CN1766097A

CN1766097A - 菊酸乙酯酯酶及其编码基因与其表达专用工程菌和该酶的应用

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Publication number: CN1766097A
Application number: CNA2005100979944A
Authority: CN
Inventors: 夏国兴; 邱并生; 胡学博
Original assignee: XIAHAN BIOENGINEERING (SHANGHAI) CO Ltd
Current assignee: XIAHAN BIOENGINEERING (SHANGHAI) CO Ltd
Priority date: 2005-09-02
Filing date: 2005-09-02
Publication date: 2006-05-03
Anticipated expiration: 2025-09-02
Also published as: CN100480380C

Abstract

本发明公开了一种菊酸乙酯酯酶及其编码基因与其表达专用工程菌和该酶的应用。该酶是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有菊酸乙酯酯酶活性的蛋白质。本发明在原有的环形节杆菌的菊酸乙酯酯酶基因序列的基础上进行改造，改造后的基因可在枯草杆菌中高水平表达菊酸乙酯酯酶，并构建了菊酸乙酯酯酶的枯草杆菌表达工程菌。实验证明，分泌表达的菊酸乙酯酯酶可转一性的作用于(+)－反式菊酸乙酯，并生成(+)－反式菊酸。本发明具有较高的实用性和可推广性，在(+)－反式菊酸的工业化生产中具有广阔的应用前景。

Description

菊酸乙酯酯酶及其编码基因与其表达专用工程菌和该酶的应用

技术领域

本发明涉及酶及其编码基因与其表达专用工程菌和该酶的应用，特别是涉及一种菊酸乙酯酯酶及其编码基因与其表达专用工程菌和该酶在生产(+)-反式菊酸中的应用。

背景技术

菊酸(Chrysanthemic acid，[2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)环丙烷羧酸]，分子结构见式1)是一种新型、高效、低毒的拟除虫菊酯类杀虫剂的重要中间体，因其作为人工合成的拟除虫菊酯类杀虫剂的酸性部分而被广泛地应用于此类杀虫剂的合成。此外，菊酸也是国际上最流行的美白成分之一，能够有效抑制酪氨酸酶的活性。

式1

拟除虫菊酯是一种模拟天然除虫菊酯的化学结构合成的杀虫剂。它的分子结构由菊酸和醇两部分组成。迄今为止，人工合成的拟除虫菊酯已近万种。目前广泛使用的有20多种，以氯菊酯、溴菊酯、氯氰菊酯、甲醚菊酪，氰戊菊酯、节菊酯(敌杀死)和杀灭菊酪(速灭杀丁)等为代表。

我国于70年代开始在农业生产中推广使用拟除虫菊酯。这类农药的特点为：对哺乳动物毒性较低，除虫毒性大于胃毒，且没有内吸毒性；低温效果高于高温，在环境中持留时间短，对害虫的击倒力强；它们除作杀虫剂外，尚可用于杀螨、防霉等用途。基于上述特点，该类农药具有广阔的应用前景。

采用人工化学反应合成拟除虫菊酯，一直无法解决合成产物中混杂几乎无任何作用的光学异构体的难题。合成拟除虫菊酯类杀虫剂的关键性中间体是菊酸(Campbell，I.G.M.，and S.H.Harper.The chrysanthemumcarboxylic acids.IV.Opticalresolution of the chrysanthemic acids.J.Sci.Food Agric.1952，3：189-192.；Yoshioka，H.，and J.Miyamoto.Synthetic Pyrethroids(1).Chem.Biol.1976，14：427-434.(In Japanese.))，它有四种同分异构体。

研究表明，菊酸的四种立体异构体分别与一定结构的菊醇形成的除虫菊酯的杀虫活性相差很大，通常以(+)-反式-菊酸形成的菊酯的杀虫活性最高(Schneider，M.，N.Engel，and H.Boensmann.Enzymatic synthesis of chiral building blocks fromracemates：preparation of(1R，3R)-chrysanthemic，-permethrinic and-caronicacids from racemic，diastereomeric mixtures.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1984，23：64-66.)，因此分离菊酸的四种立体异构体是拟除虫菊酯研究及生产中的重要环节之一。

