct _{TPx，exposed} ^-Ct _{18S，exposed} ^)-(Ct _{TPx，unexposed} ^-Ct _{18S，unexposed} ^)]，计算日本血吸虫毛蚴侵袭湖北钉螺不同时间点Oh-TPx基因表达的倍差值。其中，Ct_{TPx，exposed}是指暴露组目的基因Oh-TPx的Ct值，Ct_18S,exposed是指暴露组内参基因18SRNA的Ct值，Ct_{TPx,unexposed}是指非暴露组目的基因Oh-TPx的Ct值，Ct_{18S,unexposed}是指非暴露组内参基因18SRNA的Ct值。

结果如图7，表明：湖北钉螺在感染初期（5hr），Oh-TPx基因表达14倍，10hr后达到88倍，而随后的24hr、48hr表达为1.4、0.86倍。结果表明：Oh-TPx基因在日本血吸虫毛蚴感染湖北钉螺的早期表达水平增高，而在感染后期表达水平与感染前水平相似，提示Oh-TPx蛋白可能参与湖北钉螺-日本血吸虫毛蚴感染过程的早期应激反应。

因此，本发明的Oh-TPx蛋白可应用于制备抗寄生虫感染、抗氧化、抗衰老的药物中。

Claims (11)

1.一种湖北钉螺硫氧还蛋白过氧化物酶基因，其特征在于：所述基因的cDNA序列如SEQID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于：所述基因是通过RACE的方法，从湖北钉螺总RNA中分离得到的硫氧还蛋白过氧化物酶基因TPx，其中，为实现RACE方法的PCR引物序列如SEQ ID NO.3-4所示，RACE引物序列如SEQ ID NO.5-6所示；

所述cDNA的最大读码框为750bp。

3.一种蛋白，其特征在于：是由如权利要求1所述的基因编码形成的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求3所述的蛋白，其特征在于：所述蛋白的等电点为5.5，分子量为27.7kD，蛋白质信号肽区位于N端1～21氨基酸，高度保守的N端和C端半胱氨酸残基分别定位于97、218位，蛋白活性区域位于52～210位；

其中，蛋白活性区域的PCR引物序列如SEQ ID NO.7-8所示。

5.一种表达载体，其特征在于：包含有SEQ ID NO.1所示的基因序列，或包含有编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸的基因序列，或包含有编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸蛋白活性区域的基因序列。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pET-28a-TPx，该表达载体是在质粒pET-28a的多克隆位点中间插入His的亲和标记位点和编码包含有如SEQ IDNO.2所示氨基酸蛋白活性区域的基因序列形成的。

7.一种宿主细胞，其特征在于：含有如权利要求5所述的表达载体，或其基因组中整合有：SEQ ID NO.1所示的基因序列、或含有编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸的基因序列、或包含有编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸蛋白活性区域的基因序列。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞是含有如权利要求6所述的表达载体pET-28a-TPx的大肠杆菌BL21DE3。

9.一种蛋白的制备方法，其特征在于，包括步骤：

1）培养如权利要求7所述的宿主细胞；

2）从培养物中分离出蛋白。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述蛋白，是通过表达载体pET-28a-TPx在宿主细胞大肠杆菌BL21DE3中以胞内可溶的形式表达，表达量达620mg/L，且能经Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化。

11.一种如权利要求3所述的蛋白的应用，其特征在于：在制备抗寄生虫感染、抗氧化、抗衰老的药物中的应用。

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