现今，国内常利用化学拆分剂和立体异构体光学拆分的方法进行菊酸的化学合成，但利用生物合成的方法进行菊酸的工业化生产还未见报道(钟民，陈良.顺式(+-)菊酸动力学拆分研究.华东师范大学学报(自然科学版).1995，3：55-60.)。

国外亦主要用化学方法合成菊酸(Synthetic pyrethroids chemical WATCHfactsheet 2003，Beyond Pesticides.；Aratani，T.，Y.Yoneyoshi，and T.Nagase.Asymmetric synthesis of chrysanthemic acid.An application of copper carbenoidreaction.Tetrahedron Lett.1975，21：1707-1710.)。菊酸合成过程中重点强调环丙烷部分的合成，依据该部分的合成方法，可把菊酸的化学合成方法归为两类：(a)ylide，carbenoid化学，和其它相关的[2+1]补充；(b)1，3-消旋和相关的2，2-dimethyldimedone同分异构体(Stephane Jeanmart.Trends in chrysanthemic acidchemistry：A survey of recent pyrethrum syntheses.Aust.J.Chem.2003，56，559-566.)。上述化学合成方法亦未能解决合成产物中混杂几乎无任何作用的光学异构体的难题。关于菊酸生物合成方法的研究，Masako nishizawa等人的研究最富有成果，但还存在一些不完善的地方，如在可溶性及分泌表达等方面仍需完善。他们用环形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的菊酸乙酯酯酶在大肠杆菌中发酵表达，利用产生的菊酸乙酯酯酶生物合成(+)-反式菊酸，但获得的菊酸乙酯酯酶的酶活力较低(Masako nishizawa，Masatoshi shimizu，Hideo ohkawa，and Masaharu kanaoka.Steroselective production of(+)-trans-chrysanthemic acid by a microbialesterase：cloning，nucleotide sequence，and overexpression of the esterasegene of Arthrobacter globiformis in Escherichia coli.Applied AndEnvironmental Microbiology.1995，61：3208-3215.)。

环形节杆菌菊酸乙酯酯酶(ethyl chrysanthemate esterase，ECE)基因(GenBank号为：L22516)是从一种环形节杆菌(Arthrobacter globiformis SC-6-98-28)中克隆得到的，此基因编码由375个氨基酸残基组成的蛋白，蛋白分子量约为40KD。它是迄今为止所发现的唯一一个能很好辨别(+/-)-cis，trans-菊酸乙酯的酯酶(Masakonishizawa，Masatoshi shimizu，Hideo ohkawa，and Masaharu kanaoka.Steroselective production of(+)-trans-chrysanthemic acid by a microbialesterase：cloning，nucleotide sequence，and overexpression of the esterasegene of Arthrobacter globiformis in Escherichia coli.Applied AndEnvironmental Microbiology.1995，61：3208-3215.)。此酯酶能立体选择性地水解(+)-反式-菊酸乙酯为(+)-反式-菊酸和乙醇，而对其它菊酸乙酯立体异构体不起作用，从而为(+)-反式-菊酸的合成提供了一个良好的途径(Nishizawa，M.，H.Gomi，and F.Kishimoto.Purification and some properties of carboxylesterase fromArthrobacter globiformis：stereoselective hydrolysis of ethyl chrysanthemate.Biosci.Biotechnol.Biochem.1993，57：594-598.)。与常规的拟除虫菊酯的化学合成方法相比，利用该酶不仅能简化流程，且能提供高度专一活性的拟除虫菊酯。研究表明，此酶稳定性好，可利用固定化酶技术，在酶反应器中选择最佳条件不间断地生产(+)-反式-菊酸。若能使此合成途径高效地运作起来，必将带来美好的应用前景并取得良好的经济效益(K.H.E.Lam，K.C.Chow，W.K.R.Wong.Construction ofan efficient Bacillus subtillis system for extracellar production ofheterologous proteins.Journal of Biotechnology 1998，63：167-177.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种菊酸乙酯酯酶及其编码基因。

本发明所提供的菊酸乙酯酯酶，命名为ECE1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有菊酸乙酯酯酶活性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由375个氨基酸残基组成。

编码上述菊酸乙酯酯酶的基因(ECE1)也属于本发明的保护范围，它是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由1128个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第1128位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系均属于本发明的保护范围。

扩增上述菊酸乙酯酯酶编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种菊酸乙酯酯酶的专用表达工程菌，是将含有上述菊酸乙酯酯酶基因ECE1的表达载体导入枯草芽孢杆菌中得到的。

用于构建所述含有菊酸乙酯酯酶基因ECE1的表达载体的出发载体可为pMA5、pBE2、pSBPTQ、pC194或pM2Veg等，优选为pMA5。

以pMA5为出发载体，构建的含有菊酸乙酯酯酶基因ECE1的表达载体为pMA5-ECE1。

所述枯草芽孢杆菌可为枯草芽孢杆菌DB1342、WB700、DB104或WB600等，优选为枯草芽孢杆菌DB1342。

本发明的第四个目的是提供一种(+)-反式菊酸的生产方法。

本发明所提供的(+)-反式菊酸的生产方法，是发酵上述菊酸乙酯酯酶的专用表达工程菌，获得菊酸乙酯酯酶，再加入底物(+)-反式菊酸乙酯，得到(+)-反式菊酸。

上述生产方法中，所述发酵用培养基可为普通枯草芽孢杆菌培养基或2×MSR培养基。普通枯草芽孢杆菌培养基配方为：每1000mL水中含2-3％酵母浸出物，1-2％蛋白胨，0.1-0.2％K₂HPO₄.3H₂O，0.1％KH₂PO₄和1％NaCl，其余为水；2×MSR培养基配方为：每1000mL水中含5％酵母浸出物，3％蛋白胨，0.6％K₂HPO₄，1.0％葡萄糖，其余为水。所述百分比浓度均为质量百分浓度。

发酵温度为27-42℃，优选为35-37℃；发酵时间为24-148小时，优选为72-120小时。

本发明在原有的环形节杆菌(Arthrobacter globiformis SC-6-98-28)的菊酸乙酯酯酶基因序列的基础上，根据枯草杆菌的密码子偏好性对编码菊酸乙酯酯酶的前10个氨基酸残基的密码子用PCR的方法进行改造，改造后的基因可在枯草杆菌中高水平表达菊酸乙酯酯酶，并利用枯草杆菌表达载体将改造的基因转化到枯草杆菌中，获得了菊酸乙酯酯酶的表达工程菌。该工程菌在普通枯草芽孢杆菌培养基或2×MSR培养基中经24-148小时发酵后，即可产生酶活较高的菊酸乙酯酯酶，酶活力可达到5.7×10⁵U/L，显著高于用已有方法生产的菊酸乙酯酯酶的酶活力，并且该工程菌具有表达量高，生产成本低，易于产业化的优点。实验证明，本发明的菊酸乙酯酯酶可转一性的作用于(+)-反式菊酸乙酯，并生成(+)-反式菊酸。本发明具有较高的实用性和可推广性，在(+)-反式菊酸的工业化生产中具有广阔的应用前景。

说明书附图

图1为PCR扩增的菊酸乙酯酯酶基因的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为ECE1专用表达载体pMA5-ECE1的构建示意图

图3为ECE1的枯草芽孢杆菌表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳检测结果

图4为pMA5-ECE1在普通枯草芽孢杆菌培养基中发酵不同时间的培养液的酶活力测定结果

具体实施方式

下属实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有引物合成及测序工作均由上海生工完成。

实施例1、菊酸乙酯酯酶基因ECE1的克隆

1、PCR扩增菊酸乙酯酯酶基因

根据已公开的菊酸乙酯酯酶基因的核苷酸序列(GenBank号为：L22516)设计引物，引物序列如下：

ECE-UP(上游引物)：5’-GAGCT CCATGGATGCACAGACGATTGCC-3’；

ECE-Down(下游引物)：5’-GAAGACTCCTACTGAGCCAGTTCGG-3’

其中，上游引物引入了限制性内切酶NcoI识别序列(带下划线碱基)，并将菊酸乙酯酯酶基因的起始密码子“GTG”改为“ATG”。以环形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)的基因组DNA为模板，在引物ECE-UP和引物ECE-Down的引导下，PCR扩增菊酸乙酯酯酶基因。PCR反应体系为：1μl经5分钟超声波处理过的环形节杆菌菌液，上、下游引物各1μl，1μl 10mM dNTP，5μl 10倍PCR缓冲液，0.5μl pfuTaq酶(Stratagene公司)，补水至50μl；PCR反应条件为：首先94℃ 5min；然后94℃ 1min，55℃ 30sec，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃ 10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为MarkerIII(北京奇华盛公司)，泳道1为PCR产物)，PCR扩增出了大小约1200bp的单一条带，与预期结果相符。再将PCR产物克隆入载体pMD18T(TaKaRa公司)中，得到含有菊酸乙酯酯酶基因的重组载体，命名为pMD18T-ECE。用测序的方法做进一步的鉴定，测序结果表明扩增的菊酸乙酯酯酶基因与已公开的菊酸乙酯酯酶基因一致。

2、菊酸乙酯酯酶基因核苷酸序列的改造

为在枯草杆菌中高水平表达菊酸乙酯酯酶，在原有菊酸乙酯酯酶基因核苷酸序列的基础上，根据枯草杆菌的密码子偏好性对编码菊酸乙酯酯酶的前10个氨基酸残基的密码子用PCR的方法进行改造，首先根据枯草杆菌的密码子偏好性设计引物，引物序列如下：

引物1(上游引物)：

5’-GGAATTCCATATGGACGCTCAAACTATCGCTCCTGGATTCGAATCAGTCGCC-3’；

引物2(下游引物)：5’-GAAGATCTCTACTGAGCCAGTTCGGTGAC-3’

再以步骤1构建的含有菊酸乙酯酯酶基因的重组载体pMD18T-ECE为模板，在引物1和引物2的引导下，PCR扩增经改造的菊酸乙酯酯酶基因。PCR反应体系为：1μlpMD18T-ECE质粒，上、下游引物各1μl，1μl 10mM dNTP，5μl 10倍PCR缓冲液，0.5μl pfu Taq酶，补水至50μl；；PCR反应条件为：首先94℃ 5min；然后94℃1min，55℃ 30sec，72℃延伸1min 30sec，共30个循环；最后72℃ 10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增出了大小约1200bp的单一条带，与预期结果相符。再将PCR产物克隆入载体pMD18T中，用测序的方法做进一步的鉴定，测序结果表明获得的经改造的菊酸乙酯酯酶基因具有序列表中SEQ ID№：2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：2由1128个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第1128位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID №：1由375个氨基酸残基组成，将获得的经改造的菊酸乙酯酯酶基因命名为ECE1。

实施例2、ECE1专用表达工程菌的构建

1、ECE1专用表达载体pMA5-ECE1的构建

如图2所示，ECE1专用表达载体pMA5-ECE1的构建方法为：用无水乙醇沉淀并回收实施例1 PCR扩增的ECE1，将其用限制性内切酶NdeI和BglII双酶切后，与经限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切的载体pMA5用T₄ DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选挑取转化子提质粒，用限制性内切酶NdeI和XbaI进行酶切鉴定，经酶切获得1100bp片段的为阳性克隆，再对阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为实施例1中的引物1和引物2，对PCR产物进行测序，测序结果表明构建的含ECE1的重组表达载体正确，将其命名为pMA5-ECE1。

2、ECE1专用表达工程菌BSMA5-ECE1的构建

将pMA5-ECE1用热击的方法转化枯草芽孢杆菌DB1342(基因型：his nprR2 nprE18aprAS epr)，将经鉴定正确的整合有pMA5-ECE1的枯草芽孢杆菌转化子命名为BSMA5-ECE1。

实施例3、ECE1在枯草芽孢杆菌中的表达及酶活力的测定

一、ECE1在枯草芽孢杆菌中的表达

普通枯草芽孢杆菌培养基配方：每1000mL水中含2-3％酵母浸出物，1-2％蛋白胨，0.1-0.2％ K₂HPO₄.3H₂O，0.1％KH₂PO₄，1％NaCl。

将实施例2构建的ECE1专用表达工程菌BsMA5-ECE1接种于普通枯草芽孢杆菌培养基中，在37℃下连续培养120h，以转化有pMA5空载体的枯草芽孢杆菌DB1342和转化有ECE1的大肠杆菌BL21(DE3)plys(将ECE1克隆入载体pET26(Navagen公司)中，得到含有ECE1的大肠杆菌表达载体，命名为pET26-ECE1，再将pET26-ECE1转化大肠杆菌BL21(DE3)plys，经筛选获得阳性克隆转化子，发酵培养条件为37℃下培养12h。)为对照。于第三天取样(每份样品1.5mL)，提取总蛋白，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，检测结果如图3所示(泳道M为Marker，泳道1为转化有pMA5空载体的枯草芽孢杆菌DB1342的培养液上清，泳道2为转化有pMA5空载体的枯草芽孢杆菌DB1342经超声破碎后的培养液上清，泳道3为转化有pMA5空载体的枯草芽孢杆菌DB1342经超声破碎后浓缩的培养液上清，泳道4 BsMA5-ECE1的培养液上清，泳道5为BsMA5-ECE1经超声破碎后的培养液上清，泳道6为BsMA5-ECE1经超声破碎后浓缩的的培养液上清，泳道7为BsMA5-ECE1经浓缩的上清，泳道8为转化有pET26-ECE1的大肠杆菌BL21(DE3)plys转化子经发酵后的培养液上清，泳道9为转化有pET26-ECE1的大肠杆菌BL21(DE3)plys转化子经发酵后重悬的沉淀)，结果表明ECE1在普通枯草芽孢杆菌中获得了表达(图中箭头所指)，表达产物的分子量约为40KD，与预期结果相符。

二、ECE1的枯草芽孢杆菌表达产物的酶活力测定

1、在普通枯草芽孢杆菌培养基中ECE1的枯草芽孢杆菌表达产物的相对酶活力测定

按步骤一所述的方法在枯草芽孢杆菌中发酵表达ECE1，每隔24h取培养液15μl测酶活，为测定质粒稳定性，将连续培养120h后转接在普通枯草芽孢杆菌培养基中，再连续培养120h，每隔24h取培养液15μl测酶活。蛋白相对酶活是以721分光光度计测定254nm处的吸光值。菊酸乙酯的快速酶活性检测用酚酞二丁酸酯(Phenolphthalein Dibutyrate，Sigma-Aldrich R289086)。反应混合液含1.5mL 200mM甘氨酸-氢氧化钠(pH 10.0)5μl 10mM的酚酞二丁酸酯。40℃温育3min后，加入适量的酶ECE1或培养液(25μl)，40℃下反应。用分光光度计测定550nm光吸收的增长速率。以转化有pMA5空载体的枯草芽孢杆菌DB1342的培养液为对照，测定5min内不同处理在254nm的吸光值。结果如表1所示，发酵BsMA5-ECE1获得的酯酶ECE1的活性很高，550nm处的光吸收值最高为0.5，对照设为0。

表1 通枯草芽孢杆菌培养基上发酵不同时间BsMA5Z2-ECE1获得的ECE1的相对

酶活测定结果

2、在2×MSR培养基中ECE1的枯草芽孢杆菌表达产物的相对酶活力测定

2×MSR培养基配方：5％酵母浸出物，3％蛋白胨，0.6％K₂HPO₄，1.0％葡萄糖。

将培养基换成2×MSR培养基，其余发酵条件与步骤1相同，以环形节杆菌(Arthrobacter globiformis)为对照，发酵结束后，分别取1、2、6、15μl菌液测定相对酶活，结果如表2所示，发酵BsMA5-ECE1获得的酯酶ECE1的活性很高，550nm处的光吸收值最高为0.52。

表2 用2×MSR培养BsMA5Z2-ECE1后取不同量菌液的的相对酶活测定结果

3、在普通枯草芽孢杆菌培养基中ECE1的枯草芽孢杆菌表达产物和环形节杆菌(Arthrobacter globiformis)发酵产物的相对酶活力比较

分别取37℃摇床培养2天的3mL原始菌种环形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)LB液体培养液和37℃摇床培养5天的3mL BsMA5-ECE1的普通枯草芽孢杆菌培养液作相对酶活性比较，具体方法为：接种环形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)于3mL LB液体培养基中，37℃摇床培养2天，把3ml菌液离心到一个1.5ml离心管中，弃上清(上清几乎没有测到酶活性)，把菌体同离心管中残余的培养液混匀，成为浓缩的菌体混悬物，约60μl。同时以BsMA5-ECE1在3mL普通枯草培养基中37℃摇床培养发酵5天。分别取前者60μl中的15μl，后者发酵5天的培养液1μl，2μl，6μl，15μl加入到1.5mL反应液40℃反应5min(以BsMA5-ECE1 37℃摇床培养发酵4天为对照，设为0)，然后用721分光光度计测550nm的光吸收值，结果如表3所示。由表1和表2可以粗略计算出在枯草杆菌表达系统中经发酵产生的ECE1相对酶活性为发酵环形节杆菌所产生的菊酸乙酯酯酶的500-750倍。

表3 BsMA5Z2-ECE1与环形节杆菌相对酶活的对比

4、在普通枯草芽孢杆菌培养基中ECE1的枯草芽孢杆菌表达产物的绝对酶活力测定

相对酶活力没有严格依据一般酶效率的计算方法，因此只能作初步估计。绝对酶活力酶活力则根据一个酶活单位的定义：40℃反应每分钟产生1μmol酚酞的酶量。分别在0，5，10，15，20min时间段取样，计算回归方程。根据比尔定律：

A＝εbc (1)

其中，A为吸光度；ε为消光系数；b为光程；c为吸光物质浓度。在波长、溶液和温度确定的情况下，物质的摩尔消光系数是由给定物质的特性决定的。Nishizawa等人(Nishizawa，M.，H.Gomi，and F.Kishimoto.Purification and some propertiesof carboxylesterase from Arthrobacter globiformis：stereoselectivehydrolysis of ethyl chrysanthemate.Biosci.Biotechnol.Biochem.1993，57：594-598.)测得的酚酞二丁酸酯消光系数为23200/M.cm。酶活力单位可以依据其定义和上述公式计算得出。分析不同时间段254nm处BsMA5-ECE1在普通枯草芽孢杆菌培养基中发酵的培养液吸收值的变化，如图4所示(发酵液离心后上清(a)，沉淀用PBS悬浮后上清(b)，以及超声波破碎细胞壁后离心上清(c))。由于上清最易得到，且量大，因此最具有实际意义。上清的回归方程为：y＝0.0164x+0.141，按公式(1)计算出上清酶活力为1.41U/25ul酶液，约合5.7万单位/升发酵液。

实施例4、用本发明的菊酸乙酯酯酶ECE1制备(+)-反式菊酸的特异性分析

取500ul菊酸乙酯混合物((+)-反式：(-)-反式：(+)-顺式：(-)-顺式＝45∶45∶5∶5(重量分数比))加入到24.5mL的200mM甘氨酸溶液(pH10.0)，再加入50ul实施例3表达的菊酸乙酯酯酶ECE1酶液(1.41U/25ul)，在500rpm、45℃下反应24h后用2mL 35％HCl终止反应。然后用甲基异丁酮(MIBK)萃取，在5mL萃取液中加入100ul二氯苯胺和100ul二环己基碳二胺，室温反应3h，反应液用1.0N HCl和水洗，MgSO₄脱水后用高压液相色谱(HPLC)进行产物分析。HPLC反应中用Bio-Rad Hipore C18反向色谱柱分析，流动相为己烷∶二氯甲烷＝17∶3，流速1mL/min，在254nm处检测。结果表明，加入酶液的处理在18.5min有产物(+)-反式菊酸胺洗脱峰出现。测定反应生成的(+)-反式菊酸和未水解的(+)-反式菊酸乙酯，没有生成其它类型的菊酸异构体，表明本发明的菊酸乙酯酯酶ECE1的底物仅为(+)-反式菊酸乙酯。用该酶可以替代化学法，直接用(+)-反式菊酸乙酯耒生产(+)-反式菊酸。

序列表

<160>2

<210>1

<211>375

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Met Asp Ala Gln Thr Ile Ala Pro Gly Phe Glu Ser Val Ala Glu Leu

1 5 10 15

Phe Gly Arg Phe Leu Ser Glu Asp Arg Glu Tyr Ser Ala Gln Leu Ala

20 25 30

Ala Tyr His Arg Gly Val Lys Val Leu Asp Ile Ser Gly Gly Pro His

35 40 45

Arg Arg Pro Asp Ser Val Thr Gly Val Phe Ser Cys Ser Lys Gly Val

50 55 60

Ser Gly Leu Val Ile Ala Leu Leu Val Gln Asp Gly Phe Leu Asp Leu

65 70 75 80

Asp Ala Glu Val Val Lys Tyr Trp Pro Glu Phe Gly Ala Glu Gly Lys

85 90 95

Ala Thr Ile Thr Val Ala Gln Leu Leu Ser His Gln Ala Gly Leu Leu

100 105 110

Gly Val Glu Gly Gly Leu Thr Leu Ala Glu Tyr Asn Asn Ser Glu Leu

115 120 125

Ala Ala Ala Lys Leu Ala Gln Met Arg Pro Leu Trp Lys Pro Gly Thr

130 135 140

Ala Phe Gly Tyr His Ala Leu Thr Ile Gly Val Phe Met Glu Glu Leu

145 150 155 160

Cys Arg Arg Ile Thr Gly Ser Thr Leu Gln Glu Ile Tyr Glu Gln Arg

165 170 175

Ile Arg Ser Val Thr Gly Ala His Phe Phe Leu Gly Leu Pro Glu Ser

180 185 190

Glu Glu Pro Arg Tyr Ala Thr Leu Arg Trp Ala Ala Asp Pro Ser Gln

195 200 205

Pro Trp Ile Asp Pro Ala Ser His Phe Gly Leu Ser Ala Asn Ser Ala

210 215 220

Val Gly Asp Ile Leu Asp Leu Pro Asn Leu Arg Glu Val Arg Ala Ala

225 230 235 240

Gly Leu Ser Ser Ala Ala Gly Val Ala Ser Ala Glu Gly Met Ala Arg

245 250 255

Val Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Gly Leu Ala Ala Asn Gly Asp Arg Ala

260 265 270

Ala Val Ala Pro Leu Leu Ser Glu Glu Thr Ile Gln Thr Val Thr Ala

275 280 285

Glu Gln Val Phe Gly Ile Asp Arg Val Phe Gly Glu Thr Ser Cys Phe

290 295 300

Gly Thr Val Phe Met Lys Ser His Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Ser Tyr

305 310 315 320

Arg Ala Phe Gly His Asp Gly Ala Ser Ala Ser Leu Gly Phe Ala Asp

325 330 335

Pro Val Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Tyr Val Pro Gln Gln Ala Glu Pro

340 345 350

Gly Gly Ala Gly Cys Arg Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ala Val Arg Lys

355 360 365

Ala Val Thr Glu Leu Ala Gln

370 375

<210>2

<211>1128

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

atggacgctc aaactatcgc tcctggattc gaatcagtcg ccgaactctt tggccgtttc 60

ctgagcgaag accgggaata ttcagcccag ctcgcggcct accaccgcgg agtcaaggta 120

ttggacatca gcggtgggcc gcaccgccgc ccggattccg tgaccggtgt tttctcctgc 180

tccaagggag tatccgggct ggtcatcgca cttttggtcc aggacggctt cctcgacctc 240

gacgccgaag tggtcaagta ctggccggaa ttcggcgccg aaggaaaggc cacgattacc 300

gtggcccagc tgctctccca ccaggccggg cttctgggag tcgaaggcgg actcaccctc 360

gcggaataca acaactccga actggccgcc gccaagctcg cgcagatgcg gccgctgtgg 420

aagcccggga ccgccttcgg gtaccacgcc ctgaccatcg gcgtcttcat ggaggagctt 480

tgccgccgga tcaccgggtc cacgctccag gaaatctacg aacagcggat ccgctcggtc 540

acgggcgccc acttcttcct gggactgcct gagtccgagg aaccccgcta tgccaccctc 600

cgttgggctg cagacccctc ccagccgtgg attgatcccg ccagccattt cggcctttcc 660

gcaaactcgg ccgtggggga catccttgac ctgcccaacc tccgcgaggt ccgcgcagcc 720

ggcctgagtt cagccgccgg agtcgccagc gcggaaggca tggcccgcgt ctacgctgcg 780

gcactcaccg gacttgccgc caacggcgac cgagccgccg tcgcgcccct cctcagcgaa 840

gagaccatcc aaaccgtcac ggccgagcag gtcttcggca tcgaccgggt gttcggcgag 900

acgagctgct ttgggacagt gttcatgaaa tcgcatgcac gctcgcctta tggcagctac 960

cgggcgttcg ggcacgacgg cgccagcgca tctttggggt tcgctgaccc tgtgtatgaa 1020

ctcgccttcg ggtacgtgcc gcaacaggcc gagccgggcg gagcgggatg ccgcaacctt 1080

gagctgagcg ccgccgtgcg gaaggcagtc accgaactgg ctcagtag 1128

Claims

1、一种菊酸乙酯酯酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2、根据权利要求1所述的菊酸乙酯酯酶，其特征在于：所述菊酸乙酯酯酶具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列。

3、编码权利要求1所述的菊酸乙酯酯酶的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因具有序列表中SEQ ID №：2的DNA序列。

5、含有权利要求3所述基因的表达载体和转基因细胞系。

6、一种菊酸乙酯酯酶的专用表达工程菌，是将含有权利要求3所述的菊酸乙酯酯酶基因的表达载体导入枯草芽孢杆菌中得到的。

7、根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于：用于构建所述含有权利要求3所述菊酸乙酯酯酶基因的表达载体的出发载体为pMA5、pBE2、pSBPTQ、pC194或pM2Veg。

8、根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于：所述表达载体为pMA5-ECE1。

9、根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌DB1342、WB700、DB104或WB600。

10、一种(+)-反式菊酸的生产方法，是发酵权利要求6所述的菊酸乙酯酯酶的专用表达工程菌，获得菊酸乙酯酯酶，再加入底物(+)-反式菊酸乙酯，得到(+)-反式菊酸；所述发酵用培养基为普通枯草芽孢杆菌培养基或2×MSR培养基，普通枯草芽孢杆菌培养基配方为：每1000mL水中含2-3％酵母浸出物，1-2％蛋白胨，0.1-0.2％K₂HPO₄.3H₂O，0.1％KH₂PO₄和1％NaCl，其余为水；2×MSR培养基配方为：每1000mL水中含5％酵母浸出物，3％蛋白胨，0.6％K₂HPO₄，1.0％葡萄糖，其余为水；发酵温度为27-42℃，发酵时间为24-148小时。